全身モデリングにより、アルツハイマー病における尿中ギ酸濃度の低下に関するマイクロバイオームとゲノムの相互作用が明らかになった

哉百名

2023年9月7日 16:29

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論文

全身モデリングにより、アルツハイマー病における尿中ギ酸濃度の低下に関するマイクロバイオームとゲノムの相互作用が明らかになった

https://www.researchsquare.com/article/rs-3306891/v1

フィリッポ・マルティネッリ、アルムート・ハインケン、アン＝クリスティン・ヘニング、マリア・A・ヴェルハイド、他36名

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https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-3306891/v1

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科学報告書

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2023年09月05日掲載

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要旨
本研究では、アルツハイマー病（AD）の発症における腸内細菌叢の潜在的役割を理解することを目的とした。この関係を調べるために多面的なアプローチをとった。AD患者および対照者の尿中メタボロミクスを検討し、ADではギ酸およびフマル酸濃度が低下していることを明らかにした。さらに、AD患者と対照者の別のグループから得られた全ゲノム配列決定（WGS）データを利用した。この情報により、宿主-マイクロバイオームパーソナライズドモデルを作成し、調査することができた。注目すべきは、これらのモデルにおいて、AD患者はギ酸微生物分泌の減少を示したことである。さらに、宿主におけるギ酸の産生を担う特定の反応を同定し、興味深いことに、これらの反応はADと相関のある遺伝子と関連していた。この研究は、ギ酸塩がADの初期マーカーとなる可能性を示唆するとともに、ギ酸塩の産生に対する遺伝子およびマイクロバイオームの寄与を明らかにするものである。ギ酸分泌の低下とその遺伝的関連は、腸内細菌叢とADとの複雑な関係を示唆している。このような全体的な理解は、AD管理における新たな診断・治療の道を開くかもしれない。

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生物科学/計算生物学・バイオインフォマティクス

生物科学/計算生物学・バイオインフォマティクス/計算モデル

アルツハイマー病

代謝モデリング

制約に基づくモデリング

マイクロバイオーム

ギ酸塩

メタボロミクス

宿主マイクロバイオーム

パスウェイ

共代謝

図
図1
図1

図2
図2

図3
図3

図4
図4

はじめに
アルツハイマー病（AD）は、世界でも有数の神経変性疾患であり、認知症の最も一般的な原因である1,2。人口の高齢化と有効な治療法の欠如により、ADは先進国において社会経済的に大きな負担となっている3。ADは、脳の病態の進行と認知機能の低下に加え、メタボロームの変化をもたらす代謝ネットワークの破綻によって特徴づけられる4。

ヒトの腸内細菌叢は、ヒトの健康と福祉において重要な役割を果たしており、幅広い必須機能を果たしている5,6。腸内細菌叢は、肝臓、腎臓、脳などの下流の臓器に影響を与え、またその影響を受ける7。また、神経保護（インドールアクリル酸など）や神経毒性（キノリン酸など）の代謝産物の主要な供給源でもある8。近年、ADにおける微生物異常が報告されている9,10。さらに、一次および二次胆汁酸（BA）などの腸内細菌代謝産物の変化は、軽度認知障害やAD認知症と相関することが報告されている11,12。

マイクロバイオームの変化、メタボロームの変化、宿主の代謝の変化、そして疾患の発症との関連を理解するためには、マルチオミクスデータを統合できるメカニズム論的な計算モデルの構築が不可欠である。制約に基づく再構築と解析（COBRA）アプローチは、代謝の変化と疾患によって影響を受ける生化学的経路をよりよく理解するための強力なツールを提供する13。COBRAは一般に、対象生物のゲノム配列からボトムアップで構築される、手作業で精緻化されたゲノムスケールの代謝再構築に依存している14。これらのゲノムスケール代謝再構築は、食事情報、メタゲノミクス、メタボロミクスなどの制約条件を適用することで、条件特異的な代謝モデルに変換することができ、フラックスバランス解析15などの広く使用されている手法により、これらの代謝モデルの生物学的に実行可能な解空間の計算が可能になる。ヒト腸内細菌叢の規模に対応するため、AGORA 16と呼ばれる773のヒト腸内微生物のゲノムスケール再構築リソースが作成され、その後、規模と範囲が拡大され（AGORA2）、現在では7,302のヒト腸内微生物に対応している17。AGORAやAGORA2を使えば、Microbiome modelling toolbox 18,19のようなツールを使って、メタゲノミクスデータから得られた微生物の相対量を用いて、パーソナライズドマイクロバイオームモデルを構築することができる。パーソナライズドマイクロバイオームモデリングを用いれば、炎症性腸疾患18,19や大腸がんなどの疾患状態における腸内細菌叢の代謝能力に関する洞察を提供し、その変化を特定することができる。このように予測された代謝能力は、糞便メタボロームデータと照らし合わせて検証することができる20。さらに、ヒト代謝の性特異的全身モデル（WBM）が発表されており21、臓器分解された解剖学的に正確なヒト代謝を表現している。これらのWBMは、生理学的パラメータ、食事インプット、および個人化されたマイクロバイオームモデル21を用いて文脈化することができる。また、これらのモデルは初めて、宿主と微生物叢の代謝の相互作用21,22や宿主とウィルスの共代謝23を調べるためにも使用できるようになった。これらのシミュレーションから得られた新規仮説は、その後検証することができる。

研究結果
本研究では、認知機能の低下とADに関連する代謝の変化の特徴を明らかにするとともに、これらの変化におけるヒト腸内細菌叢の役割を解明することを目的とした。まず、ドイツを拠点とするDELCODE研究コホートから、臨床的ADスペクトラムの個体と認知的に年齢が一致した健常者の1D-NMR尿メタボロームデータを作成した。その結果、AD認知症患者ではギ酸およびフマル酸濃度が統計学的に有意に低下していることが確認された。微生物が関与している可能性を明らかにするため、AD認知症患者24名と、年齢・性別・BMIをマッチさせた認知障害のない対照者24名からなる独立したコホートから得られたWGSデータを用いて、各個人にパーソナライズされた宿主マイクロバイオームモデルを構築した。その結果、AD宿主マイクロバイオームモデルでは、健常対照宿主マイクロバイオームモデルと比較して、ギ酸微生物分泌量が低下していることがわかった。さらに、予測された尿中ギ酸産生には、アミノ酸と糖の宿主-マイクロバイオーム共代謝が関与していることがわかった。ADにおけるこれら2つの宿主経路の意義は、その基礎となる遺伝子とAD病態との既知の関連によってさらに裏付けられた。以上をまとめると、我々の解析は、AD患者と対照群との間のマイクロバイオームのギ酸分泌能の変化と、その産生における宿主-マイクロバイオーム相互作用を示唆している。これらの知見は、ADにおける宿主とマイクロバイオームとの相互作用を理解する上で、臨床的に関連する可能性がある。

メタボローム解析により、AD患者の尿中のフマル酸およびギ酸濃度が低下していることが明らかになった。
ADと認知機能低下における代謝の変化を明らかにするため、DELCODE参加者24人（n=177）のベースライン時の1D-NMR尿メタボロームデータを利用した（図1A）。DELCODEコホートには4つの主要研究グループがあり、尿メタボロミクスを用いてサブサンプルの特徴を明らかにした：健常対照（n = 49）、自覚的認知機能低下（n = 45）、軽度認知機能障害（n = 49）、AD-認知症（n = 34）。標的メタボロミクス解析の結果、49種類のクレアチニン規格化尿代謝物が定量された（表S01）。定量された代謝物のうち、研究グループ変数と関連する非ゼロ測定値が50％以上あるものをすべてスクリーニングした。トリカルボン酸（TCA）サイクルの中間体であるフマル酸は、AD認知症患者の尿中で減少していた（FDR < 0.05、図1B、表S02）。さらに、ギ酸塩もAD認知症群で減少していたが、この結果は多重検定で補正しても統計的に有意ではなかった（図1C、表S02）。注目すべきは、ギ酸塩とフマル酸塩が、軽度認知障害（MCI）と同様に、自覚的認知機能低下（SCD）のある人の間でも低下していたことで、ギ酸塩とフマル酸塩の変化は、ADの病因の初期過程を示している可能性が示唆された。

マイクロバイオームモデルでは代謝内容に差はなかった
ヒトの腸内細菌叢は宿主の代謝に影響を及ぼし、ヒトのギ酸産生に最大50％寄与している25。尿中のフマル酸およびギ酸レベルの変化に対する微生物の影響の可能性を調べるために、ヒトと微生物の代謝の個人化された制約ベースのモデルを使用した。DELCODE研究参加者のマイクロバイオームデータは入手できなかったので、ADによる認知症患者24名と、Wisconsin Registry for Alzheimer's Prevention study（WRAP）とWisconsin Alzheimer's Disease Research Center（WADRC）のコホートから年齢と性別をマッチさせた対照被験者24名から便サンプルを入手した26。予想されたように、AD認知症患者ではAPOE4対立遺伝子の保有率が高く（図2A）、遅発性ADの最も強い遺伝的危険因子であった27,28。これらの48人について、便サンプルからメタゲノム配列データを作成し、Qiita 31のWeb of Life（Release 1）30に対してデフォルトのWoltka 29ツールキットを用いて解析した。サンプルに含まれるリード量の中央値は2,561,443（四分位範囲（IQR）= 2,344,948）リードであった（図2A）。(図2A）。リード数には、症例と対照の間で統計的に有意な差は認められなかった。

マイクロバイオーム代謝に関する知見を得るために、微生物種の相対的存在量を用いて個人化されたマイクロバイオーム代謝モデルを作成し、その特性を調べた。そのため、種の分類学的情報がないリードはすべて破棄し、同定された種のリストとAGORA2代謝再構築リソース17で説明されている種のリストを比較し、AGORA2上にマッピングできなかった種に属するリードはすべて破棄した。同じ種の対応する AGORA2 株に存在するすべての代謝物と反応の組み合わせからなる汎種微生物代謝再構築を作成した（Methods）。次に、これらの汎種微生物再構成を組み合わせて、各サンプルについて 1 つのマイクロバイオーム再構成を作成した。このAGORA2マッピングの結果、48サンプルのうち少なくとも1つには815の異なる種が存在し、各サンプルには平均476（SD = 74）の微生物が存在した。低存在種をカットオフした後（Methods）、サンプル特異的マイクロバイオームモデルは平均259（SD = 29）の汎種モデルで構成され、シーケンスデータの全リードの平均73.60%（SD = 11.92%）を占めた（図2A）。その結果、48のサンプル特異的マイクロバイオームモデルは、平均で373,118（SD = 40,819）の非ユニーク代謝物と337,340（SD = 36,718）の非ユニーク反応で構成された（図2A）。マイクロバイオームモデルにおける反応と代謝物の冗長性は、各汎微生物再構成がマイクロバイオーム再構成内に保存されていることに由来する。ユニークな反応のセットのみを考慮すると、ADマイクロバイオームモデルには平均7,558（SD = 169）のユニークな反応が含まれていた。ADマイクロバイオームモデルと対照マイクロバイオームモデルの間で、代謝内容に違いは検出されなかった（図2A）。

AD-認知症における微生物の存在量シフト
マイクロバイオーム再構築において変化した微生物の相対存在量を調べたところ、Turicibacter sanguinis、Hungatella hathewayi、Turicibacter sp h121、Haemophilus parainfluenzae、Ruminococcus champanellensis、Dialister succinatiphilus、およびCoprobacillus cateniformisが減少し、Akkermansia sp kle1797、Akkermansia sp kle1798、Parabacteroides distasonis、Bacteroides finegoldii、Collinsella tanakaei、Collinsella stercorisおよびBacteroides thetaiotaomicronの相対量が健常対照と比較して増加した（表S04）。相対存在量データの組成的性質のため、gOTUカウントを用いて、増加した種と減少した種の対数比分析を行った。この分析により、相対量に見られた変化が確認された（図2B）。

AD認知症患者と健常対照者の間で、ギ酸塩尿分泌フラックスに変化はないことが予測された。

ギ酸は腸内嫌気性菌の発酵産物であり、腸内細菌叢の代謝は宿主25におけるギ酸産生全体の最大50％を占める可能性がある。ギ酸塩の尿中排泄にマイクロバイオームが関与している可能性を評価するため、我々は、性特異的な臓器分解型ヒト代謝全身モデル（WBM）21を用い、女性または男性のWBMの大腸管腔に個人化マイクロバイオームモデルを追加した。DELCODE研究でAD患者の尿中に変化が見られたギ酸は、マイクロバイオームモデルとWBMの一部であった。この代謝の重複により、宿主-マイクロバイオーム共代謝への直接的な影響を調べることができた。すべてのマイクロバイオーム関連WBMと2つの性特異的無菌WBMについて、ギ酸の最大尿分泌フラックスと最大マイクロバイオーム生産フラックスを計算した。WBMのシミュレーション設定は、性特異的宿主代謝とマイクロバイオームモデルを除いて同一であった。したがって、以降の統計解析では、性別を共変量として含めた。健常者とADの間で統計的に有意な差は観察されなかった（表S05）。

宿主-マイクロバイオーム共代謝による尿ギ酸分泌の変動への微生物代謝産物の寄与
ギ酸尿産生における宿主-微生物共代謝の存在と寄与を評価するために、微生物叢を個人化したWBMと非微生物叢を個人化したWBM、すなわち細菌を含まないWBMのギ酸尿流束の予測差を調べた。この差は、マイクロバイオームが分泌するギ酸の量よりも大きかった。つまり、他の微生物由来の代謝産物が、宿主とマイクロバイオームのギ酸の共代謝に関与しているに違いない（図3A-B）。尿中ギ酸産生に寄与した主な微生物代謝産物を特定するため、最大ギ酸尿分泌量に関するマイクロバイオームパーソナライズドモデルを解く際の解ベクトルを調べ、平均フラックス値が30mmol/人・日以上であった微生物分泌フラックスをすべて抽出した（表S06）。ギ酸を除くと、14種類の代謝物がマイクロバイオームから高度に分泌されることがわかった。これらの代謝物が本当に最大ギ酸尿分泌量を増加させるかどうかを調べるため、14種類の代謝物をそれぞれ個別に無菌WBMの食事に添加し、最大ギ酸尿分泌量を求めた。14種類の代謝物のうち9種類は、それらを添加しないヨーロッパの平均的な食事と比較して、尿中ギ酸分泌のフラックス値が高くなり、宿主の代謝によってギ酸塩を合成するために利用される可能性があった（図3C）。興味深いことに、代謝産物のひとつであるアンモニウムイオンは炭素源ではない。それにもかかわらず、アンモニウムイオンを飼料に添加するとギ酸の尿中分泌量が増加したことから、ギ酸生成経路への関与が示唆された。これらの結果は、宿主モデルが微生物分泌産物を代謝していることを示し、尿中ギ酸塩の前駆物質として微生物由来の代謝産物が重要であることを示している。

宿主のギ酸は食事と微生物代謝産物の代謝に由来する
続いて、ギ酸産生に関与する宿主-微生物代謝経路の解明を目指した。宿主は食事から摂取したギ酸を様々な経路で産生することができる25,32。宿主のギ酸代謝に関与すると示唆されている47の反応と、ペルオキシソームおよび小胞体への、またはペルオキシソームおよび小胞体からの3つの輸送反応を考慮し、経路を完成させた（図4、表S07）25。尿中ギ酸分泌に関与する宿主の代謝反応の寄与を定量化するため、無菌WBMモデルでギ酸産生に関与する代謝反応を欠失させた。全体として、47反応中17反応（36％）の欠失は、尿中ギ酸分泌フラックスを10％以上減少させた（図4、表S08）。次に、4つの反応の最小セットを同定した（VMH ID： PSP_L, ホスホセリンホスファターゼ; VMH ID： SFGTH、S-ホルミルグルタチオンヒドロラーゼ；VMH ID： TRPO2、L-トリプトファン：酸素2,3酸化還元酵素；およびVMH ID： DKMPPD, 2,3-Diketo-5-Methylthio-1-PhosphopentaneDegradation）（図4）。これらを一緒に欠失させると、無菌WBMモデルによる尿中ギ酸分泌が大きく減少した（男性で92％減少、女性で86％減少）。これら4つの反応は、ホルムアルデヒドの形成を直接または間接的に介して、最終的にギ酸産生につながる複数の経路の終点を示しており、その後、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（VMH ID: FALDH）によってS-ホルミルグルタチオンに変換され、S-ホルミルグルタチオンヒドロラーゼ（VMH ID: SFGTH）によってギ酸に変換される（図4）。この4つの反応は、WBMモデルの多くの臓器に存在し、脳、膵臓、肺、副腎にはすべて存在した。さらに8つの臓器（結腸、胃、肝臓、心臓、脂肪細胞、胆嚢、腎臓、甲状腺）にも3つの異なるサブセットが存在した。注目すべきことに、この4つの反応は、以前に同定した10種類の微生物代謝産物の代謝経路の一部でもあった（図3C）。まとめると、微生物代謝産物は、宿主-マイクロバイオーム共代謝を介して尿ギ酸分泌フラックスに寄与しており、宿主反応のネットワークは、多くの臓器に広く分布している4つの反応を欠失させることで、ほとんど不活性化することができた。

尿中ギ酸分泌に関与する反応はADと関連している
我々は、同定された反応のどれかとそれに対応する遺伝子が、以前にADと関連していたかどうかに興味を持った。ADに関するネットワークベースの統合的リソースであるADatlas（https://adatlas.org/）33を用いると、47反応のうち28反応（59.5％）がAD／認知機能低下の表現型と関連する遺伝子を持つことがわかった（図4、表S09）。これら28の反応のうち9つ（32％）は、最大尿ギ酸分泌フラックスを10％以上変化させると予測された（図4）。これら9つの反応のうち6つ（すなわち、VMH IDs： SARCOXp、r1378、SFGTH、PGCD、PSERT、およびPSP_L、完全名称は表S07に記載）は、ホルムアルデヒドおよび3-ホスホグリセリン酸の異化を介したギ酸生成に関与し、ADと正の相関を示した。さらに、2つの反応（VMH ID： FKYNH、N-ホルミル-L-キヌレニンアミドヒドロラーゼ；およびVMH ID： TRPO2、L-トリプトファン：酸素2,3-オキシドレダクターゼ）は、トリプトファンの異化を介したギ酸生成に関与し、ADと負の相関を示した。注目すべきは、葉酸代謝に関連する反応（MTHFDm、MTHFDm2、MTHFCm、MTHFD、MTHFD2）も、ADで異なる発現を示す遺伝子、特にMTHFD1遺伝子の低発現とMTHFD2遺伝子の高発現と関連していたことである（図4、表S09）。これらの結果は、ギ酸代謝が遺伝的変異によりAD患者で変化していること、そしてこれらの遺伝的変化が、微生物によるギ酸産生に加えて、ギ酸尿分泌の変化にもつながる可能性があることを示している。

考察
健康および神経疾患における腸内細菌叢の役割を理解する上での課題は、微生物叢自体およびそれに由来するメタボロームの変化を、宿主の代謝や認知症状の変化に結びつけることである。ここで我々は、ADにおける宿主とマイクロバイオームの共代謝を調べるための個別化代謝モデリングアプローチを提示する。この枠組みを通して、ヒト代謝の全身モデルを用いて、ギ酸微生物分泌の変化と、宿主-マイクロバイオーム共代謝を介した尿量との関連がもたらす結果についての洞察を得た。これらのインシリコ研究は、独立したコホートから得られた、ADにおけるギ酸尿レベルの変化という知見によって動機づけられた。これらを総合すると、われわれの解析は、ギ酸産生における腸内細菌叢の分泌能の変化と宿主-微生物叢の相互作用を示唆しており、この結果はADにおける宿主と微生物叢の代謝のクロストークを理解するのに役立つ可能性がある。

非侵襲的に採取可能な生体液としての尿メタボロミクスをADに応用し、ADの初期マーカーを同定することは、成功する治療法を開発する上で極めて重要である34,35。注目すべきは、尿中ギ酸塩がアルツハイマー病の新たなバイオマーカーとなる可能性が、独立した研究によってすでに示唆されていることである36。ギ酸塩は、ヒトおよび微生物代謝の最終分解産物として、通常ヒトの尿中に含まれる37。その濃度は、環境暴露と食事暴露の両方によって影響を受けるが、今回の結果から、尿中ギ酸分泌は、宿主と微生物のギ酸共代謝の変化が直接影響している可能性が示唆された25。微生物群ごとにパーソナライズされた性特異的WBMモデルを用いて、尿中最大ギ酸分泌量を計算したところ（図4）、ADの微生物群ではギ酸分泌能が低いことが明らかになった。この結果から、ギ酸尿の分泌には、グルコース、L-セリン、L-グリシン、L-トリプトファン、L-システイン、L-チロシン、オルニチンなどの微生物由来の代謝物を異化する宿主と微生物叢の共代謝が関与していることが示唆された。チロシン経路はADに繰り返し関与しており38,39、トリプトファン代謝産物は、脳内のAβペプチドの分解とクリアランスを制御するメタロプロテイナーゼであるネプリライシンの脳内活性を制御することが示されている40。

今回の結果は、ADの特徴として代謝の変化をさらに強調するものである41,42。特に、WBMはギ酸生成におけるアミノ酸分解の役割を明らかにし、微生物由来のトリプトファン分解がギ酸の主要な微生物源のひとつであることを強調した。トリプトファンは、セロトニンやキヌレニンなどの神経伝達物質や神経活性代謝産物の重要な前駆体であるだけでなく、免疫調節にも関与している4。さらに、トリプトファンの枯渇はAD患者の認知障害を増加させ44、セロトニンとキヌレニン経路の代謝物の生物学的利用能は、AD患者の尿と血清の両方で変化している45。マイクロバイオームモデリングは、ADにおいて微生物によるトリプトファン産生が減少している可能性を示唆しており、マイクロバイオームがヒトのトリプトファンプールに寄与していることを示す以前の研究結果21と一致している。したがって、WBMと合わせて、ADおよびMCI患者におけるギ酸の減少という所見は、ADにおけるトリプトファン分解の変化を示唆している。これらの結果は、ADがトリプトファン代謝に関連した疾患であるという最近提唱された仮説46とも一致する。

ギ酸はまた、さまざまな経路に関与しており、プリン合成の前駆体でもある47。われわれの研究では、ギ酸塩と葉酸代謝との関連も強調された。葉酸代謝は、ADやDNAメチル化と関連することが判明している経路である48。宿主微生物とギ酸の共代謝の重要性は、ADに関連する遺伝子を調べた結果、ギ酸代謝に関与する反応（図4）のほとんどが、AD患者では健常対照群と比べて発現が変化している遺伝子に属していることがわかった。葉酸代謝に関連する5つの反応（MTHFDm、MTHFDm2、MTHFCm、MTHFD、MTHFD2）は、ADで発現が異なる遺伝子と関連しており、3つの反応（VMH ID：ギ酸の前駆体である可能性のあるL-セリンの産生を伴う解糖からの代替経路を介した3-ホスホグリセリン酸の異化に関与する3つの反応（VMH ID：PGCD、PSERT、PSP_L）は、ADにおいて過剰発現している遺伝子と関連していた。この結果は、AD患者における解糖中間体濃度の低下という報告を裏付けるものであろう49。全体として、これらの結果は、ギ酸代謝が遺伝的変異によってもAD患者で変化していることを示唆しており、微生物によるギ酸産生に加えて、ギ酸尿分泌の変化にもつながる可能性がある。注目すべきは、宿主のギ酸代謝の役割を明らかにしたWBMモデリングがなければ、この推論は不可能であっただろうということである。この追加のin silico解析がなければ、メタボロームデータで測定されたAD患者の尿中ギ酸分泌量の減少の原因は、マイクロバイオーム組成の違いによる微生物ギ酸産生の変化であると誤って結論づけられたかもしれない。われわれのWBMモデルは、個人のゲノム、メタボローム、トランスクリプトームデータを用いてさらにパーソナライズされたものではないため、今後のインシリコ研究では、前述の宿主遺伝因子を考慮すべきであり、宿主の尿中ギ酸分泌に関するインシリコ結果の妥当性を高める可能性がある。

COBRAモデリングアプローチは、ADにおける宿主-マイクロバイオーム共代謝の関与を調べる上で非常に有用なアプローチであるが、ある種の限界に注意すべきである。例えば、われわれは比較的少数の被験者と対照群を用いた。したがって、われわれの結果は、より大規模な独立したコホートで検証される必要がある。また、AGORA2リソースで考慮されていない微生物が廃棄されると、対応するマイクロバイオームモデルの代謝能力が失われる可能性があることに注意しなければならない。さらに、モデルはリード数データから生成された微生物の相対存在量データに基づいて構築されており、結果はモデル固有の組成構造に左右される。ゲノムスケールの代謝再構築も、新しい実験データや生化学的知識が利用可能になるにつれて、継続的に更新されている50-52。代謝再構築の不完全さは、限られたデータしか利用できない腸内細菌に特に当てはまる。AGORA2微生物再構成の構築に使用されているDEMETER 53のような計算による再構成ツールは、例えばBacDive 54のような実験データを再構成の過程で取り込むことを可能にする。同様に、欠損や誤った注釈を修正する精緻なゲノムアノテーションを行うことで、再構成の誤差を最小化し、予測の忠実度を高めることができる。このような再アノテーションは、AGORA2のほとんどの微生物に対して行われている。さらに、COBRAアプローチの本質的な限界は、生物系が定常状態にあると仮定しているため、微生物群集の動的な性質が無視されていることである。注目すべきは、マイクロバイオーム・モデリングによって得られた予測分泌能は、年齢や性別などの異なる要因によって混乱させられることがなく、観察データの統計的依存性パターンから推測されるのではなく、決定論的モデリングから導かれるため、分泌と微生物の相関関係の同定が向上することである。さらに、本研究では腸内微生物と宿主の代謝および遺伝の役割を強調したが、生活習慣要因（食事や運動など）や薬剤の違いも、宿主-微生物共代謝、尿メタボローム、AD病態の変化に寄与していると考えられる。

結論として、本研究では、オミックスデータとCOBRAモデリングを組み合わせ、マイクロバイオームとヒト超器官全体のレベルで解析し、形質産生経路におけるマイクロバイオームと宿主の相互作用の役割を明らかにした。特に、アミノ酸およびグルコース代謝と、ADの初期マーカーとなりうるギ酸との関連におけるマイクロバイオームの役割は、臨床的に重要であり、ADの表現型に寄与する可能性がある。ADにおけるギ酸代謝の変化には、腸内細菌と宿主の遺伝の両方が寄与しているという、我々のモデルによって示唆された根本的なメカニズムは、より的を絞った検証研究によって評価される必要がある。我々の研究は、複雑なヒトの疾患という文脈における、パーソナライズされた全身モデリングの概念を証明するものである。このパラダイムは、メタボローム研究で発見されたバイオマーカーを含む宿主-マイクロバイオーム共代謝を明らかにし、病態仮説を検証または示唆する上で有望である。

研究方法
本研究では新たなユニークな試薬は作成していない。

DELCODEコホート
研究サンプル
Deutsches Zentrum für Neurodegenerative Erkrankungen（DZNE）24が実施したDELCODE研究の中間データフリーズを使用した。DELCODE研究では、現在大うつ病エピソードのある人、主要な精神疾患、AD以外の神経疾患、不安定な病状のある人は含まれていないことに注意されたい24。われわれの研究では、尿サンプルがない人も除外した。その結果、健常対照49例、自覚的認知機能低下45例（n=45）、軽度認知障害49例、AD認知症34例のサブコホートが得られた（図1A）。主観的認知機能低下（SCD）とは、CERADテストバッテリーで測定される客観的認知機能障害が観察されず、少なくとも6ヵ月間持続し、エピソード的な出来事55とは無関係な、自己認識による一定の認知機能低下と定義した。MCIおよびAD関連認知症の中核的臨床基準を定義するために、米国老化研究所-アルツハイマー病協会（NIA-AA）ワークグループガイドライン56,57が用いられた。対照群は、認知機能検査で客観的な認知機能障害を示さず、神経疾患や精神疾患の既往歴がなく、認知機能の低下を自己認識していなかった。インフォームド・コンセントは、すべての参加者またはその代理人によって行われた。研究プロトコルは、参加施設の施設審査委員会および倫理委員会の承認を得ており、研究は1975年のヘルシンキ宣言に準拠して実施された。

1 H-NMR測定

尿検体は58と同様に取り扱い、調製した。185人の尿サンプルは、University Medicine Greifswaldで、TOPSPIN 3.2ソフトウェア（Bruker Biospin, Rheinstetten, Germany）で操作されるBruker AVANCE-II 600 NMRスペクトロメーターで測定された。スペクトロメーターには、5mmのz-gradientプローブと自動チューニング＆マッチング（ATMA）ユニットが装備されていた（いずれもBruker Biospin社、ドイツ、ラインシュテッテン）。試料はSampleJet（Bruker Biospin, Rheinstetten, Germany）を介して標準的な5 mm NMRチューブに入れられ、自動的にスペクトロメーターに送られた。測定温度は300°Kに設定した。水のピークを抑制した標準的な一次元1H-NMRパルスシーケンス（NOESYPREAST）を使用した59。4人の尿サンプルは、1H-NMR測定に使用できる生体物質が少なすぎたため、まったく処理できなかった。生スペクトルを処理した後、50の代謝物をBruker Suite B.I.Quant-UR b™を使用して標的分析用に定量した。希釈を考慮するため、2つの異なる正規化アプローチを行った： 1）クレアチニン正規化、2）PQN正規化。異なる正規化アプローチには、異なる利点と欠点があることが示されており、複数のアプローチを使用し、正規化技術間で結果を比較することが推奨されている60。品質チェックの目的で、1H-NMR由来のクレアチニン測定値を標準クレアチニン測定値と比較するために、酵素標準キットを用いてクレアチニンを測定した。酵素と1H-NMRのクレアチニン測定値の間に強い差があったため、さらに4つの観察が除外された。残りのオブザベーションは、2つのタイプのクレアチニン測定値の間に0.95を超える相関を示しました。最終的に、n = 177のスペクトルが統計解析に含まれた。

標的メタボロームデータの記述的サンプル統計
4つの研究グループに属する177人のメタデータと尿サンプルが解析に利用可能であった（図1A）。上述したように、8人が解析から除外されたため、尿メタボロームデータが得られた最終サンプルは177人で構成されました。図1Aは、基本的なサンプル特性の記述統計量である。重要なことは、4つの研究グループ（健常者、自覚的記憶障害、MCI、AD）の年齢と体格指数（BMI、図1A）のバランスがとれていなかったことである。そのため、すべてのメタボローム統計解析では、年齢とBMIを共変量として統計モデリングに含めることで、年齢とBMIの違いを考慮しました。

NMRメタボロームデータの統計解析
クレアチニン正規化後の49代謝物について記述統計量を導出した。これらの49代謝物のうち、50％以上のサンプルで尿中濃度測定値がゼロでなかった代謝物は16代謝物のみであった。重要なことは、NMR測定において測定値がゼロであっても、その代謝物が検出限界以下であるとは限らないということです。対応する代謝物のシグナルが他の代謝物によって曇らされたり、イオン濃度のpH差によってシフトした可能性もあるため、測定値ゼロは欠測として扱いました。年齢、性別、BMIを共変量として含む多変量線形回帰により、50%の基準を満たす代謝物をすべてスクリーニングした。対数変換したクレアチニン正規化代謝物濃度を従属変数とし、研究グループ変数（カテゴリー）を予測変数とした。1.研究グループ変数が統計モデルに全体的に寄与しているかどうか、2.ADグループと健常対照の間に特異的な差異があるかどうかを調べるために、Wald-test法を用いて大域検定を行った。多重検定の補正には、偽発見率を用いた。

WISCONSINコホート
糞便サンプル
本研究では、Wisconsin Alzheimer's Disease Research Center（WADRC）およびWisconsin Registry for Alzheimer's Prevention（WRAP）研究のデータを利用した。AD-認知症の参加者はWADRCから、認知機能に障害のない参加者はWADRCとWRAP研究から募集された。年齢、性別、BMI、APOE遺伝子型、診断、認知機能検査の結果に関するデータが収集された61,62。我々の研究では、48人（AD-認知症患者24人、性・年齢をマッチさせた健常対照者24人）からなるコホートのサブセットを使用した。共変量は、APOE4と性についてはFisherの正確検定、年齢とBMIについてはWelchのt検定を用いて臨床診断と比較した。

配列決定とメタゲノムデータの処理
糞便サンプルの塩基配列を決定し、メタゲノミクスデータのデフォルトワークフローを用いてQiita 31で処理した。つまり、複数回の実行を表すために、複数の準備で生ファイルをロードし、デフォルトのパラメータで処理した。その後、生シーケンスデータをデマルチプレックスし、150塩基でトリミングした。アダプター除去はfastp 63を用いて行い、ヒトリードはminimap2 64を用いてフィルターした。Genomic OTUs (gOTUs)は、Woltka Toolkit 29を用いて、Bowtie2 65を用いてWeb of Life (Release 1)参照ゲノムデータベース30にリードをアライメントして作成した。

統計解析
記述統計では、計量変数は平均値と標準偏差で表し、カテゴリー変数は比率で表した。p値はすべて両側で報告した。統計解析はSTATA 16.1/MP（STATA Inc.）

個別化マイクロバイオーム代謝モデルの構築
まず、Web of Lifeデータベースを用いてgOTUに分類学を割り当て、分類学的情報が一致するgOTUを合計した。ゲノムスケール代謝微生物再構築データベース（AGORA2）17で説明されている種に割り当てられたすべてのリードを考慮した。すべてのリードの合計が1になるように、検討したリードを正規化し、サンプル中の各微生物の相対存在量を得た。この量を、1,742のAGORA2汎種再構築（1種の各菌株特異的再構築の反応と代謝物の結合）にマッピングした。次に、Microbiome Modelling Toolbox 18,19のmgPipeモジュールを用いて、サンプル固有のマイクロバイオームモデルを導出した。簡単に説明すると、各個体について、対応するサンプルで見つかったすべての汎種再構築を1つのマイクロバイオーム再構築18に組み立て、サンプルの相対的な種の存在量データに基づいてコミュニティバイオマス反応をパーソナライズすることによりマイクロバイオームモデルに変換した。次に、各微生物反応を対応するバイオマス反応に結合させるために、さらなる制約を適用した。これらの「カップリング制約」は、対応するバイオマス反応のフラックスがゼロでない場合にのみ、マイクロバイオームモデル内の汎ゲノムモデルを通過するフラックスがゼロでないことを保証する。結合係数は任意に400とした66,67。APOE4対立遺伝子の存在を補正した線形回帰を用いて、症例と対照の間のマイクロバイオームモデルにおける代謝量の測定値の違いを検証した。

種の存在量の評価
AGORA2でカバーされた微生物量の症例と対照の差を調べるために、相対的微生物量を応答変数とし、健康状態を独立変数として、カテゴリーAPOE遺伝子型を補正した分数回帰を行った。増加した種と減少した種のgOTUの合計を計算した後、比率を計算し、グループ間でt検定を実行した。

食事の制約
胆汁酸（コール酸およびチェノデオキシコール酸）を添加した平均的なヨーロピアンダイエット 68 を適用して、各マイクロバイオームモデルをさらに制約し、状態特異的モデルに変換した（表 S11）。食事制約の単位はmmol/人/日とした。COBRAツールボックス69に実装されているMicrobiome Modelling Toolbox 18を使用して、食事で定義された取り込みフラックス値をすべてのマイクロバイオームモデルに統合し、すべての汎種モデルが定義された食事下で増殖できることを確認した。

マイクロバイオームモデルのシミュレーション
与えられた条件固有の制約のもとで、各微生物叢モデルをフラックス変動解析（FVA）70 を用いて調べ、モデルの全分泌反応に対応する正味の最大分泌能力を求めた。FVA は、実行可能領域を指定するために異なる制約条件（モデルであらかじめ設定された反応フラックスの上限と下限、食餌フラックス、および（S.S.）形式のマスバランス）を条件として、関心のある反応の分泌フラックスを目的変数として最大化問題を解く。 v = dv/dt = 0、ここで代謝物を行、反応を列とする化学量論マトリックス、v はフラックスベクター）。各代謝物分泌能力について、ゼロの値はモデルが対応する代謝物を分泌できないことを意味し、正の値は与えられたシミュレーション制約下でマイクロバイオームモデルが代謝物を分泌できることに対応する。すべてのシミュレーションは、線形計画法ソルバーとして IBM CPLEX（IBM, Inc.）、COBRA Toolbox v3 69 および Microbiome Modelling Toolbox 19 を使用し、MATLAB（Mathworks, Inc.）

全身代謝（WBM）個別化モデルの尋問
PSCMツールボックス21を用い、女性または男性の臓器分解ヒト代謝全身モデル（WBM）の大腸内腔に、個々のマイクロバイオームモデルを適宜追加した。我々は、これまでの解析で有意であり、ヨーロッパの平均的な食事68の下で微生物に関連付けられたWBMによって産生されうる代謝産物の最大尿分泌フラックスを計算した。男性および女性のWBMは、それぞれ基準男性および女性21に対応し、サブコホートは健常人とADの間で年齢およびBMIが一致していたため、それ以上の個人化は行わなかった。各微生物関連WBMの最大尿分泌率は、PSCMツールボックス21を使用して、対応する尿代謝物交換反応（例えば、ギ酸塩の「EX_for[u]」）を目的関数として選択し、この反応について最大化することにより算出した。調査した代謝物の最大尿分泌速度も、非個性化、無菌、男性および女性のWBMについて計算した。最大微生物分泌フラックスは、微生物内腔[luM]と大腸内腔[luLI]間の対応する微生物代謝物交換反応を選択し、その反応を最小化するモデルを解くことによって計算した。

AD症例と対照の分泌フラックスの違い
症例と対照の反応フラックスの違いを調べるために、フラックスを応答変数とし、健康状態を独立変数とし、カテゴリーAPOE遺伝子型を補正し、性別をWBMモデルの性特異性とする線形回帰を行った。

宿主-微生物叢共代謝の調査
ギ酸産生における宿主-微生物叢共代謝の関与を調べるため、個人化モデルと無菌モデルのギ酸分泌量の差を検討し、これらの差を同じ代謝産物の群集微生物分泌量と比較して、微生物分泌量に直接相関する尿分泌量と宿主-微生物叢共代謝に相関する尿分泌量を評価した。

微生物叢が分泌しうる代謝産物を個別に飼料に添加することで、全身モデルが他の微生物代謝産物からギ酸を産生する能力を確認した。すべての代謝産物は、潜在的な最大摂取量を300mmol/dに設定して食餌に添加した。これらの実施した食餌を無菌モデルで最大尿ギ酸産生量を試験し、以前の基準値の変化を評価した。

ADにおける宿主ギ酸産生経路への遺伝的関与
我々は、宿主-微生物叢共代謝に関与することが判明したものを含め、ギ酸代謝に関与することが文献25から知られているすべての反応を検討した。これらの反応に関連するすべての遺伝子を、汎用ヒト代謝再構築Recon3D 51を格納しているVirtual Metabolic Humanデータベース（VMH）68から検索し、ADのネットワークベースの統合リソースであるAD Atlas 33を用いて、遺伝子と健康状態との関連を調べた。ADアトラスは、大規模な集団ベース研究およびAD症例対照研究から得られたマルチオミクスデータを統合しており、ユーザーは、ADに関連する文脈で、関心のある遺伝子、代謝産物、または表現型にアノテーションを付けることができる。ここでは、ギ酸代謝に関与すると同定された遺伝子を用いてADアトラスを検索し、ADにおける脳領域特異的な遺伝子発現の差やタンパク質の存在量の差、大規模ゲノムワイド関連研究（GWAS）から推定されたAD関連表現型との遺伝的関連に関する情報を得た。ADアトラス33で実装されているように、GWASの結果をフィルタリングするために遺伝子ごとの有意閾値が適用された。

宣言
資金提供および謝辞

本研究は、欧州連合（EU）のHorizon 2020研究・革新プログラム（757922）に基づく欧州研究評議会（ERC）からIT社、アイルランド科学財団（Science Foundation Ireland）から助成番号12/RC/2273-P2の資金提供を受けた。このプロジェクトの資金は、NIA助成金U19AG063744アルツハイマー病腸内マイクロバイオームプロジェクト（AGMP）、デューク大学Kaddurah-Daouk主任研究者、および複数の学術機関からも提供された。ADアトラスへの追加資金提供には、NIA R01AG046171、RF1AG051550、RF1AG057452、RF1AG059093、RF1AG058942、U01AG061359、U19AG063744およびFNIHが含まれる： #DAOU16AMPAはデューク大学のKaddurah -Daouk博士に授与された。

ウィスコンシン州での研究資金には、ウィスコンシン州パートナーシッププログラム助成金（BBB、FER）、National Institute on Aging助成金R01AG070973（BBB、FER）、National Institute on Aging助成金P30AG062715（SA）、National Institute on Aging助成金RF1AG027161（SCJ）、National Institute of General Medical Sciences助成金T32GM081061（MBH）、National Institute of Neurological Disorders And Stroke助成金F99NS130922（MBH）が含まれる。National Institute on Agingより追加助成を受けた（RF1AG058942、R01AG037639、R01AG021155、R01AG069901、R01AG054047、U01AG061359）。

著者貢献

I.T.とJ.H.は本研究を立案した。S.T.はDELCODEコホートの生体試料を収集し、臨床データから得られた知見の解釈を手伝った。Deutsches Zentrum für Neurodegenerative Erkrankungen（DZNE）の協力者は、DELCODEコホートの参加者を募集し、尿サンプルを収集した。S.A.、C.D.E.、M.H.、S.C.J.、F.E.R.、B.B.B.は参加者を募集し、糞便サンプルを収集し、年齢、性別、BMI、APOE遺伝子型、診断、Trail Making Test B Scoreに関するデータをAlzheimer's Disease Metabolomics Consortium（ADMC）に提供した。UCSDのKnight LabはWGSデータを提供した。F.M.は相対存在量表を作成し、F.M.とA.H.はパーソナライズドマイクロバイオームモデルを構築した。F.M.はマイクロバイオームモデルのシミュレーションを行った。J.H.とF.M.は統計解析をデザインした。J.H.はDELCODE解析を実施。M.A.W.、M.A.、G.K.はADアトラスに基づく解析を行った。A.K.H.、K.B.、M.N.はDELCODE研究のNMR定量を行った。H.J.G.はDELCODE関連の解析と計算を監督した。F.M.とT.H.は反応KOシミュレーションを行った。F.M.とI.T.はWBMシミュレーションを行った。I.T.はプロジェクトの考案と監督を行った。I.T.、F.M.、J.H.、A.H.は最初の原稿を執筆した。

著者全員が結果について議論し、最終原稿の執筆に貢献した。

AGMPおよびAlzheimer's Disease Metabolomics Consortiumの研究者は、本書の著者リストには特に記載されていないが、前処理とともにデータを提供し、解析の準備を行ったが、本原稿の解析や執筆には参加していない。AGMP研究者のリストはhttps://alzheimergut.org/meet-the-team/。ADMCの研究者一覧はhttps://sites.duke.edu/adnimetab/team/。"

また、Wisconsin Registry for Alzheimer's PreventionおよびWisconsin Alzheimer's Disease Research Centerの研究参加者にも感謝する。

利益宣言

GKとMAは、アルツハイマー病におけるメタボロミクスの利用に関する複数の特許出願の共同発明者であり、Chymia LLCの株式と知的財産、および本研究とは無関係のPsyProtixの知的財産を所有している。RKDは、中枢神経系疾患の診断および治療におけるメタボロミクスの利用に関する一連の特許の発明者であり、Metabolon Inc.、Chymia LLCおよびPsyProtixの株式を保有している。STは、ロシュ、エーザイ、グリフォルス、バイオジェンの国内外の諮問委員会の委員を務め、ENVISION試験（バイオジェン）の独立データ安全監視委員会の委員でもある。HJGは、Fresenius Medical Care、Neuraxpharm、Servier、Janssen Cilagから出張助成金と講演謝礼を受領しており、Fresenius Medical Careからは研究助成金を得ている。

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全身モデリングにより、アルツハイマー病における尿中ギ酸濃度の低下に関するマイクロバイオームとゲノムの相互作用が明らかになった

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