ヒト軟部肉腫は、ナチュラルキラー細胞浸潤および予後と関連する腫瘍内ウイルスマイクロバイオームを保有する

ヒト軟部肉腫は、ナチュラルキラー細胞浸潤および予後と関連する腫瘍内ウイルスマイクロバイオームを保有する

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http://orcid.org/0000-0002-1306-9950Lauren M Perry1, http://orcid.org/0000-0001-9007-6639Sylvia M Cruz1, Kara T Kleber1, Sean J Judge1, Morgan A Darrow2, Louis B Jones3, Ugur N Basmaci1, Nikhil Joshi4, Matthew L Settles4, Blythe P Durbin-Johnson4, Alicia A Gingrich1, Arta Monir Monjazeb5, Janai Carr-Ascher6, Steve W Thorpe7, http://orcid.org/0000-0002-2793-401XWilliam J Murphy6,8, Jonathan A Eisen9, および http://orcid.org/0000-0002-3331-5418Robert J Canter1.
Dr Robert J Canter 宛て; rjcanter@ucdavis.edu
要旨
背景 画期的な研究により、腸内細菌は免疫恒常性や抗腫瘍免疫反応に関連していることが明らかになった。軟部肉腫（STS）を含む腫瘍内マイクロバイオームも実証されつつあるが、STSの腫瘍内マイクロバイオームの詳細な特性評価は限られている。我々は、術前放射線治療および術後手術を受けたSTS患者における腫瘍内マイクロバイオームの特徴を明らかにすることを目的とし、臨床的に重要な微生物シグネチャーを持つ可能性のある明確な腫瘍内マイクロバイオームが存在すると仮定している。

方法 我々は、汚染を最小限に抑えるために厳格な無菌採取プロトコルを用いて、非転移性STSの成人患者から腫瘍および便のサンプルを前向きに採取した。メタゲノム分類を用いて、分類されたすべての生物について属および種の分類学的レベルを用いて存在量を推定し、臨床病理学的因子に関してデータを分析した。

結果 15人の患者が登録された。ほとんどの腫瘍は四肢に存在し（67％）、組織学的グレード3であった（87％）。40%は高分化型/低分化型脂肪肉腫の組織型であった。追跡期間中央値24ヶ月で、4人（27％）が転移を起こし、3人（20％）が死亡した。腫瘍内にはヒトのDNAが圧倒的に多い（99％以上）にもかかわらず、すべての腫瘍で、Proteobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes、およびウイルス種を含む細菌のDNAがわずかながら一貫した割合（0.02〜0.03％）で検出された。腫瘍微小環境では、ウイルスの相対量とナチュラルキラー（NK）浸潤の間に強い正の相関が認められ、免疫組織化学、フローサイトメトリー、多重免疫蛍光分析によりNK浸潤が高いほど無転移生存率および全生存率が優れていることが確認された。

結論 我々は、STS患者における明確かつ測定可能な腫瘍内マイクロバイオームの存在を、複数の時点においてプロスペクティブに証明した。我々のデータは、STS腫瘍マイクロバイオームが、ウイルスの相対的存在量がNK浸潤および腫瘍学的転帰と関連する予後的意義を有することを示唆するものであった。これらの知見の臨床的影響をさらに評価するために、さらなる研究が必要である。

データ入手に関する声明
データは、合理的な要求があれば入手可能である。

http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/
本論文は、Creative Commons Attribution Non Commercial (CC BY-NC 4.0) ライセンスに従って配布されるオープンアクセス論文であり、原著作物が適切に引用され、適切なクレジットが与えられ、変更があればそれが示され、使用が非商業的であるという条件で、他の者がこの作品を非商業的に配布、リミックス、適応、構築し、派生作品を別の条件でライセンスすることを許可するものである。http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/ を参照してください。

http://dx.doi.org/10.1136/jitc-2021-004285

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このトピックについて既に知られていること
いくつかの種類のがんにおいて、腫瘍内マイクロバイオームの存在が証明され、腸内および腫瘍内マイクロバイオームががんの進行や免疫療法反応と関連する証拠が増えつつある。しかし、腫瘍内ウイルスやナチュラルキラー（NK）浸潤などの免疫表現型や機能と常在菌群、系統、種との間の具体的な関連性についての詳細な報告はない。

本研究で明らかになったこと
本研究では、厳密な無菌収集プロトコルを用いた前向きコホートにおいて、初めて腫瘍内軟部肉腫（STS）のマイクロバイオームの特徴を明らかにした。我々は、複数の時点にわたって再現可能な、STS患者における明確かつ測定可能な腫瘍内マイクロバイオームを同定した。腫瘍内ウイルスマイクロバイオームは、NK細胞浸潤の高さ、無転移生存率および全生存率の高さと相関しているようである。

この研究が研究、実践、政策に与える影響
これらのデータは、STSにおける測定可能な腫瘍内マイクロバイオームの存在を示し、ウイルス-NK軸のレベルでの予後的意義の証拠を示している。これらの知見は、がん、マイクロバイオーム、宿主免疫系が相互に作用し形成し合うというパラダイムシフト的な概念における新たな研究路線を示唆している。

背景
がん、マイクロバイオーム、宿主免疫系が相互に作用し、形成し合うという考え方は、腫瘍学においてパラダイムシフトを起こす概念であり、マイクロバイオーム-免疫系相互作用が抗腫瘍免疫応答の形成に基本的な役割を果たすことが現在認識されています1。 -最近の発見により、マイクロバイオームが一部のがんの発症と進行に関与していること、および腸内細菌組成が免疫チェックポイント阻害療法（例えば、抗プログラム細胞死タンパク質-1/プログラム死リガンド-1（PD-1/PD-L1））の治療効果に影響を与えることが明らかになりました7-9。 7-9 例えば、Routyらは、進行がんのマウスにおいて、広域抗生物質の使用は免疫チェックポイント阻害剤（ICI）の効果を逆転させること、ヒトICI反応者から無菌または抗生物質処理マウスへの糞便微生物叢移植（FMT）は、前臨床試験においてPD-1阻害の抗腫瘍効果を改善することを実証しました8。同様に、最近の臨床研究では、進行性メラノーマ患者において、ICI療法に反応した患者から非反応者へのFMTにより、ICI療法への耐性の逆転を含む腸内細菌叢の急速な変化が生じるという驚くべき結果が示されました4 6。

10-13 重要なことは、これらの組織は解剖学的に外界とつながっており、「無菌」組織と推定される軟部肉腫（STS）に腫瘍内マイクロバイオームが存在するかという問題は、腫瘍特異的な傾向を持つ複数の固形がんにおいて微生物の存在を示す証拠があるにもかかわらず、まだ深く検討されていないことです12。

マイクロバイオームとがんの進行や免疫療法の反応を関連付ける研究は画期的なものですが、マイクロバイオーム研究の計画や解釈において、特に胎盤、固形臓器、腫瘍などのバイオマス量の少ない組織では、汚染や偽陽性結果が重要な注意点として残っています14。 -例えば、Aagaardらは、16SリボソームRNA遺伝子PCRと全ゲノムショットガンシーケンスを用いて、主に非病原性の常在菌からなるユニークな胎盤マイクロバイオームの特徴を明らかにし、胎盤マイクロバイオータは非妊娠時のヒト口腔マイクロバイオームと最も似ていると結論付けています17。しかし、Kupermanらが細菌培養と16SリボソームRNA遺伝子増幅法を用いて同様の研究を再現したところ、すべてのサンプルとコントロールが陰性であった18。この重要なフォローアップ研究は、当初の所見は採取時または処理時の汚染であると結論付け、胎盤マイクロバイオームの存在を示唆する証拠に異議を唱えた。さらに、Salterらは、DNA抽出キットの試薬や実験器具が、特に水や土壌環境と頻繁に関連する分類群である細菌DNAで汚染されている可能性があることを示した19 。

腫瘍微小環境（TME）と宿主免疫系および腫瘍内マイクロバイオームとの相互作用は複雑であり、まだ完全に解明されていない。しかし、自然免疫系の重要なエフェクターであるナチュラルキラー（NK）細胞は、事前の抗原感作なしに腫瘍細胞とウイルス感染細胞の両方を標的とすることができ、ヒトNK細胞がウイルス感染に反応して拡大し組織への輸送を刺激されることを考えると、重要な関連性を示しています20。21 さらに、ウイルス感染の初期段階において、NK細胞はI型インターフェロン、インターロイキン（IL）-12、IL-15およびIL-18というサイトカインによって活性化される22。NK細胞の浸潤は、全体として低い傾向があるものの、複数の固形がんにおいて良好な予後と関連している23 24が、我々の知る限り、STSなどの固形がんにおける腫瘍内ウイルス微生物の役割と腫瘍内NK細胞との関連について特徴付けた研究は存在しない。

これらの知識のギャップを解決するために、ネオアジュバント放射線治療（RT）と手術を受けた非転移性STS患者における腫瘍内マイクロバイオームを評価することを目指した。最高品質の解析を行うため、すべての腫瘍検体について厳密な無菌生検を行い、さらに、ワークフローにおいて汚染の可能性がある領域を説明できる硬表面および皮膚対照を収集した。本論文では、NK細胞の腫瘍内浸潤および予後の改善と相関する明確な腫瘍内マイクロバイオーム、特に腫瘍内ウイルス性マイクロバイオームを同定し、免疫療法抵抗性のSTSにおいて治療標的となりうる新規領域を明らかにした。

研究方法
患者さんのスクリーニングと登録
対象患者は、外科的切除の前にネオアジュバントRTが推奨される局所進行、非転移性STSと診断された患者である25。IRBが承認したプロトコルは、オンライン補足資料に含まれている。

補足資料
[jitc-2021-004285supp001.pdf]
補足資料
[jitc-2021-004285supp002.pdf]
マイクロバイオーム解析のための糞便採取
便サンプルは、ネオアジュバントRT前の診断時、および外科的切除前のRT後に採取された。参加者は適切な採取方法を指導され、市販の糞便採取キット（OMNIgene Gut OMR-200、DNAGenotek、オンタリオ、カナダ）を使用して自分でサンプルを採取した。

マイクロバイオーム解析のための腫瘍採取
STS腫瘍サンプルは、生検および切除時に、滅菌手袋、オートクレーブ滅菌した手術用具、および18ゲージコア生検器具を使用して採取された。さらに、UC Davis病理学教室から、研究者が病理学的評価のために組織を移送する前に無菌状態で検体を採取する許可を得た。配列解析と DNA 含有量の評価のために十分な試料を確保するため、標準的に約 100 mg の組織（4～5 個のコア針生検標本）を採取した。組織標本は滅菌鉗子で滅菌採取バイアルに移し、液体窒素で凍結保存し、DNA抽出まで-80℃で保存した。

コントロール検体
検体の汚染パターンをよりよく理解するために、検体採取のワークフローと相互作用する可能性のある表面をシークエンス解析用にサンプリングした。さらに、選択した患者の皮膚マイクロバイオームを、クロルヘキシジングルコン酸塩による手術前、手術後、手術創の閉鎖直前の3時点でサンプリングした。これらの対照は、皮膚またはその他の乾燥表面からのマイクロバイオームプロファイリングを目的とした市販の収集キット（OMNIgene SKIN OMR-140、DNAGenotek、カナダ、オンタリオ州）を使用して収集した。

臨床病理学的データ
標準的な臨床データ、病理データ、および治療データを収集し、転移形成と死亡を主な結果変数として分析した26 。再発の有無は、切除した日から数えた。

DNA抽出と配列決定
DNA は QIAGEN QIAamp PowerFecal Pro DNA キットを用いて全ての検体から単離した。DNAの質と量はNanoDrop分光光度計（Thermo Scientific, Wilmington, Delaware, USA）を用いて評価した。ライブラリーは、Illumina NovaSeq V.274プラットフォームを使用して300 bpペアエンドリードで配列決定された。画像解析、塩基コール、品質チェックはIllumina data analysis pipeline RTA V.3.3.5 and bcl2fastq V.2.20 を用いて行った。

メタゲノム品質管理および前処理
生リードデータは、HStream (V.1.3.3) を用いてフィルタリングし、コンタミネーション（PhiXなど）のスクリーニング、PCR重複リードの除去、品質ベースのトリミング、アダプターのトリミングなどを行いました28。 30 サンプルタイプ別のリード断片数、塩基対数、リードカバレッジの詳細な報告をオンライン補足表 1 に示します。全サンプル中、リードフラグメントの平均数は 28,323,921 (範囲 79,513,844) 、平均塩基対数は 8,553,824,089 (範囲 24,013,180,888) 、平均読み取り範囲は 2.61× (範囲 7.34×) であることがわかった。

フローサイトメトリー
血液と腫瘍のサンプルをフローサイトメトリー用に処理し、25 31 32 細胞を以下の蛍光色素標識モノクローナル抗体で染色した。CD3-FITC (clone HIT3a, BioLegend), CD56-PE (clone HCD56, BioLegend), and CD45-BV510 (clone HI30, BioLegend). Fixable Viability Dye 780 (eBioscience #65-0865-14)を用いて生死染色を実施した。フローサイトメトリーの結果は、BD LSRFortessaフローサイトメーター（Becton Dickinson, San Jose, California, USA）を用いて取得し、FlowJo Software（Becton Dickinson, San Jose, California, USA）を用いて解析した。

免疫組織化学および免疫蛍光法
ホルマリン固定、パラフィン包埋スライドを、NKp46（ウサギ抗ヒトNKp46、Abcam、クローンEPR22403-57）、CD57（マウス抗ヒトCD57、Thermo Scientific、クローンNK1）、およびCD94（ウサギ抗ヒトCD94、Abcam、クローンEPR21003）発現のために染色した。免疫蛍光（IF）は、NKp46と4′，6-ジアミノ-2-フェニルインドール（DAPI）を用いて評価した。IF染色はOpal蛍光色素を用いて行い、Spectral DAPI（Akoya Biosciences社製）で対比染色した。画像取得には Ventana Discovery Ultra システムを使用し、データ解析は既報の通り行った33。

統計解析
メタゲノム解析データのフィルタリングと前処理は、Bioconductor package phyloseq, V.1.34.0 を用いて行った。34 差分存在量解析は、Bioconductor package limma (V.3.46.0) を用いて TMM 正規化、対数変換したタクソンカウントで行い、p 値は Benjamini-Hochberg 調整した35 36 追加詳細は online supplemental methods で示している。

結果
STSには定量化可能な腫瘍内マイクロバイオームが存在する
特に存在量の少ない微生物環境では、マイクロバイオーム研究で汚染されるリスクがあることが知られているため、厳格な無菌組織収集プロトコルを採用した。図1Aは、臨床治療と検体採取のスキーマを示したものである。非転移性STSを疑う所見を呈した適格患者を前向きに登録した。その後、RT前の便サンプルが自己採取された。RT前の腫瘍組織は、画像誘導下コア針生検で採取された。ネオアジュバントRT終了後、手術前に、2回目の便サンプルが採取された。2回目の腫瘍サンプルは、手術時の切除標本から、手術標本の登録前にコアニードル生検を採取するために再び無菌技術を使用して採取された。

図1
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図1
軟部肉腫には定量化可能な腫瘍内マイクロバイオームが存在する。(A）臨床治療と腫瘍および便のマイクロバイオームサンプルのプロスペクティブコレクションを示すシェーマ（図1）。左は軟部肉腫が疑われる大腿内側の大きな軟部組織腫瘤で、診断用生検とマイクロバイオーム解析用の腫瘍サンプル採取のために腫瘍に挿入されているエコー源性のコア針生検器具の超音波画像である。外科的切除時の肉眼的腫瘍標本の写真と、腫瘍標本の病理学的登録とインキングを行う前のコアニードル生検器具の挿入。挿入図は、無菌的に採取された腫瘍のコア試料の例である。(B）プロスペクティブに解析されたコホートの人口統計学的および臨床病理学的特徴。(C）腫瘍、便、採取表面、皮膚表面対照検体のDNA抽出量。(D-G) 腫瘍、便、採取表面対照検体中の DNA の相対的存在量、（D）真核生物／ヒト、（E）細菌、（F）古細菌、（G）ウイルス由来。Relative abundanceは、全生物数に対する特定の生物の構成比を表す。NLR、好中球-リンパ球比；RT、放射線治療。

図1Bは、我々の患者の臨床病理学的および治療上の特徴を示したものである。ほとんどの患者は男性で、平均年齢は66.1歳（±16.4歳）であった。組織型は四肢腫瘍（67％）、高分化型・未分化型脂肪肉腫（40％）が多かった。患者の大半は局所進行型であったが、2例（高分化型脂肪肉腫1例、線維粘液肉腫1例）は、初期所見で高悪性度を疑ったものの、低悪性度の組織型であった。現在までに4人（27％）が転移を起こし、3人（20％）が死亡している（図1B）。

腫瘍、便、皮膚、血液、表面対照から抽出されたDNAの量を図1Cに示す。生検試料から抽出された平均DNA量は、外科的切除時に採取されたDNA量（87.1±74.0ng/μL、p=0.014）よりも有意に多く、DNA回収に対するRTの効果が示唆された。一方、便検体から抽出されたDNAの平均量は、診断前の検体（170.7±175.3 ng/µL）と負荷療法後の検体（219.0±234.0 ng/µL、p>0.05）で同等であった。予想通り、皮膚、血液、表面のコントロールは、それぞれ0.07 ng/µL (±0.15), 6.1 ng/µL (±2.05), 7.8 ng/µL (±2.9) と、採取した平均DNA量が少なく、マイクロバイオ研究のエンドポイントとして、相対量に加えて定量化が重要であることが浮き彫りになりました。図1D,Eに示すように、腫瘍検体は圧倒的に真核生物/ヒトのDNA（平均99%以上）を示し、細菌DNA（平均0.02%±0.004%）は少ないが全ての検体に一定割合で存在した。便検体は、ほとんどが細菌性DNA（平均53.2%±11.1%）で、少量の真核生物性DNA（平均0.08%±0.13%）が存在し、残りは未分類のものであった。表面コントロール綿棒（図 1C）は、真核生物/ヒト DNA の相対的存在量に大きなばらつきがあり（滅菌バイアル 24.1% 対 病理作業室 98.7%）、おそらく病理作業室での外科検体の処理など、存在しうる汚染の種類と量を反映したものであると考えられる。病理検査室の表面サンプルは、無菌バイアル（39.1%）および病院の便器（62.4%）と比較して、少量の細菌DNA（0.27%）を示し、これも汚染物質への曝露の可能性を表している。図1F,Gに示すように、古細菌とウイルスDNAの相対的存在量はすべてのサンプルで低かったが、腫瘍サンプルや採取表面のコントロールと比較して、便サンプルでは比較的豊富であった。

診断時のSTS腫瘍内マイクロバイオームが予後と関連する可能性
次に、腫瘍生検検体内の非真核生物を解析し、群集の特徴をさらに明らかにするとともに、主要な臨床的・病理学的変数との関連を評価した。典型的なSTSコホートと同様に、生検および腫瘍標本には巨視的および微視的レベルで有意な形態的不均質性が見られた（図2A）。次に、分類学的スペクトルにわたる微生物群集を分析した。全体として、図2Bに示すように、診断時のサンプルでは高いα多様性が観察され、腫瘍生検15個中14個が、分類学的生物多様性が高いことを示す定量的マーカーであるシャノンα多様性指数スコア4を示しました。しかし、ある患者（患者11、図2C）では、診断時の腫瘍マイクロバイオームの約90%が単一のウイルス種（ヒトヘルペスウイルス6；HHV-6）で占められており、他のすべてのサンプルと比較してα多様性指数のスコアが低くなっていることが示された。図2Cは、他のすべての腫瘍内マイクロバイオームサンプルが、主に細菌で代表され、ウイルスと古細菌がわずかに代表されていることも示している。細菌門レベル（図2D）では、診断時の腫瘍内マイクロバイオームの大部分は、Proteobacteria、Bacteroidetes、Firmicutesで構成されていた。細菌ファミリーレベルでは、20以上のファミリーが同定され（図2E）、かなりのバリエーションが観察された。4名の患者において、Pasteurellaceaeは腫瘍内微生物DNAの相対的存在量の約25％を占めていたが（図2E）、他の患者では、このファミリーは細菌ファミリーの≦5％を占めていた。

図2
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図2
軟部肉腫の診断時の腫瘍内マイクロバイオームが予後と関連する可能性がある。(A）四肢の滑膜肉腫の代表的な肉眼像。アスタリスクは腫瘍壊死を、矢印は包埋された大動脈を示す。(B) RT前の腫瘍内微生物群の分類学的分岐の数学的距離に基づく多次元尺度法（MDS）プロット（アルファ多様性による）。MDSプロットは、腫瘍内生物多様性が低い1人の患者（青色）を除いて、すべてのRT前腫瘍サンプルで顕著な生物多様性を示している。(C-E)RT前の腫瘍内微生物群の相対的存在量を、(C)王国レベル、(D)門レベル、(E)ファミリーレベルで患者ごとに示したもの。相対的存在比は、全生物数に対する特定の生物の構成比を表す。(F) RT前の腫瘍内微生物群の患者死亡数別のMDSプロット。(G) 転移への進行度によるRT前の腫瘍内微生物群のMDSプロット。(H）全生存期間（OS）および無転移生存期間（MFS）のカプラン・マイヤー推定値。(I-J)RT前の腫瘍内マイクロバイオームのMDSプロット（(I)組織型、(J)腫瘍サイズ、(K)腫瘍位置別）。RT、放射線治療。

次に、死亡（図2F）および遠隔転移（図2G）を含む主要な腫瘍学的転帰に関して、腫瘍マイクロバイオームサンプルのベータ多様性を分析した。多次元尺度法（MDS）プロットで示したように、初診時の腫瘍内マイクロバイオームは、生存している患者と比較して、死亡した患者の間でクラスター化していた。このクラスタリングは、転移を起こした患者と比較して死亡した患者でより強く、STS研究における転移進行と死亡の間の複雑な関係を補強している（図2G）。図2Hに示すように、我々のコホートにおける全生存期間（OS）と無転移生存期間（MFS）は、局所進行型STS患者の他の高リスクコホートと一致している37。しかし、診断時の腫瘍内マイクロバイオームを他の確立したSTS予後因子に関して分析すると（図2I-K）、これらの変数で層別しても腫瘍マイクロバイオームプロファイルに有意なクラスタリングは観察されなかった。これらのデータを総合すると、STSは診断時に腫瘍内マイクロバイオームを保有しており、これらの微生物成分が単独であれ集合体であれ、腫瘍の予後と相関があることが示唆される。

治療用放射線は手術時にSTSの腫瘍内微生物相を正常化する
次に、外科的切除標本から得られた腫瘍内マイクロバイオームを解析した。王国レベルでは、細菌、ウイルス、古細菌の相対的存在量に、放射線治療の前後で有意な差は認められなかった（図3A）。注目すべきは、患者11の腫瘍内マイクロバイオーム（α多様性が低く、HHV-6ウイルスの含有量が非常に多い）は、時点を通して驚くほど一貫しており、非真核生物DNAの約90％がHHV-6ウイルスDNAを構成していたことである。同様に、門や科のレベルでは著しく多様で不均一であるが（図3B、C）、RT後のサンプルの微生物組成は、検体取得からRTの細胞毒性効果までの時間間隔にもかかわらず、患者内でRT前のサンプルの結果を反映した。図3Dに示すように、ほとんどのSTS腫瘍マイクロバイオーム試料は、シャノンアルファ多様性指数スコア>4で定量化されるように、RT前およびRT後の微生物分類学的多様性を示した。 しかし重要なことに、患者11は、それらの試料中のHHV-6の相対的存在度が著しく高いためにRT前およびRT後腫瘍両方で低いアルファ多様性の異常値のままであった。

図3
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図3
治療用放射線は手術時のSTS腫瘍内微生物相を正常化する。(A-C） RT前とRT後の患者別腫瘍内マイクロバイオームの（A）王国、（B）門、（C）科レベルの相対的存在量。相対的存在量とは、全生物数に対する特定の生物の構成比を表す。(D) RT期間中の腫瘍内アルファ多様性。ほとんどの腫瘍生検では、分類学的生物多様性の定量的指標であるShannon alpha diversity index scoreが4であったが、1人の患者では、RT前とRT後の両方の期間で生物多様性が低かった。(E）RT前後における最も豊富な4つの腫瘍内細菌フィラの生のブラッケンカウント。Bacteroidetes、Cyanobacteria、Firmicutesのブラッケンカウントに有意な差は見られなかったが、Proteobacteriaの体腔内カウントは大きな幅があるものの、RT後に平均で減少した。(F) RT前とRT後の最も豊富な4つの細菌科の生のブラッケンカウント。腸内細菌科、フラボバクテリウム科、メチルアシジフィラ科では、期間による存在量の差は見られなかった。RT後の腫瘍サンプルでは、Pasteurellaceaeの存在量が大幅に減少したが、この減少は統計的に有意ではなかった（p>0.05）。(G）RT期間中の腫瘍標本の主成分分析（PCA）により、RT前とRT後の腫瘍マイクロバイオーム試料を比較した場合、腫瘍内マイクロバイオームに有意な変動がないことが示された（p＝0.167）。(H) 転移性疾患への進行度で層別した場合、RT前の腫瘍マイクロバイオームで2つの異なる豊富な属（Piscirickettsia (p=0.002), Respirovirus (p=0.041)) がPCAで強調表示される。(I）ピシリケッチアとレスピロウィルスの生のブラッケンカウントを、期間と転移への進行度によって分類したもの。箱ひげ図は、転移に進行した患者とそうでない患者でRT前とRT後の腫瘍マイクロバイオーム試料を比較したときに、ピシリケチア存在量が増加し、レスピロウィルス存在量が減少していることを示す。(J）術前のPET/CT（上）は大腿前区画の代謝亢進性腫瘤を示す；四肢粘液線維肉腫の切除手術標本（下）；アスタリスクはRT後の腫瘍壊死を強調表示する。(K)最終手術時の患者別の腫瘍壊死の割合。生存している患者は青いバーで示し、死亡した患者は赤いバーで示すか、腫瘍壊死が0％または利用できない場合はアスタリスクで示す。95%の腫瘍壊死（完全な病理学的壊死とみなす）の閾値は、破線の水平線で示されている。(L）患者別のPD-L1発現率。生きている患者は青いバーで示し、死亡した患者は赤いバーで示すか、PD-L1発現が0％または得られなかった場合はアスタリスクで示す。9人の患者がPD-L1発現の陽性（腫瘍割合スコア>0）を示した。(M）侵襲的な臨床経過、急速な死亡、および免疫組織化学における高いPD-LI染色を特徴とする脱分化型脂肪肉腫の患者#4の代表的H&E顕微鏡写真。IHC、免疫組織化学的；PD-1、プログラム細胞死タンパク質-1；PD-L1、プログラム死リガンド-1；PET、ポジトロン放射断層撮影；RT、放射線療法。

図3Eは、相対的存在量の最も高い腫瘍内細菌フィラのRT前およびRT後の生のブラッケンカウントを示す。Bacteroidetes、Cyanobacteria、Firmicutesの正規化ブラッケンカウントに有意差は見られなかったが、Proteobacteriaの腫瘍内カウントは広い範囲にもかかわらずRT後、平均して減少していることがわかった。同様に、図3Fは、検体間で最も豊富な細菌科のブラッケンカウントを示し、Enterobacteriaceae、Flavobacteriaceae、またはMethylacidiphilaceaeのRT前とRT後の腫瘍内カウントに明らかな違いはなかったが、RT後の腫瘍試料ではPasteurellaceaeカウントが大幅に減少したが統計的に有意ではなかった（p>0.05）。図3Gは、RT期間ごとの腫瘍標本の主成分分析（PCA）を示し、RT前とRT後の腫瘍マイクロバイオーム試料を比較した場合、腫瘍内マイクロバイオームに有意な変動がないことを示している（p＝0.167）。RT前後の腫瘍内マイクロバイオームと、年齢、性別、肥満度（BMI）、組織型、腫瘍サイズ、腫瘍部位などの確立したSTS予後因子との間に有意な関連性は認められなかったが、転移病巣への進行度で層別化すると、RT前の腫瘍マイクロバイオームで異なる豊かさを示す2つの属が観察された。Piscirickettsia（p=0.002）およびRespirovirus（図3H、p=0.041）である。同様に、図3Iに描かれているように、転移に進行した患者のRT前とRT後の腫瘍マイクロバイオーム試料を比較すると、Piscirickettsiaのブラッケンカウントが増加し、Respirovirusのカウントが減少する、生のブラッケンカウントの違いも確認された。さらに、局所進行した高リスクの患者コホート（図3J）を登録したにもかかわらず、単変量解析でMDSによる腫瘍内マイクロバイオームや臨床転帰と関連する病理学的完全奏効やPD-L1発現（図3K、L）を観察しなかった38 39 図3Lと9人の患者がPD-L1発現陽性（腫瘍割合スコア>0）を示した。全体として、これらのデータは、STSの腫瘍内マイクロバイオームは、ネオアジュバントRT後にほぼ安定し、診断時の腫瘍内マイクロバイオームよりも腫瘍学的転帰に対する影響が少ないことを示唆している。

STS患者における腸内細菌叢は臨床転帰と関連しないようである。
免疫療法への反応を含む宿主免疫反応の調節における腸内細菌叢の極めて重要性を考慮して、次に、我々のコホートにおける便の微生物叢の構成を評価した3 4 7-9 40 王国レベルでは、マッチした検体の間では、RT前後の細菌、ウイルス、古細菌の相対存在量に有意差は認められなかった（図4A）。全体として、細菌は全患者の相対存在量の90％以上を占めていた。古細菌の割合が少ない患者（患者10、13、15）もいたが、その頻度は時系列で比較的安定していた。興味深いことに、患者8は、RT後の腸内細菌叢に約10％のアーキアを保有していた。メタン生成菌は一般にヒトの腸内では年齢と関連しているが、この患者は約3ヶ月前の診察時に腸内細菌叢に1％未満のアーキアを保有していたため、急変は年齢だけでは説明できない41。メタン生成物質は、吸入した際の骨髄細胞の蓄積や病理組織学的炎症など、バイオシスや免疫調節障害と関連しているため、この患者の腸内細菌叢の変化と転移や死亡を伴う疾患の急速な進行の関連性は興味深く、仮説が生み出される42。

図4
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図4
STS患者の腸内細菌は臨床転帰と関連しないようである。(A-C）患者ごとのRT前とRT後の腸内細菌群の相対的存在量を（A）王国、（B）門、（C）ファミリーレベルごとに示したもの。相対的存在量とは、全生物数に対する特定の生物の構成比を表す。(D) 腸内細菌叢のアルファ多様性は、RT期間間で差はなかった（p>0.05）。シャノンアルファ多様性指数のスコアが大きいほど、分類学的な生物多様性が大きいことを示す定量的な指標となる。(E-F)最も豊富な4つの腸内細菌群(E)と(F)ファミリーの生のブラッケンカウントは、RT時間帯によって大きく変化しなかった。(G) RT時間帯に渡る腸内細菌標本のPCA。(H）種レベルの差異を上乗せしたRT時間帯にわたる腸内細菌群のPCAは、RT投与に関して腸内細菌群の有意差を示さなかった（p＝0.078）。(I-L）転移（I）、死亡（J）、年齢（K）、およびBMI（L）に関して、STS腸内細菌叢と関連がないと思われるRT時間期間にわたる腸内細菌叢を示すMDSプロット。丸印はRT前の腸内細菌叢試料、三角印はRT後の腸内細菌叢試料を表す。BMI、体格指数、MDS、多次元尺度法、PCA、主成分分析、RT、放射線治療、STS、軟部組織肉腫。

次に、便の微生物相を門レベルで評価した。相対的な存在量が最も高かったのは、ファーミキューテス、プロテオバクテリア、バクテロイデテス、およびアクチノバクテリアで、患者間の不均一性は大きかったものの、RT前後で最小限の変動しか示さなかった（図4B）。しかし、細菌ファミリーレベルでは、マッチングされた患者サンプル内で、治療前後にかなりのばらつきがあった（図4C）。最終的に、患者の便検体全体で20以上の異なる細菌ファミリーを同定しました。図4Dは、遠隔治療前後の便検体のShannon alpha diversity indexを示したものである。RT前の検体はより大きなアルファ多様性を示したが、線形混合効果モデルを用いて、これらの差は有意ではなかった（p>0.05）。図4E,Fに示すように、腸内マイクロバイオームで最も豊富な4つの細菌群および細菌ファミリーのブラッケンカウントは、RT時間帯によって大きく変化しなかった。同様に、RT時間帯別の便検体のPCA（図4G）は、傾向はあったが、RT投与に関して腸内細菌叢に有意差は示さなかった（p＝0.078）。図4Hは、RT時間帯間の腸内細菌叢の差異を駆動している可能性のある生物を特定する試みで、その上に種レベルの差異を追加した腸内細菌叢の同じPCAを図解している。この分析では、腸内細菌叢の種に差は見られなかった（p>0.05）。さらに、順列型多変量分散分析（PERMANOVA）分析を用いて、腸内細菌群とRTの時期および他の臨床的に関連するSTS予後因子との間に有意な関連を見いださなかった（図4I-L、すべての変数 p>0.05）。転移進行（図4I）または死亡（図4J）に関して腸内細菌を分析した場合、転帰に関して腸内細菌プロファイルの有意なクラスタリングは観察されなかった。年齢（図4K）またはBMI（図4L）のような腸内細菌に影響を与える確立された因子を考慮した場合、我々はまた、層別化に関する有意なクラスタリングを観察することができなかった。これらのデータを総合すると、STSにおける腸内細菌は、診断時の腫瘍マイクロバイオームとは異なり、患者や治療期間によってかなりの変動性を示し、予後や腫瘍学的転帰とは関連性がないようであることが示唆される。

STSの腫瘍内マイクロバイオームは、皮膚から混入する可能性のある微生物とは測定不能なほど異なる。
腫瘍サンプルの採取過程における汚染の可能性をより適切に評価するため、皮膚、血液、腫瘍、便などの組織コンパートメント全体のマイクロバイオーム組成も分析した。外科用防腐剤塗布前、外科用プレパラート塗布後、および外科手術中の皮膚閉鎖時に皮膚試料から抽出したDNAの量を図5Aに示す。全体として、すべてのサンプルで抽出されたDNAの平均量は0.07ng/μL（±0.15）と非常に少なく、皮膚閉鎖時に有意に多くのDNAが採取された（p=0.022）。王国レベルでは、皮膚と血液のマイクロバイオームは、真核生物／ヒト由来が優勢である（図5B,C）。細菌門レベルでは、腫瘍（図5D）、皮膚（図5E）、血液（図5F）サンプルは区別されるようである。図5Gは、少なくとも3つの組織を分析した患者における組織区画ごとのマイクロバイオームの違いを描いたMDSプロットであり、マイクロバイオームプロファイルが場所によって大きく異なり、腫瘍、便、皮膚、血液のマイクロバイオームが明確にクラスタリングされていることが示されている。1人の患者内で分離した場合、この組織区画の分離パターンが、組織タイプによる分類学的分岐をさらに際立たせている（図5H）。組織特異的なシーケンスデータを総合すると、マイクロバイオームのバイオマスと、これらの組織における常在菌が、腫瘍から回収されたマイクロバイオームとは異なり、汚染によるものである可能性が低いことに光を当てていることがわかる。

図5
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図5
軟部肉腫の腫瘍内マイクロバイオームは、皮膚から混入する可能性のある微生物とは大きく異なる。(A）皮膚対照検体からのDNA抽出量を、手術部位に防腐剤を塗布する前、手術切開前に防腐剤を塗布した直後、手術終了後の創閉鎖時の3時点において分析した。(B) 患者別、手術前プレップ塗布時期別の皮膚マイクロバイオームの相対存在量（王国レベル）定量可能なDNAが回収された皮膚サンプルの大半で真核生物DNAの相対存在量がほぼ100％であることがわかる。(C) サンプルが入手できた患者のサブセットについて、個々の患者別の血液マイクロバイオームの相対的存在量。(D-F）（D）腫瘍、（E）皮膚、（F）血液サンプルの細菌門レベルでの相対的存在量。(G)新規登録患者全員の組織区画ごとのマイクロバイオームの違いを示すMDSプロット。(H) 1人の患者における組織区画ごとのマイクロバイオームの違いを示すMDSプロット。腫瘍の軟部組織に皮膚が近接しているにもかかわらず、腫瘍と皮膚の間で分類学的に分岐していることが強調される。MDSは多次元尺度法（multidimensional scaling）。

腫瘍内ウイルスマイクロバイオームは、NK細胞浸潤および臨床転帰の改善と関連する
次に、腫瘍内マイクロバイオームの影響を評価するために、複数の免疫リードアウトを用いてTMEの免疫組成を評価した。まず、NKp46の染色強度が死亡した患者よりも生存した患者で高いことが観察されたが、この所見は統計的に有意ではなかった（図6A）。次に、STS TMEにおけるNK浸潤の臨床的意義をさらに評価するために、我々の施設からのより大規模なSTSコホート（N=29、オンライン補足表2）を分析した。このコホートでも、腫瘍内NKp46の高発現患者（p=0.08）においてOSが改善する傾向が認められた（図6B,C）。患者11の腫瘍マイクロバイオームには、両時点で90%を超えるHHV-6が存在し（図6D）、GenBankのBLAST解析で確認されたことから、腫瘍内のウイルス量と臨床転帰の影響についてより深く理解しようとした。その結果、フローサイトメトリーで測定した腫瘍内ウイルスの相対量とNK浸潤の間に強い正の相関（r=0.90、p=0.006）が認められた（図6E）が、腫瘍内細菌や真核生物では認められなかった（図6F、G）。腫瘍内ウイルス量とNK浸潤の潜在的関連性を調べるために、我々はまた、ウイルスブラッケン数を分析し、これもフローサイトメトリーによるNK浸潤と正の相関（r=0.75、p=0.05）があった（図6H）。次に、フローサイトメトリーによるNK浸潤が高い場合の影響を評価したところ、転移のない患者は、転移のある患者と比較してNK浸潤が高い傾向を示した（p=0.11）。また、腫瘍内ウイルスブラッケン数も転移のない患者は転移のある患者と比較して高かったが、この差は有意な差ではなかった（図6I,J）。しかし、レスピロウィルス・ブラッケン数を解析すると、転移のない患者では、転移のある患者に比べ、腫瘍内レスピロウィルスが有意に多いことがわかった（図6K）。IHCとフローサイトメトリーに加えて、マイクロバイオームコホートのTMEをIFで解析した（図6N）。図6O,Pに示すように、NK細胞密度がMFS（r=0.45、p=0.078）およびOS（r=0.46、p=0.073）の両方に正の相関があるという心強い証拠が再度観察された。これらのデータは、肉腫のTMEにおける興味深い相互作用を示唆しており、腫瘍内のウイルス性マイクロバイオームの存在は、NK浸潤の増加および臨床転帰の改善と関連しています。

図6
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図6
腫瘍内ウイルス微生物群は、NK細胞浸潤および臨床転帰の改善と関連している。(A）免疫組織化学（IHC）分析によるNKp46の染色強度は、統計的に有意ではないが、マイクロバイオームコホートの生存患者において死亡した患者と比較して高いことが示された。(B）著者らの施設からの大規模なレトロスペクティブ軟部肉腫コホート（N=29、オンライン補足表2）からのNKp46染色強度のカプラン・マイヤー解析は、腫瘍内NKp46高発現患者において全生存率が改善する傾向を示す（p=0.08）。(C）NKp46の高染色と低染色の代表的なIHC写真（200×倍率）。(D）患者ごとのRT前およびRT後の腫瘍マイクロバイオームにおけるファミリーレベルのウイルス相対存在量。患者11では、RT前およびRT後の腫瘍マイクロバイオームにおいて、ヒトヘルペスウイルス6の相対量が90％を超えていた。 E）マイクロバイオーム患者における腫瘍内ウイルスの相対量とフローサイトメトリーによる生きたCD45+細胞のNK細胞数パーセントの間に強い正の相関が認められた（p=0.006, r=0.90）。(F）腫瘍内細菌および（G）真核生物の相対存在量は、CD45+細胞のNK細胞数パーセントと相関しなかった（それぞれp=0.70、r=0.18およびp=0.40、r=0.38）。(H）腫瘍内ウイルスブラッケン数は、CD45+生細胞NK細胞数パーセントと正の相関があった（p=0.05, r=0.75）。(I) 転移のないマイクロバイオーム患者は、転移のある患者と比較して、CD45+細胞の生存NK細胞率（フローサイトメトリーによる）が高い傾向を示した（p=0.11）。(J, K）全体の腫瘍内ウイルスブラッケン数は、転移の状態に基づく患者間で有意な差はなかったが、レスピローウイルスブラッケン数は転移のない患者で有意に高かった。(L-M）低NK細胞（患者8）および高NK細胞（患者11）浸潤を有する2人の患者の腫瘍内NK細胞（CD56+CD3-）およびCD3+T細胞（CD56-CD3+）を示す代表的フローサイトメトリゲートは、リンパ球の親ゲートから得られたパーセンテージであり、分析のための定量は生CD45+細胞の高次ゲートに基づいて行われた。(N）DAPIで染色した核（青）を背景に、NKp46の高発現と低発現（ピンク）を示す代表的なオパール顕微鏡写真。細胞密度はQuPathソフトウェアを用いて決定し、中央値に基づいて高発現と低発現に層別化した。(O-P）免疫蛍光法により、NK細胞密度は（O）無転移生存率（p=0.078、r=0.45）および（P）全生存率（p=0.073、r=0.46）の両方と正相関する傾向があった。DAPI, 4′,6-diamidino-2-phenylindole.NK, natural killer; RT, radiotherapy; SSC-A, side scatter area.抗ウイルス剤を投与したNK細胞は、転移がないにもかかわらず、転移があることを示す。

抗ウイルス表現型を持つNK細胞は、STSの生存率向上と関連している。
腫瘍内NK細胞および腫瘍内ウイルスマイクロバイオームが予後に及ぼす影響をさらに評価するために、次に、これらのマーカーを発現するNK細胞は抗ウイルス反応の高まりと関連していることから、CD57およびCD94の発現を調べた43-46。腫瘍内CD94発現（図7C）とOSの間にも同様の傾向が見られ、ピアソン係数は0.48であったが、これは統計的に有意ではなかった（図7D、p=0.1）。同様に、CD57の発現は、試験期間終了時に生存していた患者では、死亡した患者と比較して高かったが、これは統計的有意性には達しなかった（図7E、p=0.09）。中央値を用いて患者を高発現と低発現に層別化すると、CD57が高発現の患者は低発現の患者に比べ有意にOSが向上し（図7F、p=0.02）、CD94が高発現の患者もOSが向上したが、この差は有意には至らなかった（図7G、p=0.07）。全体として、これらの結果は、抗ウイルス表現型を持つNK細胞がSTSにおいてより良好な転帰と関連することを示唆しており、腫瘍内ウイルスマイクロバイオーム、NK細胞浸潤、および良好な臨床転帰の間の関連性がさらに強化された。

図7
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図7
抗ウイルス表現型を持つナチュラルキラー細胞は、STSの生存率向上と関連している。(A）著者らの施設の大規模なレトロスペクティブSTSコホート（N=29、オンライン補足表2）のCD57の低染色と高染色の100倍拡大した代表的IHC写真（B）STS患者の全体生存率はCD57発現と正の相関があり、統計的に有意な傾向があった（p=0.06, r=0.53）。(C）CD94の低染色と高染色の代表的なIHC顕微鏡写真（100×倍率）。(D）STS患者の全生存率は、統計学的に有意ではないが、CD94発現と正の相関を示した（p=0.1, r=0.48）。(E）CD57の発現は、生存した患者と死亡した患者で高い傾向を示した（p=0.09）。(F-G）CD57とCD94の発現のKaplan-Meier解析で、高発現と低発現を発現レベルの中央値で層別化したもの。(F) CD57の腫瘍内発現が高い患者は、低い患者に比べ、全生存率が有意に改善した(p=0.02)。(G）CD94の解析では、腫瘍内CD94の高発現の患者は低発現の患者と比較して、全生存率が改善する傾向が見られた（p=0.07）。IHC、免疫組織化学的、STS、軟部組織肉腫。

考察
無菌操作と厳格な収集プロトコルを用いたこの前向き分析において、我々は全ゲノムショットガンシーケンスを用いて、診断時およびRT後のSTS患者における測定可能な腫瘍内マイクロバイオームの存在を証明した。特に、腫瘍内ウイルス相対量が腫瘍内NK細胞浸潤および生存率の向上と関連しているという興味深いデータから、診断時のSTS腫瘍内マイクロバイオームには予後的意義がある可能性が示唆された。さらに、術前RTを受けたSTS患者の腸内細菌を前向きに解析したところ、患者や治療期間によって著しい変動が認められたが、腫瘍の転帰とは関連がないようであった。また、腸内細菌と転帰との関連も観察されなかった。これは、腸内細菌が非常に複雑であるためか、腸内細菌が手術やRTなどの局所療法ではなく、ICIなどの全身療法とより密接に関連している可能性があるためである。

我々はSTSにおける腫瘍内マイクロバイオームの存在を立証するデータを提示するが、真核生物またはヒトのDNAの存在量（99％以上）と比較して、非真核生物のDNAの全体的な相対的存在量が低かったことに注目することが重要である。しかし、ヒトのゲノムが微生物のゲノムよりも指数関数的に大きいことを考えると、この結果は予想外ではありません。12 私たちの腫瘍サンプルにおける非真核生物 DNA の相対量が少ないことを考慮すると、無菌収集プロトコールにもかかわらず、汚染の可能性を完全に排除することができないことは認めざるを得ません。しかし、表面コントロールと比較した場合、すべての腫瘍サンプルにおける真核生物および非真核生物DNAの相対量は一貫して再現性よく異なっており、このことは、我々の所見が無作為でもなければ、汚染だけに起因するものでもないことを示唆している。さらに、患者11の腫瘍内マイクロバイオーム配列と免疫TMEのデータから、アルファ多様性が低く、この患者の非真核生物DNAの90%以上がHHV-6に起因し、高いNK浸潤を伴っていることが示された。これらの所見は、3ヶ月間隔で採取された同じ患者の腫瘍サンプルで再現性があり、偶然に起こる可能性は極めて低いので、この所見が汚染のみに起因するものではないことをさらに裏付けるものである。

腫瘍内ウイルスマイクロバイオームと腫瘍浸潤NK細胞との関係を解析した結果、フローサイトメトリーによる腫瘍内ウイルスの相対量とNK細胞との間に納得のいく関連性が見出された。STSではNK細胞浸潤の全体的な程度は概して低かったが、IHCによるNKp46の高い発現はOSの改善と関連しており、同様にIFによるNK細胞密度はMFSおよびOSの両方と正の相関があることが示された。ウイルスは、活性化受容体を通じて直接的に、またNK細胞活性化サイトカインの放出を通じてNK細胞を刺激することから、腫瘍内ウイルスのマイクロバイオームが、腫瘍に浸潤するNK細胞のプライミングに重要な役割を果たし、予後の程度を左右すると考えられる22。患者の生存率との関連に加えて、腫瘍浸潤NK細胞と腫瘍内ウイルス（特にレスピロウイルス）は、転移を生じなかった患者で高いレベルで確認された。抗ウイルス反応に特異的に関連するNKマーカーであるCD57とCD94の発現を解析したところ、TMEでの高い発現がより良い予後と関連しており、この潜在的な関連性も強調された。

我々の研究で得られた刺激的な知見にもかかわらず、限界を認識する必要がある。15人の患者からなるこの前向きコホートは小規模であり、追跡期間も比較的短かったため、腫瘍内マイクロバイオームと再発および生存との潜在的な関連性に関して確固たる結論を導き出す能力には限界がある。慎重な組織、収集、解析にもかかわらず、汚染や偽陽性結果はマイクロバイオーム研究の計画や解釈における大きな課題であることを認識している。綿密な研究計画、厳格な収集プロトコル、対照群のサンプリング、全ゲノムショットガンシーケンスを用いた高品質な解析は、我々の研究の特筆すべき強みであるが、我々の結果はマイクロバイオーム解析に固有の汚染を反映している可能性がある。さらに、今回登録に成功した15名の患者数は、比較的少ない。STSが希少疾患であることを考慮すると、すべての研究基準を満たす15人の患者を登録することは重要な閾値であるが、決定的な研究を行うには、おそらく約10倍の登録が必要であろう。しかし、マイクロバイオーム研究における科学的発見のスピードが速いことを考えると、そのような研究は合理的な期間内に実現できなかったでしょう4 5。

最終的に、我々のデータは、前向きSTSコホートにおいて、測定可能で臨床的に関連性のある腫瘍内マイクロバイオームの存在を実証している。転移が進行し死亡した患者において、腫瘍内マイクロバイオームは予後にとって重要であり、ウイルスの相対的な存在量がNK浸潤と予後の改善を促すようであることを実証している。また、我々のデータは、腫瘍内マイクロバイオームとSTS TMEとの関連を示唆しており、STS患者の免疫浸潤と転帰に影響を与えるためにSTS腫瘍内マイクロバイオームの標的化方法を理解することの重要性を強調するものであった。

データ提供について
データ提供のご希望に応じます。

倫理に関する記述
発表に関する患者さんの同意
該当事項はありません。

倫理的承認
本研究の倫理的承認は、カリフォルニア大学デービス校の施設審査委員会（プロトコル#939793-5および#484670-5）により取得された。参加者は、インフォームドコンセントを得た上で研究に参加した。

謝辞
Abimbola Olusanyaには患者の機密保持と記録管理を手伝ってもらい、病理学教室のDoug Peabody, Jesse Low, Lesha Saltoには試料準備と試料採取を手伝ってもらい、特に感謝する。

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補足資料
補足資料
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データ補足1
データ補足2
脚注
LMP と SMC は同等に貢献した。

LMP、LBJ、UNB、JAE、RJCが研究の企画を行った。LMP、SMC、MAD、SJJ、JAE、RJCは実験を行い、データを収集した。LMP, SMC, KTK, MAD, BPD-J, AAG, SJJ, JAE, RJCはデータを解析した。LMP、SMC、RJCは原稿を執筆した。AMM、JC-A、SWT、WJMを含む全著者が原稿の批評を行った。RJCは、完成した研究成果および/または研究の実施について全責任を負い、データにアクセスし、出版の決定を支配した。

NCI P30 CA093373 (Cancer Center), and S10 OD018223 (Astrios Cell Sorter), and S10 RR 026825 (Fortessa Cytometer) grantsからの資金援助、Bridget McLaughlin, Jonathan Van Dykeからの技術支援も得ている。標本は、National Cancer Institute (NCI P30 CA093373) とUC Davis Department of Pathology and Laboratory Medicineが共同で授与するUC Davis Comprehensive Cancer Support Grant (CCSG) によって提供されたUC Davis Pathology Biorepository から提供された。配列決定は、NIH Shared Instrumentation Grant 1S10OD010786-01 の支援を受け、UC Davis Genome Center の DNA Technologies and Expression Analysis Cores で行われ、Ms Emily Kumimoto, Ms Claire Barron Goldman, Dr Lutz Froenicke の技術支援を得た。また、UC Comprehensive Cancer Centerの寛大な助成金により、研究支援が行われた。この研究は、LMP (T32 CA251007) とKTK (T32 CA251007) に授与されたNCI資金によるプレドクトラルフェローシップからも一部支援を受けている。

競合利益 なし。

Provenance and peer review 委託研究ではなく、外部専門家による査読。

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