くしゃみと咳の乖離した感覚経路
細胞
2024年9月6日オンライン公開
論文
くしゃみと咳の乖離した感覚経路
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867424009000?via%3Dihub
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https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.08.009Get 権利と内容
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ハイライト
-くしゃみと咳は異なる感覚集団によって媒介される
-鼻のMrgprC11発現感覚ニューロンは、「くしゃみ」の中核をなす。
-気道SSTを発現する感覚ニューロンは、化学的に誘発された咳を媒介する。
-くしゃみと咳は異なる神経経路によって伝達され、調節される。
まとめ
くしゃみと咳は、多くの呼吸器ウイルス感染症やアレルギーの主症状である。一般に、くしゃみと咳には共通の感覚受容体と分子神経伝達機構が関与していると考えられている。ここで我々は、鼻粘膜はいくつかの個別の感覚ニューロン集団によって支配されているが、1つの集団（MrgprC11+MrgprA3-）だけが、多数の鼻刺激物、アレルゲン、ウイルスに対するくしゃみ反応を媒介することを示した。この集団は気管も支配しているが、我々が新たに確立した咳モデルによって明らかになったように、咳を媒介することはない。その代わりに、くしゃみではなく、別の感覚集団（ソマトスタチン[SST+]）が咳を媒介し、くしゃみと咳の間の予期せぬ感覚の違いが解明された。回路レベルでは、くしゃみと咳のシグナルは異なる神経経路によって伝達され、調節されている。本研究により、くしゃみと咳の感覚受容体や神経伝達・調節機構の違いが明らかになり、呼吸器ウイルス感染症やアレルギーの症状管理のための神経細胞薬物標的が提供されることになる。
グラフィカル抄録
キーワード
くしゃみ
咳
感覚ニューロン
アレルギー
呼吸器ウイルス感染
はじめに
呼吸器ウイルス感染症（例：インフルエンザ、感冒、COVID-19）は、鼻と下気道をそれぞれ支配する一次感覚線維を活性化することにより、くしゃみと咳を頻繁に誘発する。宿主の防御機構として推定されるくしゃみと咳は、病原体、アレルゲン、刺激物を排出して気道を保護すると考えられている。しかし、この2つの反射は呼吸器ウイルスに乗っ取られ、新たな宿主に感染する可能性もある。実際、呼吸器感染症は、くしゃみや咳によって発生するウイルスを含むエアロゾル飛沫を介して感染するのが最も一般的である1,2,3。
くしゃみは、鼻粘膜を支配する一次感覚線維によって誘発される。鼻粘膜は、三叉神経節にある多様な感覚ニューロンの末梢軸索によって密に支配されている。これらのニューロンは、末梢軸索上の膜イオンチャネルや受容体を介して機械的、熱的、化学的刺激を感知し、中枢軸索を介して脳幹に信号を伝達する。しかし、一次感覚ニューロンは、軸索の神経支配パターン、遺伝子発現、生理学的特性、および機能性の点で高度な不均一性を示す6。さらに、くしゃみは、呼吸器ウイルス、アレルゲン、およびヒトにおいて様々な鼻感覚（例えば、痛みやかゆみ）を誘発する刺激物によって誘発される可能性がある。
くしゃみと同様に、咳も空気の痙攣性排出を特徴とする呼吸反射であるが、主に下気道で起こる。これら2つの呼吸反射は、多くの一般的な気道病原体、アレルゲン、刺激物質（気流、カプサイシン、ヒスタミンなど）によって誘発される。どちらの反射も、気道を傷つける可能性のある物質を排出するメカニズムとして機能する。したがって、くしゃみと咳には共通の感覚受容体が関与していると一般に考えられている。この仮説を検証するためには、くしゃみや咳を媒介する感覚受容体を同定することが重要です。10,11,12,13の研究では、麻酔をかけたマウスは気道に機械的刺激を与えても咳のような反応を示さないことから、マウスに咳反射がないことが示唆されている。対照的に、最近の研究では、アンモニアや二酸化硫黄の吸入により、覚醒マウスで咳様反応が誘発されることが示されている10,11,14。しかし、アンモニアや二酸化硫黄は嗅覚系と上下の気道の両方を刺激し、広範な呼吸器系の変化を誘発するため、これらの結果の解釈を複雑にしている。
本研究では、鼻粘膜は複数の感覚ニューロン集団によって支配されているが、in vivo機能スクリーニングによって、くしゃみを媒介するのは1つの集団（MrgprC11+MrgprA3-）だけであることが明らかになった。興味深いことに、感覚ニューロンの同じ集団は下気道も支配している。咳研究のモデルを開発することで、マウスの咳の特徴的な呼吸パターンと音声パターンを同定し、くしゃみとは異なることを明らかにした。しかし、インフルエンザ感染や化学的に誘発された咳は、MrgprC11+ニューロンを介するものではなかった。その代わりに、くしゃみではなく咳を媒介する個別の感覚集団（ソマトスタチン[SST+]）が存在する。くしゃみと咳のシグナルは、さらに中枢神経経路によって伝達され、調節される。この知見は、くしゃみと咳の間に予期せぬ感覚の違いがあることを明らかにし、呼吸器感染症やアレルギーにおけるくしゃみと咳の管理に、異なる神経細胞の標的を提供するものである。
研究結果
鼻粘膜は複数の感覚ニューロン集団に支配されている。
くしゃみを誘発する神経細胞集団を同定するために、まず鼻粘膜の感覚神経支配を調べた。鼻甲介と鼻中隔を覆う呼吸器上皮は、一次感覚ニューロンによって密に神経支配されている15。われわれの研究では、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーVメンバー1（TRPV1）が鼻の感覚ニューロンに広く発現しており、TRPV1+の感覚ニューロンが、化学物質によって誘発されたくしゃみとアレルギーに関連したくしゃみを媒介することが示されている15。検討した感覚集団のうち、遺伝的軸索追跡により、C線維感覚ニューロンの4つの集団が鼻粘膜を支配していることがわかった。最初の集団はMrgprD+ポリモーダルC線維求心性ニューロンで、機械的な痛みとヒスタミン非依存性のかゆみの両方を媒介する16,17,18。MrgprdEGFPf /+ノックインレポーターマウスによって明らかにされたように、MrgprD+感覚線維は鼻の前部を支配しているが（図1A）、後部は支配していない。くしゃみは鼻の前部と後部の両方の感覚線維によって媒介されるので19、この神経パターンはMrgprD+ニューロンがくしゃみを媒介しないか、あるいは鼻の異なる部分で起こるくしゃみには異なる感覚集団が関与していることを示唆している。
図1. マウスの鼻粘膜は複数の感覚ニューロン集団によって支配されている。
(A）MrgprDを発現するポリモーダルC線維（緑）は、MrgprdEGFPf/+マウスの鼻前部で鼻甲介と鼻中隔を支配している。挿入図は枠で囲んだ部分の拡大図。
(B）SstCre/+；ROSA26tdTomato/+マウスでは、ソマトスタチン（SST）発現のかゆみ感知線維（赤）が鼻甲介を支配している。
(C）TRPM8を発現する冷感線維（緑）は、TRPM8EGFPf /+マウスでは鼻甲介と鼻中隔をまばらに支配している。
(D）MrgprC11+知覚線維（赤）は、Mrgprc11CreERT 2; ROSA26tdTomato/+マウスの鼻壁、鼻甲介、鼻中隔を密に支配している。特に鼻甲介のMrgprC11+神経支配が高い。
(E）Mrgpra 3GFP-Cre；ROSA26tdTomato/+マウスでは、MrgprA3発現かゆみ感知線維（赤）は鼻粘膜を支配していない。
(F）MrgprB4発現C線維触覚求心性神経（赤）は、Mrgprb 4tdTomato-Cre/+マウスでは鼻粘膜を支配していない。
(G)前篩骨神経から逆行性に標識した鼻感覚ニューロンのシングルセルRT-qPCR。各ドットは1つの感覚ニューロンを表す。すべての画像は3つの生物学的複製を代表する。スケールバーは500μmを表す。
番目の集団は、セロトニンとインターロイキン（IL）-31のレセプターを発現し、これらの掻痒物質によって誘発されるかゆみを媒介するSST+感覚ニューロンである20,21。20,21。SST+ニューロンは、SstCre/+; ROSA26tdTomato/+（ SsttdTomato）マウスを用いた遺伝的軸索追跡によって明らかになったように、鼻甲介を支配している（図1B）。中隔と鼻壁にも疎な神経支配が観察された（図1B）。TRPV1+感覚ニューロンによる鼻粘膜の密な神経支配とは対照的に、15 SST+ニューロン神経支配は比較的疎であり、鼻TRPV1+感覚線維の小さなサブセットを構成している。TRPV1+ニューロンの多様なサブセットの中で、くしゃみを媒介するかどうかは不明である。
第三の集団は、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーMメンバー8（TRPM8）を発現する寒冷感覚ニューロンである。TRPM8チャネルは、寒さとメントール（ペパーミントの活性成分22,23,24,25）の両方によって活性化される。26,27。Trpm8EGFPf/+ノックインレポーターマウスによって明らかにされたように、TRPM8+知覚線維は鼻甲介と鼻中隔の上皮内膜をまばらに支配している（図1C）。
第4の集団はMrgprC11+感覚ニューロンである。28,29,30。Mrgprc11CreERT 2; ROSA26tdTomato/+マウス（タモキシフェン処理後はMrgprc11 tdTomatoと呼ばれる）で明らかになったように、MrgprC11+感覚ニューロンは鼻壁、鼻甲介、鼻中隔の粘膜を密に支配している（図1D）。興味深いことに、鼻甲介の神経支配は特に高く、これは鼻甲介が環境刺激に対して超敏感であることの背景にあるかもしれない。鼻粘膜を支配している感覚ニューロンの逆行性追跡から、MrgprC11+感覚ニューロンは鼻感覚ニューロン全体の17.08%±0.76%を占めていることが示された（図S1A-S1D）。
図S1. 図1に関連する鼻MrgprC11+感覚ニューロンの特性解析
(A-D）アレクサ蛍光555（WGA555）を結合させた小麦胚芽アグルチニンを用いた鼻感覚ニューロンの逆行性標識。矢印は三叉神経節の切片で、WGA555（赤、AおよびC）によって標識されたMrgprC11+ニューロン（緑、BおよびC）を示す。(D）MrgprC11を発現するWGA標識鼻感覚ニューロンの割合を示す。
(E）一次感覚ニューロンの分類（Usoskinら20を基に改変）。個別の神経細胞集団の分子マーカーは赤で強調表示されている。複数の感覚細胞集団によるTRPV1の発現は、以前の研究によって明らかにされている（Usoskinら20; Zylkaら84; McCoyら85; Liら86）。
(F）前篩骨神経から逆行性に標識された鼻感覚ニューロンのシングルセルRT-qPCR。鼻TRPV1+感覚ニューロンのサブセットとして、MrgprC11+MrpgrA3-ニューロンは、調べた他の感覚集団のほとんどの分子マーカーを発現していない。MrgprC11+鼻感覚ニューロンのごく一部（11ニューロン中3ニューロン）は、ペプチド作動性PEP1集団の分子マーカーであるTac1を発現している。しかし、PEP1集団はMrgprc11や P2rx3を発現しておらず、MrgprC11+感覚ニューロンとは別個である。各ドットは1個の感覚ニューロンを表す。データは平均値±SEMで示した。すべての画像は3つの生物学的複製を代表する。スケールバーは50μm。
皮膚感覚ニューロンでは、MrgprC11の発現は抗マラリア薬クロロキンを認識するかゆみ受容体であるMrgprA3とほぼ重なっている31,32。驚くべきことに、Mrgpra3GFP -Cre; ROSA26tdTomato/+（ Mrgpra3tdTomato）マウスを用いた鼻では、MrgprA3を発現する感覚線維を見つけることができなかった（図1E）。さらに、MrgprC11+感覚ニューロンのサブセットが、C線維触覚求心性ニューロンの分子マーカーであるMrgprB433を発現していることが研究で示されている34,35,36。しかし、Mrgprb4Cre-tdTomato /+マウスを用いた鼻では、MrgprB4を発現する感覚線維は検出されなかった（図1F）。これらの結果から、鼻のMrgprC11+感覚ニューロンはMrgprA3やMrgprB4を共発現せず、皮膚を神経支配するものとは異なることが示唆される。したがって、その生理的機能を推測することは難しい。
鼻粘膜の感覚神経支配パターンを確認するために、我々は前篩骨神経からの逆行性標識と単一細胞定量的逆転写PCR（RT-qPCR）を行った。遺伝子誘導による軸索追跡とよく相関し、単一細胞RT-qPCRでは、逆行性に標識した鼻感覚神経細胞でMrgprd、Trpm8、Sst、Mrgprc11の発現が認められた（図1G）。対照的に、Mrgpra3や Mrgprb4の発現は検出されず、鼻のMrgprC11+感覚ニューロンは、皮膚を神経支配するニューロンとは異なることが確認された32,33,37。さらに特徴を調べると、鼻のMrgprC11+ニューロンは、調べた他の感覚集団のほとんどの分子マーカーを発現しておらず（図S1EとS1F）、転写レベルでは比較的均質なニューロン集団を構成していることが示唆された。
くしゃみ集団のin vivo機能スクリーニング
くしゃみをコードする鼻感覚集団を同定するために、鼻感覚ニューロンのさまざまな集団を薬理学的あるいは化学遺伝学的に活性化することにより、in vivo機能スクリーニングを行った（図2A）。β-アラニンは、MrgprDを活性化することで痒みやヒリヒリ感をもたらすという副作用を持つ筋肉増強サプリメントである。この所見を確認するため、化学遺伝学的アプローチを用いてMrgprD+ニューロンを活性化した場合の行動学的結果をさらに調べた。我々は、MrgprdCreERT 2/+マウス39と TgCAG-LSL-Gq- DREADD(hM3Dq)マウスを交配することにより、MrgprdCreERT 2/+; TgCAG-LSL-Gq-DREADD(hM3Dq)(Mrgprd-M3)マウスを作製した。Mrgprd-M3マウスのMrgprD+三叉神経細胞によるhM3Dq導入遺伝子の特異的発現は、RNAscopein situハイブリダイゼーションによって確認された（図S2AおよびS2B）。さらに電気生理学的記録を行ったところ、クロザピン-N-オキシド（CNO、hM3Dqリガンド40）を用いた人工Gタンパク質共役型受容体（GPCR）hM3Dqの活性化により、MrgprD+ニューロンの活動電位発火が誘導された（図S2CとS2D）。最後に、CNOの鼻腔内投与によって、これらのマウスの鼻MrgprD+感覚線維を活性化した。β-アラニンアッセイと一致して、CNOを用いたMrgprD+ニューロンの化学遺伝学的活性化はくしゃみを誘発しなかった（図2C）。コントロールとして、CNOの皮内注射は、かゆみに関連したひっかき行動（図S2E）と、最近の研究41で示された痛みに関連した拭き取り行動を誘発し、この化学遺伝学的アプローチをin vivoで検証した。
図2. くしゃみを媒介する神経細胞集団のin vivo機能スクリーニング
(A）鼻感覚ニューロンの様々な集団に対する特異的アゴニスト。
(B）エアロゾル化β-アラニン溶液（MrgprDに対する特異的アゴニスト、100 mM）は、ビヒクルコントロールの生理食塩水と比較して、WTマウスに有意なくしゃみを誘発しなかった。
(C）MrgprDCreERT 2/+；TgCAG-LSL-Gq-DREADD(hM3Dq)（MrgprD-M3）マウスにおいて、クロザピン-N-オキシド（CNO、2nmol、2μL/鼻孔）の鼻腔内投与は、同腹の対照マウスと比較して有意なくしゃみ反応を惹起しなかった。
(D）エアロゾル化LY344864溶液（SST+ニューロンを選択的に活性化する5HT1Fアゴニスト、1mM）は、WTマウスにおいて生理食塩水（ビヒクルコントロール）よりも有意にくしゃみを誘発しなかった。
(E)SstCre/+；TgCAG-LSL-Gq-DREADD(hM3Dq)（SST-M3）マウスにおいて、CNO（2 nmol、2μL/鼻孔）の鼻腔内投与は、同腹のコントロールSstCre /+マウスと比較して、有意なくしゃみ反応を惹起しなかった。
(F）WTマウスでは、冷気（10℃）もメントール溶液（TRPM8アゴニスト、1mM）も有意なくしゃみを誘発しなかった。
(GおよびH）MrgprC11アゴニストBAM 8-22ペプチド（20nmol、2μL/鼻孔）またはNPFFペプチド（2nmol、20nmol、2μL/鼻孔）の鼻腔内投与は、生理食塩水コントロールと比較して、WTマウスに有意なくしゃみ反応を惹起した。
(I）エアロゾル化クロロキン溶液（MrgprA3に対する特異的アゴニスト、12mM）は、WTマウスにおいて、ビヒクルコントロール（生理食塩水）と比較して有意なくしゃみを誘発しなかった。
(J）CNO（2nmol、2μL/鼻孔）の鼻腔内投与は、コントロールのMrgprc 11 CreERT 2マウスと比較して、Mrgprc 11CreERT2; TgCAG-hM3Dq-mCitrineマウス（c11-M3）において有意なくしゃみを誘発した。各ドットは試験した個々のマウスを表す（n= 5-11マウス/群）。データは平均値±SEMで示した。∗ p≦0.05；＊＊＊＊ p≦0.001。
図S2. 図2に関連するMrgprdCreERT 2/+; TgCAG-LSL-Gq-DREADD(hM3Dq)-mCitrine(Mrgprd-M3)マウスの特性解析
(A）タモキシフェン誘導後のMrgprd-M3マウスと対照MrgprdCreERT 2/+マウスの三叉神経節におけるMrgprd（緑）とhM3DqmRNA（赤）のRNAscopein situハイブリダイゼーションを示す代表的な画像。
(B）Mrgprd-M3マウスおよびコントロールMrgprdCreERT2/+マウスにおいて、hM3DqmRNAを共発現するMrgprd +感覚ニューロンの割合を示す。各ドットは個々のマウスを表す。
(C)Mrgprd-M3マウスの培養hM3Dq-mCitrine+およびhM3Dq-mCitrine-三叉神経細胞の全細胞電流クランプ記録。トレースは、浴用クロザピン-N-オキシド（CNO、100μM）に対する神経細胞の反応を代表するものである。
(D）Mrgprd-M3マウスの培養三叉神経細胞におけるCNO反応の定量化（n＝3）。
(E）頬にCNO（20μL中20nmol）を皮内注射すると、Mrgprd-M3マウスではかゆみに関連した掻破行動が強く見られたが、対照マウスでは見られなかった。データは平均値±SEMで示した。∗∗p≤ 0.01. すべての画像は3つの生物学的複製を代表するものである。スケールバーは50μm。
次に、くしゃみにおけるSST+ニューロンの役割を調べた。5-ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体1F（5HT1F）アゴニストであるLy344864は、SST +ニューロンを選択的に活性化し、皮膚にかゆみを引き起こす。この結果を確認するため、Sstcre/+; TgCAG-LSL-Gq-DREADD(hM3Dq)(Sst-M3)マウスを作製した。RNAscopein situハイブリダイゼーションと電気生理学的記録により、Sst-M3マウスのSST+三叉神経細胞でhM3Dqが特異的かつ機能的に発現していることが確認された（図S3A-S3D）。しかし、CNOを用いた鼻SST+感覚線維の化学的活性化では、有意なくしゃみは誘発されなかった（図2E）。対照的に、CNOの皮内注射はSst-M3マウスにかゆみに関連したひっかき行動を誘発した（図S3E）。
図S3. 図2に関連するSstCre/+; TgCAG-LSL-Gq-DREADD(hM3Dq)-mCitrine(Sst-M3)マウスの特性解析
(A）Sst-M3マウスおよびコントロールSstCre /+マウスの三叉神経節におけるSst（緑）およびhM3DqmRNA（赤）のRNAscopein situハイブリダイゼーションを示す代表的な画像。
(B）Sst-M3マウスとコントロールSstCre /+マウスのhM3DqmRNAを共発現するSst+感覚ニューロンの割合を示す。各ドットは個々のマウスを表す。
(C）Sst-M3マウスの培養hM3Dq-mCitrine+およびhM3Dq-mCitrine-三叉神経細胞の全細胞電流クランプ記録。トレースは、浴用クロザピン-N-オキシド（CNO、100μM）に対する神経細胞の反応を代表するものである。
(D）Sst-M3マウスの培養三叉神経細胞におけるCNO反応の定量化（n＝3）。
(E)SstCre/+；TgCAG-LSL-Gq-DREADD(hM3Dq)（Sst-M3）マウスの頬に本薬（CNO、20μL中20nmol）を皮内注射したところ、対照SstCre /+マウスでは認められなかったが、Sst-M3マウスでは有意な痒みに関連した掻破行動が生じた。データは平均値±SEMで示した。∗∗∗P ≤0.001. すべての画像は3つの生物学的複製を代表するものである。スケールバーは50μm。
さらに、くしゃみにおけるTRPM8+寒冷感知ニューロンの役割を調べた。その結果、冷気またはメントールを用いてTRPM8を活性化しても、対照群と比較して有意なくしゃみ反応は誘発されず（図2F）、くしゃみにおけるTRPM8の関与は否定された。このことは、冷気やミントにさらされてもくしゃみがほとんど出ないという臨床観察と一致している26,27。
最後に、MrgprC11+MrgprA3-感覚ニューロンのくしゃみへの関与を調べた。まず、MrgprC11特異的アゴニストであるウシ副腎髄質（BAM）8-22ペプチドに対するくしゃみ反応を調べた42,43。驚くべきことに、BAMはビヒクルコントロールと比較して、野生型（WT）マウスで有意なくしゃみを誘発した（図2G）。さらに、肥満細胞から放出されるMrgprC11活性化神経ペプチドであるニューロペプチドFF（NPFF）44も、用量依存的にくしゃみを誘発した（図2H）。対照として、MrgprA3のアゴニストであるクロロキンは、鼻のMrgprC11+感覚ニューロンがMrgprA3の発現を欠くという我々の観察と一致して、有意なくしゃみを誘発しなかった（図2I）。MrgprC11+感覚ニューロンがくしゃみを媒介することをさらに証明するために、Mrgprc11CreERT 2; TgCAG-LSL-Gq-DREADD(hM3Dq)(Mrgprc11-M3)マウスを作製した。Mrgprc11-M3マウスのMrgprC11+三叉神経細胞によるhM3Dqの特異的かつ機能的発現は、RNAscopein situハイブリダイゼーションと電気生理学的記録によって確認された（図S4）。Mrgprd -M3マウスやSst-M3マウスとは対照的に、CNOを用いて鼻のMrgprC11+感覚線維を化学的に活性化すると、Mrgprc11-M3マウスではくしゃみ行動が顕著に誘発された（図2J）。この結果は、試験した感覚集団の中で、鼻のMrgprC11+MrgprA3-感覚ニューロンがくしゃみを媒介することを示している。
図S4. 図2に関連するMrgprc11CreERT 2; TgCAG-LSL-Gq-DREADD(hM3Dq)-mCitrine(Mrgprc11-M3)マウスの特性解析
(A）タモキシフェン誘導後のMrgprc11-M3マウスとコントロールのMrgprc11CreERT 2マウスの三叉神経節におけるMrgprc11（緑）とhM3DqmRNA（赤）のRNAscopein situハイブリダイゼーションを示す代表的な画像。
(B）Mrgprc11-M3マウスおよびコントロールMrgprc11CreERT 2マウスにおいて、hM3DqmRNAを共発現するMrgprc 11+感覚ニューロンの割合を示す。各ドットは個々のマウスを表す。
(C)Mrgprc11-M3マウスの培養hM3Dq-mCitrine+およびhM3Dq-mCitrine-三叉神経細胞の全細胞電流クランプ記録。トレースは、浴用クロザピン-N-オキシド（CNO、100μM）に対する神経細胞の反応を代表するものである。
(D）Mrgprc11-M3マウスの培養三叉神経細胞におけるCNO反応の定量化（n＝3）。データは平均値±SEMで示した。すべての画像は3つの生物学的複製を代表するものである。スケールバーは50μm。
鼻のMrgprC11+感覚ニューロンはくしゃみの中核集団を構成する。
くしゃみは、ヒトに様々な感覚を引き起こす様々な感覚刺激によって誘発される。例えば、カプサイシン（唐辛子の辛味成分）は強い灼熱痛とくしゃみを引き起こすが、ヒスタミンとセロトニンはかゆみとくしゃみを引き起こす7,8,9。興味深いことに、鼻のMrgprC11+感覚線維は、くしゃみを誘発する多くの刺激（例えば、カプサイシン、ヒスタミン、セロトニン）に対して感受性があり、くしゃみを誘発しない試験済み化学物質に対しては感受性がない（図S5）。したがって、くしゃみを誘発する様々な刺激は、くしゃみ反射を誘発する鼻感覚ニューロン（すなわちMrgprC11+）の共通集団を活性化し、たとえ他の感覚ニューロンを活性化して異なる感覚を誘発したとしても、くしゃみ反射を誘発するという仮説を立てた。我々の仮説を検証するため、MrgprC11+ニューロンの遺伝子破壊が、様々な化学的刺激に対するくしゃみ反応を減弱させるかどうかを調べた。タモキシフェンによるCre-loxP組換え後、霊長類のジフテリア毒素受容体（DTR）はMrgprC 11+感覚ニューロンに特異的に発現する（図3AおよびS6）。この系統（タモキシフェン誘導後はMrgprc 11DTRと呼ばれる）により、ジフテリア毒素を用いてMrgprC11+ニューロンを効率的に切除し（図3A）、くしゃみへの影響を調べることができる。驚くべきことに、MrgprC11+ニューロンの遺伝子破壊は、MrgprC11+ニューロン以外にも多くの感覚ニューロンを活性化する化学刺激物質（カプサイシン、ヒスタミン、セロトニンなど）があるにもかかわらず、試験したすべての刺激物質に対するくしゃみ反応を事実上消失させた（図3Bと3C）。この結果は、鼻のMrgprC11+感覚ニューロンが「くしゃみニューロン」の中核集団を構成し、くしゃみを広く媒介することを示唆している。
図S5. 鼻のMrgprC11+感覚線維は、くしゃみを誘発する様々な刺激に敏感であり、生理学的に定義された集団を構成している。
(A) 全マウント鼻粘膜の代表的な生体外カルシウムイメージングから、鼻MrgprC11+感覚線維（MrgprC11アゴニストNPFF [20 μM]に対する感受性で示される）が、ヒスタミン（His, 10 mM）やカプサイシン（Cap, 10 μM）を含む様々なくしゃみ誘発刺激によって活性化されることが、PirtGCaMP 3/+マウスのGCaMP3の蛍光変化から明らかになった。
(B-E）MrgprC11アゴニストNPFFまたはBAM 8-22（20μM）、およびヒスタミン、カプサイシン、セロトニン（5-HT、100μM）を含む他のくしゃみ誘発刺激による鼻感覚線維の代表的なCa2+過渡変化。棒グラフは、他のくしゃみ誘発刺激によって活性化されたMrgprC11アゴニスト感受性の鼻感覚線維の割合を示す。
(F-I）鼻MrgprC11+感覚線維（BAM感受性で同定）は、β-アラニン（1 mM）、IL-31（300 nM）、メントール（1 mM）、CQ（1 mM）に反応しない。注目すべきことに、これらの化学物質はMrgprC11+ニューロン以外の鼻腔神経細胞集団を活性化するが、マウスに著しいくしゃみを誘発しない（図2参照）。データは平均値±SEMで示した。各ドットはPirtGCaMP 3/+マウス（n= 3-6/群）からの鼻粘膜摘出物を表す。すべての画像は3つの生物学的複製を代表するものである。スケールバー、20μm。
図3. 鼻のMrgprC11+感覚ニューロンはくしゃみの中核集団を構成する。
(A）MrgprC11+感覚ニューロンの遺伝子破壊。MrgprC11+感覚ニューロンを特異的に切除する遺伝子戦略を示す図。代表的な画像は、タモキシフェンを投与したMrgprc11CreERT 2;AviliDTRマウス（MrgprC 11DTRマウスと呼ぶ）の三叉神経節において、ジフテリア毒素（DTX）によりMrgprC11+感覚ニューロンがアブレーションされたことを示している。
(B）MrgprC11+感覚ニューロンの遺伝子破壊は、コントロールのAviliDTRマウスと比較して、MrgprC11アゴニストNPFF（2μL/nostril中20nmol）およびBAM8-22（2μL/nostril中20nmol）に対するくしゃみ反応を消失させた。
(C）エアロゾル化ヒスタミン溶液（His, 100 mM）、セロトニン（5-HT, 1 mM）、カプサイシン（Cap, 12 μM）に対するくしゃみ反応は、コントロールのAviliDTRマウスと比較して、MrgprC11+ニューロンアブレーションマウスでは実質的に消失した。
(DおよびE）急性および慢性アレルギー性鼻炎モデルマウスにおいて、アレルゲン（オバルブミン、0.2mg、2μL PBS/ノストリル中）チャレンジに対するくしゃみ反応は、コントロールのAviliDTRマウスと比較して、MrgprC11+ニューロンアブレーションマウスで有意に減少した。
(F)正常マウスおよびアレルギー性Mrgprc11CreERT 2; ROSA26tdTomato/+マウスの全マウント鼻粘膜の代表的画像。アレルギーマウスにおけるアビジン染色肥満細胞（緑、矢印で示す）の蓄積と脱顆粒に注目。棒グラフは、アレルギーマウスにおけるMrgprC11+感覚線維（赤）と密接に関連した肥満細胞の割合を示す（n= 4鼻粘膜摘出）。
(G）エアロゾル化ヒスタミン溶液（100 mM）により誘発されたくしゃみ反応は、BAM（2 nmol）とQX-314（1％、2 μL）の鼻腔適用により、BAM（2 nmol、2 μL）またはQX-314（1％、2 μL）単独で前処理した対照群と比較して阻害された。
(HおよびI）急性および慢性アレルギー性鼻炎モデルの両方において、アレルゲンであるオバルブミン誘発くしゃみ反応は、BAM（2 nmolを2 μL中）またはQX-314（1％、2 μL）単独で前処理した対照群と比較して、QX-314（1％、2 μL）をBAM（2 nmol）とともに前処理することにより有意に抑制された。各ドットは個々のマウスを表す（n= 6-11マウス/群）。データは平均値±SEMで示した。∗∗p≤ 0.01;p ≤0.001; nsは有意ではない。すべての画像は少なくとも3つの生物学的複製を代表するものである。スケールバーは50μm。
図S6. 図3に関連するMrgprc11CreERT 2;Avil-DTRマウスの特性評価
(A）タモキシフェン誘導後のMrgprc11 CreERT2；Avil-DTRマウスおよび対照Avil -DTRマウスの三叉神経節におけるMrgprC11（緑色）および霊長類ジフテリア毒素受容体（DTR、赤色）の蛍光免疫染色を示す代表的画像。
(B）Mrgprc11CreERT 2；Avil-DTRマウスおよび対照Avil- DTRマウスのDTRを共発現するMrgprC11＋感覚ニューロンの割合を示す。各ドットは個々のマウスを表す。データは平均値±SEMで示した。すべての画像は3生物学的複製を代表する。スケールバー、50μm。
44,45,46,47,48,49我々はさらに、MrgprC11+感覚ニューロンがアレルギー性鼻炎に伴うくしゃみを媒介するかどうかを調べた。急性および慢性アレルギー性鼻炎モデルマウス15を用い、MrgprC11+ニューロンのアブレーションがアレルギー性くしゃみを有意に減少させることを見出した（図3Dおよび3E）。全層免疫染色により、ほとんどの肥満細胞が鼻粘膜のMrgprC11+感覚線維と密接に関連し、アレルゲン負荷時に顆粒を放出することが明らかになった（図3F）。
我々のデータから、鼻のMrgprC11+感覚ニューロンは鼻刺激誘発くしゃみを媒介するだけでなく、アレルギーに関連した病的くしゃみにも必須であり、くしゃみを管理するための神経細胞標的を提供することが明らかになった。これらのニューロンを薬理学的に不活性化し、くしゃみへの影響を調べるため、我々はQX-314と低用量BAMをマウスの鼻腔に共投与した。QX-314は膜不透過性のナトリウムチャネル遮断薬である。QX-314は、BAMによって誘発されたニューロンの興奮時に、開口したイオンチャネルを通してのみ鼻のMrgprC11+感覚線維に入ることができる。QX-314とBAMを用いて鼻MrgprC11+線維をサイレンシングすると、ヒスタミンに対するくしゃみ反応が消失するだけでなく（図3G）、急性および慢性アレルギー性鼻炎に伴うくしゃみも有意に抑制された（図3Hおよび3I）。以上より、本研究は、鼻くしゃみニューロンのサイレンシングによる抗くしゃみ戦略の概念実証となった。
MrgprC11+感覚ニューロンは、インフルエンザに関連したくしゃみを媒介する。
くしゃみは、感冒、インフルエンザ、COVID-19（オミクロン変異体など）を含む多くの種類の呼吸器ウイルス感染症の主要な症状である。インフルエンザ感染モデルマウスは、ウイルス学、肺学、免疫学などの研究に広く用いられてきた。しかし、インフルエンザに関連したくしゃみの研究は不足している。従来のインフルエンザ感染モデルマウスでは、25〜40μLのウイルス溶液を下気道および肺まで経鼻投与する51,52,53。しかし、このモデルでは、おそらく下気道への主要な感染のため、有意なくしゃみを発生させることができなかった。くしゃみは鼻腔感染によって引き起こされるため、少量のインフルエンザウイルスを鼻腔に投与することで、インフルエンザの上気道感染を模倣したマウスモデルを開発した。ウイルス量が5μLと少ないため、ウイルス転写産物量から明らかなように、インフルエンザウイルス感染は鼻粘膜と咽頭に限定された（図4A）。インフルエンザウイルスの免疫染色により、鼻粘膜への高い感染効果が確認されたが、下気道や肺への感染は確認されなかった（図4B）。陰性対照として、紫外線不活化ウイルスは鼻粘膜に感染しなかった（図4B）。
図4. MrgprC11+感覚ニューロンはインフルエンザ関連くしゃみを媒介する
(A）我々のインフルエンザ感染モデルマウスにおいて、インフルエンザウイルスA/PR/8/34は主に鼻粘膜と咽頭に感染した。
(B）免疫染色により、鼻粘膜（B2）のインフルエンザウイルス感染（赤）が示されたが、下気道（気管と肺、B3とB4）には見られなかった。陰性対照として、紫外線不活化ウイルスは鼻粘膜に感染しなかった（B1）。組織はDAPI（青）で対比染色した。
(C）インフルエンザ感染マウスは顕著なくしゃみを示し、そのピークはウイルス接種後36時間であった。陰性対照として、UV不活化ウイルスを感染させたマウスはくしゃみをしなかった。
(D）インフルエンザ感染マウスは体重を適度に減少させたが、よく生存した。コントロールとして、紫外線不活化ウイルスは体重減少を有意に抑制した。
(E）Mrgprc11CreERT 2;AviliDTRマウスにおけるMrgprC11+感覚ニューロンの遺伝子破壊は、AviliDTR同腹仔マウスと比較して、インフルエンザに関連したくしゃみを有意に減少させた。
(F）低用量BAM（2μL中2nmol）を含む1％QX-314溶液を用いた鼻MrgprC11＋ニューロンの薬理学的サイレンシングは、BAM（2μL中2nmol）単独で処置したコントロールと比較して、インフルエンザ関連くしゃみを有意に軽減した。各ドットは、試験した個々のマウスを表す（n= 4-9マウス/群）。データは平均値±SEMで示した。∗p≤ 0.05、p≤ 0.01、p ≤0.001。示した画像はすべて3生物学的複製を代表するものである。スケールバーは200μm。
このモデルでは、感染マウスは顕著なくしゃみを示し、そのピークはウイルス接種後36時間であった（図4C）。このモデルにより、インフルエンザ感染マウスでもヒトと同様にくしゃみが誘発されることが証明された。陰性対照として、紫外線不活化ウイルスを接種したマウスはくしゃみをしなかった（図4C）。さらに、従来のインフルエンザ感染マウスモデル51,53とは異なり、本モデルではマウスの体重減少は緩やかで、生存率も良好であった（図4D）。紫外線で不活化したウイルスは体重減少を有意に少なくし（図4D）、体重減少は主にウイルス感染によるものであることが確認された。
インフルエンザ関連くしゃみにおけるMrgprC11+感覚ニューロンの役割を明らかにするために、タモキシフェンとジフテリア毒素処理後に、Mrgprc 11DTRマウスと対照AviliDTR同腹子にインフルエンザウイルスを感染させた。驚くべきことに、MrgprC11+ニューロンの遺伝子破壊は、コントロールのAviliDTR同腹体と比較して、ウイルス接種後24時間と36時間でくしゃみをほぼ消失させ、48時間でくしゃみを有意に減少させた（図4E）。この結果は、MrgprC11+ニューロンがインフルエンザ関連くしゃみを媒介することを示している。
鼻のMrgprC11+ニューロンは、呼吸器ウイルス感染に伴うくしゃみを緩和するための有望な薬物標的となる。これらのニューロンをサイレンシングするために、インフルエンザウイルス接種24時間後にQX-314と低用量BAMをマウスの鼻腔に共投与した。QXを介した鼻MrgprC11+感覚線維のサイレンシングは、インフルエンザ誘発くしゃみを有意に減弱させた（図4F）。この効果は8時間以上持続した（図4F）。したがって、これらのニューロンの薬理学的サイレンシングは、インフルエンザ感染時のくしゃみを管理するための新規かつ効果的な治療戦略を提供する。
マウスにおける咳モデルの確立
われわれのマウスインフルエンザ感染モデルは、くしゃみ以外の呼吸パターンを誘導する。くしゃみに加えて、咳はヒトにおけるインフルエンザ感染の主要な症状である。我々のマウスモデルでは、咽頭へのインフルエンザ感染が観察された（図4A参照）。この呼吸パターンはマウスの咳を表しているのか、またMrgprC11+感覚ニューロンも咳を媒介するのか、という疑問が生じる。
図5. マウスにおける咳モデルの確立
(A）インフルエンザ感染マウスにおけるくしゃみおよび咳様反応の代表的な呼吸パターン。
(B）非侵襲的気管内投与法を示す図。アンモニア（0.2％、10μL）の気管内投与により、咳様呼吸反応が誘発された。
(C）アンモニア（0.2％、10μL）、クエン酸（0.5M、10μL）およびブラジキニン（10μL中25μg）を含む咳止め剤の気管内投与に対する咳様反応。ビヒクル生理食塩水コントロールは、気管への機械的刺激により軽度の咳を誘発した。
(D）くしゃみと咳様反応の代表的な音声パターン。咳様音には、くしゃみで観察される鋭い音声ピークがない（矢印で示す）。音声スペクトル解析によると、くしゃみ音は咳様音よりも多くの超音波成分（矢印で示す）を示す。
(E）咳様反応は、矢印で示すように、染料を含むアンモニア溶液を気管から咽頭、口へと効果的に排出した（n= 5マウス）。コントロールとして、色素を含む生理食塩水はこのような強力な排出を誘導しない（n = 3マウス）。
(F）リドカイン（1％）を鼻ではなく気管に塗布すると、その後の気管内アンモニア（0.2％、10μL）に対する咳様反応が有意に減少した。
(G)ウイルス感染後の肺線維症は自発的な咳を誘発するが、くしゃみは誘発しない。各点は、試験した個々のマウスを表す（n= 5-8マウス/群）。データは平均値±SEMで示した。∗p≤ 0.05、∗ p≤ 0.001。すべての画像は3生物学的複製を代表するものである。
ビデオS1も参照。
咳の定義とは、空気を放出し、喉（咽頭）や気道から刺激物を取り除くために、突然、力強くハッハッと音を立てることである。私たちは、インフルエンザ感染モデルにおけるくしゃみ以外のパターンが、マウスにおける咳を表していると仮定している。しかし、マウスが咳をするかどうかについては議論がある。10,11,12,13私たちの仮説を検証し、マウスが咳をするかどうかを決定するために、イソフルランで軽く麻酔をかけたマウスの気管に少量の試験溶液を送り込む非侵襲的な方法を開発した（図5B）。試験溶液は鼻腔を迂回して直接気管に送り込まれるため、この新しい方法は鼻の感覚線維（くしゃみなど）や嗅覚によって引き起こされる呼吸反応を最小限に抑えることができる。さらに、従来の気管切開術（首の前面を切開する外科的処置）に比べ、我々のアプローチは非侵襲的である。マウスは処置後すぐに目を覚ますので、自由に動くマウスの呼吸反応をモニターすることができる。
54,55,56,57これらの咳止め剤を気管から投与すると、確かにインフルエンザ感染モデルと同じ呼吸パターンが誘発された（図5Bおよび5C）。さらに、マウスの咳様反応の音声パターンはヒトのそれと類似している58。咳様音にはくしゃみで観察される鋭い音声ピークがない（図5D）。音声スペクトル解析によると、咳様音はくしゃみ音に比べて超音波成分が非常に少ない（図5D）。咳は、病原体、アレルゲン、刺激物を喉や下気道から排出するための重要なメカニズムであるため、我々はさらにマウスの咳様反応の排出効果を調べた。その結果、染料を含むアンモニア溶液（咳止め剤）は気管から咽頭、口へと排出されたが、対照の生理食塩水ではそのような強力な排出は誘導されなかった（図5E）。
観察された反応が咳であることを確認するため、鼻粘膜の感覚線維ではなく、気管を支配する感覚線維によって媒介されるかどうかをテストした。鼻の感覚線維を遮断するために、以前の研究11と同様に、局所麻酔薬であるリドカインを鼻腔に塗布した。アンモニアに対する咳様反応は、リドカインの鼻腔塗布によって影響を受けないことがわかり（図5F）、これらの反応が鼻の感覚線維によって媒介されていないことが確認された。対照的に、リドカインによる気管神経線維の局所遮断は、アンモニアに対する咳様反応を有意に減少させた（図5F）。
呼吸器系ウイルス感染症は、ヒトでも動物でも肺線維症を引き起こすことが多く、慢性的な咳を誘発する59,60。ウイルス感染によって誘発される肺線維症モデルを利用して、我々はマウスで有意な自発的咳反応を見出した（図5G）。一方、有意なくしゃみは観察されなかった（図5G）。この反射は呼吸性感覚線維によって媒介され、痙攣的な空気の排出を特徴とし、気道のクリアランスに不可欠である。
MrgprC11+ニューロンではなくSST+感覚ニューロンが咳を介する
咳を媒介する感覚集団をスクリーニングするために、我々は気管の様々な求心性ニューロン集団の神経支配を調べた。試験した感覚集団の中で、Mrgprc11tdTomatoと Mrgprc11CreER;Rosa26PLAP/+の両レポーター株を用いて、MrgprC11+感覚ニューロンが気管を支配していることを見いだした（図6AとS7）。さらに、SST+感覚ニューロンは気管を密に支配していた（図6Bと S7）。対照的に、MrgprD+ポリモーダルC線維求心性ニューロンとTRPM8+寒冷感覚ニューロンは、鼻粘膜に神経支配があるにもかかわらず、気管を神経支配していない（図6Cと6D）（図1参照）。気管の感覚神経支配パターンは、気道迷走神経感覚ニューロンの逆行性追跡と単一細胞RT-qPCRによって確認された（図6E）。この結果から、鼻と下気道で異なる感覚神経支配パターンが明らかになった。
図6. MrgprC11+ニューロンではなくSST+感覚ニューロンが咳を媒介する。
(AおよびB）MrgprC11+およびSST+感覚ニューロンが気管を支配している（矢印で示す）ことが、それぞれMrgprc11CreERT 2; ROSA26tdTomato/+およびSstCre /+;ROSA26tdTomato/+レポーターラインによって明らかになった。
(CおよびD）MrgprdCreERT2/+; ROSA26tdTomatoおよびTrpm8EGFPf /+レポーター株によって明らかにされたように、MrgprD+ポリモーダルC線維求心性ニューロンおよびTRPM8+低温感知ニューロンは気管を支配していない。
(E)気道逆行性追跡と単一細胞RT-qPCRにより、気道迷走神経感覚ニューロンによるMrgprc11と Sstの発現は確認されたが、Mrgprdと Trpm8の発現は確認されなかった。各ドットは個々の感覚ニューロンを表す。
(F)MrgprC11+感覚ニューロンの遺伝子破壊は、AviliDTR同腹対照と比較して、インフルエンザに関連した咳を減少させなかった。
(G）MrgprC11アゴニストBAM 8-22ペプチド（10μL中100nmol）の気管内投与は、WTマウスにおいて、ビヒクルコントロール（生理食塩水）よりも有意に多くの咳を誘発しなかった。
(H）CNO（10μL中10nmol）の気管内投与は、Mrgprc 11CreERT2；TgCAG-hM3Dq-mシトリン（c11-M3）マウスにおいて、ビヒクルコントロールおよびMrgprc11CreERT 2同腹子コントロールと比較して、有意な咳を誘導しなかった。
(I）シングルセルRT-qPCRにより、気管SST+迷走神経ニューロンによるHtr1fおよびIl31rmRNAの発現が確認された。
(J）LY344864（SST+ニューロンを選択的に活性化する5HT1Fアゴニスト、10μL中10nmol）およびIL-31（10μL中0.04nmol）による気管SST+ニューロンの薬理学的活性化は、ビヒクルコントロール（生理食塩水）よりも有意に多くの咳を誘発した。
(K）CNO（10μL中10nmol）による気管SST+ニューロンの化学原性活性化は、SstCre/+；TgCAG-hM3Dq-mCitrine（Sst-M3）マウスにおいて、SstCre /+同腹子コントロールと比較して有意な咳を誘導した。
(L）MrgprC11+感覚線維（赤、矢印で示す）は、Mrgprc11CreERT 2; ROSA26tdTomato/+レポーターラインによって明らかにされたように、全マウントの咽頭と喉頭を密に支配している。
(中）口腔咽頭誤嚥モデルマウスにおいて、生理食塩水（25μL）の吸引は、気道の機械的刺激により著しい咳を誘発した。BAM8-22溶液（25μL中250nmol）の吸引は、生理食塩水よりも多くの咳を誘発しなかった。陽性対照として、Ly344864溶液（25μL中25nmol）の吸引は、生理食塩水よりも有意に多くの咳を誘発した。(F)-(H)、(J)、(K)および(M)の各点は、試験した個々のマウスを表す（n＝5-9マウス/群）。データは平均値±SEMで示した。∗∗∗p≤ 0.001；nsは有意ではない。すべての画像は3つの生物学的複製を代表するものである。スケアバー、100μm。
図S7も参照。
咳におけるMrgprC11+感覚ニューロンの役割を明らかにするために、まずインフルエンザに関連した咳を調べた。驚くべきことに、インフルエンザに誘発された咳は、MrgprC11+感覚ニューロンの遺伝的切除には影響されなかった（図6F）。咳におけるMrgprC11+感覚ニューロンの役割をさらに調べるため、マウスの気管にBAMペプチドを塗布した。BAMによる気管MrgprC11+感覚線維の薬理学的活性化は、ビヒクルコントロールと比較して有意な咳嗽反応を誘導できなかった（図6G）。MrgprC11+感覚ニューロンが咳を媒介しないことを確認するため、さらに気管MrgprC11+感覚線維の化学的活性化の行動学的帰結を調べた。CNOの気管内投与は、ビヒクルコントロールまたはMrgprc11CreERT 2同腹仔コントロールと比較して、Mrgprc11-M3マウスにおいて有意な咳反応を誘導しなかった（図6H）。これらの結果は、Mrgprc11-M3マウスにCNOを鼻腔内投与すると有意なくしゃみ行動が誘発されるという我々の観察結果（図2参照）とは対照的であり、MrgprC11+感覚ニューロンはくしゃみを選択的に媒介するが、咳は媒介しないことを示している。
MrgprC11+感覚ニューロンに加え、SST+感覚ニューロンも気管を支配している。この集団はくしゃみを媒介しないが（図2参照）、咳は媒介するのだろうか？研究により、SST+感覚ニューロンはセロトニン受容体5HT1FとIL-31受容体を発現し、5HT1FアゴニストLy344864とIL-31によって誘発されるかゆみを皮膚で媒介することが示されている20,21。これらのニューロンの機能を調べるために、気管を支配するSST+ニューロンを選択的に活性化するために、Ly344864とIL-31を気管内に投与した。驚くべきことに、両薬剤ともマウスに顕著な咳を誘発した（図6J）。薬理学的活性化に加えて、化学遺伝学的に気管SST+ニューロンを活性化すると、同腹のコントロールと比較して有意な咳が誘発された（図6K）。これらの結果は、SST+感覚ニューロンが咳を媒介することを示している。
MrgprC11+感覚ニューロンによる気管への神経支配はSST+ニューロンのそれよりも密度が低いので、気管MrgprC11+感覚ニューロンはその神経支配密度のために咳を媒介しないという可能性はないだろうか？咳は、気管や肺だけでなく、咽頭（のど）や喉頭を刺激することによっても誘発される。驚くべきことに、MrgprC11+感覚ニューロンは咽頭と喉頭の両方を密に支配している（図6L）。咽頭と喉頭の感覚線維を活性化するために、強制口呼吸によって試験溶液を気道に吸引する口腔咽頭吸引モデルマウスを利用した61。このモデルでは、生理食塩水の吸引は機械的に誘発される有意な咳を誘発したが、くしゃみは起こらなかった（図6M）。しかしながら、BAM溶液の吸引は、生理食塩水対照よりも多くの咳を誘発しなかった（図6M）。対照的に、Ly344864溶液の吸引は咳を有意に増加させた（図6M）。これらの結果は、気道MrgprC11+感覚線維の活性化が咳を誘発しないことを確認するものである。これらの結果を総合すると、咳とくしゃみを媒介する異なる感覚受容体が明らかになった。
くしゃみと咳は異なる感覚経路によって調節されている。
われわれの以前の研究で、鼻の感覚ニューロンはニューロメジンB（NMB）ペプチドを放出し、脳幹のくしゃみ誘発領域にあるNMB受容体（NMBR）発現後シナプスニューロンを活性化して、くしゃみのシグナル伝達を行うことが示された15。対照的に、気道感覚ニューロンは孤束核（NTS）でシナプスし、咳を媒介する62。くしゃみと咳は別々の解剖学的経路によってコード化され伝達されるが、分子レベルでは共通の神経伝達メカニズムを持っているのだろうか？
この疑問に答えるため、まずMrgprC11+感覚線維が解剖学的・機能的に、脳幹のくしゃみ誘発領域にあるほとんどのNMBR+ニューロンとシナプスしていることを確認した（図7Aおよび7B）。MrgprC11+感覚ニューロンはNMBを発現する三叉神経細胞の小さなサブセットであるが（図S7）、MrgprC11+ニューロンにおけるNmbのコンディショナルノックアウトは、BAMおよびNPFFペプチドに対するくしゃみ反応を消失させた（図7C）。これらの結果は、鼻のMrgprC11+感覚ニューロンがNMBペプチドを放出し、くしゃみのシグナル伝達のためにくしゃみ誘発中枢領域内のNMBR+ニューロンを活性化することを示している。対照的に、マウス気道からの逆行性トレースでは、NTS内の気道感覚ニューロンの中心投射領域にNMBR-GFPニューロンはほとんどないことが明らかになった（図7D）。NMB-サポリンを用いたNMBR+NTSニューロンのアブレーションは、Ly344864またはIL-31に対する咳嗽反応に影響を与えなかった（図7E）ことから、NMB感受性NTSニューロンは咳嗽を媒介しないことが示唆される。
図7. くしゃみと咳は異なる感覚経路によって媒介され、調節される。
(A）脳幹のくしゃみ誘発領域において、MrgprC11+求心性神経（赤）がシナプス前マーカーであるシナプトフィシン1（青）を発現し、NMBR+ニューロン（緑）とシナプス接続していることを示す代表的な画像。シナプス結合は、枠で囲んだ領域の拡大図に矢印で示した。グラフは、くしゃみ誘発領域のMrgprC11+求心性神経にシナプス後接続するNMBR+ニューロンの割合を示す。各ドットは個々のマウスを表す（n= 3）。
(B）BAM8-22ペプチド（100μM）によるMrgprC11+感覚ニューロンの活性化が、くしゃみ誘発領域内で記録された12個のNMBR-GFPニューロンのうち7個において、有意な興奮性シナプス後電位（EPSP）を誘導し、活動電位放電に至ったことを示す代表的なトレース。対照として、TRPM8+寒冷感受ニューロンのメントール（1mM）活性化では、NMBR-GFPニューロンのEPSPを誘導できなかった（記録した6ニューロン中0ニューロン）。
(C）Mrgprc11CreERT 2；Nmbflox/floxマウスは、BAM（2μL生理食塩水中20nmol）およびニューロペプチドFF（NPFF；2μL生理食塩水中20nmol）に対するくしゃみ反応を有意に減少させた。
(D)NmbreGFPマウスの代表的な冠状脳幹切片。WGA-Alexa Fluor 555を用いたマウス気道からの逆行性トレースによって明らかになったように、至陰核（NTS）内の気道感覚ニューロン（赤、矢印で示す）の中心投射帯にNMBR-GFPニューロン（緑）がほとんどないことを示す。グラフは気道中心投射帯内のNMBR-GFPニューロンの数を示す（各ドットは脳幹切片を表す）。DMX：背側運動核。XII：舌下核。
(E）NMB-サポリンをNTSにマイクロインジェクションしても、LY344864（10μL中10nmol）またはIL-31（10μL中0.04nmol）の気管内投与に対する咳嗽反応は有意に変化しなかった。
(F）SST-サポリンをNTSにマイクロインジェクションすると、ブランクのサポリンと比較して有意な自発的咳嗽が誘発された。(C)、(E)、(F)の各ドットは個々のマウスを表す（n= 5-9マウス/群）。データは平均値±SEMで示した。∗∗p≤ 0.01. ∗∗∗p≤ 0.001；nsは有意ではない。すべての画像は3つの生物学的複製を代表するものである。スケールバーは100μm。
図S7も参照。
(AおよびB）鼻粘膜（Aでは矢印で示す、Mrgprc11CreERT2; ROSA26tdTomato/+マウス）および気管（Bでは矢印で示す、Mrgprc11CreERT 2; ROSA26PLAP/+マウス）におけるMrgprC11+感覚線維支配。
(C-F）Alexa Fluor 488を結合させた小麦胚芽アグルチニン（WGA）を用いた気管感覚ニューロンの逆行性標識。矢印は、SstCre/+;ROSA26tdTomato/+レポーターラインの迷走神経節の切片において、WGA（緑）で標識されたSST-tdTomatoニューロン（赤）を示す。グラフはSST-tdTomatoを発現するWGA標識気管感覚ニューロンの割合を示す。
(G-J）MrgprC11+感覚ニューロンはニューロメジンB（NMB）ペプチドを発現する。(G-I)WTマウスの三叉神経節(TG)のV1分裂におけるMrgprc11(緑)とNmbmRNA(赤)のRNAscopein situハイブリダイゼーションを示す代表的な画像。(J)Nmb mRNAを共発現するMrgprC11+感覚ニューロンの割合を示す。各ドットは個々のWTマウスを表す。データは平均値±SEMで示す。すべての画像は3つの生物学的複製を代表するものである。スケールバーは100μm。
SST+気道ニューロンは咳を媒介するので、NTS内のシナプス後ニューロンのサブセットが神経ペプチドSSTに感受性があり、咳に関与していると推測するのは妥当である。我々の仮説を検証するため、NTS内の気道中心投射帯にSST-サポリンをマイクロインジェクションした。驚くべきことに、SST感受性ニューロンのアブレーションは、自発的な咳を有意に増加させた（図7F）。このことは、これらのニューロンが咳のシグナル伝達を阻害する作用を持つことを示唆している。以前の研究では、SSTが抑制性ダイノルフィン・ニューロンを抑制し（脱抑制）、かゆみを促進することが示されている63,64。鼻のSST+ニューロンを薬理学的および化学遺伝学的に活性化しても有意なくしゃみは誘発されないことから（図2参照）、このSST依存性の調節神経経路は、咳には選択的であるがくしゃみには選択的ではないと考えられる。以上の結果から、くしゃみと咳の感覚経路は分子レベルおよび細胞レベルで異なっていることが明らかになった。
考察
くしゃみと咳は、多くの呼吸器ウイルス感染症やアレルギーの主症状である。くしゃみと咳はそれぞれ、鼻と下気道から刺激物、アレルゲン、病原体を排出するための防御機構である。くしゃみと咳は共通の感覚受容体によって引き起こされるという一般的な仮説とは対照的に、われわれはくしゃみと咳を媒介する個別の感覚集団を同定し、それらは軸索の神経支配パターン、分子プロファイル、機能性が異なることを明らかにした。MrgprC11+感覚ニューロンは鼻粘膜を密に支配し、くしゃみを媒介するのに対し、SST+ニューロンは下気道を優先的に支配し、咳を媒介する。さらに、SST+ニューロンは、MrgprC11+ニューロンではなく、IL-31やシステイニルロイコトリエンなどの炎症性メディエーターのレセプターを選択的に発現し20、気道炎症に対して特異的な感受性を示す。研究により、喘息やその他の病的状態において炎症性メディエーター（IL-31やロイコトリエンなど）の発現が上昇することが示されている65,66,67。慢性気道炎症がSST+咳嗽ニューロンの遺伝子発現、軸索神経支配、神経興奮性に及ぼす影響を調べることは興味深い。このことは、喘息、長いCOVID、慢性閉塞性肺疾患（COPD）に伴う病的な咳の研究への扉を開くだろう。
進化的な観点から見ると、くしゃみと咳のニューロン集団は、補完的な感覚監視を提供し、潜在的に有害な物質の検出と物理的クリアランスにおいて優位に立つ可能性がある。例えば、多くの呼吸器系ウイルス（例：インフルエンザ、ライノウイルス）はくしゃみと咳の両方を誘発するが、一部の呼吸器系ウイルス（例：重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）の初期変異型、呼吸器合胞体ウイルス（RSV））は主に咳を誘発する68,69。くしゃみニューロンと咳ニューロンによる二重の感覚監視は、特にウイルスが一方の感覚監視から逃れた場合に、ウイルス感染を検出するための、より広範で効率的なメカニズムを提供する。このことは、呼吸器系ウイルスが急速に進化する中で特に重要である。
マウスで得られた知見をヒトに応用することは重要である。MrgprC11+くしゃみニューロンに関して、霊長類のMrgprX1はMrgprC11アゴニストに感受性があり、マウスのMrgprC11の機能的オルソログである。正常および病的状態におけるヒト鼻粘膜のMrgprX1+感覚線維の神経支配と生理学的特性を研究することは興味深い。さらに、マウスMrgprC11+感覚ニューロンにヒトMrgprX1を発現させ、内因性のマウスMrgprを欠失させたトランスジェニックマウス系統が作製された72。この系統を用いれば、マウスモデルにおいてhMrgprX1受容体とhMrgprX1+ニューロンの機能を研究することができる。これらの研究から得られた結果は、ヒトにおけるくしゃみの研究と治療のための確かな基礎となるだろう。
SST+咳ニューロンについても、同様のトランスレーショナル研究が行われる予定である。ヒト感覚ニューロンのシングルセルシークエンシングから、SST発現は、IL-31受容体サブユニット（IL31RAと OSMR）およびヒスタミン受容体（HRH1）も発現する神経細胞クラスターを示すことが示され、マウスやサルのSST+侵害受容性／掻痒受容性集団と一致している73,74,75,76,77。しかし、マウスSST+ニューロンとは異なり、ヒトSST+ニューロンは、HTR1Fの代わりにカルシトニン遺伝子関連ペプチドCGRP（CALCA）とセロトニン受容体HTR3Aを発現し、システイニルロイコトリエン受容体2（CYSLTR2）を発現しない。 73,74,75,76,77正常および疾患条件下でのヒト気道組織におけるSST+感覚線維の神経支配と生理学的特性を明らかにすることは、咳嗽への関与を明らかにし、ヒトにおける咳嗽の神経生物学的理解を深めるのに役立つであろう。
くしゃみや咳のニューロンを標的とすることは、アレルギーや呼吸器ウイルス感染症における症状管理のための安全で効率的な戦略となる。第一に、この戦略では、感覚細胞集団に特異的に沈黙させるので、他の神経細胞集団、杯細胞、腺、気道上皮の機能には影響を与えない。これにより、気道の乾燥、出血、感染など、従来の抗ヒスタミン薬やコルチコステロイドによく見られる好ましくない副作用を回避することができる。また、治療試薬を鼻や気道に投与することで、全身的な副作用も最小限に抑えることができる。第二に、BAMとQX-314の併用による鼻のくしゃみニューロンのサイレンシングの概念実証研究により、この治療戦略の実行可能性と有効性に関する重要な前臨床エビデンスが得られた。同じ戦略が咳の管理にも応用できる。SST+咳ニューロンは、マウスではLy344864、ヒトではHTR3AアゴニストのようなSSTニューロン選択的アゴニストとともにQX-314を気管内投与することによりサイレンシングすることができる。さらに、ヒトのSST+ニューロンは、アトピー性皮膚炎やその他のアトピー性疾患の病態生理に関与するサイトカインであるIL-31の受容体を選択的に発現している65。臨床試験では、ヒト化抗IL-31RAモノクローナル抗体（CIM331、ネモリズマブ）がアトピー性皮膚炎患者のそう痒症を有意に緩和することが示されている。これらの研究を総合すると、くしゃみや咳の神経基盤が明らかになり、アレルギーや呼吸器ウイルス感染症における症状管理のための薬物標的が同定された。
研究の限界
咳は、機械的刺激と化学的刺激の両方によって誘発される可能性があり、それぞれ結節Aδ線維と気管支肺C線維によって検出されることが示唆されている。しかし、これらのニューロンが咳を媒介する唯一の神経細胞集団である可能性は低い。ある研究では、TRPV1+知覚線維（SST+線維を含む）のカプサイシン脱感作は、モルモットの化学的咳嗽を消失させたが、機械的咳嗽には影響しなかった。モルモットでの先行研究によると、結節性Aδ線維集団は穿刺性の機械的刺激に極めて敏感である62,82。SST+C線維性咳ニューロンとは異なり、結節性Aδ線維はブラジキニンやカプサイシンなどの侵害刺激に鈍感である。我々の咳嗽行動モデルやマウス遺伝学的ツールを用いて、有髄感覚ニューロンの多様なサブセットの中からAδ咳嗽ニューロンをスクリーニングし、分子プロファイル、生理学的特性、機能性、回路において、これらをSST+C線維咳嗽ニューロンとさらに比較することは興味深い。
リソース
リード連絡先
リソースや試薬に関する詳細な情報やリクエストは、リードコンタクトであるQin Liu(qinliu@wustl.edu)までお願いします。
材料の入手可能性
本研究では、新しいユニークな材料や試薬は生成していない。
データおよびコードの利用可能性
-本論文では、ヌクレオチド配列決定関連データセット、プロテオミクス、ペプチドミクス、メタボロミクス、生体高分子の構造、低分子結晶構造解析は報告しない。
-本論文ではオリジナルコードは報告しない。
-本論文で報告されたデータに関する追加情報は、要望があれば主担当者から入手可能である。
謝辞
Xinzhong Dong氏、Brian S. Kim氏、Ru-Rong Ji氏には原稿に対する洞察に満ちたコメントを、Fengrui Zhang氏には音声解析を手伝っていただいた。本研究は、米国国立衛生研究所（R01AI163146、R01EY024704、R01EY035261）およびPew Scholar Award（Q.L.に授与）の支援を受けた。L.H.は米国国立衛生研究所の助成金（R01HL141269）の支援を受けている。M.J.H.は、米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）からの助成金（National Heart, Lung, and Blood InstituteR35-HL145242; National Institute of Allergy and Infectious DiseasesR01 AI130591; Department of Defense TTDAW81XWH2010603andW81XWH2210281）の支援を受けている。
著者貢献
H.J. 鼻組織の組織化学研究、前篩骨神経（AEN）からの逆行性標識、シングルセルRT-qPCRおよびデジタルPCRのための組織およびシングルセルの分離、くしゃみ行動研究、ex vivoカルシウムイメージング、ホールセルパッチクランプ記録、インフルエンザ感染モデル、ホールマウント組織化学染色を実施、 咳行動研究、肺線維症研究、急性および慢性アレルギー性鼻炎モデル、感覚神経節および脳幹の免疫蛍光染色、脳幹スライス作製と電気生理学的記録、データ解析に携わり、原稿の準備と執筆にも参加した。H.C.は、鼻組織の組織化学的研究、逆行性標識と遺伝的軸索追跡、シングルセルRT-qPCRとデジタルPCR、くしゃみ行動研究、RNAscopein situhybridization、インフルエンザ感染モデル、咳行動研究、感覚神経節と脳幹の免疫蛍光染色、データ解析を行い、原稿作成に参加した。M.C.はSST-サポリンおよびNMB-サポリンを用いた神経細胞切除を行った。F.L.は逆行性標識と遺伝的軸索追跡、免疫蛍光染色、くしゃみ行動研究、データ解析を行った。X.S.は、AENからのインフルエンザ感染モデルと逆行性標識の開発に協力した。C.J.G.はシングルセルRT-PCR、デジタルPCR、RNAscopein situハイブリダイゼーション、データ解析を行い、原稿作成と執筆に参加した。G.E.H.はデジタルPCRアッセイ、くしゃみ行動研究のデータ収集と解析、RNAscopein situhybridizationを行った。Y.Z.は気管の遺伝的軸索追跡を行った。L.H.はトランスジェニックマウス系統MrgC11CreERの特性解析、遺伝的軸索追跡を行い、原稿作成に参加した。K.W.は肺線維症モデルを作成し、原稿作成に参加した。M.J.H.はくしゃみと咳の研究に知的貢献をし、原稿作成に参加した。Q.L.はすべての実験を計画・指示し、論文を執筆した。
利益申告
M.J.H.は、この研究とは無関係に競合しない経済的利益を有しており、NuPeak Therapeutics Inc.の創設者である。
STAR★メソッド
主要資源表
試薬またはリソースソース識別子
抗体
マウス抗インフルエンザウイルス核タンパク質 Abcam Cat#ab20343; RRID: AB_445525
ヤギポリクローナル抗 tdTomato SICGEN Cat#AB8181-200; RRID: AB_2722750
ウサギ ポリクローナル抗 MrgprC11 Proteintech Group Cat#S3893-2
ヒト HB-EGF (DTR) 抗体 R&D Systems Cat#AF-259-NA; RRID: AB_354429
ニワトリ抗 GFP Aves Cat#GFP-1020; RRID:AB_2307313
ヤギ抗 WGA Vector Laboratories Cat#AS-2024; RRID: AB_2315608
モルモット抗シナプトフィシン 1 シナプスシステム Cat#101004; RRID: AB_1210382
ヤギ抗ウサギ IgG-Alexa Fluor-488 Invitrogen Cat#A11008; RRID:AB_143165
ヤギ抗ウサギ IgG-Alexa Fluor-555 Invitrogen Cat#A21429; RRID:AB_2535850
ロバ抗マウス IgG (H+L)-Alexa Fluor™ 594 Invitrogen Cat#A21203; RRID:AB_141633
Alexa Fluor® 488 AffiniPure F(ab')₂ Fragment ロバ抗ニワトリ IgY (IgG) (H+L) Jackson Immuno Research Cat#703546155; RRID:AB_2340376
Alexa Fluor® 488 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Jackson Immuno Research Cat#705545147; RRID:AB_2336933
Cy™3 アフィニピュア ロバ抗ヤギ IgG（H+L） Jackson Immuno Research Cat#705165147; RRID:AB_2307351
Cy™5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig IgG (H+L) Jackson Immuno Research Cat#706175148; RRID:AB_2340462
細菌およびウイルス株
インフルエンザ A ウイルス（IAV） A/PR/8/34 株 Michael J.Holtzman53 N/A
インフルエンザAウイルス（IAV）A/PR/8/34株 ATCC VR-95またはVR-95PQ
センダイウイルス（SeV）Sendai/52 Fushimi ATCC VR-105 株
化学物質、ペプチド、組換えタンパク質
β-アラニン Sigma Cat#A9920; CAS: 107-95-9
Ly344864 塩酸塩 Sigma Cat#SML0556; CAS: 1217756-94-9
メントール Sigma Cat#M2780; CAS: 2216-51-5
クロロキン Sigma Cat#C6628; CAS: 50-63-5
カプサイシン Sigma Cat#M2028; CAS: 404-86-4
ヒスタミン二塩酸塩 Sigma Cat#H7250; CAS: 56-92-8
セロトニン Sigma Cat#H9523; CAS: 153-98-0
BAM (8-22) トクリス Cat#1763; CAS: 412961-36-5
ニューロペプチド FF Bachem Cat#H-5655.0001; CAS: 99566-27-5
ニューロペプチド FF Tocris Cat#3137; CAS: 99566-27-5
クロザピン-N-オキシド Tocris Cat#4936; CAS: 34233-69-7
タモキシフェン Sigma Cat#T5648; CAS: 10540-29-1
ジフテリア毒素 リストラボ Cat#150
オバルブミン Sigma Cat#A5503; CAS: 9006-59-1
アンモニア Sigma Cat#1054221000; CAS: 1336-21-6
クエン酸 Sigma Cat#251275; CAS: 77-92-9
ブラジキニンSigma Cat#B3259; CAS: 6846-03-3
IL-31 PeproTech Cat#200-31
エバンスブルー Sigma Cat#E2129; CAS: 314-13-6
ソマトスタチン-ビオチン標識 Phoenix Pharmaceuticals Cat#B-060-03
ストレプトアビジン-ZAP Advanced Targeting Systems Cat#IT-27
NMB-saporin Advanced Targeting Systems Cat#IT-70
ブランク-サポリン Advanced Targeting Systems Cat#IT-21
QX-314 Sigma Cat#L5783; CAS: 21306-56-9
Absolute Q DNA デジタル PCR マスターミックス Applied Biosystems Cat#A52490
コーンオイル Sigma Cat#C8267; CAS: 8001-30-7
アビジン Sigma Cat#189727
BCIP Sigma Cat#B6149; CAS: 102185-33-1
NBT Sigma Cat#N6876; CAS: 298-83-9
ウシ血清アルブミン Fisher BioReagents Cat#BP9706-100
DAPI Fluoromount-G Southern Biotech Cat#0100-20
Fluoromount-G Southern Biotech Cat#0100-01
インジェクトミョウバン ThermoFisher Scientific Cat#77161
オパール 520 アコヤバイオサイエンス Cat#FP1487001KT
オパール 570 アコヤバイオサイエンス Cat#FP1488001KT
PowerSYBR Green PCR マスターミックス Applied Biosystems Cat#4367659
シングルセル溶解バッファー/溶解エンハンサー Invitrogen Cat#11739-010
Trizol Invitrogen Cat#15596026
WGA-Alexa Fluor 488 分子プローブ Cat#W11261
WGA-Alexa Fluor 555 分子プローブ Cat#W32464
HBSS ギブコ Cat#14175079
ディスパーゼ Gibco Cat#17105041
コラゲナーゼ ギブコ Cat#17100017
DMEM/F12 ギブコ Cat#11330032
重要な市販アッセイ
高容量 cDNA 逆転写キット Applied Biosystems Cat#4368814
RNAscope Multiplex Fluorescent V2 Assay キット ACD Bio Cat#323100
Superscript III CellsDirect RT-PCR キット Invitrogen Cat#18080-300
実験モデル 生物／株
マウス C57BL/6J ジャクソン研究所 Stock#000664
マウス Aviltm1(HBEGF)Phep/Cnrm(AviliDTR+) European Mouse Mutant Archive EMMA ID: 10409
マウス B6N.129S1-Mrgprb4tm3(cre)And/J The Jackson Laboratory Stock#021077
マウス B6;129S6-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J The Jackson Laboratory Stock#007905
マウス B6N;129-Tg(CAG-CHRM3∗,-mCitrine)1Ute/J ジャクソン研究所 Stock#026220
マウス B6N.Cg-Ssttm2.1(cre)Zjh/J ジャクソン研究所 Stock#018973
マウス B6;129-Gt(ROSA)26Sortm2Nat/J ジャクソン研究所 Stock#009253
マウス マウス:Mrgpra3GFP-cre XinzhongDong31 N/A
マウス Mrgprc11CreERT2 LiangHan87 N/A
マウス マウス:MrgprdCreERT2/+ Penn Gene Targeting Core and Laboratory (PGT) at the University of Pennsylvania N/A
マウス MrgprdEGFPf/+ David JAnderson84 N/A
マウス Nmbflox/flox セントルイス・ワシントン大学分子遺伝学コア N/A
マウス NmbreGFP Zhou-fengChen88,89 N/A
マウス PirtGCaMP3/+ XinzhongDong90 N/A
マウス Trpm8EGFPf/+ GinaStory91 N/A
オリゴヌクレオチド
デジタルPCR用プライマーおよびプローブ N/A
プライマー：InfA Forward： GTGCAGATGCAACGGTTCAA Thermofisher Custom
プライマー：InfA Reverse： AGACTTTGGCACTCCTTCCG サーモフィッシャー カスタム
InfAプローブ ABY-AGGCCCTCCTTTCAGTCCGT-QSY Thermofisher Custom
mm Actb Taqman assay (FAM/MGB) サーモフィッシャー TAQMAN MM01205647_G1
RNAscope プローブ - Mm-Mrgprx1 ACD Bio Cat#488771
RNAscope Probe - Mm-Nmb-C2 ACD Bio Cat#459931-C2
RNAscope プローブ - Mm-Mrgprd ACD Bio Cat#417921
RNAscope プローブ - Hs-CHRM3-No-XMm-O1-C2 ACD Bio Cat#1071861-C2
RNAscope プローブ - Mm-Sst-O1 ACD Bio Cat#482691
シングルセルRT-qPCR用プライマー、表S1 参照。
ソフトウェアおよびアルゴリズム
FinePointe™ ソフトウェア DSI 007898-001 Rev03
Audacity Audacity Teamhttps://www.audacityteam.org/
MATLAB Mathworkshttps://www.mathworks.com/products/matlab.html
pCLAMP 10.5 Molecular Deviceshttps://support.moleculardevices.com/s/article/Axon-pCLAMP-10-Electrophysiology-Data-Acquisition-Analysis-Software-Download-Page
Prism 9 グラフパッドhttps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
その他
Absolute Q Digital PCR System Applied Biosystems N/A
StepONE リアルタイム PCR システム Applied Biosystems N/A
ホールボディプレチスモグラフィーシステム DSI 601-1400-001 Rev11
超音波ネブライザー DSI 08271-001
クライオスタット Leica CM-1950
C2 コンフォーカルシステム Nikon N/A
実体顕微鏡 ZEISS SteREO Discovery.V12
脳定位固定装置 Leica 39477001
バイブラトーム Leica VT1200 S
ビデオカメラ Canon VIXIA HFG10
マイクロピペットプーラー Sutter Instrument P-1000
MultiClamp 700B アンプ Molecular Devices N/A
ホウケイ酸ガラスキャピラリー World Precision Instruments 1B150F-4
実験モデルおよび研究参加者の詳細
マウス系統
C57BL/6J 野生型（Stock#: 000664）、B6N.129 S1-Mrgprb4tm3(cre)And/J（Stock#：021077）、B6;129S6-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J（ROSA26tdTomato；Stock#：007905）、B6N.Cg-Ssttm2. 1(cre)Zjh/J（Stock#：018973）、B6N;129-Tg(CAG-CHRM3∗,-mCitrine)1Ute/J（Stock#：026220）、B6;129-Gt(ROSA)26Sortm2Nat/J（ROSA26IAP、Stock#：009253）マウスはJackson Laboratoryから取り寄せた。Aviltm1(HBEGF)Phep/Cnrm(AviliDTR+, EMMA ID: 10409)マウスはEuropean Mouse Mutant Archive (EMMA)から取り寄せた。MrgprdEGFPf/+マウスはCalifornia Institute of TechnologyのDavid J Anderson博士から入手した。MrgprdCreERT2/+マウスはペンシルバニア大学のPenn Gene Targeting Core and Laboratory (PGT)により作製された。Trpm8EGFPf/+マウスは、Gina Story博士がWashington University Pain Centerに勤務していたときに贈られた。Mrgpra3GFP-creおよびPirtGCaMP 3/+マウスは、ジョンズ・ホプキンス大学のXinzhong Dong博士から寄贈された。Mrgprc11CreERT2マウスは、Liang Han博士がジョンズ・ホプキンス大学のXinzhong Dong博士の研究室に勤務していたときに作製した。Nmbflox/floxマウスは、Washington University in St.LouisのMolecular Genetic CoreがEuropean Conditional Mouse Mutagenesis Program (EUCOMM)から入手したES細胞を用いて作製した。NmbreGFPマウスは、Zhou-Feng Chen博士がセントルイスのWashington University School of Medicineに勤務していたときのものである88,89。行動実験に用いた動物は、B6/Jバックグラウンドに戻し交配した。この研究で使用されたすべてのマウスは、12時間：12時間の明暗サイクルで温度と湿度が制御されたビバリウムで飼育され、餌と水は自由に摂取できた。すべての動物実験は、セントルイスにあるWashington University School of MedicineのInstitutional Animal Care and Use Committeeによって承認されたプロトコールのもとで行われた。
方法の詳細
鼻組織の組織化学的研究
マウスをケタミン/キシラジンで麻酔し、氷冷PBSとPBS（w/vol）中4％パラホルムアルデヒド（PFA）で経心灌流した。鼻を解剖し、氷上で4％PFAに2時間後固定した。その後、鼻組織を30％スクロース/PBS中EDTA溶液（250mM）中、4℃で2日間、12時間ごとに緩衝液を交換しながら脱灰した。脱灰後、鼻腔組織をOCT（Sakura, 4583）に包埋し、OCTの鼻腔内への浸透を促進するために真空チャンバー内に2時間保持した。その後、包埋した鼻組織を凍結し、Leica CM-1950クライオスタットを用いて30μmで切片化した。
免疫染色のために、鼻の切片をPBST（0.2％Triton X-100を含むPBS）中の10％ロバ血清で1時間ブロックし、一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートした。洗浄後、切片を二次抗体と室温で2時間インキュベートした。一次抗体：ニワトリ抗GFP（Aves, GFP-1020; 1:1000希釈）、ヤギポリクローナル抗tdTomato（SICGEN, AB8181-200; 1:1000）、マウス抗インフルエンザAウイルス核タンパク質（Abcam, ab20343; 1:1000）。二次抗体 Alexa Fluor® 488 AffiniPure F(ab')₂ Fragment Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L) (Jackson ImmunoResearch, 703546155; 1:500), Cy™3 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch, 705165147; 1:500), Donkey anti-Mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor™ 594 (Invitrogen, A21203; 1:1000). 染色後、切片をFluoromount-Gを用いてマウントし、Nikon C2共焦点システムを用いて画像化した。
鼻粘膜からの逆行性標識
ケタミン／キシラジン麻酔した成体マウスを実体顕微鏡下に置き、細いガラスキャピラリーを用いて約2μlのWGA-Alexa Fluor 555（PBS中5mg/ml）を鼻粘膜に直接注入した。マウスは注入の2日後に免疫蛍光染色に使用された。
前篩骨神経（AEN）からの逆行性標識
簡単に言うと、動物をケタミン／キシラジンで麻酔し、顕微鏡下で開頭して前頭蓋窩を露出させた。右側のAENを同定し（鼻粘膜に入る前に右嗅球の下外側に沿って走行）、約500nlのWGA-Alexa Fluor 488（PBS中5mg/ml、Molecular Probes社、Cat#W11261）またはWGA-Alexa Fluor 555（PBS中5mg/ml、Molecular Probes社、Cat#W32464）を細いガラスキャピラリーを用いて神経線維に注入した。注入の2日後、マウスの三叉神経節を単一細胞のRT-qPCRまたは免疫蛍光染色に用いた。
気管からの逆行性標識
マウスをケタミン／キシラジンで麻酔し、仰臥位にした。頸部前面を切開し、気管を露出させた。WGA-AlexaFluor488またはWGA-AlexaFluor555（PBS中5mg/ml）を、細いガラスキャピラリーを用いて気管に沿った4つの個別の部位に注射した（約500nl/部位）。注入3日後、マウスの迷走神経知覚神経節をシングルセルRT-qPCRまたは免疫蛍光染色に用いた。
シングルセルRT-qPCR
AENまたは気管からの逆行性標識後、三叉神経節および迷走神経感覚節を回収し、解離させ、15％BSA密度勾配カラムで精製した。WGAマークを付けたニューロンを、蛍光顕微鏡を用いて視覚的に同定し、手作業で単離し、1μlの溶解エンハンサー（Invitrogen 11739-010）とRNase阻害剤（Invitrogen 18080-300）を加えた溶解バッファー10μlを入れたPCRチューブに回収した。単離したニューロンを直ちにドライアイスで凍結し、cDNA合成まで-80℃で保存した。
単一ニューロンからのcDNAは、Invitrogen SuperScript III CellsDirect cDNA Synthesis Kit (Invitrogen, 18080-300)を用いて、メーカーが提供するプロトコールに従って作成した。すべてのサンプルはDNase処理を行った。リアルタイムPCRは、2μlのcDNAとPowerSYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems 4367659）を用いて、Applied Biosystems StepONEシステムで行った。感覚神経節全体の溶解液から得たcDNAを陽性対照として用いた。単一神経細胞ゲノム DNA を陰性対照として用いた。すべての遺伝子発現値は、2-（Ct(target Gene) - Ct(Gapdh)）を用いて計算したGapdhに対して正規化されている。遺伝子特異的プライマーは表S1に示す。
くしゃみ行動研究
マウスのくしゃみ行動は、Buxco Small Animal Whole Body Plethysmography System (DSI, 601-1400-001 Rev11)を用いて、我々の過去の論文15から適応したプロトコルで記録した。くしゃみを誘発するために、化学物質をネブライザー(DSI, 08271-001)で試験室に噴霧するか(2分間で300μl)、動物の鼻孔にピペットで注入した。記録室の給水口に氷を入れ、局所温度が10℃前後に安定するように冷気を投与した。くしゃみ反応を5分間または10分間記録し、FinePointe™ Software（DSI、007898-001 Rev03）を用いて解析を行った。
噴霧した化学物質 β-アラニン（Sigma, A9920, 100 mM）、5HT1FアゴニストLy344864塩酸塩（Sigma, SML0556, 1 mM）、メントール（Sigma, M2780, 1 mM）、 クロロキン（シグマ、C6628、12 mM）、カプサイシン（シグマ、M2028、12 μM）、ヒスタミン（シグマ、H7250、100 mM）、セロトニン（シグマ、H9523、1 mM）。
ピペッティング試薬： BAM（TOCRIS、1763、2μl生理食塩水中20nmol）、NPFF（BACHEM、H-5655.0001またはTOCRIS、3137、2μl生理食塩水中2または20nmol）、およびClozapine-N-Oxide（TOCRIS、4936、2μl、0.5％DMSO生理食塩水中1mM）。
解離した三叉神経細胞の全細胞パッチクランプ記録
三叉神経節（TG）を成体マウスから採取し、HBSS（Gibco, 14175079）に入れた。その後、三叉神経節をディスパーゼ（4U/ml, Gibco, 17105041）とコラゲナーゼ（342U/ml, Gibco, 17100017）を用いて、HBSS中、37℃で30分間消化した。酵素消化後、TGニューロンを穏やかにトリチュレーションして解離させ、ペレット化して再懸濁した。ニューロンをポリ-D-リジンとラミニンでコートしたカバースリップに播種し、10％FBSと抗生物質を添加したDMEM/F12培地（Gibco, 11330032）中で、空気95％、二酸化炭素5％の加湿インキュベーター中、37℃で24～48時間培養した。
全細胞電流クランプ記録は、MultiClamp 700BアンプとpCLAMP 10.5ソフトウェア（Molecular Devices）を用いて行った。パッチピペットは、ホウケイ酸ガラスキャピラリー（1B150F-4、World Precision Instruments）からP-1000水平プーラー（Sutter Instrument）を用いて引き抜いた。パッチピペットの抵抗は、内溶液で満たされたとき3-5 MΩであった。内部溶液は以下のものを含んでいた（単位はmM）： K+-gluconate 120, KCl 30,MgCl22, HEPES 10, MgATP 2,CaCl21, EGTA 11, pHはTris-baseを用いて7.2に調整した。記録中、ニューロンを取り付けたカバースリップは、室温（22±2℃）で、（mM単位で）以下を含む外部溶液中に維持された： NaCl 145、KCl 3、CaCl2 2、MgCl2 2、グルコース10、HEPES 10、pH 7.4。安定化後、静止膜電位（RMP）を記録し、RMPが-45mVを超えるニューロンは試験から除外した。
かゆみ行動試験
つまり、8～12週齢のトランスジェニックマウスと対照同腹子を、本薬-N-オキシド（20μl、1mM、0.5％DMSO生理食塩水）を右頬に皮内注射した。その後、試験動物を単独で試験室に入れ、撮影を行った。後肢を注射部位に向けたひっかき傷を30分間採点した。
カルシウムイメージング
鼻腔摘出片のホールマウントカルシウムイメージングのために、3～5週齢のPirtGCaMP 3/+マウスから鼻腔粘膜を急速に剥離し、氷冷外液中で、以下を含む（単位：mM）： NaCl 145、KCl 3、CaCl2 2、MgCl2 2、グルコース10、HEPES 10、pH 7.4を含む氷冷外液に浸し、室温で20分間静置した。その後、剥離した摘出片を記録チャンバーに移し、外液で10分間連続灌流した。カルシウムシグナルは、Nikon Ti-E 倒立顕微鏡とPhotometrics CoolSnap HQ2 CCDカメラ（Tucson, AZ）を用いて取得した。化学物質は、重力ベースのデリバリーシステム（ヒスタミンとカプサイシン）を通して記録チャンバーに灌流されるか、あるいはバスで塗布された（セロトニン、NPFF、BAM）。鼻感覚線維は、Nikon NIS Elements ARを用いて可視化し、解析した。反応は、GCaMP3蛍光強度（ΔF/F0）の5％以上の増加として定義された。
インフルエンザ感染モデル
インフルエンザAウイルス（IAV）A/PR/8/34株は、ATCC（VR-95またはVR-95PQ）またはWashington University School of MedicineのPulmonary and Critical Care MedicineのMichael J. Holtzman博士から入手した。野生型C57BL/6Jマウス（5～6週齢）をケタミン/キシラジンで麻酔し、IAVを接種した（5μl/鼻孔中1500PFU）。対照群では、WTマウスに同量のUV不活化ウイルスを接種した。ウイルス接種後、各指定時点（12時間、24時間、36時間、48時間、60時間、72時間）で40分間の自発的くしゃみ行動をWBPで記録した。体重は毎日測定した。
MrgprC11+ニューロンを消失させるため、Mrgprc11CreERT 2+;AviliDTR/+マウスおよび対照同腹子AviliDTR/+に、コーン油（Sigma, C8267）に溶解した40mg/kgのタモキシフェン（Sigma, T5648）を、P21頃から6日間連続で経口経口投与した。タモキシフェン投与終了3週間後、マウスに生理食塩水に40μg/kgのジフテリア毒素（DTX、List labs、150）を2回（3日間隔）腹腔内注射した。DTX処置の3週間後、上記のようにマウスにIAVを接種した。
MrgprC11+鼻感覚線維を薬理学的に沈黙させるため、1% QX-314 (Sigma, L5783)を含むか含まないBAM (2 nmol)を含む溶液2μlを、接種後24時間に被検マウスの各鼻孔に注入した。30分後、4時間後、8時間後、12時間後のくしゃみ行動を記録した。
デジタルPCR
IVA感染後36時間に鼻粘膜、咽頭、喉頭、気管および肺を採取し、重量を測定した。Trizol（Invitrogen, 15596026）を用いて全RNAを単離し、50μlのRNaseフリー水に溶解した。Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, 4368814)を用いて、各サンプル1μlのRNAを製造元の指示に従って逆転写した。cDNAを1:50に希釈し、希釈したcDNAの1μlを10μlのdPCR反応に用いた。デジタルPCRはApplied Biosystems Absolute Q DNA Digital PCR Master Mix (A52490)とQuantStudio Absolute Q dPCR Systemを用いて行った。ネガティブコントロールとしてゲノムDNAを用いた。プライマーとプローブはkey resources tableに記載されている。
ホールマウント組織化学染色
蛍光レポーターマウスをケタミン／キシラジンで麻酔し、氷冷PBSで経心的に灌流した後、PBS中の4％PFA（w/vol）で灌流した。鼻甲介、鼻壁粘膜、口腔咽頭、喉頭蓋、喉頭および気管を注意深く剥離し、氷上で4％PFAに15～30分間後固定した。蛍光tdTomatoまたはGFPイメージングのため、鼻腔組織をPBSで洗浄後、Fluoromount-Gを用いて直接マウントし、Nikon C2共焦点システムを用いて画像化した。
PLAPホールマウント組織化学染色は、以前に記載されたように行った87。簡単に述べると、成体Mrgprc 11CreERT2;ROSA26IAP/+マウスを上記のように4％PFAで灌流し、気管を解剖し、4％PFA中で4℃、2時間後固定した。解剖した組織をB1緩衝液（0.1M Tris pH 7.5、0.15M NaCl）で3回、B3緩衝液（0.1M Tris pH 9.5、0.1M NaCl、50mMMgCl2）で3回洗浄した後、B3緩衝液を含むBCIP（37.5μg/ml、Sigma、B6149）およびNBT（175μg/ml、Sigma、N6876）中で室温で一晩インキュベートした。その後、組織を4％PFAで一晩4℃で固定し、BABB（ベンジルアルコールと安息香酸ベンジルの1：2混合物）で洗浄した。画像はカラーカメラ付きZEISS SteREO Discovery.V12実体顕微鏡で収集した。
肥満細胞の染色には、鼻組織全体をフルオレセイン結合アビジン（Millipore Sigma, 189727; 1:500）と室温で30分間インキュベートした。PBSで洗浄後、鼻組織をFluoromount-Gを用いてマウントし、Nikon C2共焦点システムを用いて画像化した。
咳行動試験
マウスの咳行動をBuxco Small Animal Whole Body Plethysmography System（DSI, 601-1400-001 Rev11）を用いて記録した。化学物質による咳誘発では、マウスをイソフルランで軽く麻酔し、仰向けに寝かせた。試験溶液（10μl）を、先端から約3 mmのところで90°曲げた30ゲージ針注射器を用いて気管に直接注入した（Video S1）。試験試薬には、エバンスブルー（Sigma, E2129, 10%）を含むか含まないアンモニア溶液（Sigma, 1054221000, 0.2%）、クエン酸（Sigma, 251275, 0.5M）、ブラジキニン（Sigma, B3259, 2. 5mg/ml）、BAM（10μl生理食塩水中100nmol）、Clozapine-N-Oxide（0.5％DMSO生理食塩水中1mM）、IL-31（PeproTech、200-31、4μM）およびLY344864塩酸塩（Sigma、SML0556、1mM）。咳嗽反応は10-30分間記録した。
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ビデオS1. 図5およびSTAR Methodsに関連する、咳行動研究のための気管内投与法。化学物質で咳を誘発させるため、マウスはイソフルランで軽く麻酔し、仰向けに寝かせた。試験溶液（10 μl）は、先端から約3 mmのところで90°に曲げた30ゲージ針注射器を用いて気管に直接注入した1。
咳やくしゃみの音声を録音するため、Zoom H4n Proレコーダー（96 kHZ）を録音室の上部に設置した。音声信号はMATLABを用いて解析した。
口腔咽頭吸引
マウスをイソフルランで軽く麻酔し、市販の挿管板の上に置いた。マウスの舌を無外傷の鉗子で静かに口から引き抜いた。鼻孔を無外傷の鉗子で静かにクランプして閉じながら、試験溶液を口腔咽頭に投与した。30秒以内にマウスに口呼吸をさせ（喘鳴）、実験物質を吸入させた。喘鳴の直後、マウスの鼻と舌は解放され、通常の鼻呼吸が再開した。マウスはすぐに麻酔から回復した。試験試薬は、生理食塩水、BAM（25μlの生理食塩水に250nmol）およびLY344864塩酸塩（25μlの生理食塩水に25nmol）である。呼吸反応は15分間記録した。
SST-サポリンおよびNMB-サポリンによる神経細胞アブレーション
WTマウスはケタミン/キシラジンを用いて麻酔し、慎重に定位固定装置（Leica, Model# 39477001）にセットして固定した。SST-サポリンは、ビオチン標識ソマトスタチン（Phoenix Pharmaceuticals、Cat. #B -060-03）とStreptavidin-ZAP（Advanced Targeting Systems、Cat. #IT -27）を1：1のモル比で室温で20分間混合することによりカスタマイズした。SST-サポリン（10μM、50nL）、NMB-サポリン（Advanced Targeting Systems、Cat. #IT -70；50nL中50ng）またはブランク-サポリン（Advanced Targeting Systems、Cat. NMB-サポリン（Advanced Target Systems社製、Cat. #IT -70、50 nL中50 ng）またはブランク-サポリン（Advanced Target Systems社製、Cat. #IT -21、50 nL中10 μMまたは50 ng）を、以下の座標：前後方向（AP）-7.55 mm、背腹方向（DV）-4.35 mm、縦方向（ML）±0.50 mm（ブレグマから）を介して孤束核（NTS）領域に注入した。
肺線維症モデル
センダイウイルス（SeV、Sendai/52 Fushimi株、ATCC VR-105）はATCCから購入し、ストック株は既述のように胚化鶏卵で増殖させ、プラーク形成アッセイで滴定し、-80℃で保存した93。雄のC57BL/6JマウスをJackson Laboratoryから購入し、前述のようにSeVまたはSeV-UV（UVで不活化したSeV）を30μlのPBS中で経鼻接種した。
急性および慢性アレルギー性鼻炎モデル
すなわち、滅菌PBS（w/vol）中の0.02％オバルブミン（OVA、Sigma、A5503）と等容量のImject Alum（Thermo Scientific、77161）を混合してエマルジョンを調製した。1日目と11日目に、マウスにOVA/Imject Alum混合液（200μl）をi.p.注射した。急性アレルギーモデルでは、14日目にOVA（10％、2μl）を鼻腔内注射した後、くしゃみ行動を10分間記録した。慢性アレルギーモデルでは、感作マウスにイソフルラン麻酔下で毎日OVA（10％、2μl）を5日間連続経鼻投与した（14日目から18日目まで）。くしゃみ行動は、19日目にOVA（10％、2μl）を鼻腔内チャレンジした直後に試験した。
MrgprC11+鼻感覚線維を薬理学的に沈黙させるために、2nmol BAMおよび/または1% QX-314を含む2μl混合溶液を、OVAチャレンジの30分前に試験マウスの各鼻孔に注入した。OVA投与後10分間、くしゃみ反応を記録した。
インサイチュハイブリダイゼーション
蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）は、RNAscope Multiplex Fluorescent V2 Assay kit（ACD Bio、323100）を用い、製造元の推奨プロトコールに従った手順で行った。簡単に説明すると、動物をCO2窒息で安楽死させ、氷冷PBSで経心灌流し、組織温度を速やかに下げた。三叉神経組織とDRG組織を直ちに解剖し、OCTで凍結した後、Leica CM-1950クライオスタットを用いて切片化し、スライドにマウントした。スライドを-20℃のフリーザーで1時間乾燥させた後、氷冷4％PFAで15分間固定した。固定後、スライドを2分間のPBS洗浄を2回行った後、製造元のプロトコールに従って脱水、H2O2クエンチ、抗原回収を行った。抗原回収後、スライドを再度脱水し、60℃の乾燥オーブンで5分間乾燥させ、プロテアーゼ処理とプローブハイブリダイゼーションの前に室温で一晩乾燥させた。Opal520および570蛍光試薬（アコヤバイオサイエンス、それぞれFP1487001KTおよびFP1488001KT）を用い、メーカー推奨のプロトコールでシグナル発現を行った。スライドはDAPI Fluoromount-G（SouthernBiotech、0100-20）を用いてマウントし、4℃で一晩乾燥させてから画像化した。動物を犠牲にしてからマウントするまでの総処理時間は28時間以内であった。使用したプローブは主要リソースの表に示した。
感覚神経節と脳幹の免疫蛍光染色
ケタミン／キシラジン麻酔をかけた成体マウスを氷冷PBSで経心灌流し、4％PFAで灌流した。三叉神経節（TG）、迷走神経節（VG）、脳幹を採取し、それぞれ同じ固定液で30分間（神経節）、4-6時間（脳幹）氷上で後固定した。固定後、組織を30%(w/v)スクロース中、4℃で一晩（神経節）または二晩（脳幹）凍結保護し、OCT中に包埋・凍結した。TGとVGは12μmでスライドに切り出し、脳幹は50μmで切り出し、クライオスタットを用いて浮遊切片染色を行った。切片化した組織は、前節で述べたように染色し、画像化した。一次抗体：ウサギポリクローナル抗MrgprC11（Proteintech Groupによる特注品、S3893-2；1:1000）、ヒトHB-EGF（DTR）抗体（R&D Systems、AF-259-NA；1： 1000）、ニワトリ抗GFP（Aves, GFP-1020; 1:1000）、ヤギ抗WGA（Vector Laboratories, AS-2024; 1:1000）、モルモット抗Synaptophysin 1（Synaptic System, 101004, Lot# 3-38; 1:200）。二次抗体：ヤギ抗ウサギ IgG-Alexa Fluor-488（Invitrogen, A11008; 1:500）、ヤギ抗ウサギ IgG-Alexa Fluor-555（Invitrogen, A21429; 1:500）、Alexa Fluor® 488 AffiniPure F(ab')₂ Fragment Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L) (Jackson ImmunoResearch, 703546155; 1： 500), Cy™3 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch, 705165147; 1:500), Alexa Fluor® 488 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch, 705545147; 1:500), Cy™5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch, 706175148; 1:500).
脳幹スライスの調製と電気生理学的記録
前述したように、14 ～ 21 日齢のNmbreGFPマウスをイソフルランで深麻酔し、頸椎の高さで断頭した。脳幹を素早く回収し、氷冷溶液に浸した： スクロース209、KCl 2、NaH2PO4 1.25、MgCl2 5、CaCl2 0.5、NaHCO3 26、グルコース10。その後、脳幹を寒天に水平に埋め込み、バイブラトーム（Leica VT1200 S）を用いて矢状切片（1切片あたり350μm）を作成した。スライスは34℃で30分間、（mM単位で）以下を含む人工脳脊髄液（ACSF）溶液中で回復させた： NaCl 92、KCl 2.5、NaH2PO4 1.25、NaHCO3 30、MgCl2 2、CaCl2 2、グルコース25、HEPES 20、95%O2、5%CO2でバブリング。記録前、スライスは少なくとも1時間室温に置いた。インキュベーション後、スライスを記録チャンバーに移し、酸素添加した記録用ACSF溶液を連続的に灌流した： その後、MultiClamp 700BアンプとpCLAMP 10.5ソフトウェア（Molecular Devices）を用いて、脳幹スライスのくしゃみ誘発領域のNMBR+ニューロンに対してホールセル電流クランプ記録を行った。パッチピペットはホウケイ酸ガラスキャピラリー（1B150F-4、World Precision Instruments）から水平マイクロピペットプーラー（Model P-1000、Sutter Instrument）を用いて引き抜いた。パッチピペットの抵抗は、(mM)を含む内溶液で満たされたとき、5-7 MΩであった： K+-gluconate 130、NaCl 10、MgCl2 1、EGTA 0.2、HEPES10、Mg-ATP 1、Na-GTP 5を含み、浸透圧は290-300 mOsm、pHはKOHで7.25に調整した。
定量と統計解析
サンプルサイズは、''サンプルサイズの決定''95、我々のパイロット研究、関連する先行研究、および技術的制約、資源の利用可能性、倫理的利用を含むその他の考慮事項に基づいて選択した。特に断りのない限り、すべての図中のn数は生物学的複製を示す。統計解析はすべてPrism 9（GraphPad, San Diego, CA）を用いて行った。両側Studentのt検定は、2群間の統計的有意性を決定するために行った。一元配置分散分析（One-way ANOVA）とTukey-Kramer post hoc 検定は3群以上の比較に使用した。群間で統計的に有意であることの閾値はP≦0.05とした。
補足情報
メディアプレーヤー
0秒
0:00 / 0:19スピード：1倍速停止
表S1. 図1に関連するシングルセルRT-qPCR用プライマー。