次世代プロバイオティクス開発のための相乗効果と酸素適応

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発行：2023年08月02日
次世代プロバイオティクス開発のための相乗効果と酸素適応

https://www.nature.com/articles/s41586-023-06378-w

ムハンマド・タンウィール・カーン、チンメイ・ドウィベディ、...フレドリック・ベッケド 著者一覧を見る
ネイチャー (2023)この記事を引用する

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指標詳細

要旨
ヒトの腸内細菌叢は、健康や疾患に関与する環境因子として関心を集めている1。次世代プロバイオティクスの開発は、腸内細菌叢を調節し、ヒトの健康を改善する有望な戦略である。しかし、次世代プロバイオティクスの主要候補のいくつかは厳密に嫌気性であり2、最適な増殖には他の細菌との相乗作用が必要な可能性がある。Faecalibacterium prausnitziiは、ヒトの腸内細菌として非常に一般的で豊富であり、ヒトの健康に関連しているが、プロバイオティクス製剤として開発されるには至っていない2。ここでは、F. prausnitziiと硫酸還元菌であるDesulfovibrio pigerの共分離、および増殖と酪酸産生のための交差摂食について述べる。次世代プロバイオティック製剤を製造するために、我々はF. prausnitziiを酸素曝露に耐えるように適合させ、概念実証試験において、この共生製剤がマウスおよびヒトに許容され（ClinicalTrials.gov識別子：NCT03728868）、試験参加者のサブセットにおいてヒト腸内で検出されることを実証した。本研究では、潜在的に有益な特性を低下させることなく酸素曝露に耐えるよう、厳密に嫌気性細菌を適応させることに基づく、次世代プロバイオティクスの生産技術について説明する。本研究の技術は、次世代プロバイオティクスとして他の嫌気性菌株の開発に利用できる可能性がある。

主な内容
成人のヒト腸内細菌叢は、少なくとも体細胞および生殖細胞の総数と同数の細菌細胞から構成されており3、その集合ゲノム（マイクロバイオーム）にはヒトゲノムの500倍以上の遺伝子が含まれている4。比較メタゲノム解析により、2型糖尿病5,6,7、高脂血症8、炎症性腸疾患9,10患者のマイクロバイオームと比較して、健康なマイクロバイオームでは微生物の多様性が増加し、Faecalibacterium prausnitziiのような酪酸産生菌の存在量が増加していることが明らかになった。特にF. prausnitziiは、その存在量が年齢やライフスタイルによって変化する主要な種であり、欧米に住む人々の腸内細菌叢では相対的に減少している11。

ヒトの腸内微生物は単独で行動しているわけではなく、複雑な生態学的相互作用を形成しており、腸の恒常性維持に重要である。腸内細菌叢の重要な特質のひとつは、炭水化物を酪酸などの短鎖脂肪酸（SCFA）に発酵させることであり、これは宿主にいくつかの利益をもたらす12。発酵は腸内微生物が利用する主要なエネルギー生成プロセスであり、発酵プロセスを維持するためには、乳酸や水素などの発酵電子シンク副産物の除去が不可欠である13。したがって、メタン生成菌や硫酸還元菌などの水素除去因子は、腸内代謝ネットワークの構築に重要である14。

ここでは、硫酸還元菌Desulfovibrio pigerの新規株との共培養によるF. prausnitziiの新規株の単離について報告する。次世代プロバイオティクスとしてのF. prausnitziiの生産技術の開発について述べ、ヒトへの摂取に対する安全性を評価した。

微生物-微生物間の相互作用を保持し、電子シンクとして機能し、乳酸を除去することができる細菌を単離するために、我々は健康な個人の糞便を嫌気的条件下でポストゲート培地（PGM）の寒天平板上に直接プレーティングした（Methods）。この条件下で、PGM中でD. piger（DSM 32187）株と共培養して増殖したF. prausnitzii株（DSM32186）を分離した（図1a,b）。D. pigerは偏性嫌気性、非発酵性のグラム陰性桿菌15であり、ヒトの腸内で広く見られる硫酸還元菌16である。

図1：試験管内でのF. prausnitziiとD. pigerの共分離と交雑摂食。
図1
a, F. prausnitzii DSM 32186とD. piger DSM 32187のPGMプレート上での共培養（グルコースまたは酢酸の添加なし）。 b, F. prausnitzii DSM 32186とD. piger DSM 32187の分離コロニーのグラム染色。矢印はF. prausnitzii（長いフシ状桿菌）(1)とD. piger（短い桿菌）(2)を示す。c, D. piger DSM 32187と関連ゲノムの関係を示すデンドログラム。 d, F. prausnitzii DSM 32186と関連ゲノムの関係を示すデンドログラム。f, mPGM培地で24時間嫌気条件下で単培養または共培養したF. prausnitzii DSM 32186およびD. piger DSM 32187の代謝物プロファイル： グルコース：P = 0.0000031（F. prausnitzii + D. piger 対 D. piger）、P = 0.0000038（F. prausnitzii + D. piger 対 F. prausnitzii）、乳酸：P = 0.0000001（F. prausnitzii + D. piger 対 F. prausnitzii）： 乳酸：P = 0.0000001（F. prausnitzii + D. piger 対 D. piger）, P = 0.0000005（F. prausnitzii 対 D. piger）, P = 0.00014（F. prausnitzii + D. piger 対 F. prausnitzii）; 酢酸： 酢酸：P = 0.0000004（F. prausnitzii + D. piger 対 D. piger）、P = 0.0000003（F. prausnitzii 対 D. piger）；酪酸：P = 0.000001（F. prausnitzii + D. piger 対 D. piger）： 酪酸：P = 0.000001（F. prausnitzii + D. piger 対 D. piger）、P = 0.0000031（F. prausnitzii + D. piger 対 F. prausnitzii）。n = 3独立実験、***P < 0.001は両側t検定(e)または一元配置分散分析(f)により決定。データは平均値±s.e.m.。

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分離株の同一性を確認するため、ゲノムの塩基配列を決定したところ、D. piger DSM 32187は、塩基配列が決定された他のD. piger株とクラスターを形成した（図1c）のに対し、F. prausnitzii DSM 32186は、A2-165株を含むF. prausnitzii系統群IIとクラスターを形成した（図1d）。ゲノム解析の結果、両菌株は系統樹において特異的なクレードを形成しており、これまで同定されていなかった菌株であることが示された。A2-165には抗炎症作用18があり、粘膜の界面で相互作用することができるので19、A2-165と比較して免疫調節特性を評価することで、DSM 32186のプロバイオティクスの可能性を検証した。異なるF. prausnitzii株の上清をCaco-2細胞に適用したところ、インターロイキン-1β（IL-1β）誘発性のIL-8分泌が同様に減少することが観察され（Extended Data Fig.1）、表現型レベルでA2-165との関連性が確認された。

我々は、PGMにおけるF. prausnitziiとD. pigerの共分離と推定される共生関係は、相補的な代謝要求から生じたと仮定した。この仮説を検証するため、F. prausnitziiを支持するグルコースを含む改良PGM培地で2株を共培養したところ、F. prausnitziiの増殖が、同じ培地での単培養に比べて共培養で有意に増加することが観察された（図1e）。24時間生育後の調整培地中の代謝物を分析した結果、予想通り、D. pigerの単培養株はグルコースを消費せずに乳酸を消費し、酢酸を産生したが、F. prausnitziiの単培養株はごく少量の乳酸を産生した（図1f）。しかし、F. prausnitziiとD. pigerの共培養では、グルコースの発酵が促進され、乳酸と酪酸の生産が見られた（図1f）。F. prausnitziiは、ブチリル-コエンザイムA（CoA）：酢酸CoA-トランスフェラーゼ経路を通じて酪酸を産生するため、酢酸は酪酸の産生に必要である20,21から、共培養では培地中に蓄積しなかった（図1f）。このことから、D. pigerは乳酸を消費するため、PGMでの共培養において電子シンクとして機能し、D. pigerが生成した酢酸はF. prausnitziiが増殖と酪酸産生に利用したことが示唆された（図1g）。

次世代プロバイオティクスの製品開発は、ヒトの腸内細菌が酸素に敏感であるため、難しい。このプロセスには、十分なバイオマス収量を得るための増殖条件の最適化や、最終製品の生存率を維持するための新たな戦略も必要である2。われわれは、図1eに示すように、F. prausnitziiをD. pigerと共培養することで、発酵における増殖収率を向上させた。しかし、F. prausnitziiは大気中の酸素に極めて敏感であるため21、F. prausnitzii DSM 32186を20分間空気にさらすと、コロニーは回収されなかった（図2a）。対照的に、D. pigerは同じ条件下で比較的酸素に強い（Extended Data Fig.2）。

図2：段階的適応によるF. prausnitziiの酸素耐性の発達。
図2
a, YCFAG培地で20分間大気暴露した後のF. prausnitzii DSM 32186の酸素耐性と、嫌気培養した対照プレートとの比較。 b, 改良型ヒト酸化還元腸模擬モデル（m-SHIRM）バイオリアクターの概略図。c, F. prausnitziiの酸素耐性株の開発に用いられた酸化適応戦略。 d, 親株DSM 32186から開発された酸素適応F. prausnitzii DSM 32379の酸素耐性。酸素曝露は図2aと同様に行った。a,dの寒天平板の右側の数字は希釈度を示す。

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先に示したように、F. prausnitziiを含む製剤の保存期間は、システインのような抗酸化剤を使用することで延長できる。F. prausnitziiの酸素耐性を向上させるため、我々はm-SHIRMバイオリアクター23を用いた適応戦略を用いた。この戦略では、DSM 32186を、システイン濃度を減少させ、陽極電位を増加させながら、連続した10回のサブ培養ステップで酸化条件に曝した（図2b,c）。各ステップで、前のステップのサンプルを酵母エキス・カシトン脂肪酸グルコース（YCFAG）増殖培地に嫌気的に接種した。プレートの目視検査により、6回目と10回目の再培養時に明確なコロニー形態が確認され（Extended Data Fig.3）、16S rRNA遺伝子の塩基配列決定によりF. prausnitziiであることが分類学的に確認された後、5つのコロニー形態が酸素耐性の特性解析のために選択された。酸素耐性の増加は、DSM 32378（Extended Data 図4a）とDSM 32379（Extended Data 図4b）の2つの形態型（Extended Data 図4d）で明確に観察され、酪酸産生能を失うことなく生じた（Extended Data 図4c）。DSM 32379は酸素耐性が最も高く（Extended Data Fig.4a）、D. piger DSM 32187との相乗効果の解析のためにさらに選択されたが、D. piger DSM 32187も影響を受けなかった（Extended Data Fig.5）。

したがって、酸素耐性とD. pigerとの共培養の結果、ヒトへの投与に十分な量のF. prausnitziiを生産することができた。酸素耐性のDSM 32379は凍結乾燥が可能であり、-20℃で2週間の十分な安定性基準を満たし、生存率の低下を抑えながらカプセルに展開することができた（2週間の保存前と保存後で、それぞれlog10（コロニー形成単位（CFU）g-1）＝9.6対9.5）。対照的に、親株であるDSM 32186はバイオマス量が少なく（log10(CFU g-1) = 8.5）、97%の生存率が失われた。

酸素耐性の向上につながる可能性のある分子機構を明らかにするため、DSM 32379のゲノム塩基配列を決定したところ、23塩基（全ゲノムの0.0007％）に影響する10の遺伝子座に15の変異があることがわかった。これらのバリアントは、既知および未知の機能を持つ遺伝子に存在した（Extended Data Table 1）が、分子生物学的アプローチによるDSM 32186の遺伝子組み換えができなかったため、酸素耐性の発現に果たす役割を確認できず、分子メカニズムは不明のままであった。しかしながら、DSM 32379の酸素耐性は免疫調節特性を変化させず（Extended Data Fig.1）、DSM 32379は、我々が以前にF. prausnitzii A2-165で特徴付けたリボフラビン依存性細胞外電子シャトル（Extended Data Fig.6）を利用する能力を保持していた（文献19）。これらの結果から、DSM 32379の酸素耐性は、細胞生理、代謝、および粘膜界面における宿主との相互作用の可能性を変化させないことが示され、この変異体が治験薬の生産に選択された。

次に、F. prausnitzii DSM 32379とD. piger DSM 32187を含む細菌懸濁液をスイス・ウェブスター（Swiss Webster）雌雄マウスに経口投与し、複合製品の安全性を評価した。マウスには、1株および用量あたり1010 CFUを、最初の1週間に5回、その後3週間にわたり週2回投与したが、有害反応は観察されなかった。F. prausnitziiとD. pigerの糞便中レベルを定量的PCR（qPCR）により評価したが、おそらく投与方法と頻度、F. prausnitziiの大腸局在性、および／または宿主特異性に起因すると思われるが、試験終了時にいずれの種についてもレベルの上昇は観察されなかった。

菌の忍容性を調査するため、20～40歳の健康な男女50名を募集し、低用量（1カプセルあたり1×108～5×108 CFU）または高用量（1カプセルあたり1×109～5×109 CFU）のF. prausnitzii DSM 32379およびD. pigerを8週間補充し、プラセボと比較する無作為プラセボ対照試験を行った（補足表1）。両群は、年齢（低用量群ではプラセボ群より高い）、アラニントランスアミナーゼ値（低用量群ではプラセボ群より低い）、アルカリホスファターゼ値（高用量群ではプラセボ群より低い）を除いて、臨床的特徴が一致していた。治験薬の忍容性は、投与量にかかわらず良好であった。有害事象のために試験を中止した試験参加者はなく（補足表2）、有害事象や胃腸症状の発現頻度が治療群で増加することはなかった（補足表3および4）。血液生化学の副次評価項目（腎機能、血球数、肝酵素、炎症マーカー、ヘモグロビン、グリコシル化ヘモグロビン、空腹時血糖値を含む；補足表5および6）において、ベースライン時と8週間後の変化において、臨床的に関連性のある、あるいは統計的に有意な群間差は認められなかった。

ヒト腸内細菌叢への影響の可能性を評価するため、全ゲノムメタゲノムシークエンシングを行った。ベースライン時および投与終了時の全体的な組成に群間差はなく（Extended Data図7a,b）、どの群においてもベースライン時と比較して変化は認められなかった（Extended Data図7c-e）。しかし、種レベルで評価したD. pigerのシーケンスリード数は、高用量投与群で増加した（P < 0.01）（図3a）のに対し、種レベルのF. prausnitziiのリード数は変化しなかった（図3b）。ゲノムキャプチャーを用いて菌株を特異的に定量したところ、ベースライン時には親株のF. prausnitzii DSM 32186とD. piger DSM 32187の両方が高頻度に検出された（それぞれ43人中43人、43人中35人）。種レベルの結果と同様に、D. piger DSM 32187の割合は高用量群で増加し（P = 0.051；図3c）、特にベースライン時の相対存在量が低いもの（0.05％未満、P = 0.042；拡張データ図8）で増加したが、プラセボ群（図3c）や1年間に複数回サンプリングした健康なスウェーデン人で観察された範囲内にとどまった16。また、F. prausnitzii DSM 32186の割合に変化はなかった（図3d）。組成に変化がなかったことと同様に、糞便中のSCFAsレベルにも変化はなく（補足表7）、D. pigerが増加したにもかかわらず、糞便中の硫化水素レベルにも変化はなかった（拡張データ図9）。これらの結果は、我々のプロバイオティクス製剤が、宿主（つまり有害事象や胃腸症状の欠如）と腸内細菌叢（つまり組成や代謝のシフトの欠如）の両方にとって安全であることを示唆している。

図3：健康なボランティアにD. piger DSM 32187とF. prausnitzii DSM 32379を8週間投与した後のD. pigerとF. prausnitziiの存在量。
図3
a,b、治験薬投与前後のメタゲノムデータにおけるD. piger (P = 0.033)(高用量)(a)とF. prausnitzii (b)の糞便総数。n = 13（プラセボ）、16（低用量）、14（高用量）; **P < 0.01, 両側Wilcoxon 符号順位検定。データは平均値±s.e.m.。

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F. prausnitziiの種レベルの総存在量は3.4～25.9％（平均13.2％）であり、これは米国の同年齢の健常者、およびスウェーデンや英国の高齢健常者に観察された範囲と同様であり16、7,907の糞便メタゲノムを含む最近の大規模メタ解析11における種レベルの存在量（平均6.5±7.6％）よりも高かった。したがって、F. prausnitziiのさらなる増加は、ニッチの飽和によって制限されたと考えられる。しかし、D. piger DSM 32187の増加が観察されたことから、図1gのモデルに基づいて、F. prausnitziiと同様に酪酸産生に細胞外酢酸を必要とする酪酸産生菌など、他の酪酸産生菌の存在量にも影響があるのではないかと考えた20。酪酸産生に関わる末端遺伝子を定量化したところ、投与終了時の酪酸産生能の変化とD. piger DSM 32187のベースラインとの比較において、全個体（スピアマンのrho = 0.48、P = 0.001）および低用量または高用量を投与した個体（スピアマンのrho = 0.49、P = 0.006）で有意な正の相関が認められたが、プラセボ群（スピアマンのrho = 0.39、P = 0.185）では認められなかった。これらの結果は、Faecalibacterium、Roseburia、Oscillospira、Coprococcusなどの異なる酪酸産生菌とDesulfovibrioの共存を示した最近の研究と一致しており24、我々のプロバイオティクス製剤が、ヒト腸内の複雑な群集における全体的な酪酸産生の可能性をサポートする可能性を示唆している。これらの結果はまた、微生物叢に基づく治療戦略25,26,27,28にとって、ベースラインおよび／または特定の腸内細菌叢構成が重要である可能性を強調している。

最後に、糞便サンプル中のF. prausnitzii DSM 32379の検出を試みたが、1つ以上の遺伝子変異体を標的としたqPCRアッセイでは十分な識別ができず、ゲノムキャプチャー法を用いても酸素耐性変異株DSM 32379と親株DSM 32186を区別することはできなかった。なぜなら、これらの方法では固有の菌株を同定するためには全ゲノムの類似性が96％未満である必要があり29、DSM 32379はDSM 32186と99.9993％同一であるからである。したがって、投与終了時にゲノムキャプチャーによって検出されたF. prausnitzii DSM 32186の数は、おそらく内因性のDSM 32186と、プロバイオティクス製剤とともに投与された酸素耐性DSM 32379の合計であると考えられる。糞便サンプル中にDSM 32379が存在する可能性を追跡するために、メタゲノミックデータから特定の遺伝子変異を検出した（Methods）。ベースライン時またはプラセボ群では、F. prausnitziiの遺伝的可塑性10と一致する少数のマーカー変異体（例えば、変異体7）が観察され、低用量群および高用量群の試験参加者のサブセットでは、投与終了時にさらなる変異体および／またはいくつかの組み合わせが見つかった（補足表8）。糞便メタゲノムにおけるDSM 32379の検出率が低かったのは、DSM 32379と親株のゲノム同一性が高く、その結果メタゲノミックデータのカバー率が不十分であったためかもしれない。しかし、F. prausnitziiは粘膜界面にも存在するため19、糞便サンプリングは粘膜に近いDSM 32379の数を反映していないかもしれない。したがって、我々は、F. prausnitzii A2-165の投与が大腸炎を改善し、マウスの微生物叢を部分的に回復させることができるという観察から支持されるように、次世代プロバイオティクスが、この細菌の存在量が少ない患者グループ（2型糖尿病患者など）や腸の炎症がある患者（炎症性腸疾患など）において、F. prausnitziiを増加させることができるかもしれないという仮説を立てた9。

我々の研究にはいくつかの限界がある。縦断的なデータが限られているため、投与した製剤に対する一過性の腸内細菌叢反応や個別化された腸内細菌叢反応については調査していない。さらに、F. prausnitziiの酸素耐性向上につながる分子メカニズムも明らかにできなかった。しかしながら、本研究で分離されたF. prausnitziiとD. pigerの間の共栄的相互作用に基づくアプローチを開発したことで、in vitroでのF. prausnitziiの増殖と酪酸産生が増加し、ヒト腸内でのin vivoでの酪酸産生能に影響を及ぼす可能性がある。

結論
腸内細菌叢を標的とすることは、ヒトの健康を改善する上で大きな可能性を秘めており、過去20年間のメタゲノム研究により、次世代プロバイオティクスの開発候補となり得る細菌が幅広く同定されている2。しかし、メタゲノミクス調査で検出された細菌種の70％には培養代表菌がないため30、ヒトを対象とした研究で評価された候補菌はほとんどない。例えば、Akkermansia muciniphila31やAnaerobutyricum soehngenii25は、単一種として、あるいは芽胞形成菌32との組み合わせで、ヒトが摂取しても安全であることが分かっており、予備データでは、マウスやヒトの糖代謝に好影響を与えることが示されている25,31,32。

次世代プロバイオティクスとしてヒト腸内細菌を開発するための主な課題は、潔癖な増殖（つまり、特定の栄養素や条件を必要とすること）と酸素に対する感受性である。実際、これまでに次世代プロバイオティクスとして選択されたヒト分離株の例には、腸内嫌気性細菌の中でも比較的酸素耐性が高いバクテロイデス株やクロストリジウム株2（バクテロイデス・フラギリスやクロストリジウム・ブチリカムなど）が含まれている33,34。B.fragilisの酸素耐性変異体を単離したMeehanら34が示したように、もともと酸素耐性を持つ腸内細菌は、酸素に直接さらされることで酸素耐性が高まる可能性がある。このアプローチは、F. prausnitziiのような極めて酸素に敏感な細菌には適用できないが、ここで述べたアプローチであれば対象とすることができる。

われわれの知る限り、F. prausnitziiのような厳密に嫌気性の細菌は、ヒト食用の生菌製剤では報告されていない。高脂血症8、糖尿病前症および2型糖尿病5,6、非アルコール性脂肪性肝疾患35、炎症性腸疾患9の患者では、F. prausnitziiの存在量が減少していることから、次世代プロバイオティクスとしてのF. prausnitziiの生産は非常に興味深い。腸内微生物と酸素耐性の向上との間に存在する相乗効果の利用に基づく我々の戦略は、F. prausnitziiをヒト用の次世代プロバイオティクスとして開発する方法を示している。この技術は、次世代プロバイオティクスとして、酸素感受性が極めて高い他の細菌を開発し、これらの細菌の存在量が減少している患者集団をターゲットとするために利用できるかもしれない。

方法
F. prausnitziiとD. pigerの共単離と培養
過去6ヶ月間抗生物質の投与を受けていない36歳の健康な男性ドナーから採取した新鮮な糞便サンプル10μgをPGM寒天培地プレートに直接接種し、コイ・チャンバー（コイ・ラボラトリー・プロダクツ社製）を用いて37℃で嫌気培養（5％H2、10％CO2、アースガスとしてN2）した。PGMは硫酸還元菌の分離に広く用いられている増殖培地である。

純粋培養を得るために、古典的な微生物学的手法が用いられた。連続継代培養後、無作為にコロニーを選び、グラム染色を行った。F. prausnitziiとD. pigerの推定細胞型が観察された。それぞれF. prausnitziiとD. pigerの生育を支持するYCFAG培地とPGM培地で継代培養を繰り返した結果、F. prausnitziiとD. pigerの純粋培養株が得られ、全長16S rRNA遺伝子配列決定により分離株を同定した。分離株はブダペスト条約に基づきLeibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbHに寄託され、F. prausnitzii DSM 32186およびD. piger DSM 32187としてコレクションに記載された。

F. prausnitzii DSM 32186株は、コイ嫌気チャンバー内で厳密に嫌気条件下で日常的に維持されていた。培地はYCFAGで、2.5 g l-1酵母エキス、10 g l-1カシトン、4.5 g l-1グルコース、0.9 g l-1塩化ナトリウム、0.45 g l-1リン酸二カリウム、0.45 g l-1リン酸二水素カリウム、1. 32 g l-1 硫酸アンモニウム、4 g l-1 炭酸水素ナトリウム、1 g l-1 システイン、0.001 g l-1 レサズリン、0.01 g l-1 ヘミン、100 µg l-1 ビオチン、100 µg l-1 コバラミン、300 µg l-1 p-アミノ安息香酸、500 µg l-1 葉酸、1,500 µg l-1 ピリドキサミン。すべての成分は、チューブをCO2でフラッシュしながら無菌的に添加した。培地は100kPa、121℃で15分間オートクレーブ滅菌した。最後に、チアミンとリボフラビンを0.22μmのフィルターを通して最終濃度0.05μg ml-1になるように添加した。培地中のSCFAの最終濃度は、アセテート33 mM、プロピオネート9 mM、イソブチレート、イソバレレート、バレレート各1 mMであった。

D. piger DSM 32187はPGMで培養した。PGMは以下を含む： 0.5 g l-1 リン酸二カリウム、1 g l-1 塩化アンモニウム： 3. 5 g l-1乳酸ナトリウム、1 g l-1酵母エキス、0.1 g l-1アスコルビン酸塩、0.5 g l-1システイン、1 g l-1塩化ナトリウム、10 g l-1ペプトン、1 g l-1硫酸ナトリウム、1 g l-1塩化カルシウム、2 g l-1硫酸マグネシウム、0.5 g l-1硫酸第一鉄、0.5 g l-1七水和物。硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム七水和物、塩化カルシウムは別々にオートクレーブ滅菌し、硫酸第一鉄七水和物は0.22μmのフィルターで濾過滅菌し、オートクレーブ滅菌と全成分の混合後に添加した。培地の最終pHは7.2±0.2に調整した。

共培養実験では、PGMに25 mMのグルコースを加えて改変PGM培地（mPGM）を調製した。

酸素適応戦略
F. prausnitzii DSM 32186の酸素耐性を高めるため、特注のバイオリアクター（m-SHIRM）を用いた（図2b）。嫌気性Coyチャンバーで、7mlのYCFAGに単一コロニーを接種して接種液を調製した。37℃で16時間培養した後（600 nmの光学密度（OD600）≒0.7）、この前培養液2.5 mlを、250 mlのYCFAGを入れたm-SHIRMバイオリアクターの陽極チャンバーに接種した。グラファイト陽極（8.5cm×0.25cm×2.5cm）にポテンショスタット（CHI、660C）を介して外部電圧を印加し、酸化電位を維持した。m-SHIRMバイオリアクターは37℃に保たれ、接種前に窒素ガスで15分間パージした。24時間後（OD600≈0.7）、2.5 mlの細菌培養液を、アノード電位とシステイン/シスチン濃度のシフトを除き、同じ増殖条件で別のm-SHIRMバイオリアクターに再接種した。この手順を、アノード電位を上げ、システイン/シスチンの比率を下げながら10回繰り返した（図2cのグラフ）。

F. prausnitzii DSM 32186の酸素適応変異体の選択
図2cに示したサブカルチャー手順の間、100 µlのアリコートを採取し、900 µlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で連続希釈した。各希釈液から50 µlのアリコートをYCFAGに接種し、72時間嫌気培養した。コロニー形態型の差異に基づき、コロニーを摘出し（Extended Data Fig.3）、グリセロールストック（20％グリセロールを含むYCFAG）として-80℃で保存した。酸素に適応した変異体は、グラム染色で純度を確認した。

酸素耐性の評価
F. prausnitzii DSM 32186およびその変異株の酸素耐性をYCFAGで、D. piger DSM 32187の酸素耐性をPGM培地で評価した。培養後、嫌気的に10倍連続希釈液を調製し、各希釈液100 µlをYCFAGまたはPGM寒天培地2セットに接種した。嫌気的条件下で培養したプレートは、酸素耐性を測定するために使用した、20分間大気暴露したプレートの生存率のコントロールとなった。酸素の拡散は、YCFAG培地に含まれるレサズリン色素の酸化によって確認した。大気暴露後、プレートはコイチャンバー内で72時間嫌気培養し、CFUを計数した。

細菌代謝物の定量
グルコース、SCFA、乳酸を屈折率検出付き高速液体クロマトグラフィー（HPLC）で測定した。遠心分離してフィルター滅菌した培養ブロス20マイクロリットルを、ガードカラム付きReprogel H 9 µmカラム（250×4.6 mm）に注入した。Jasco AS-2507+オートインジェクター サンプルを4℃で冷却し、溶離液として0.0025 M硫酸を用い、Dionex社製UltiMate 3000ポンプで400 µl/min-1の流速で注入した。ピークはBischoff 8020 RI検出器で検出した。

リボフラビンによる細胞外電子伝達
先に述べたように、F. prausnitziiはリボフラビンを利用して、微生物燃料電池のアノードに細胞外電子伝達を行うことができる19。YCFAG寒天プレートに、-80℃に保存した冷凍グリセロールストックからF. prausnitzii DSM 32186とDSM 32379を植菌し、Coyチャンバー（Coy Laboratory Products）内で37℃で嫌気培養（5% H2、10% CO2、N2）した。単一コロニーを6mlのYCFAGブロスに接種し、嫌気的に37℃で一晩培養した。培養がOD600～0.9に達した時点で、4,000 rpm、20分間の遠心分離により細胞を回収した。細胞ペレットを200μlのアノライトに懸濁し、アノードチャンバーに注入した。細胞を5分間インキュベートした後、電子メディエーターとしてリボフラビン200 µMを添加した。

特注の2室型微生物燃料電池は、以前に記載されたとおりに組み立て、若干の修正を加えた36。カソード室とアノード室の容積は9mlで、作動容積は6mlであった。2つのチャンバーは、CMI-7000S陽イオン交換膜（Membranes International）の直径1.8cmの隔壁で仕切られた。2cm×1cm×0.2cmのグラファイトプレートをカソードとアノードとして使用した。2つの電極間の距離は10cmであった。電極は絶縁銅線で外部回路に接続され、回路は150Ωの固定抵抗を介して閉じられた。陽極チャンバーには、溶質として50mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）と0.1Mグルコースが入った。カソードチャンバーには100mMリン酸カリウムバッファー（pH7.0）、カソード液として50mMフェリシアン化カリウムを入れた。セルは37℃に保たれ、アノード室とカソード室はそれぞれ窒素ガスと空気で連続的にパージされた。データはLabJackデータ収集システム（LabJack Corporation）を用いて1分間隔で記録した。

Caco-2細胞における免疫調節機能
European Collection of Cell Cultures (batch 18H036, Merck)のCaco-2を、Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (PAA Laboratories)を添加した培地で、37℃、5% CO2インキュベーター内で培養した。細胞は、LYBHIで培養した異なるF. prausnitzii上清画分（DMEM培地で1:25および1:10）とインキュベートし、（4 ng ml-1 IL-1β）で6時間刺激した。IL-8レベルは、ELISAキットDuoSet（R&D systems）を用いて細胞上清中の二重測定した。細胞は定期的にマイコプラズマ感染の有無を検査した。

マウスにおけるF. prausnitziiおよびD. pigerの経口投与の安全性
雄雌8週齢のスイス・ウェブスターマウスを、温度20±1℃、湿度45-70％の特定病原体非存在下、12時間明暗サイクル（明は07:00から19:00）で1ケージあたり5匹ずつ同居させ、オートクレーブ処理したチャウ食（LabDiet）と水を自由摂取させた。マウスには、F. prausnitzii DSM 32379およびD. piger DSM 32187を含む細菌培養物、または培地/グリセロールビヒクルのいずれかを、最初の1週間に5回、その後3週間は週2回投与した。全ゲノムDNAはマウスの糞便内容物から既述の方法で単離し37、Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit（Invitrogen）で定量した。F. prausnitziiおよびD. pigerは、プライマーFpr-2F（GGAGGAAGAAGGTCTTCGG）/Fprau645-R（AATTCCGCCTACCTCTGCAC）38,39およびDSV691-F（CCGTAGATATCTGGAGGAACATCAG）/DSV826-R（ACATCTAGCATCCATCGTTTACAGC）40を用いたqPCRにより定量した。臨床観察は1日1回行った。間代性運動や強直性運動、定型行動や異常行動がモニターされた。体重と食物消費量がモニターされた。血液学的検査では、ヘマトクリット値、ヘモグロビン濃度、赤血球数、総白血球数および白血球鑑別数、血小板数を測定した。血液サンプルの臨床生化学検査では、ナトリウム、カリウム、尿素、総コレステロール、血中尿素窒素、クレアチニン、総蛋白、総アルブミン、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ、胆汁酸が用いられた。胃十二指腸、小腸、大腸（パイエル板を含む）、肝臓、脾臓、胸腺、腸間膜リンパ節の病理組織学的検査を行った。臨床観察、体重、食物摂取量、臓器重量評価および剖検は盲検化せずに行われた。血液学的検査、臨床生化学的検査、病理組織学的検査は、盲検化された外部の担当者が行った。サンプルサイズの計算や無作為化は行わなかった。すべての動物実験は、ヨーテボリ動物倫理委員会（Dnr 5.8.18-16056/2019）の承認を得た。

若い健康な男女におけるF. prausnitziiおよびD. pigerの経口投与の安全性
試験デザイン
本試験は、20～40歳の健康な男女を対象とした10週間の二重盲検無作為化プラセボ対照単施設試験である。対象者は、D. pigerとF. prausnitziiの高用量（1菌種あたり1×109～5×109 CFU、n=18）または低用量（1×108～5×108 CFU、n=16）のカプセルを1日1回、8週間摂取する群（n=16）と、その後2週間摂取しない群（n=16）に無作為に割り付けられた。合計16名（高用量）、16名（低用量）、14名（プラセボ）の参加者が全試験を完了した。有害事象により試験を中止した参加者はいなかった。無作為化は、スポンサー（Metabogen社）がSealed Envelope（2017, https://www.sealedenvelope.com/simple-randomiser/v1/lists）を用いて行った。無作為化は性別により層別化した。試験デザイン、解析および試験目的に関する情報は、試験開始前にClinicaltrials.gov（NCT03728868）で公表された。本研究は、ヨーテボリの地域倫理審査委員会の承認を得た。

参加者
ソーシャルメディア（FacebookやInstagramなど）や公共の場所（大学、病院、スポーツジムなど）にポスターを掲示し、参加ボランティアを募集した。すべての組み入れ基準（20～40歳、インフォームド・コンセントに署名している、既知の疾患がなく健康である、計画された訪問、電話インタビュー、指示に従う意思があり参加できる、スウェーデン語の話し言葉と書き言葉を理解できる）を満たし、すべての除外基準（処方された薬による治療を継続中、プロバイオティクスサプリメントの摂取、過去3ヵ月以内の抗生物質による治療、妊娠中、過去数ヵ月間に試験参加に影響を及ぼす可能性のある胃腸症状、現在のタバコ使用、他の臨床研究への参加）を欠き、血液生化学、血圧、心拍数が正常である参加者を招待した。

主要および副次的エンドポイント
主要評価項目は忍容性で、8週間の治療期間中に治験薬による中止（はい/いいえ）を用いて試験した。副次的評価項目は、胃腸症状評価尺度（GSRS）、空腹時血糖、グリコシル化ヘモグロビン（HbA1c）、腎機能（血清クレアチニンに基づく推定糸球体濾過量（eGFR））、赤血球数および白血球数、血清アラニントランスアミナーゼ（ALT）、血清アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ALT）の変化（ベースラインと8週間の間）、 血清アスパラギン酸トランスアミナーゼ（AST）、血清アルカリホスファターゼ（ALP）、血清ビリルビン、血清C反応性蛋白（CRP）、血清総蛋白、糞便SCFA値（酪酸塩、酢酸塩、乳酸塩、プロピオン酸塩、イソバレラート、イソ酪酸塩、コハク酸塩）をベースラインから4週目と8週目（SCFAについては10週後）の間に評価した。

手続き
試験期間中に6回の診療所（Sahlgenska University Hospital, Mölndal, Geriatric Medicine）への受診が必要であった。参加者は書面と口頭で試験に関する情報を受け取った。除外基準のない適格な参加者は、研究手続きと登録の前に、署名入りのインフォームド・コンセントを提供した。心拍数と血圧は、Carescape V100（GE Healthcare社製）を用いてスクリーニング時に2回測定された。身長、体重、ウエスト周囲径、ヒップ周囲径は、スタディオメーター、体重計、メジャーを用いて測定した。立位静脈から静脈血が採血され、血液生化学分析に用いられた。すべての血液生化学は、採血後4時間以内にClinical Chemistry laboratory（Sahlgrenska University Hospital Mölndal）で分析された。すべての女性は妊娠検査（尿中ヒト絨毛性ゴナドトロピン）も行い、陰性でなければ組み入れられなかった。

無作為化の際に、糞便サンプルが採取され、前週の胃腸症状に関する情報を収集するためにGSRSが記入された。すべての参加者は、毎日の服用量を記録し、潜在的な有害事象についてメモするための日記を受け取った。3～5回目の来院時に、糞便と血液のサンプル、およびGSRS質問票のデータが収集された。治療終了の2週間後、胃腸症状（GSRS）のデータを収集し、検便を採取するために最後の研究訪問が行われた。無作為化された最初の15人の被験者には、最初の1週間は毎日電話で連絡し、潜在的な有害事象について問い合わせた。その後、有害事象に関する問い合わせと前週の胃腸症状（GSRS）に関する情報収集のため、すべての参加者に週1回電話連絡が行われた。

介入
試験製品は、小腸に到達すると崩壊するように設計されたカプセルに充填された凍結乾燥菌として提供された。プラセボと介入製品には同一のカプセルと賦形剤が使用された。

胃腸症状の評価
最近1週間の胃腸症状の評価は、GSRS質問票41を用いて行った。GSRSは合計15項目からなり、0から45までの合計スコアで分析した。0～9は胃腸症状なし～軽微、10～19は胃腸症状軽微、20～29は胃腸症状中等度、30～39は胃腸症状中等度～重度、40～45は胃腸症状重度に相当する。

血液生化学
すべての血液生化学分析は、Sahlgrenska大学病院のSwedac認定（認定番号1240）臨床化学検査室で行われた。血糖はCobas 6000装置（Roche Diagnostics Scandinavia）でGlucose HKを用いて測定した。分散係数（CV）は5mMと15mMの濃度で3％であった。HbA1cはHPLC（Mono S, Tricorn 50/50 GL (CDP), MonoBeads Column (GE Healthcare)）を使用して測定した。分離されたヘモグロビン画分はUV検出器を用いて測定され、417 nmで吸光度が定量された。42mmol/mol、63mmol/mol、94mmol/molの濃度でCVは2%であった。赤血球沈降速度はStarrsed ST Instrument, Mechatronics (Triolab)を用いて測定した。赤血球数（2、4および5×1012 l-1でのCV：3％）は、K2-EDTAによる抗凝固静脈血を用い、光の吸収を測定した。使用した装置はADVIA 2120i（Siemens Medical Solutions Diagnostics）である。白血球数は、K2-EDTAによる抗凝固静脈血を用い、ADVIA 2120i装置（Siemens Medical Diagnostics AB）を用いて光の吸収を測定し、濃度3×109 l-1から16×109 l-1でのCVは7％であった。血小板数は、K2-EDTAによる抗凝固静脈血を用いて測定し、ADVIA 2120i装置で分析した80、200および500×109 l-1でのCVは9％であった。ALTはL-アラニンと2-オキソグルタル酸の反応を触媒する。生成されたピルビン酸とNADHのさらなる反応により、NADH酸化の測定値が生成され、これは吸光度の減少を介して測定されたALT活性に正比例した。CVは1 µkat l-1で6%、4 µkat l-1で4%で、使用した装置はCobas 6000であった。ASTはL-アスパラギン酸と2-オキソグルタミン酸をオキサロ酢酸とL-グルタミン酸に触媒する。オキサロ酢酸とNADHの反応はNADH酸化の指標を生成し、これは吸光度の減少を介して測定されたAST活性に正比例した。CVは1 µkat l-1で5%、3 µkat l-1で3%で、使用した装置はCobas 6000であった。ALPはCobas 6000を用いた比色分析法で分析され、7μkat l-1でのCVは4%であった。血清総ビリルビンはCobasシステム（Roche Diagnostics Scandinavia）のコロメトリックアッセイを用いて測定され、濃度20μMと130μMでのCVは5％であった。血清クレアチニンはCobas 6000装置でCREP2を用いて測定され、濃度85μMと400μMでのCVは4％であった。推定糸球体濾過量（eGFR）は、血清クレアチニン、年齢、性別に基づき、Lund-Malmö式を用いて算出した42。総タンパク質はCobas 6000を用いて測定し、濃度50および75 g l-1におけるCVは3％であった。

糞便中SCFAs
酢酸、プロピオン酸、酪酸、およびコハク酸、乳酸の糞便中濃度は、ガスクロマトグラフィー質量分析計（Agilent Technologies）を用いて既述の方法で測定した43。簡単に説明すると、凍結した糞便100 mgをスクリューキャップ付きの16 × 125 mmチューブに移し、100 µlの体積の内部標準ストック溶液（[1-13C]酢酸、[2H6]プロピオン酸1 M、[13C4]酪酸0.5 M、[1-13C1]イソ酪酸および[1-13C]イソバレレート0.1 M）を加えた。抽出の前に、サンプルを一晩凍結乾燥した。50μlの37%HClで酸性化した後、有機酸を2mlのジエチルエーテルで2回抽出した。抽出したサンプルの500μlのアリコートを50μlのN-tert-ブチルジメチルシリル-N-メチルトリフルオロアセトアミド（シグマ）と20℃で混合した。得られた物質の1マイクロリットルを、質量分析検出器（Agilent Technologies 5975 C）に連結したガスクロマトグラフ（Agilent Technologies 7890 A）に注入した。温度は、初期温度65 °Cで6分間、15 °C min-1で260 °Cまで上昇し、280 °Cで5分間保持する直線勾配で上昇させた。インジェクターとトランスファーラインの温度は250℃であった。定量は、m/z比117(酢酸)、131(プロピオン酸)、145(酪酸)の標識内部標準物質との比較により、イオンモニター取得モードで完了した、 146（イソ酪酸）、159（イソ吉草酸）、121（[2H2,1-13C]酢酸）、136（[2H5]プロピオン酸）、146（[1-13C1]イソ酪酸）、149（[13C4]酪酸）、160（[1-13C]イソバレレート）。

統計分析
有害事象により試験を中止した被験者の割合の予想される差異に基づいて、統計的検出力を算出した。両側Fisherの正確検定を用いて、2つの治療群対プラセボ群（2：1に無作為化、被験者32人対16人）における治験薬による中止率をそれぞれ0.50対0.05とし、αレベルを0.05とすると、検出力88％が達成された。

すべての解析は、intention to treatおよびper protocol集団の両方で行われた。治療群（低用量、高用量）とプラセボ間の連続変数の比較はFisherのノンパラメトリック並べ替え検定で行い、二項変数にはFisherの正確検定（片側P値の最小値に2を乗じたもの）を用いた。主要評価項目は忍容性で、8週間の治療期間中の治験薬投与中止（はい／いいえ）を用いて検証した。副次的エンドポイント変数の潜在的な差は、プラセボで調整した相対変化で評価し、フィッシャーのノンパラメトリック並べ替え検定で比較し、平均差の信頼区間も作成した。すべての解析は完全症例に対して行われた-すなわち、インピュテーションは用いられなかった。統計学的有意性はP値が0.05未満の場合に考慮され、すべての統計はSASソフトウェアバージョン9.4（SAS Institute）を用いて行われた。主要アウトカムの信頼区間は、Newcombe hybrid score interval44を用いて算出した。パーミュテーションに基づく信頼区間（補足表5-8）は、ユーザー作成のSASマクロ45,46（https://github.com/imbhe/PermTestCI）を用いて算出した。

糞便中硫化水素の測定
硫化水素は、以前に記述された方法で定量した47。すべての試薬と緩衝液は窒素でパージして脱気した。糞便サンプルを切断し、ドライアイス上で分注（～150mg）し、2mlの密閉プロピレン管に凍結保存した。その後、サンプルを嫌気チャンバー（COY）に移し、リン酸緩衝生理食塩水で希釈した。希釈した糞便スラリーを酢酸亜鉛溶液で処理した後、N,N-ジメチル-p-フェニレンジアミン硫酸塩からなる試薬溶液を加えた。直ちにチューブを閉じてボルテックスし、室温で20分間保持した後、波長670 nmで吸光度を測定した。硫化水素は、ベースライン時および投与終了時に便を採取した40人（プラセボ、n=12；低用量、n=16；高用量、n=12）の糞便サンプルで測定した。

糞便サンプルからのDNA抽出とショットガンメタゲノムシークエンシング
便サンプルは参加者が自宅で採取し、クリニックに届けるまで室温で保存し、サンプルは-80℃で保存した。全ゲノムDNAは、IHMS DNA抽出プロトコルQ48を改変して、100～150mgの糞便から単離した。サンプルは、ASL緩衝液（Qiagen）を含むLysing Matrix Eチューブ（MP Biomedicals）で抽出し、2分間ボルテックスし、FastPrep-24 Instrument（MP Biomedicals）で90℃で10分間加熱した後、5.5 m s-1で60秒間ビーズビートを2回繰り返すことにより溶解した。各ビーズビーティングバースト後、サンプルを氷上で5分間静置した。各サイクルの後、4℃で遠心して上清を回収した。2回の遠心分離ステップの上清をプールし、各サンプルから600μlのアリコートをQIAcube（QIAGEN）装置でQIAamp DNA Miniキット（QIAGEN）を用いてヒトDNA分析用の手順で精製した。サンプルは200 µlのAEバッファー（10 mM Tris-Cl; 0.5 mM EDTA; pH 9.0）で溶出した。ショットガンメタゲノムシークエンシング用のライブラリーは、PCRを用いない方法で調製した。ライブラリー調製とシークエンシングは、Novogene社（中国）でNovaSeq装置（Illumina）を用い、150bpペアエンドリード、サンプルあたり少なくとも6Gのデータで行った。

ゲノム配列決定のための細菌培養からのDNA抽出
全ゲノムDNAは、一晩の増殖後または定常期に収穫した微生物バイオマスから抽出した。液体培養から得られたバイオマスは、4℃で4,500rpm、10分間の遠心分離により回収し、キャリーオーバーした汚染物質を除去するためにPBSで1回洗浄した。

イルミナショートリードシークエンシング用のDNAは、SL2溶解バッファーとSxエンハンサーの存在下、NucleoSpin Soilキット（740780.50, Macherey-Nagel）を用いて、メーカーの記載に従って抽出した。FastPrep-24 Instrument (MP Biomedicals)を用い、5.5 m s-1 で 60 秒間、2 ラウンドのビーズビーティングを行い、2 回のビーズビーティ ングの間に氷上で 5 分間インキュベートした。DNAの品質は、Genomic DNA ScreenTapeと試薬を用いたTapestation 4200（Agilent）を用いて評価し、定量はQuant-iT dsDNA BR Assay Kit（ThermoFisher Scientific）を用いて行った。シーケンス用のライブラリーは、Covaris S220 Focused-ultrasonicator（Covaris）を用いて調製し、平均550bpのインサートサイズに断片化し、TruSeq DNA PCR-free Library Preparation kit（20015963および20015949、Illumina）を用いた。Quant-iT dsDNA HS Assay Kit（ThermoFisher Scientific）を用いてライブラリーを定量し、MiSeq Reagent Kit v3、600サイクルを用いてイルミナMiseq装置でシーケンスした。

ナノポア・ロングリードシーケンス用の大量の高品質DNAは、Marmur手順の修正版を用いて得た49。細胞をTris-EDTAバッファー（20 mM Tris HCl pH 8、2 mM EDTA）に懸濁し、プロテイナーゼK存在下、リゾチーム（20 mg ml-1）とSDS（2%w/v）で溶解した。抽出された全DNAは、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：1 v/v）およびクロロホルム：イソアミルアルコール（24：1 v/v）で抽出を繰り返した後、冷エタノール（99.5％ v/v）で沈殿させ、DNAをガラス棒に巻き取ることで精製した。DNAを70%(v/v)のエタノールで洗浄し、室温で乾燥させた後、4℃で一晩水に懸濁した。DNA の完全性と濃度は、Tapestation 4150 with Genomic DNA ScreenTape and reagents (Agilent) と Qubit 3.0 Fluorometer and Qubit dsDNA BR assay kit (ThermoFisher Scientific) を用いて評価した。単離したDNAは、Rapid barcoding kit (SQK-RBK004)を用いて、製造元の説明書に従って調製し（ONT）、ONTのMinIONデバイスを用い、R9.4.1フローセル（FLO-MIN106D）で塩基配列を決定した。ベースコーリングはONT社のguppy v.4.2.2を用いて行った。

バイオインフォマティクス手法
ゲノム解析
F. prausnitzii DSM 32186およびDSM 32379とD. piger DSM 32187のゲノムは、NanoporeとIlluminaリードのハイブリッドアセンブリによって得られた。Unicycler pipeline v0.4.8をハイブリッドモードで使用し、de novoアセンブリーを得た。Unicyclerの依存関係はすべてconda環境にインストールした。依存プログラムには、SPAdes v3.13.0、racon v1.4.1、bowtie2 v2.3.5.1、pilon v1.23が含まれる。ハイブリッドアセンブリーはProkka v1.14.5 (https://github.com/tseemann/prokka)を用いてアノテーションした。

進化的関係を推定するために、F. prausnitziiとD. pigerのゲノムを、それぞれprogressiveMauve50を用いて、一般に入手可能な同種の高品質ゲノム、および/または既知のクレードの代表的な配列、それらの近傍およびアウトグループとアライメントした。マルチプルアラインメントを使用して、MEGA X51で両菌株の系統樹を再構築した。進化的距離は最大合成尤度法を用いて計算し、部位あたりの塩基置換数52の単位で表した。

全ゲノムメタゲノミクス解析とゲノムキャプチャー
イルミナのリードは、fastX toolkit (https://github.com/lianos/fastx-toolkit/)のfastq_quality_trimmerを用いて品質フィルターおよびトリミングした。ヒトリードは、Bowtie2 (ref. 53) (v2.4.4)を用いてヒトゲノム(hg19)に対して高品質リードをマッピングすることで除去した。低品質リード（品質スコア<20）とヒトリードを除去した後、各糞便サンプルについて平均4500万深さの高品質ペアエンド微生物リードを得た。

RefSeqデータベース（リリース107）に新規株F. prausnitzii DSM 32186およびD. piger DSM 32187のクローズドゲノムを追加して設計したカスタムデータベースに対して、Kraken 2（ref.54）（v2.1.2）を用いて高品質な微生物リードをデフォルト設定でマッピングした。株存在量の推定は、Bracken55（v2.6.2）を用いて、最小100 bpのリードで行った。

腸内細菌叢の全体的な組成は、Bray-Curtis非類似度に関する主座標分析を用いて種の存在量を評価した。組成の差は、Rのveganパッケージ（https://github.com/vegandevs/vegan/）のadonis2関数を10,000回の並べ替えで使用した並べ替え多変量ANOVAによって検定した。

メタゲノムデータ中の遺伝子数は、15,186,403 個の非冗長微生物遺伝子を含む遺伝子カタログ6 を用いて、MEDUSA56 を用いて推定した。酪酸産生能は、4つの腸内酪酸産生経路57の末端酵素をコードする5つの遺伝子（but、buk 4hbt、atoA/D）に基づいて定量化した。遺伝子カタログのこれらの遺伝子をスクリーニングするために、プロファイル隠れマルコフモデルを使用した。

酸素耐性F. prausnitzii DSM 32379については、snippy v4.4.5をデフォルト設定（https://github.com/tseemann/snippy）で用いて、親株DSM 32186のアセンブル済みゲノムに対して生リードをマッピングすることにより、遺伝子変異を検出した。糞便メタゲノム中の遺伝子変異を検出するために、bowtie2 v2.3.5.1を用いて各サンプルのDSM 32379にマッピングされたF. prausnitziiリードを取得し、snippy v4.4.5を用いて親株ゲノムDSM 32186に対してバリアントコーリングを行った。F. prausnitzii DSM 32379は、以下の場合にのみサンプルから検出された可能性があると考えられた： (1) DSM 32379の遺伝的変異が投与終了時にのみ検出されたこと、(2) 関連するゲノム領域をカバーする遺伝的変異が全リードの少なくとも10%存在したこと、(3) ベースライン時に検出された場合、投与終了時にその糞便サンプルで複数の変異が検出され、それらの頻度がすべて増加していること（補足表1）。

統計
統計解析はGraphPad Prism v_8.4.3を用いて行った。2群の比較には両側Studentのt検定を用い、3群の比較にはTukeyの多重比較を用いた一元配置分散分析を用いた。

ノンパラメトリック検定は、糞便微生物群中の種および菌株の存在量の比較に用いた。ウィルコクソンの符号順位検定は、各個人から採取した一致する検体について、投与終了時の存在量をベースライン時と比較して比較するために用いた。3群の比較にはクラスカル・ワリス検定を用いた。

報告概要
研究デザインに関する詳細は、本論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。

データの入手可能性
データの利用可能性に関する補足情報は、論文のオンライン版にリンクされている。ゲノムアセンブリーと生のメタゲノム配列データはEMBL-EBI European Nucleotide Archive (ENA)にアクセッション番号PRJEB62463で寄託されている。再解析に必要な処理済み配列データはGitHub (https://zenodo.org/record/8019851)で入手可能。処理された仮名化された被験者ごとのメタデータは、補足表2-8に記載されている。マウス安全性試験のデータは補足表9にある。臨床コホートに関する質問については、M.L.に問い合わせること。細菌株はMetabogen ABの所有物であるため、同社に問い合わせること。

参考文献
Schroeder, B. O. & Backhed, F. 生理と疾患における腸内細菌叢から遠隔臓器へのシグナル。Nat. Med. 22, 1079-1089 (2016).

論文

論文

PubMed

Google Scholar

O'Toole, P. W., Marchesi, J. R. & Hill, C. 次世代プロバイオティクス：プロバイオティクスから生きたバイオ治療薬までのスペクトル。Nat. Microbiol. 2, 17057 (2017).

論文

PubMed

グーグル・スカラー

Sender, R., Fuchs, S. & Milo, R. 体内のヒトと細菌の細胞数の推定値の改訂。PLoS Biol.14, e1002533 (2016).

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

ヒト腸内細菌叢における参照遺伝子の統合カタログ。Nat. Biotechnol. 32, 834-841 (2014).

論文

論文

PubMed

Google Scholar

Allin, K. H. et al. Aberrant intestinal microbiota in individuals with prediabetes. Diabetologia 61, 810-820 (2018).

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Wu, H. et al. 糖尿病前症および糖尿病における腸内細菌叢：集団ベースの横断研究。Cell Metab. 32, 379-390.e3 (2020).

論文

CAS

パブコメ

Google Scholar

2型糖尿病における腸内細菌叢のメタゲノムワイド関連研究。Nature 490, 55-60 (2012).

論文

ADS

CAS

PubMed

Google Scholar

Fu,J.Y.ら：腸内細菌叢は血中脂質の変動のかなりの割合に寄与している。Circ. Res. 117, 817-824 (2015).

論文

CAS

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Sokol, H. et al. Faecalibacterium prausnitziiはクローン病患者の腸内細菌叢解析から同定された抗炎症性常在菌である。Proc. Natl Acad. Sci. USA 105, 16731-16736 (2008).

論文

ADS

CAS

パブコメ

パブメドセントラル

Google Scholar

Cao、Y., Shen、J. & Ran、Z. H. Faecalibacterium prausnitziiの減少と炎症性腸疾患との関連：メタアナリシスと文献の系統的レビュー。Gastroent. Res. Pract. 2014, 872725 (2014).

論文

グーグル・スカラー

De Filippis, F., Pasolli, E. & Ercolini, D. Faecalibacterium diversity is connected to age, lifestyle, geography, and disease. Curr. Biol. 30, 4932-4943 (2020).

論文

PubMed

Google Scholar

食物繊維から宿主生理へ：主要な細菌代謝産物としての短鎖脂肪酸。Cell 165, 1332-1345 (2016).

論文

CAS

PubMed

Google Scholar

Wang, S. P. et al. ヒト大腸微生物生態系の安定性におけるpH、乳酸、乳酸資化性細菌の重要な役割。

論文

パブコメ

パブメドセントラル

Google Scholar

ヒト消化管の水素クロスフィーダー。Gut Microbes 10, 270-288 (2019).

論文

CAS

PubMed

Google Scholar

Warren, Y. A., Citron, D. M., Merriam, C. V. & Goldstein, E. J. C. Desulfovibrio species and other phenotypically similar genera. J. Clin. Microbiol. 43, 4041-4045 (2005).

論文

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Olsson, L. M. et al. 正常腸内細菌叢の動態：スウェーデンにおける1年間の縦断的集団研究。Cell Host Microbe 30, 726-739.e3 (2022).

Rey, F. E. et al. 著名な硫酸還元性ヒト腸内細菌の代謝ニッチ。Proc. Natl Acad. Sci. USA 110, 13582-13587 (2013).

論文

ADS

CAS

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Lopez-Siles, M., Duncan, S. H., Garcia-Gil, L. J. & Martinez-Medina, M. Faecalibacterium prausnitzii: from microbiology to diagnostics and prognostics. ISME J. 11, 841-852 (2017).

Khan, M. T. et al. 腸内嫌気性菌Faecalibacterium prausnitziiは、細胞外電子シャトルを用いて、酸化-無酸素間相で増殖する。isme j. 6, 1578-1585 (2012).

ヒト糞便細菌による酪酸生成への酢酸の寄与。Br. J. Nutr. 91, 915-923 (2004).

論文

論文

PubMed

Google Scholar

日本農芸化学会誌『日本農芸化学会誌』に掲載された日本農芸化学会誌（日本農芸化学会誌）に掲載された日本農芸化学会誌（日本農芸化学会誌）。J. Syst. Evol. Microbiol. 52, 2141-2146 (2002).

CAS

PubMed

Google Scholar

ヒトの腸内細菌であるFaecalibacterium prausnitziiは、抗酸化物質によって大気中でも生き続けることができる。PLoS ONE 9, e96097 (2014).

論文

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Koh, A. et al. 微生物産生イミダゾールプロピオン酸塩は、mTORC1を介したインスリンシグナル伝達を障害する。Cell 175, 947-961.e17 (2018).

Chen, Y. R. et al. Desulfovibrio is not always associated with adverse health effects in the Guangdong Gut Microbiome Project. PeerJ 9, e12033 (2021).

Gilijamse, P. W. et al. Anaerobutyricum soehngeniiによる治療：メタボリックシンドロームのヒト被験者におけるグルコース代謝に対する安全性と用量反応効果のパイロット研究。NPJ Biofilms Microbiomes 6, 16 (2020).

論文

論文

PubMed

パブメッドセントラル

Google Scholar

ベースラインの腸内細菌叢がダイエットによる体重減少の軌道を方向づける。Gastroenterology 160, 2029-2042.e16 (2021).

論文

PubMed

Google Scholar

Rodriguez、J.ら、肥満患者におけるプレバイオティクス介入の有効性を促進する腸内細菌シグネチャーの発見。Gut 69, 1975-1987 (2020).

論文

CAS

PubMed

Google Scholar

Kootte, R. S. et al. メタボリックシンドロームにおけるリーンドナー糞便摂取後のインスリン感受性の改善はベースラインの腸内細菌叢組成によって左右される。Cell Metab. 26, 611-619.e616 (2017).

論文

CAS

PubMed

Google Scholar

Aggarwala, V. et al.糞便微生物叢移植後の細菌株の正確な定量化は、長期生着を明らかにし、転帰を説明する。Nat. Microbiol. 6, 1309-1318 (2021).

論文

論文

パブコメ

パブメドセントラル

Google Scholar

Almeida, A. et al. ヒト腸内細菌叢から得られた204,938の参照ゲノムの統一カタログ。Nat. Biotechnol. 39, 105-114 (2021).

論文

論文

パブコメ

グーグル奨学生

Depommier,C.ら：過体重および肥満のヒトボランティアにおけるAkkermansia muciniphilaのサプリメント：概念実証の探索研究。Nat. Med. 25, 1096-1103 (2019).

論文

CAS

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

2型糖尿病患者における食後血糖コントロールの改善：新規プロバイオティクス製剤の多施設共同二重盲検プラセボ対照無作為化試験。BMJ Op. Diabetes Res. Care 8, e001319 (2020).

論文

Google Scholar

Morvan, C., Folgosa, F., Kint, N., Teixeira, M. & Martin-Verstraete, I. 酸素に対するクロストリジウムの反応：解毒から適応戦略まで。Environ. Microbiol. 23, 4112-4125 (2021).

論文

論文

パブコメ

Google Scholar

Meehan, B. M., Baughn, A. D., Gallegos, R. & Malamy, M. H. 単一遺伝子の不活性化により偏性嫌気性細菌Bacteroides fragilisの微好気的増殖が可能になる。Proc. Natl Acad. Sci. USA 109, 12153-12158 (2012).

論文

ADS

CAS

パブコメ

パブメドセントラル

Google Scholar

Loomba, R. et al. ヒト非アルコール性脂肪性肝疾患における進行した線維化を非侵襲的に検出するための、腸内細菌に基づくメタゲノミックシグネチャー。Cell Metab. 25, 1054-1062.e5 (2017).

カーン、M.T.、ブラウン、W.R.、ファン・ダイル、J.M.&ハームセン、H.J. Faecalibacterium prausnitziiは細胞外電子伝達にリボフラビンをどのように利用できるか？抗酸化。Redox Signal. 17, 1433-1440 (2012).

論文

論文

パブコメ

Google Scholar

腸内細菌叢と食事脂質のクロストークはTLRシグナルを介してWATの炎症を悪化させる。Cell Metab. 22, 658-668 (2015).

論文

CAS

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Wang, R. F., Cao, W. W. & Cerniglia, C. E. ヒトおよび動物の糞便サンプル中の優勢嫌気性細菌のPCRによる検出と定量。Appl. Environ. Microbiol. 62, 1242-1247 (1996).

論文

ADS

CAS

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Suau, A. et al. Fusobacterium prausnitziiとその近縁種はヒト糞便細菌叢の中で支配的なグループである。Syst. Appl. Microbiol. 24, 139-145 (2001).

論文

論文

パブコメ

Google Scholar

リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を用いた粘膜および糞便中のデスルホビブリオの同定と定量。Gut 53, 523-529 (2004).

論文

CAS

PubMed

PubMed Central

Google Scholar

Svedlund, J., Sjodin, I. & Dotevall, G. GSRS-a clinical rating scale for gastrointestinal symptoms in patients with irritable bowel syndrome and peptic ulcer disease. Dig. Dis. Sci. 33, 129-134 (1988).

論文

CAS

パブコメ

Google Scholar

成人における相対糸球体濾過量の予測：スウェーデンの白人および標準化された血漿クレアチニン測定法に基づく新しい改良式。Scand. J. Clin. Lab. Clin. Lab. 67, 678-695 (2007).

論文

CAS

パブコメ

Google Scholar

Djekic, D. et al.虚血性心疾患患者におけるベジタリアン食が心代謝リスク因子、腸内細菌叢、血漿メタボロームに及ぼす影響：無作為クロスオーバー試験。J. Am. Heart Assoc. 9, e016518 (2020).

論文

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Fagerland, M. W., Lydersen, S. & Laake, P. 2つの独立二項比例の推奨信頼区間. Stat. Methods Med. Res. 24, 224-254 (2015).

論文

MathSciNet

PubMed

Google Scholar

Bradley, J. V. Distribution-Free Statistical Tests 78-80 (Prentice-Hall, 1968).

Good, P. Permutation Tests: a Practical Guide to Resampling Methods for Testing Hypotheses 36-37 (Springer, 2000).

Strocchi, A., Furne, J. K. & Levitt, M. D. A modification of the methylene-blue method to measure bacterial sulfide production in feces. J. Microbiol. Methods 15, 75-82 (1992).

論文

CAS

Google Scholar

Costea, P. I. et al. メタゲノム研究におけるヒト糞便サンプル処理の標準化に向けて。Nat. Biotechnol. 35, 1069-1076 (2017).

論文

CAS

PubMed

Google Scholar

微生物からデオキシリボ核酸を分離する手順。J. Mol. 3, 208-218 (1961).

論文

CAS

Google Scholar

遺伝子の獲得、喪失、再配列を考慮したマルチゲノムアライメント。PLoS ONE 5, e11147 (2010).

論文

論文

パブコメ

パブメドセントラル

Google Scholar

MEGA X：コンピューティングプラットフォームを横断した分子進化遺伝学解析。Mol. Biol. Evol. 35, 1547-1549 (2018).

論文

CAS

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

近傍結合法による超大型系統樹推定の展望。Proc. Natl Acad. USA 101, 11030-11035 (2004).

論文

ADS

CAS

パブコメ

パブメドセントラル

Google Scholar

Bowtie2による高速ギャップドリードアライメント。Nat. Methods 9, 357-359 (2012).

論文

論文

パブコメ

パブメッドセントラル

Google Scholar

Wood, D. E., Lu, J. & Langmead, B. Kraken 2によるメタゲノム解析の改善。Genome Biol.20, 257 (2019).

論文

CAS

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

メタゲノミクスデータにおける生物種の存在量の推定。PeerJ Comput. Sci. 3, e104 (2017).

論文

Google Scholar

Karlsson, F. H., Nookaew, I. & Nielsen, J. Metagenomic data utilization and analysis (MEDUSA) and construction of a global gut microbial gene catalog. PLoS Comput. Biol. 10, e1003706 (2014).

論文

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Vital, M., Howe, A. C. & Tiedje, J. M. (メタ)ゲノムデータの解析による細菌の酪酸合成経路の解明。

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

参考文献のダウンロード

謝辞
著者らは、A. Hallén、R. Jakubowicz、L. Olsson、M. Bergentall、S. Håkanssonの技術協力、およびFisher-Pitmanの並べ替え検定と信頼区間のSASマクロを共有してくれたH. Imbergに感謝する。UPPMAX の Swedish National Infrastructure for Computing (SNIC) により提供されたプロジェクト SNIC 2020/5-384 および SNIC 2019/8-169 のリソースにより計算が可能となった。本研究は、Knut and Alice Wallenberg Foundation (2017. 0026）、Swedish Research Council（2019-01599）、Leducq Foundation（17CVD01）のTransatlantic Networks of Excellence Award、AFA insurances、Swedish Heart Lung Foundation（20210366）、Novo Nordisk foundation（NNF17OC0028232）、スウェーデン政府とランスティング間の協定に基づくスウェーデン国からの助成金、ALF-agreement（ALFGBG- 718101）、およびMetabogen ABによるものである。F.B.はWallenberg Scholarであり、Torsten Söderberg医学部教授である。

資金提供
イェーテボリ大学よりオープンアクセス資金提供。

著者情報
著者メモ
これらの著者は同等に貢献した： Muhammad Tanweer Khan、Chinmay Dwibedi

これらの著者は本研究を共同で監督した： Valentina Tremaroli、Mattias Lorentzon、Fredrik Bäckhed

著者および所属
スウェーデン、ヨーテボリ、ヨーテボリ大学医学研究所、分子・臨床医学部門、ワレンベリ研究所

ムハンマド・タンウィール・カーン、チンメイ・ドウィベディ、ミーナクシ・プラダン、ジェイミー・D・クラフト、ロバート・シーザー、ヴァレンティーナ・トレマローリ、フレドリック・ベッケド

メタボゲン（スウェーデン・モルンダル

ムハンマド・タンウィール・カーン

ヨーテボリ大学神経科学・生理学研究所（スウェーデン・ヨーテボリ

チンメイ・ドウィベディ

スウェーデン・イェーテボリ、イェーテボリ大学医学研究所、内科・臨床栄養学科、サハルグレンスカ骨粗鬆症センター

ダニエル・スンド＆マティアス・ロレンツォン

ヴェストラ・ヨータランド地方、老年医学クリニック、サールグレンスカ大学病院、メルンダル、スウェーデン

マティアス・ロレンゾン

メアリー・マッキロップ健康研究所、オーストラリア・カトリック大学、メルボルン、ビクトリア州、オーストラリア

マティアス・ロレンソン

スウェーデン、ヨーテボリ、サールグレンスカ大学病院、臨床生理学部門

Fredrik Bäckhed

デンマーク、コペンハーゲン、コペンハーゲン大学健康科学部、ノボ・ノルディスク基礎代謝研究センター

フレドリック・ベッケド

貢献
M.T.K.は、菌株の分離、特性評価、適合化、プロセスの開発、製剤の開発および製造を行った。C.D.とM.P.はバイオインフォマティクス解析を行った。J.D.K.はF. prausnitziiの免疫調節特性を解析した。D.S.はヒト試験を実施した。R.C.はマウス研究を行った。M.L.はヒト介入試験を計画し主導した。V.T.、M.L.、F.B.がプロジェクトを監督し、等しく貢献した。M.T.K.とF.B.は研究のコンセプト立案と設計を行い、論文の第1稿を執筆した。著者全員がデータを分析し、原稿にコメントした。

筆者
Fredrik Bäckhed宛。

倫理宣言
競合利益
M.T.K.はMetabogen ABに一部雇用されており、F.B.はMetabogen ABの創設者である。Metabogen ABは、経済的支援とヒト介入のための製品で貢献しているが、データの分析には関与していない。F.B.はBiogaia ABから研究助成を受けており、Bactolife A/Sの科学諮問委員会のメンバーである。他の著者は競合する利害関係はないと宣言している。

査読
査読情報
Nature誌は、本研究の査読に貢献したRuth Ley、Daniel Tancredi、およびその他の匿名の査読者に感謝する。

追加情報
出版社注：Springer Natureは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。

図表
Extended Data 図1 親株F. prausnitzii DSM 32186と酸素耐性DSM 32379の抗炎症特性。
F. prausnitzii上清（A2-165株（DSM 17677）をリファレンスとして含む）と接触させたCaco-2細胞によるIL-1β誘導IL-8分泌の調節。細胞は、4ng/mLのIL-1βを含む、または含まない細菌上清に6時間暴露された。横軸のグループラベルは、F. prausnitzii培養液から濾過した培地の希釈度を示す。 p = 0.025（DSM 32186 vs. A2-165、1/25）、p = 0.0000089（LYBHI vs. A2-165、1/25）、p = 0.00013（LYBHI vs. DSM32186、1/25）、p = 0. 000016 (LYBHI vs. DSM32379, 1/25), p = 0.0000028 (LYBHI vs. A2-165, 1/10), p = 0.000013 (LYBHI vs. DSM32186, 1/10), p = 0.0000039 (LYBHI vs. DSM32379, 1/10). n = 3, ***p < 0.001, *p < 0.05, as determined by One-way ANOVA. 結果は2つの独立した実験で繰り返した。データは平均値±s.e.m.で示した。

Extended Data Fig. 2 F. prausnitzii DSM 32186との共培養で分離したD. piger DSM 32187の酸素耐性プロファイル。
連続希釈液を20分間大気暴露したPGMプレートに接種し、コイ嫌気チャンバー内で培養した対照プレートと比較した。寒天プレートの横の数字は希釈度を示す。

Extended Data 図3 酸素に適応したF. prausnitzii DSM 32379の形態型。
m-SHIRMバイオリアクターから分離されたF. prausnitzii DSM 32379の形態型（矢印b）。親株であるF. prausnitzii DSM 32186（矢印a）を参考として示す。

Extended Data 図4 F. prausnitzii酸素耐性変異株の酸素耐性と発酵プロファイル。
a, YCFAGにおける親株および酸素適応変異株の酸素耐性の定量。 b, 酸素適応F. prausnitzii DSM 32378の酸素耐性。c, YCFAG培地で培養した親株DSM 32186および酸素適応変異株の代謝物プロファイル。y軸のmM変化は、ベースラインにおける接種培地との差を示す。

Extended Data 図5 親株F. prausnitzii DSM 32186または酸素耐性DSM 32379とD. piger DSM 32187の増殖と交雑培養。
a, 親株のF. prausnitzii DSM 32186と酸素耐性株DSM 32379のコロニー形成単位、 p = 0.00000073（DSM32186）、p = 0.00000022（DSM32379）。 b, F. prausnitzii DSM 32379とD. piger DSM 32187をmPGMで単独培養または共培養した24時間後の代謝物プロファイル。グルコース：p = 0.0000008（F. prausnitzii + D. piger vs. D. piger）、p = 0.0000012（F. prausnitzii + D. piger vs. F. prausnitzii）、乳酸：p = 0.00000001（F. prausnitzii + D. piger vs. D. piger）。 酢酸：p = 0.000005（F. prausnitzii + D. piger vs. D. piger）、p = 0.0000015（F. prausnitzii vs. D. piger）、p = 0.012（F. prausnitzii + D. piger vs. F. prausnitzii）；酪酸：p = 0.0000007（F. prausnitzii + D. piger vs. D. piger）、p = 0.0000007（F. prausnitzii + D. piger vs. D. piger）。piger）、p = 0.0000007（F. prausnitzii + D. piger vs. F. prausnitzii）；y軸のmM変化はベースラインでの接種培地との差を示す。***p < 0.001、*p < 0.05は、両側t検定（a）または一元配置分散分析（b）で決定した。

Extended Data Fig. 6 親株F. prausnitzii DSM 32186と酸素耐性DSM 32379のリボフラビンを介した細胞外電子シャトリング。
グルコース（100 mM）で静止細胞を活性化した後、A2-16519について前述したように、リボフラビンをスパイク（200 µM）すると、親型F. prausnitzii DSM 32186と酸素耐性DSM 32379の両方が測定可能な電流波を発生した。

Extended Data Fig. 7 D. piger DSM 32187およびF. prausnitzii DSM 32379を8週間投与した健常ボランティアにおける糞便微生物叢全体の組成の解析。
a、ベースライン時の糞便サンプル（r2 = 0.018; p = 1; adonis）、b、投与終了時の糞便サンプル（r2 = 0.040; p = 0.660; adonis）、c、ベースライン時（v2）と投与終了時（v5）のプラセボ群の糞便サンプル（r2 = 0. 009；p＝0.997；アドニス）；d、ベースライン時（v2）と投与終了時（v5）の低用量群の糞便サンプル（r2＝0.014；p＝0.971；アドニス）；e、ベースライン時（v2）と投与終了時（v5）の高用量群の糞便サンプル（r2＝0.001；p＝0.996；アドニス）。Rのveganパッケージ（https://github.com/vegandevs/vegan/）の10,000個の並べ替えを伴うadonis2関数を用いた並べ替え多変量ANOVAによって、組成の差を検定した。多重比較の調整は行った。プロット中の点は、メタゲノミックデータを持つ43人の糞便サンプルを示す：プラセボ、n = 13; 低用量、n = 16; 高用量、n = 14。解析の結果、ベースライン時、投与終了時（それぞれパネルa、b）、投与終了時（パネルc、d、e）において、どのグループもベースライン時と比較して微生物叢組成に差がないことが示された。

Extended Data 図8 高用量群の糞便サンプルにおけるF. prausnitzii DSM 32186およびD. piger DSM 32187の存在量に関するゲノムキャプチャー。
ベースラインのD.piger DSM 32187が多いサンプル（総微生物量の0.05％以上；n＝4、p＝0.875、両側Wilcoxon符号順位検定）とベースラインのD.piger DSM 32187が少ないサンプル（総微生物量の0.05％未満；n＝10、p＝0.042、Wilcoxon符号順位検定）における相対存在量の変化。v2はベースラインの糞便サンプル、v5は投与終了時の糞便サンプル。箱ひげ図では、中央の線は中央値、下部と上部のひさしは第1四分位点と第3四分位点、ひさしはひさしから最大値と最小値までで、四分位範囲（IQR）間の1.5倍以内である。

Extended Data 図9 糞便サンプル中の硫化水素の測定。
硫化水素は、ベースライン時と投与終了時の糞便サンプルで測定した（40人：プラセボ、n=12；低用量、n=16；高用量、n=12；プラセボ群の1人と高用量群の2人については十分な資料が入手できなかった）。両側Wilcoxon符号順位検定を行った。データは平均値±s.e.m.で示した。

Extended Data 表1 酸素耐性F. prausnitzii DSM 32379のゲノムに存在する遺伝子変異。
フルサイズの表
補足情報
補足情報
補足表1～7、試験の詳細、統計報告を含む補足情報。

報告概要
補足表8
酸素耐性F. prausnitzii DSM 32379を特徴づける遺伝子変異にマッピングされた糞便メタゲノム中のリード数。

補足表9
マウス安全性試験のデータ

権利と許可
オープンアクセス 本論文は、クリエイティブ・コモンズ表示4.0国際ライセンスの下でライセンスされている。このライセンスは、原著者および出典に適切なクレジットを付与し、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられた場合にその旨を示す限り、いかなる媒体または形式においても、使用、共有、翻案、配布、複製を許可するものである。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、その素材へのクレジット表記に別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれています。この記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれていない素材で、あなたの意図する利用が法的規制によって許可されていない場合、あるいは許可された利用を超える場合は、著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。

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この記事の引用
Khan, M.T., Dwibedi, C., Sundh, D. et al. 次世代プロバイオティクス開発のための相乗効果と酸素適応. Nature (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06378-w

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受領
2021年6月30日

受理
2023年6月27日

発行
2023年08月02日

DOI
https://doi.org/10.1038/s41586-023-06378-w

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