32ヵ国56,989人において、腸内芽球癆はより健康的な食生活とより良好な心代謝系アウトカムに関連している
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32ヵ国56,989人において、腸内芽球癆はより健康的な食生活とより良好な心代謝系アウトカムに関連している
オープンアクセス掲載:2024年07月08日DOI:https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.06.018
ハイライト
-腸内細菌叢におけるBlastocystisの有病率は、地域やライフスタイルによって異なる。
-健康的な植物ベースの食事は腸内ブラストシスチス保有率の増加と関連する。
-ブラストシスチス陽性者は心代謝プロファイルがより健康的である傾向がある。
-ブラストシスチスの存在は、食事改善介入プログラム後に増加する。
要約
食事はヒトの健康に影響を及ぼし、体脂肪率や心代謝性疾患の発症リスクに影響を及ぼす。腸内細菌叢は食事-健康軸の重要な担い手であるが、その細菌分画は広く研究されている一方で、ブラストシスチスを含む微小真核生物の役割についてはあまり研究されていない。われわれは56,989個のメタゲノムについて世界規模の解析を行い、ヒトのブラストシスチスは、地理、ライフスタイル、食習慣に関連した明確な有病パターンを示すことを示した。ブラストシスチスの存在は特定の細菌シグネチャーを定義し、より良好な心代謝プロファイルと正の相関を示し、肥満（p< 1e-16）および腸内生態系の変化に関連する疾患（p< 1e-8）と負の相関を示した。1,124人を対象とした食事介入研究では、食事の質の改善が体重減少と関連し、ブラストシスチスの有病率（p= 0.003）と存在量（p< 1e-7）の増加がみられた。この知見は、ブラストシスチス（Blastocystis）が有益な役割を果たす可能性があることを示唆しており、食事に対する宿主の個別化された反応や、下流の疾患病因の説明に役立つ可能性がある。
グラフィカル抄録
キーワード
はじめに
数十年にわたるエビデンスにより、食事からの摂取と慢性疾患の発症が関連付けられてきた。
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具体的な推奨は様々であるが、主要な権威は
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は、長期的な疾患リスクの改善には質の高い食事が有効であることを推奨している。
我々は最近、単一コホート研究において、ブラストシスチスを保有するヒト腸内微生物群集が、食後グルコース反応、体脂肪率の測定、およびその他の良好なバイオマーカープロファイルの改善と関連していることを示した。
ブラストシスチスは、宿主の健康状態における役割がまだ明らかでない、一般的な単細胞真核生物である。
ブラストシスチスは遺伝子レベルで驚くほど多様である。
現在、サブタイプ（ST）と呼ばれる少なくとも28の異なる種に分類されている10。
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これらのSTのうち少なくとも8種がヒトで同定されており、ST1、ST2、ST3が最も一般的である。
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ブラストシスチスの有病率に関する以前のメタゲノム研究にもかかわらず（最大1,689人
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)にもかかわらず、腸内ブラストシスチス、栄養、および肥満、2型糖尿病（T2D）に至るインスリン抵抗性、または脳卒中や冠動脈疾患などの心血管疾患の発症を指す心代謝系健康アウトカムとの関係を確立するには、正確な食事情報を伴うより大規模で多様なコホートが必要である。
われわれは、複数のコホートから得られたデータを統合・調和させ、ブラストシスチスの世界的分布を明らかにし、その存在が心代謝系の健康に対する食物摂取の不均一で個人差のある寄与を説明するのに役立つかどうかを調べた。我々は、宿主種（すなわち、ヒト対非ヒト）、年齢、地理、および生活様式に影響されて、ブラストシスチスとそのSTの有病率が非常に変動することを見出した。ZOE PREDICT試験（Personalised REsponses to DIetary Composition Trial；PREDICT 1、PREDICT 2、PREDICT 3 US21、US22A、UK22A）では、食事と健康リスクの変数が利用可能であり、食事の質とBlastocystis保菌の間に密接な関係があり、より良好な心代謝プロファイルを有する参加者における保菌が観察された。我々はこれらの知見を外部的に検証し、ブラストシスチスの保有と体脂肪率との間に負の関連があること、また炎症性腸疾患（IBD）を含む腸内細菌叢との関連が以前に確立された疾患についても実証した、
大腸がん（CRC）を含む、
糖尿病などである。
最後に、食事の質を改善し体重を減少させた6ヵ月間の個別化食事介入研究参加者において、ブラストシスチスの有病率と存在量の有意な増加が観察された。これらの結果から、ブラストシスチスは、より健康的なライフスタイルのマーカーとして、食物に対する宿主の反応を個別化し、下流の疾患感受性に有益な役割を果たす可能性があることが示唆された。
研究結果
世界的なブラストシスチス分布の大規模かつ多様で調和されたメタゲノム調査
ブラストシスチスの存在と食事、健康アウトカム、および地理的な関連付けを行うために、マイクロバイオーム、食物摂取、および心代謝バイオマーカーに関する詳細な情報を有する5つの大規模な多国籍研究、すなわちZOE PREDICT研究へのアクセスを活用した。これらには、以前に発表されたPREDICT 1
と4つのコホート、すなわちPREDICT 2と3つのPREDICT 3コホート（US21、US22A、UK22A）である（STAR Methods）。
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これらのコホートを合わせると、英国（UK）の様々な地域から13,354人（PREDICT 1n= 1,001、PREDICT 3 UK22An= 12,353）、米国（US）から21,333人（PREDICT 1n= 97、PREDICT 2n= 968、PREDICT 3 US21n= 11,798、US22An= 8,470）、合計34,687人となり、そのうち25,548人が健康成人とみなされた（STAR Methods）。PREDICT試験の参加者それぞれについて、ベースライン時に人口統計学的情報と心代謝系血液マーカーが収集された。長期の習慣的な自由食は、確立された食物摂取頻度調査票（FFQ）を用いて評価され、毎日の食事（すなわち短期的な食事）はデジタル食物ログを用いて記録された（STAR Methods）。
また、宿主の年齢、性別、体格指数（BMI）、健康状態に関する情報を含む2つのコホート（本研究の一環として配列決定された2,596のメタゲノムを含むSardiNIAおよびDutch Microbiome Project [DMP] からの6,047サンプル；STAR Methods）、および追加的な食事嗜好に関する情報を含む5つのコホート（そのうち3つはイタリアからの参加者を登録）を対象とした
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(DeFilippisF_2019、MeslierV_2020、TaralloS_2021;STAR Methods)、米国から2名。
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(Mind-Body Study [MBS]とMen's Lifestyle Validation Study [MLVS];STAR Methods）の2つである。世界レベルでのブラストシスチスの存在を明らかにするために、さらにヒト腸内細菌叢のショットガンメタゲノムサンプルを持つ61の公開コホートを同定し、curatedMetagenomicData ver. 3（cMD3）から収集した、
に、年齢、性別、出身国、BMIを含むホストの情報を加えた（STAR Methods）。
これらのヒトのデータを合計すると、合計73のデータセットと56,989人（表S1）から得られた便メタゲノムになり、このうちn= 41,428人が健常人／対照者のデータで、n= 15,561人が「健常人ではない」（すなわち、一般に様々な症例／対照マイクロバイオーム研究から得られた症例；STAR Methods）と考えられる。このうち1,034人については、さらに縦断的な腸内マイクロバイオームサンプルが入手可能であった（STARMethods;Table S4）。さらに、ZOE PREDICT個別化食事介入研究（PREDICT 3 UK 23A RT）から、介入前後にマイクロバイオームサンプルを採取した1,124人の健常人を含めた（STARMethods）。さらに、口腔（n= 243）および皮膚（n= 237;STAR Methods;表S1）、ならびに古糞（STAR Methods）から採取した28の古代ヒトメタゲノム（STAR Methods）という、ヒトの他の身体部位からのサンプルも含めた。
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ブラストシスチスはヒト以外の宿主でも報告されている、
哺乳類、爬虫類、鳥類、両生類、昆虫類、甲殻類、軟体動物、線虫類、後生動物にまたがる）214種、49の公開データセットから4,590の腸内メタゲノムを検討した（STAR Methods;Table S2）。合計で139の異なるヒトおよび非ヒトのデータセット、合計65,809のメタゲノムをコンパイルした。
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を用いてプロファイリングし、ヒトで以前に報告された8種類の遺伝学的に異なるブラストシスチスSTの存在と存在量を決定した。
(STAR Methods;図S1A）。
図S1異なる配列決定深度におけるBlastocystisSTsとBlastocystis検出のゲノム比較（ 図1 および STARMethodsに関連 ）。
世界的なブラストシスチスの有病率は様々で、腸内微生物群集に限定されている。
ブラストシスチスは8,190のヒト便サンプル（総数n= 56,989のうち）で検出され、予想通り、他のヒトの身体部位では検出されなかった（表S1）。32カ国の健康な成人において、腸内ブラストシスティス有病率には地理的な不均一性が顕著であった。最も低い有病率は北米で観察され（6.64％、すべてのフィッシャー検定q値＜1e-3）、ヨーロッパでは比較的高い有病率（22.14％）を示した（図1A；表1およびS1）。国レベルでは、フィジー
フィジーは50検体以上ある代表的な地域の中で最も高いブラストシスチス有病率（56.29％、n＝167）を示したが、日本は最も低い（2.46％、n＝244）。
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タンザニア、エチオピア、カメルーンではブラストシスティスの有病率が高かった（35％以上；表S1）。ヨーロッパ諸国では中等度の高い有病率（通常15％以上）を示したが、アジア諸国では日本の2.46％からイスラエルの29.18％までの範囲であった。先行研究と一致している、
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PREDICT 1（米国）、PREDICT 2、PREDICT 3 US21およびUS22A参加者の14,692検体中951検体（6.47％）が陽性であった（図1B；表S1）。米国人口が多かったため、米国国勢調査局（US Census Bureau）の区分でさらに調査することができ、中西部と南部とで比較すると、両東部で増加していることが示された（図1B）。一般に、BMIが「健康体重」（すなわち、18.5≦BMI＜25kg/m2；表S1）の人のみを考慮すると、ブラストシスチス陽性サンプルの割合が増加した。
図1ブラストシスチスの世界的な有病率は、ヒトの腸内細菌叢における非病原性の役割を示唆し、民族的・地理的パターンを明らかにしている。
表1健常成人の腸内細菌叢におけるブラストシスチスの世界的有病率
データセット ST1 (%) ST2 (%) ST3 (%) ST4 (%) ST6 (%) ST7 (%) ST8 (%) ST9 (%) 有病率 (%)nサンプル
予測1 3.01 5.10 8.93 7.92 0.64 0.36 0.09 0.64 25.68 1,098
予測2 1.25 1.02 2.84 1.93 0.34 0.91 0.46 0.34 8.65 879
予測3 (UK22A) 3.52 6.12 7.35 8.98 0.52 0.54 0.14 0.53 26.99 9,855
予測3 (US21) 0.78 0.69 1.70 1.44 0.50 0.50 0.77 0.50 6.37 7,939
予測3 (US22A) 1.16 0.64 1.23 1.19 0.33 0.73 0.92 0.31 6.18 5,777
健康成人25,548人
大陸 ST1 (%) ST2 (%) ST3 (%) ST4 (%) ST6 (%) ST7 (%) ST8 (%) ST9 (%) 有病率 (%) n サンプル n データセット
アフリカ 10.10 8.01 8.81 0 0 0 0 0 23.40 624 8
アジア 5.01 2.23 7.10 0.42 0.93 0.42 0.09 0.93 15.92 2,154 16
欧州 2.95 4.67 6.84 6.86 0.46 0.42 0.17 0.47 22.14 21,511 31
北米 0.97 0.68 1.71 1.47 0.43 0.61 0.80 0.42 6.64 15,480 16
オセアニア 18.56 4.19 37.13 0 0 0 0 0 56.29 167 1
南米 11.29 9.68 4.84 0 0 0 0 0 20.97 62 4
全体 2.49 3.06 5.02 4.28 0.47 0.48 0.41 0.47 15.97 39,998 71
この表は、ZOE PREDICTの5つのコホートにおけるBlastocystisの有病率と、募集したデータセットに含まれる6大陸の世界的な有病率を示している。サブタイプ（ST）の分布は、地域によって大きく異なっていた。有病率の推定値は、12歳以上の健康な人の検体から算出した。表S1も参照のこと。
これらの生物学的および生態学的差異を検証し、サンプル間のリード深度のばらつきの寄与を除外するために、すべてのサンプルを1000万（M）ランダムリードに希釈し（STAR Methods）、Blastocystisの有無を再評価した。国レベルでは、有病率に大きな変化はなく、全リード深度で報告されたものと同じであった（表1；図S1C）。さらに、英国を拠点とする2つのPREDICTコホート（PREDICT 1とPREDICT 3 UK22A）におけるBlastocystisの有病率は、後者のサンプルは前者の半分の標的深度まで配列決定されたにもかかわらず、ほぼ同じであった（それぞれ26.97%と26.99%）（平均リード数：それぞれ58.3M対31.2M;Table S1）。最後に、高い配列決定深度でも、考慮するリード数を増やしても有病率は飽和しないことが観察された（図S1D）。したがって、ワークフローの感度を最大化するために、各サンプルのリードの完全なセットを利用してダウンストリーム解析を行った。重要なことは、同じデータセットから得られたサンプルは一般的に類似したシーケンス深度であったため、潜在的な検出限界はコホート内比較に影響しないということである。
ブラストシスチスSTの分布は、地域、年齢、宿主、およびライフスタイルによって異なる
我々は、BlastocystisSTのキャリッジと地理的および生活様式の違い（広義には欧米化vs非欧米化であり、この定義は複数の側面を包含している；STAR Methods）との関係を調査した。ST1およびST2はともに非西欧化集団でより多くみられたが、ST4は欧米化した人の検体でのみ検出された（図1Cおよび1D）。先行研究と一致して、ST4はヨーロッパでは一般的に検出されたが（6.86％）、非ヨーロッパ諸国ではごくわずかしか検出されなかった（中国、カザフスタン、イスラエル、米国、カナダ、それぞれ3％以下；表S1）。
アフリカ、アジア、オセアニア、南米の非西洋化集団では、ST6、ST7、ST8、ST9は検出されなかった。逆に、ブラストシスチスの有病率が一般的に低い北米では、ST6～9はST1およびST2と同程度のレベルで検出された（有病率1％未満）。先行する知見と一致して、新生児ではブラストシスチスは検出されなかった（健康な新生児831検体中1検体でST1のみが検出された；表S1）ことから、ブラストシスチスは後天的に獲得される可能性が高く、生後数ヵ月間の母親から乳児への伝播の対象にはならないことが示唆される。
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逆に、小児（1～11歳）では、ブラストシスチスST1、ST2、ST3、ST4のみが検出された（図1E；表S1）。エチオピアの非西洋化集団を分析した最近の研究では
我々はまた、ブラストシスチスSTが生活様式や年齢カテゴリーによって異なる流行を示すだけでなく、母親と乳児の間でも異なる共有があることを示した（例えば、ST2は存在する場合には株レベルで共有されるが、他のSTはほとんど共有されない）。
ヒトの8つのブラストシスチスSTは、検査したほとんどの動物種で検出されず（表S2）、ST1、ST2、ST3のみがヒト以外の霊長類（NHP）でまれに検出され、ほとんど飼育下でのみ検出された（フィッシャーの正確p値＝3.18e-7）ことから、ヒトからの感染の可能性が示唆された。
注目すべきは、野鳥のAnas creccaから採取した検体からBlastocystisST7が検出されたことである。
このように動物でブラストシスチスが検出されることはまれであるが、これはヒトで既に報告されている8つのSTに注目したためである。ヒト以外の宿主で発見された他のブラストシスチスSTは、一般的に完全なゲノム配列が決定されていないため、我々のパイプラインではプロファイリングできなかった。
これらを総合すると、ヒトのブラストシスチスとそのSTの世界的な有病率は、宿主のタイプ、年齢、地理的条件などさまざまな要因によって異なっていた。また、健康な人の間でもブラストシスチスがやや多く存在する（約16％）ことから、ヒトの腸内微生物群集において非病原性の役割を担っている可能性が示唆される。
ブラストシスチスの保菌が現代に特有であるかどうかを調査する、
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我々は、いくつかの異なる場所で発見された古糞から採取した28の古代のメタゲノムにおけるブラストシスチスの存在をプロファイリングした（STAR Methods）。
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ST1は3検体（西暦650年頃のメキシコ産2検体と西暦595年頃の米国産1検体）から検出され、ST3は1検体（西暦650年頃のメキシコ産）から検出された（表S1）。古代のヒトの腸内メタゲノムからブラストシスチスが検出されたことから、ブラストシスチスは人類の歴史から遠く離れた時代にも比較的広く存在していたことが示唆される。
ブラストシスチスのコロニー形成は持続的であり、宿主の遺伝とは無関係である。
複数の時点で縦断的なサンプリングを行った個体では、さらにブラストシスチスのコロニー形成の持続性を評価することができた（STAR Methods）。ほとんどの場合、同じ個体が長期間にわたって陽性または陰性のままであった（95.2％、少なくとも2回の縦断的サンプルを得た878人中836人、サンプル間の中央値180日；表S4）。少なくとも2つの時点でブラストシスチス陽性の92人と3つの時点でブラストシスチス陽性の18人をそれぞれ調べたところ、97.8％と94.4％の症例で同じSTが維持されていた（表S4）。このことは、ブラストシスチスが存在する場合、ヒト腸内細菌叢の安定したコロニー形成者である可能性が高いことを示している。
次に、3つの異なるデータセットから一卵性双生児（一卵性双生児、MZ）と二卵性双生児（二卵性双生児、DZ）のサブグループ解析を行い、ブラストシスチスのコロニー形成における宿主遺伝の潜在的役割を評価した
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(STAR Methods）。1,424人の双生児参加者において、Blastocystis保菌率は、それぞれの研究で得られた他の非双生児参加者の保菌率とほぼ同じであった（表S4）。その結果、MZ双生児（19.8％、[95％信頼区間（CI）、13.0％-26.7％]）とDZ双生児（21.6％、[95％CI、13.6％-29.6％]）の間で同程度の一致が認められ、Blastocystis保有率は遺伝的要因以外（すなわち、環境要因）によってほとんど決定される可能性が示唆された。この結論は、ブラストシスチス陽性きょうだいの一致ペアが異なるSTを保有する傾向があること（MZでは65.4％、DZでは72.7％）、無作為にペアにした参加者対DZ対MZ双生児（すなわち、非血縁から近縁、一卵性生殖細胞系列まで；表S4）の一致に傾向がないことによっても支持された。この関連性の欠如は、兄弟姉妹や双子（もはや同居していないものであっても）は、まったく血縁関係のない人よりも類似した生活様式を送る可能性が高いという可能性を考慮すると、注目に値する。
ブラストシスチス保有はより健康的な食事の摂取と関連している
食事は腸内細菌叢に大きな影響を与える可能性がある。
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食生活は腸内細菌叢に大きな影響を及ぼし、宿主の地理的条件やライフスタイルの影響を受ける、
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我々は、Blastocystisの存在が、異なる食餌療法と食餌の質に関連しているかどうかを明らかにしようとした。7つのデータセット（4つのPREDICTコホート、イタリアの2つのデータセット、米国のMBS/MLVSデータセット；STAR Methods）の健康な成人を検討し、雑食、ベジタリアン、ビーガンなど、確立された食事体系に層別化したところ、ベジタリアンのブラストシスチス有病率の中央値が高かった（図2A；表S3）。
図2高いブラストシスチス有病率は、植物性食品を多く含む健康的な食事と一貫して関連している。
さらに、PREDICT研究において、ブラストシスチス有病率は、FFQ（STAR Methods）によって評価された、より慎重なスタイルの食事と有意な用量依存的連関を示した。これらの米国および英国ベースのコホートにおいて、英国ベースのPREDICT 1およびPREDICT 3 UK22A試験と、米国ベースのPREDICT 2およびPREDICT 3 US22A試験を比較すると、全体的な有病率に国ごとの違いがあるにもかかわらず、健康的な植物ベースの食事指標（hPDI）の遵守率の増加は、ブラストシスチスの保菌率の増加と関連していた（すべてのMann-Kendall検定p値＜0.05、ただしPREDICT 3 UK22A；図2B；STAR Methods）。さらに、各US部門におけるhPDI値の中央値は、Blastocystis有病率と有意な相関を示した（ピアソンのr = 0.73、p値 = 0.02；図S2A）。hPDIは、全粒穀物、果物、野菜の摂取を強調する確立された食事パターンであり、疫学的にも良好な心代謝転帰に関連している。
この傾向は、使用した食事評価ツール（FFQvs デジタル記録）および食事摂取の時間スケール（長期 vs 短期）の両方に対して頑健であることを強調している。ブラストシスチス有病率における反対の傾向は、参加者が「不健康な」植物ベースの食事指標（uPDI）を遵守している場合に観察された（図S2B）。
図S2Blastocystisの存在と食事の質および心代謝マーカーとの関連（ 図2 および 3に関連
次に、単一の食品成分について調べたところ、ブラストシスチスの存在と一貫した用量依存的な関係が確認された（マン・ホイットニーのU検定、q値＜0.1；図2C）。一般に、アボカド、ドライフルーツ、ナッツ類、種子類、豆類、アブラナ科の野菜など、加工されていない植物性食品を多く摂取する人は、そのような食品の摂取量が少ない人に比べてブラストシスチス陽性の可能性が高かった（図2C）。逆に、ブラストシスチス陰性の人は、NOVAの分類によると、食品加工のレベルが高く、健康増進効果の低い植物性および動物性食品をより頻繁に摂取する傾向があった、
フライドポテト、キャンディー、人工甘味料入り飲料などであった（図2C）。集団特有の違いはあるものの、これらの傾向のほとんどは、すべてのPREDICTコホートにおいて方向性が一致していた。それにもかかわらず、いくつかの食品は一様に一致しなかったが、これは偶然の所見、個人間の反応の違い、国特有の調理基準や消費パターン、あるいは特定の食品の分類の不正確さを反映している可能性がある。例えば、PREDICT 3 UK22AおよびUS22Aの両コホートでは、魚の消費量が多いほどBlastocystis保有率が高いことと強く関連していたが、小規模のPREDICT 1またはPREDICT 2コホートでは明確な傾向は認められなかった（図2C）。この食い違いは、天然魚と養殖魚の区別が難しいこと、また超加工品と未加工品の違いによるものかもしれない。同様に、穀物の摂取量も、健康によいものとそうでないものがあるため、十分に把握できていない可能性がある（図2C）。全体として、ブラストシスチスの存在は、食事の質が高いこと、および加工度が低く食物繊維が豊富な食品の摂取と関連していた（図S2C）。
腸内ブラストシスチスはより良好な短期的心代謝バイオマーカーと関連している
次に、ブラストシスチスの存在が心代謝系の健康のバイオマーカーと関連しているかどうかを評価した。腸内細菌組成と空腹時および食後反応とを関連付ける我々の先行知見を発展させるために、以下のことを行った、
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は、宿主の健康状態を代表すると報告されているバイオマーカーをテストした、
また、疾患参加者における極端な値の可能性の影響を制限するために、健康な成人のみを対象とした（図S2E；STAR Methods）。
利用可能な臨床的リスク指標のうち、ブラストシスチスの存在とアテローム性動脈硬化性心血管病10年リスクスコア（ASCVD；STAR Methods）との間に明確な関係は認められなかった。
しかし、ブラストシスチスは拡張期血圧の低下と関連しており（図3A）、収縮期血圧はより低い値を示したが有意差はなかった（図S2D）。臨床測定によるグルコース濃度（STAR Methods）は明確な関連を示さなかったが、C-ペプチド値はブラストシスチス陽性者で有意に低かった（PREDICT 1q値＝3.76e-4およびPREDICT 2q値＝9.96e-3；図3B）。ブラストシスチス保因者においてC-ペプチド値が低いことは、耐糖能の改善またはインスリン感受性の亢進の代用であると解釈される。
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我々はまた、ブラストシスチス保菌とより良好な脂質プロファイルとの間に一貫した関係を見出した（図3C-3F）。ブラストシスチス保有者は概して、空腹時および食後の高密度リポ蛋白（HDL；図3D）が有意に高く、トリグリセリド値が低かった（図3F）。低HDLおよび高トリグリセリド血症はともに、その後の心血管疾患リスクの確立された危険因子である。
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T2Dリスクと関連する炎症性バイオマーカーであるGlycA
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および心血管疾患、
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は、PREDICT 1とPREDICT 2の両方で、ブラストシスチス保菌者において一様に低下していた（それぞれq値＝2.97e-5と9.96e-3；図3G）。Blastocystisの相対量を評価した場合にも同様の関連が観察された（図S9G；STAR Methods）。
図3Blastocystisはより良好な短期心代謝プロファイルと関連していた。
PREDICTコホートの健常成人において、2つ以上のSTを保有する芽球菌陽性者はほとんどいなかった（n= 130/3,555、3.66％；図S1B）。複数のST保菌は、単コロニー保有者に観察された関係を超えて、BMIまたは心代謝マーカーと有意な関連はなかった（図S5D）。先行研究では、ブラストシスチスと宿主の転帰に関連するサブクレードレベルの不均一性の可能性が示唆されていた、
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上記の所見をST別に層別化したところ、効果の大きさと方向性の両方において、層別化しなかった結果と概ね一致した（図3H-3JおよびS3A）。ブラストシスチス保有率が、食事が心代謝系の健康に与える影響の単なる指標である可能性を排除するために、参加者をhPDI値に基づいて、健康的でない（Q1）食事からより健康的な（Q4）食事までの四分位に分けた。予想されたように、上位四分位（Q4）の人は概して心代謝プロファイルが良好であった。それにもかかわらず、食事の質の各四分位値において、ブラストシスチス陽性者はブラストシスチス陰性者よりもトリグリセリド、C-ペプチド、GlycA値が低く、HDL値が高かった（図S4A-S4F）。さらに、線形回帰モデルにより、ブラストシスチスはhPDIとは独立した心代謝マーカー値の有意な予測因子であることが示された（図S4G）。これらの結果は、ブラストシスチスの存在が、心代謝系の健康の改善に対して相加的なプラスの効果を持つ可能性を示している。
図S5Blastocystisの存在および相対的存在量と、より健康的なライフスタイルおよび食生活のマーカー、良好な心代謝マーカー、および慢性疾患のオッズ低下との関連（ 図5 および STAR Methods関連
図S3単一のブラストシスチス・サブタイプは、さまざまな空腹時および食後の心代謝マーカーにおける全体的なブラストシスチス陽性傾向と 一致している。
ブラストシスチスは 、図2 および 図3に関連して、心代謝マーカー値およびBMIの有意な独立予測因子で ある。
ブラストシスチスは体重減少に関連し、健常対照者では濃縮されている。
ブラストシスチスとより健康的な食事やより良好な心代謝プロファイルとの関連性を考慮し、我々は体脂肪率との潜在的な関連性を探索した。我々は以前に、ブラストシスチスを保有する個体は内臓脂肪の減少を示したことを報告した
(図S5AおよびS5B）。内臓脂肪は脂肪分布の重要な評価であり、心代謝性疾患の独立した危険因子である、
また、肥満と正常と高代謝リスクプロファイルの患者を区別する特徴でもある。
しかし、その測定には複雑な技術が必要である、
が必要であり、大規模集団ではほとんど利用できない。そこで、より広く利用可能な体脂肪率の代用指標であるBMIを用いて、PREDICTの全コホートの個人を3つの確立されたBMI群に分類した。
健康体重、18.5≦BMI＜25kg/m2；「過体重」、25≦BMI＜30kg/m2；「肥満」、BMI≧30kg/m2、サンプルサイズが小さいためBMI＜18.5kg/m2の個体は除外；図S5C；STAR Methods）。すべてのPREDICTコホートで、過体重または肥満の人と比較して、健康体重の人のBlastocystis有病率が高く、BMI値の増加とともにBlastocystis有病率が単調減少することが示された（図4A）。同様の傾向はブラストシスチスの相対存在量を用いて観察され、BMI値が低いほど存在量が多いことと関連していたが、統計的に有意ではなかった。さらに、食事の質が同程度であっても、ブラストシスチス陽性者はBMI値が低い傾向があることから、食事以外に、ブラストシスチス保有が体脂肪率に独立した影響を与えている可能性が示唆された（図S4H-S4K）。睡眠を含む他の生活習慣指標は、食事および体重と関連している、
,
そして我々は、ブラストシスチスの存在と1晩あたりの睡眠時間の増加との間に正の関連を観察した（図S5E）。
図4ブラストシスチスの存在に関するメタアナリシスは、世界中の体脂肪率および腸内細菌異常症のマーカーと一貫した再現性のある関連を示した。
cMD3パッケージを活用した
を活用し、12カ国にまたがる24の異なる研究から36,065人の健康な成人を同定し、BMI情報が入手可能で、各研究内で少なくとも10人のブラストシスチス陽性者を同定した（表S5）。ランダム効果メタアナリシスを用いて、Blastocystisが一貫して有意に低いBMI値と関連していることを確認した（BMIが1ポイント上昇すると、Blastocystis保菌のオッズが6％低下した、ランダム効果サイズ＝-0.06；95％CI＝-0.07～-0.05、p値＜1e-16；図4C）。次に、慢性疾患とBlastocystis有病率の差との間の潜在的な関連を調査するために、以下のことを行った、
症例13,548例（PREDICTコホートから9,091例）と健常対照31,358例を、8つの疾患カテゴリーにまたがる19の研究から同定した（図4D；STAR Methods）。疾患の種類に関係なく、ブラストシスチスは2つの研究を除くすべての研究で健常対照者の間で強固に濃縮されており、不健康な人のブラストシスチスを保有するオッズは25％減少していた（ランダム効果の大きさ＝-0.29、95％CI＝-0.38～-0.20、p値＝1.45e-9）。この所見は、主要な曝露としてブラストシスチス相対量を用いた場合、さらに支持された（ランダム効果サイズ＝-0.13、95％CI＝-0.20～-0.05、p値＝1.28e-3；図S5H）。全体として、メタアナリシスの研究間でサイズに異質性があるにもかかわらず、要約推定値の方向性は一貫しており（図4C、4D、S5H）、より健康的な腸内マイクロバイオーム構成の共通メンバーとしてのブラストシスチスの役割を支持している。
ブラストシスチスのキャリッジにマイクロバイオーム全体が関与するクロスキングダム生態学
ブラストシスチスと腸内細菌叢の他のメンバーとの間のクロスキングダム生態学的相互作用の可能性を評価するために、MetaPhlAn 4を用いて細菌と古細菌の分類学的プロファイリングを行った（STAR Methods）。その結果、以前に観察されたように、すべてのデータセットにおいてブラストシスチス陽性者ではアルファ多様性が有意に高いことがわかった（図S6）。
図S6ブラストシスチスの保菌は 、図6に関連する腸内細菌のα多様性の増加と一貫して関連して いた。
特定のマイクロバイオーム構成がブラストシスチスの保菌と関連しているかどうかを調べるために、細菌種と古細菌種の相対存在量値からランダムフォレスト機械学習（ML）分類モデルをトレーニングし、ブラストシスチスの存在を予測した（STAR Methods）。以前に示唆されたことを拡張する、
クロスバリデーション（CV、受信者動作特性曲線下面積中央値AUC = 0.87）およびleave-one-dataset-out（LODO、AUC中央値 = 0.88）フレームワークの両方を用いて高い予測精度を示した、
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は、マイクロバイオーム中の細菌および古細菌集団とブラストシスチスとの間に強い再現性のある関連性があることを示している（図5A）。
図5ブラストシスチスの存在は腸内マイクロバイオームの構成に影響を与え、BMIおよび心代謝系の健康と関連する種と関連している
CV MLモデルから、特徴の重要性によって上位にランクされた種を同定し、ブラストシスチスとの関連を評価した（図5B；完全な種のリストは表S6）。ブラストシスチス陽性の個体は、科分類学的レベルでのみ割り当てられた未知の種レベルのゲノムビン（uSGB）の相対的な存在量が高く、ほとんどがルミノコックス科と強く関連していた（図5B）。逆に、Blastocystis 陰性のサンプルは、Blautia属の2種と、Bacteroides ovatusが豊富であった。
さらに、ブラストシスチス 陽性の個体で一貫して有意に豊富な生物種は、より良好な心代謝プロファイルと関連し、BMIと負の相関を示した（図5Bおよび5C；STAR Methods）。これらの知見は、マイクロバイオームの構成とブラストシスチスの存在との間に強い生態学的関連性があること、そして両要素がより健康的な食生活とより良好な心代謝プロファイルに関連していることを示唆している。
ブラストシスチスのキャリッジと存在量はPDP後に増加する。
最後に、1,124人の健康な参加者を6ヵ月間の個別化された食事プログラム（PDP）に登録し、介入前後の検便を行った（PREDICT 3 UK 23A RTコホート、n= 2,248検体、STAR Methods）。研究期間中、参加者は、（よりコントロールされた摂食試験とは対照的に）自由食に情報を提供するための個別の食事勧告を受けた。推奨事項の遵守状況および通常習慣との変化は、介入前後のFFQ（STAR Methods）により確認された。一般に、参加者は食事の質を有意に改善し（すなわち、hPDIおよび健康的食事指数[HEI]の増加、Wilcoxonp値はそれぞれ1.02e-134および1.19e-27）、体重を減少させた（平均0.5kg/月；図6AおよびS7A）。
図6食事の質の改善は、体重減少およびブラストシスチスの有病率および存在量の増加と前向きに関連していた。
観察コホート（および横断コホート）から同定された健康的な食事摂取とブラストシスチス保菌との関連を裏付けるために、PDP介入前後のブラストシスチス有病率および相対存在量を解析した。全体として、Blastocystis有病率は31.32％から33.81％に有意に増加した（McNemarp値=0.003、表S7）。1,124人の参加者のうち、715人が両時点でブラストシスティス陰性（63.61％、「いいえ-いいえ」）であったが、323人がブラストシスティス陽性のまま（28.74％、「はい-はい」）で、別のSTに切り替えた人は3人だけであった。陰性となった参加者は29人（2.58％、「はい-いいえ」）であったが、介入中にブラストシスティスを獲得した参加者はほぼ2倍の57人（5.07％、「いいえ-はい」）であった。これらの違いと一致するように、研究期間を通じて持続的に陽性であった（「はい-はい」）人の間で、Blastocystis相対存在量の有意な増加が観察された（Wilcoxonp値=2.38e-8；図6BおよびS7B）。
この関連性の根底にある可能性のある特定の食事因子を探索するために、前述の横断的解析で食物繊維摂取量の増加とブラストシスチス有病率の増加との関連性が示されたことに注目した（図S2C）。同様に、ブラストシスチスを発症した57人のうち、食物繊維と脂肪の摂取量が統計的に有意に増加していた（ウィルコクソンのp値＜0.01）が、タンパク質と炭水化物については増加していなかった（ウィルコクソンのp値＞0.05）。さらに、Blastocystisを獲得した個体で観察された食物繊維摂取の効果量は、Blastocystisを失った個体または獲得しなかった個体よりも大きかった（Cohenの dの効果量は、「いいえ-はい」で0.38、「はい-いいえ」で0.25、「いいえ-いいえ」で0.28；図S7C）ことから、Blastocystisのコロニー形成および獲得における食物繊維摂取の増加が果たす役割の可能性が示唆される。さらに、Blastocystisが安定的に存在しないか存在する個体（「No-No」および「Yes-Yes」）で、食事の質が同程度に改善した個体では、Blastocystis陽性個体は概してBMIがより低下しており、体重減少に対する腸内Blastocystis保菌の相加効果の可能性が示唆された（図S7D）。最後に、横断的解析（図5B）でブラストシスチスと関連したマイクロバイオーム種が、PDP期間中のブラストシスチスの獲得または喪失によっても影響を受けるかどうかを評価した。ブラストシスチス陽性被験者で濃縮された種の有病率は、介入中にブラストシスチスを獲得した人（「いいえ-はい」；図S7E）では増加し、喪失した人（「はい-いいえ」）では減少したが、その他の人（「いいえ-いいえ」および「はい-はい」；図S7E）では一定であった。
図S7パーソナライズされた食事 介入が ブラストシスティスの存在および存在量、多量栄養素摂取量、およびBMIに及ぼす影響（ 図5 および 図6に関連 ）。
考察
我々は、56,989のヒトマイクロバイオームサンプルからブラストシスチスとそのヒト関連ST8種を包括的にプロファイリングし、先行研究を桁違いに拡大した。その結果、ブラストシスチスは健康な成人の腸内に世界中に存在し、その有病率は地理的、生活習慣的、食生活によって異なり、生殖細胞系列の決定因子との明らかな関連は認められなかった。興味深いことに、ST4はヨーロッパと北米で流行し、アジアではほとんど見られず、南米とアフリカでは見られなかった。ブラストシスチスは新生児にはほとんど見られず、このことはブラストシスチスが垂直感染ではなく、後天的に獲得される可能性が高いことを示唆している。ブラストシスチスST1、ST2、ST3、ST4はヒトのマイクロバイオームサンプルから最も多く検出された。
その他のSTはヒトではあまり検出されなかったが、野生動物や飼育動物では以前に報告されていた、
人獣共通感染症の感染源となる可能性のある野生動物や飼育動物では以前から報告されていたが、解析した4,590の動物メタゲノム中、ST7が検出されたのは1つのみであった。
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ブラストシスチス（Blastocystis）は、ヒトの腸内に最も多く存在する真核微生物であり、原核生物または真菌類に焦点を当てた現在の計算ワークフローでは見落とされがちな、相当量のリードの原因となっている可能性がある。ジアルジア（Giardia）、エンタモエバ（Entamoeba）、ジエンタモエバ（Dientamoeba）などのヒトに寄生する他の原生動物
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メタゲノミクスと、ブラストシスチス（Blastocystis）のために開発したものと同様の計算パイプラインを組み合わせることで、将来的な研究が期待できる。
われわれはZOE PREDICTコホートを活用した。ZOE PREDICTコホートは、心代謝系の健康における個人レベルの因子、食事、腸内生態系の相互作用を探求する研究プログラムの一部である。健康なPREDICT参加者25,548人の長期および短期の食事情報を解析した結果、個々の食品項目との関連や、より健康的な植物性食品や最小限の加工食品を好む全体的な食事パターンなど、いくつかのレベルで裏付けられた、より慎重な食事とブラストシスチスの存在を関連付けることができた。さらに、個別化された食事介入の前後に1,124人を縦断的にサンプリングした解析では、食事の質の改善がBlastocystisの有病率および存在量の増加と関連していることが示され、集団スケールの横断的結果を支持した。また、ブラストシスチス陽性者では、血糖値および脂質プロファイルがより良好であることが判明し、より健康的な食事のみによる影響を超えて、心代謝系の健康にプラスの影響を及ぼす可能性が示唆された。ブラストシスチスは以前、内臓脂肪と関連していた、
今回の解析では、この知見をさらに発展させ、複数の独立したコホートを用いて、ブラストシスチスの存在および存在量と低いBMI値との間に有意かつ再現性のあるシグナルがあることを示した。我々はまた、マイクロバイオームの組成がブラストシスチスの存在を正確に予測することを示した。このことは、クロスキングドムの相互作用の可能性や、ブラストシスチスの生態学的役割（あるいはブラストシスチスに及ぼす影響）を示唆するものであり、その探索は食事-ブラストシスチス-健康の軸の解明に役立つ可能性があるが、今回の研究の範囲外である。我々のメタゲノムプロファイリングアプローチは、参照ゲノムとSGBにクラスター化されたメタゲノム集合ゲノムを利用している。
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により、既知および未知のSGBの両方を検出・定量化することができ、後者はブラストシスチス保菌を最も予測する微生物のひとつであった。最後に、メタアナリシスにより、腸内微生物構成の変化に関連する疾患（IBD、T2D、CRCなど）に関する様々な症例対照研究において、ブラストシスチス陽性者は健常対照者である可能性が高いことが示された。これらの結果を総合すると、ブラストシスチスは宿主に有害な影響を与えるのではなく、むしろヒトの腸内細菌叢の好ましい構成要素であるという仮説が支持される。このパラダイムシフトは、ヒトマイクロバイオームの真核生物成分、特にブラストシスチスをターゲットとした解析を行う今後の研究において考慮されなければならない。
糞便マイクロバイオーム移植（FMT）のようなマイクロバイオームを標的とした介入では、しばしばブラストシスチスの保有をドナー候補の除外基準として考慮する。
しかし、ブラストシスチスと宿主の健康を関連付ける我々の結果は、好ましいとは言えないまでも、非病原性の役割を支持するものである。これに関連して、ブラストシスチス陽性のドナーからのFMTは、有害事象のリスクの増大とは関連せず、比較的に高い成功率を示したという先行報告がある。
ブラストシスチス陽性者をFMT試験に含めることで、治療効果を危険にさらすことなく候補ドナープールを拡大できるかどうかは、まだ臨床的に検証されていないが
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あるいはレシピエントに危害を加える可能性があることから、我々のデータはこのような試験を実施する理論的根拠を支持するものである。さらに、ブラストシスチスを直接人工的に投与することは、これまで試みられたことがなく、技術的な限界がある（例えば、ブラストシスチスの培養液をaxenizingすることは、依然として大きな課題である）。
しかし、動物モデルを用いた試験的研究によって、宿主の健康との因果関係を明らかにすることができる。ブラストシスチスはマイクロバイオームの細菌成分に影響を与える可能性があるため、このような関連は間接的なものである可能性もある、
ブラストシスチスに基づく投与戦略の可能性をさらに強化するものである。
全体として、我々の結果は、ヒトの腸内細菌叢、食事、および心代謝性疾患の間の複雑な相互作用についての理解を深めるものである。
現在見過ごされているブラストシスチス種を含む。将来的には、腸内生態系の改変を目的とした精密栄養学的介入が、実行可能な疾病予防戦略を構成することになるかもしれない、
そして我々の研究は、十分に認識されていない非細菌分類群が、ヒトの健康の維持・増進に重要な役割を果たす可能性があることを示唆している。
研究の限界
ブラストシスチスの遺伝学的およびゲノム学的側面については、まだ解明されていない点がいくつかある。比較遺伝学的解析により、異なるSTの役割をより微妙に識別し、宿主の健康に影響を及ぼす可能性のある関連遺伝子とその根底にあるメカニズムをより明確にすることができるかもしれない。遺伝学的および機能的解析と疾患発症に関する縦断的データを組み合わせることで、ブラストシスチスの存在が心代謝性疾患の発症に影響を及ぼすかどうかの理解に役立つかもしれない。我々の計算ワークフローは、ヒト腸内で過去に発見された8つのSTを代表する、利用可能な9つのBlastocystisゲノムのセットに依存している。より稀なSTやヒト以外のSTについて、高品質なゲノムの発見と検証を優先することで、検出感度が向上し、現在報告されていないSTのプロファイリングが可能になるかもしれない。今回のプロファイリング・パイプラインでは、ブラストシスチスの存在を判定するために、保守的な10％のカバレッジ幅の閾値を用いたが、今後の研究により、偽陽性と偽陰性のトレードオフをさらに最適化することができる。さらに、Blastocystisが存在する民族的地理的パターンが明らかであり、さまざまな食品の消費との関連もあることから、より広範で包括的なデータ共有の実践と、食習慣に関するメタデータを含み、また、十分に代表されていない国々を対象としたメタゲノム研究を追加することは、我々の結果を支持する上で貴重であろう。さらに、可能性のある感染経路や獲得経路を解明し、腸内ブラストシスチスのコロニー形成に対するさまざまな環境因子や宿主因子の相対的な寄与を明らかにするためには、具体的な実験的研究が必要である。最後に、Blastocystisの樹状細胞培養を確立するための技術的な問題に対処する必要があるが、因果関係を直接評価するための介入プロトコルを開発することも可能であり、我々の研究は、倫理的な裏付けをもってそのような研究を提案するための広範なデータを提供するものである。
STAR★方法
主要リソース表
試薬またはリソースソースの識別子
重要な市販アッセイ
DNA/RNA-Shield Zymo バッファー Zymo Cat#R1100 DNA/RNA Shield™ (Zymo Research)
Qiagen DNeasy PowerSoil Pro Qiagen Cat#47016_DNeasy PowerSoil Pro Kit (250)
イルミナDNAプレップタグメンテーションキット イルミナNextera DNA Flexライブラリープレップ
イルミナ NovaSeq 6000 S4 フローセル イルミナ Cat#20012866 NovaSeq 6000 S4 試薬キット（300 サイクル）
QIAamp PowerFecal DNAキット Qiagen Cat#12830-50
寄託データ
curatedMetagenomicData（v3） Pasolli et al.
公開されているヒトメタゲノミックサンプルのアクセッション番号は、https://github.com/waldronlab/curatedMetagenomicData。
Blastocystisの有無の全表 本論文 Zenodo:https://doi.org/10.5281/zenodo.11202497
メタゲノムサンプル（PREDICT 2） 本論文 EBI： PRJEB75460
メタゲノムサンプル（PREDICT 3 US21）本論文EBI： PRJEB75462
メタゲノムサンプル（PREDICT 3 US22A）本論文 EBI： PRJEB75463
メタゲノムサンプル（PREDICT 3 UK22A）本論文EBI： PRJEB75464
メタゲノムサンプル（PREDICT 3 UK23ART）本論文EBI： PRJEB75465
ソフトウェアとアルゴリズム
Python (v3.9) Python Software Foundationhttps://www.python.org/
R (v4.3) R Core Teamhttps://www.R-project.org/
MetaPhlAn4 (v4.beta) Blanco-Míguez et al.
https://github.com/biobakery/MetaPhlAn
Bowtie2 (v2.3) Langmead and Salzberg
https://github.com/BenLangmead/bowtie2
SAMtools (v1.19) Li et al.
http://github.com/samtools/
BEDtools Quinlan
https://github.com/arq5x/bedtools2
メタアナリシス N/Ahttps://github.com/waldronlab/curatedMetagenomicDataAnalyses
前処理パイプライン N/Ahttps://github.com/SegataLab/preprocessing
Pyani (v0.2) N/Ahttps://github.com/widdowquinn/pyani
mapsharper N/Awww.mapshaper.org
その他
curatedMetagenomicData (v3) Pasolli et al.
https://github.com/waldronlab/curatedMetagenomicData
2021 US Divisions Cartographic Boundary File N/Ahttps://www.census.gov/
リソースの有無
代表連絡先
詳細情報およびリソースのリクエストは、主担当者である Francesco Asnicar(f.asnicar@unitn.it) までご連絡ください。
資料の利用可能性
本試験では新規の試薬は使用しなかった。
データおよびコードの利用可能性
-本論文は、既存の一般に入手可能なデータおよび新規のデータを解析している。すべての公開データセットの配列データとそれに付随するメタデータは、親原稿（DOIはTable S1に記載）で指定されたそれぞれの公開リポジトリ、またはcuratedMetagenomicDataパッケージを使用して見つけることができる25。
を使用することもできる。Dutch Microbiome Project (DMP)については、European Genome-Phenome ArchiveのアクセッションEGAS00001005027で、生のマイクロバイオームシーケンスデータと基本的な表現型（年齢、性別、BMIを含む）が利用可能である。これらのデータセットはhttps://forms.gle/eHeBdXJMXbVvCJRc8。ZOE PREDICT Studiesの参加者全員について、生のメタゲノミックサンプルが提供されている。具体的には、PREDICT 1 は以前報告されたように利用可能である7。
一方、PREDICT 2 および PREDICT 3 US21、US22A、UK22A、UK23ART コホートは EBI に寄託されている： PRJEB75460、PRJEB75462、PRJEB75463、PRJEB75464、PRJEB75465。これらのアクセッション番号は主要リソース表にも記載されている。性別、年齢、BMI、国、および解析したすべてのヒト集団の各サンプルにおける各Blastocystisサブタイプの有無は、Zenodo: https://doi.org/10.5281/zenodo.11202497。Mind Body StudyおよびMen's Lifestyle Validation Studyの個人レベルのデータ（今回の原稿で使用していないメタデータを含む）を入手するには、書面による申請が必要である。MBS/MLVSデータの利用申請については、標準的な研究利用手続きに従い、また、従 来の前例に則り、科学的な利点、提案された方法論への適合性、提案された利用が倫理・ガバナ ンス・フレームワークのガイドラインに適合していることの確認、および参加者から提供された同意に ついて、外部研究協力者委員会により審査される。その他の初回問い合わせは、それぞれnhsaccess@channing.harvard.edu(MBS)、hpfs@hsph.harvard.edu(MLVS)までお願いします。表S1は、対象としたすべてのデータセットについて、BlastocystisおよびST特異的有病率を報告している。-計算機による解析は、bioBakeryツール群84
,99
およびブラストシスチスに特化したワークフローを用いて行った。
メタアナリシスを実行するコードは(https://github.com/waldronlab/curatedMetagenomicDataAnalyses)にある。その他のコードとツールは主要リソース表に記載されている。-本論文で報告されたデータの再解析に必要な追加情報は、要請があれば主担当者から入手可能である。
実験モデルと研究参加者の詳細
ZOE PREDICT試験のコホート
ZOE PREDICTプログラムは、複数の個別研究から構成され、栄養、食品に対する個々人の代謝反応、および腸内細菌叢を関連付ける、最大級のマルチオミクス集団健康イニシアチブを集合的に構成している。
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簡単に言えば、我々は5つのZOE PREDICT研究を共同で検討し、調和させた： PREDICT 1、PREDICT 2、PREDICT 3 US 21、PREDICT 3 US 22A、およびPREDICT 3 UK 22Aである。先に報告されたPREDICT 1コホート（Clinicaltrials.gov識別子：NCT03479866）では、英国（UK）と米国（US）から1,098人の参加者が登録され、血液と人体測定情報の両方を収集するためのモニター付き臨床訪問を含む研究プロトコールが行われ、その後、標準化された試験と自由食の両方に対する食後反応を記録する自宅フェーズが続き、1,098個のメタゲノム便サンプルの収集が行われた。
PREDICT 2試験（Clinicaltrials.gov識別子：NCT03983733）は、PREDICT 1試験の収集プロトコールをほぼ反映していたが、精密栄養学のより代表的で患者に優しいアプローチを提供するため、登録は、米国の臨床試験において歴史的に十分代表されていないグループから975人を対象とし、完全に遠隔で行われた。最後に、3つのPREDICT 3コホートは、スマートフォンを用いた個別化栄養プログラムの有料顧客32,622人（P3_US21はn=11,798、P3_US22Aはn=8,470、P3_UK22Aはn=12,353）で構成され、健康アンケートが実施され、ベースライン便サンプルが採取された（P3 USのプロトコール番号（IRB）： P3米国プロトコール番号（IRB）：Pro00044316；P3英国倫理審査参照： HR-23/24-28300；Clinicaltrials.gov識別子：NCT04735835）： NCT04735835）。PREDICT 1試験の参加者はすべてスクリーニングされ、健康であると考えられる場合のみ考慮された。一方、他のコホートについては、心血管疾患、糖尿病、糖尿病予備軍、高脂血症、高血圧の診断または治療を自己申告した参加者を「健康ではない」とみなした。図5で報告されている "ZOEマイクロバイオームランキング2024（Cardiometabolic Health）"（略称："ZOE MB Health-rank"）は、SGBの相対存在量と、個人的、空腹時、食後の心・代謝系の健康を表すマーカーとの間の部分相関（性別、年齢、BMIで補正）から、5つのPREDICTコホートのランキングの平均要約として定義された。
PREDICT 3 UK 23A RTコホート
PREDICT 3 UK 23A RT（P3_UK23ARTとも）コホートには、6ヵ月間の個別化食事プログラム（PDP）介入試験に参加し、介入前と介入後の腸内マイクロバイオームサンプルが採取された1,124人の健常人（女性867人、男性257人）が登録された（n=2,248）。PDP介入期間
PDPの介入期間は平均5ヵ月と3週間（最短42日、最長295日；表S7）であり、その間、参加者はZOE携帯電話アプリケーションを通じて個人化された食品レベルの食事アドバイスを受けた。推奨は、食品の特徴（例えば、マクロ栄養素、グリセミック負荷、脂肪の質、加工レベル）、個人のグルコースコントロールと食後トリグリセリド濃度、腸内細菌組成、ベースラインのCVDリスク、および過去の健康歴を組み込んだZOE 2022アルゴリズムを用いて計算された個人固有の食品品質スコアに基づいていた。これらの個人別（"パーソナライズド"）食品スコアは0から100の範囲で、数値が高いほど健康によい食品であることを示す。PDPでは特にエネルギー摂取制限（すなわちカロリー計算）は行われなかった。参加者はまた、基本的な栄養および食事の健康概念（例えば、植物性食品、食物繊維、発酵食品、精製炭水化物を全粒穀物に置き換えることの潜在的な利点など）をカバーする対話型のスマートフォンベースのカリキュラムを通じて、より一般化された栄養および生活様式のアドバイスを受けた。参加者は、ベースライン時と介入後の2回、検証済みの食物摂取頻度調査票（FFQ）に記入した。慢性的な健康問題のない成人を登録すること以外に、参加者は試験登録前の3ヵ月間および2回のサンプリング期間中に抗生物質を服用していないことを自己申告することも求められた。
MBSおよびMLVSコホート
2012年から2013年にかけて、長期にわたるHealth Professionals Follow-up Study（HPFS）にネストされたMen's Lifestyle Validation Study（MLVS）の男性から、同様に2013年から2014年にかけてNurses' Health Study II（NHS II）にネストされたMind-Body Study（MBS）の女性から、縦断的な便サンプルが採取された。これら2つの前向きコホートの研究デザインと生物試料の収集については、以前に記述されている、
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が、簡単に説明すると、参加者は、検証された自己採取プロトコルを用いて、1～3日間隔で連続した排便から2検体の便を自宅で採取することに同意した。
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2回目のペア検体採取は、最初のペア検体採取から約6ヵ月後に行われた。参加者はまた、採取時間、便の外観、および食事や最近の抗生物質使用を含む様々な生活習慣因子に関する情報を詳細に記した質問票に回答するよう求められた。前述のように、サンプルは一晩かけて発送され、MITおよびハーバード大学のBroad InstituteでHiSeq paired-end shotgun sequencing platform（Illumina Inc.、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて配列決定するまで-80℃で保存された。ブラストシスチスSTのプロファイリングは、以下に述べるのと同じ計算ワークフローを用いて行った（ブラストシスチスの検出とSTプロファイリングを参照）。本研究では、高脂血症、糖尿病および/または心血管疾患を有する参加者を「健康ではない」とみなした。非経時的解析では、各被験者の4つのサンプルのうち、リード数が最も多いものを残した。
DeFilippisF_2019, MeslierV_2020, TaralloS_2021
DeFilippisF_2019コホートは、97人の健康なイタリア人参加者で構成され、習慣的な食事に基づいて3つのカテゴリーに分類された：雑食（n=23）、ベジタリアン（n=38）、ビーガン（n=36）。
MeslierV_2020コホートには、過体重または肥満で、果物や野菜の摂取量が習慣的に少なく、座りがちな生活習慣を持つ82人の健康なイタリア人が含まれていた。参加者は地中海食の並行ランダム化比較介入試験に参加した。
この場合、各被験者について1つのサンプルだけを残し、最も読み取り数の多いものを選択した。最後に、TaralloS_2021コホートには、雑食（n=40）、ベジタリアン（n=40）、ビーガン（n=40）に分類された120人の健常人が含まれていた。
SardiNIAコホート
SardiNIAプロジェクトは縦断的研究である
SardiNIAプロジェクトは、イタリアのサルデーニャ島中央東海岸に住む14～103歳の一般人口7,730人（女性57％、男性43％）を対象とした縦断的研究である。参加者は全員、サルデーニャ地方倫理委員会（プロトコル番号2171/CE）により承認された研究プロトコルに対するインフォームド・コンセントに署名した。ボランティアは、受診日の朝（または前日）に便を採取し、自宅で（冷蔵庫で）保管するよう求められた。診療所では、便は-80度で凍結された。その後、解凍を避け、一度に0.25gずつセーフロックチューブに分注し、DNA抽出まで-80℃で10分以内に凍結した。微生物DNA抽出は、ビーズビーティングプラスカラム（RBB+C）を用い、QIAamp PowerFecal DNAキットとTissuelyser II（Qiagen社製）を用いて高速振とう（15 Hz、10分間）した。メタゲノミックシークエンシングはトレント大学で行われ、Illumina Novaseq 6000プラットフォームを使用し、サンプルあたり平均8.68Gbの150bpペアエンドリードを生成した。この研究では、配列決定されたメタゲノムが利用可能な2,596人のサブセットを検討した。心血管疾患（心筋梗塞、心不全、脳卒中を含む）、糖尿病（T1DとT2Dの両方）、何らかのがん、高コレステロール、クローン病、消化性潰瘍、潰瘍性大腸炎、膵炎、喘息を報告した人を「健康ではない」とみなした。
オランダマイクロバイオームプロジェクトコホート
Lifelinesオランダマイクロバイオームプロジェクト（DMP）コホート
は、2015年から2016年の間に糞便サンプルを採取した8,208人からなり、Lifelinesコホート研究の一部である。Lifelinesは、オランダ北部の3世代にわたる前向き集団ベースコホート研究である。
本研究はUniversity Medical Center Groningenの倫理委員会（METc番号：2017/152）により承認され、参加者、または未成年（18歳未満）の参加者については両親/法定代理人が署名した同意書が追加された。サンプル採取と配列決定については、原著論文に記載されている。
簡単に説明すると、便の採取は参加者が自宅で行い、便サンプルは作成後15分以内に凍結して発送し、DNA抽出まで-80℃で保存した。微生物DNAはQIAamp Fast DNA Stool Mini Kit（Qiagen社製）を用いて単離した。メタゲノムシーケンスはNovogene社で行い、Illumina HiSeq 2000プラットフォームを使用して、サンプルあたり約8Gbの150bpペアエンドリードを作成した。本研究では、性別、年齢、BMI、および健康状態の情報を持ち、最小サンプリング深度が10Mリードの6,047人を対象とした。がん（乳がん、子宮頸がん、大腸がん、黒色腫、前立腺がん、皮膚基底部を含む）、心血管疾患（不整脈、動脈硬化、高コレステロール、心筋梗塞、心不全、心臓弁膜症、高血圧を含む）、内分泌疾患（T1DおよびT2Dを含む）、消化器疾患（セリアック病、クローン病、潰瘍性大腸炎を含む）のいずれかが報告された場合、その個人を「健康ではない」とみなした。
公開されているヒトメタゲノムサンプル
公開されているメタゲノミックコホートおよびそれぞれのメタデータは、curatedMetagenomicData version 3（cMD3）パッケージから取得した、
サンプル採取時の年齢、性別、体格指数（BMI）、国、ライフスタイル（すなわち、欧米化または非欧米化）、および宿主の健康状態に関する情報を含む。個体はcMD3でコード化された「健康ではない」に分類された。疾患は、心血管疾患（ASCVD）、糖尿病、高脂血症、炎症性腸疾患、土壌伝染性蠕虫感染症（STH）、癌、喘息、片頭痛である。10Mリード以上のサンプルのみを対象とした。さらに、cMD3における研究デザインの異質性（例えば、横断的対縦断的）を考慮し、それぞれのユニークな参加者について、リード数が最も多いものを選び、1つのサンプルだけを保持した。そして、健康な成人または小児から少なくとも10サンプルが得られたデータセットのみを考慮した。合計で61のデータセット、12,865のマイクロバイオームサンプルが集まった。
古代ヒト腸内メタゲノムサンプル
7つのデータセットから、一般に入手可能な28の古代ヒト腸内メタゲノミックサンプルを対象とした。
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リードの前処理は、対応する著作物（表S1）に記載されているように行った。10M以上のリード（範囲14.3M - 919.5M）を持つサンプルのみを検討し、後述の計算ワークフロー（Blastocystisの検出とSTプロファイリングを参照）を用いてプロファイリングを行った。全体として、サンプルはオーストリア、イタリア、メキシコ、南アフリカ、イギリス、アメリカで発見された古糞から収集され、考古学的年代は紀元前3000年から中世以降であった（表S1）。
公開されている動物メタゲノムサンプル
ヒトに関連する8種類のBlastocystisサブタイプの存在を評価するために、49の異なる公開データセット（表S2）から、ヒト以外の宿主から4,590のメタゲノムサンプルを収集した。メタデータは、各原稿のデータ利用可能性に関する記述の指示に従って取得した。マウス（n=3,318）、霊長類（n=560）、反芻動物（n=326）、鳥類（n=140）が最も多く、合計で214の異なる宿主種を網羅した。少ない分類群としては、昆虫（n=28）、肉食動物（クマ、イヌ、ネコ、アザラシ、n=31）、有骨魚類（n=17）、カメ（n=17）、ゾウ（n=13）、線虫（n=10）などがあった。ほとんどの種について、入手できたサンプルはわずかで、カニ、軟体動物、コウモリ、鯨類、ウサギ、ハリネズミ、カイメン、イソギンチャク、クラゲなど、179種がそれぞれ5サンプル以下であった。ほとんどのデータセットが単一種の動物宿主をサンプルとしているが、特筆すべき例外は、184種の野生動物のマイクロバイオームを調査した研究である。
(表S2）。
方法の詳細
サンプル採取、DNA抽出、配列決定、および品質管理
PREDICT 1コホートについては、サンプル採取、DNA抽出、配列決定に関する詳細は、以前に記述した。
PREDICT 2コホートもPREDICT 1と同じ手順に従った。PREDICT 3コホートでは、サンプルは自宅で自己採取し、DNA/RNA-Shield Zymo緩衝液の入った滅菌チューブに入れた。採取後、Qiagen DNeasy PowerSoil Proを用いて全DNAを抽出した。シークエンシングライブラリーは、Illumina DNA Prep Tagmentation kitを用い、メーカーのガイドラインに従って調製した。その後、全ゲノムショットガンメタゲノムシーケンスを、S4フローセルを用いてIllumina NovaSeq 6000でサンプルあたり3.5Gbpをターゲットに実施した。すべての生シーケンスデータは、https://github.com/SegataLab/preprocessing で利用可能な前処理パイプラインを使用して品質管理された： (i)低品質(Q<20)、短すぎる(<75nt)、または曖昧な塩基が2つ以上あるリードの除去、(ii)宿主の汚染DNA(イルミナのスパイクインΦX 174およびヒトゲノム、hg19)の除去、および(iii)ペアエンドおよび非ペアリードの同期。前処理後、各データセットの平均リード数は以下の通りであった： P2は59.4M、P3_US21は36.9M、P3_US22Aは35.0M、P3_UK22Aは31.2M、P3_UK23ARTはベースライン時31.9M、介入後31.1Mであった。
縦断的解析
経時的な腸内細菌叢におけるブラストシスチスの持続性を評価するために、cMD3、MBS、MLVS、およびMeslierV_2020コホートから、同一個体の縦断的なマイクロバイオームサンプルが入手可能なデータセットを調査した。その結果、少なくとも5人のブラストシスチス陽性者が少なくとも1つのサンプルに含まれる9つのデータセットが同定された（表S4）。これらのデータセットには、それぞれ2時点または3時点の878人と156人が含まれていた。各データセットにおいて、全時点でブラストシスチスが常に検出された（Ba）または検出されなかった（Bn）人の総数を考慮した。これらを、少なくとも1つの時点でブラストシスチス陽性と判定された個体数（Bf）と比較した。さらに、「Ba」個体において、検出されたサブタイプがすべての時点にわたって同じかどうかを評価した（表S4）。各データセットについて、同一個体のサンプル採取間の経過日数の最小値、中央値、最大値を報告した。
双子のサブグループ解析
腸内ブラストシスチス（Blastocystis）の生態における宿主遺伝の寄与の可能性を調べるため、入手可能な双生児ペアに焦点を当てた。TwinsUKコホート（n=376の一卵性双生児[MZ]ペアとn=336の二卵性双生児[DZ]ペア）から合計712組の双生児ペアを分析した。
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双生児ペアの少なくとも1人がブラストシスチス陽性であった場合、双生児ペアの両方がブラストシスチス陽性である確率を評価した（すなわち、ペアワイズ一致率
). もし遺伝的要因がブラストシスチスのコロニー形成に主要な役割を果たすのであれば、遺伝的に同一のMZ双生児では、遺伝的に特異なDZ双生児と比較して、ペアワイズ・ブラストシスチス・コンコーダンスが大きくなると予想される。さらに、一致陽性の双生児ペアにおいて、兄弟姉妹が同じBlastocystisSTを保有しているかどうかを分析した。最後に、双生児ペア（DZとMZの両方）におけるブラストシスチスの一致率を、無作為にマッチさせた参加者のペアと比較した（表S4）。
ブラストシスチスの検出とSTプロファイリング
ブラストシスチスの存在は、以前に記述された計算ワークフローを用いて評価した。
簡単に言うと、8つの異なるブラストシスチスSTの9つの参照ゲノム（ST1 [ST1_LXWW01]、ST2 [ST2_JZRJ01]、ST3 [ST3_JZRK01]、 ST4 [GCF_000743755 & ST4_BT1_JZRL01], ST6 [ST6_JZRM01], ST8 [ST8_JZRN01], ST9 [ST9_JZRO01]の8種類のBlastocystis STをBowtie2を用いてメタゲノムリードに対してマッピングした。
その後、SAMtools
およびbedtools
genomecov -bg'パラメーター）を用いて、各サブタイプのカバレッジの幅を計算した。最後に、Blastocystisが陽性であるサンプルは、そのサブタイプのゲノムのうち、少なくとも10%のカバレッジの幅を持つものであると報告した（最小カバレッジの幅はゼロ、すなわち参照ゲノムにマッピングされたリードがない場合）。10％の閾値は、異なるBlastocystisSTゲノム間の類似性（図S1A）と、別のBlastocystisSTがすでに検出された場合の2番目のBlastocystisSTの偽陽性検出率に基づいて選択された。
逆に、カバレッジの深さはBlastocystisコールに関与しないが、相対的存在量を概算するために使用した。
Blastocystisの相対的存在量を評価するために、各ST参照ゲノムについてサンプル内のBlastocystisDNA濃度を推定した。各サンプルおよび検出された各STについて、各ゲノムの塩基にマップされたリード数を合計し、それをサンプル深度（リード数にリード長の中央値を掛けたものとして推定）で割った。サンプルが複数のSTに対して陽性であった場合、検出されたすべてのSTについてこの推定値を合計した。
シーケンス深度とレアファクション
配列決定深度のばらつきはマッピング結果に影響を与える可能性があり、このため、配列決定が浅いサンプルはブラストシスチスの検出において上述の基準を満たさない可能性がある。したがって、少なくとも10Mリードを持つヒトメタゲノミック便サンプルのみを検討した。さらに、Blastocystis検出に対するシーケンス深度の影響を評価するために、各10Mランダムリードのみを考慮して全サンプルのプロファイリングも行った（図S1C）。さらに、シーケンス深度の中央値が最も高く、少なくとも15個のBlastocystis陽性サンプル（最小70Mリード以上、すなわち、BengtssonPalmeJ_2015、BritoIL_2016、LeChatelierE_2013、XieH_2016、CosteaPI_2017；図S1D）を持つ5つのデータセットについて、ステップバイステップの希少化解析を行った。簡単に説明すると、各データセットについてリード数の中央値を計算し（健常成人サンプルのみ）、中央値よりもリード数が多いサンプルを除外した。これらのサンプルについて、10Mから各データセットの中央値までのランダムリードの増加数を考慮して、Blastocystisの存在を評価した。
西洋化集団と非西洋化集団
先行研究と一致する、
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本書では、食生活を含むさまざまなライフスタイルを大まかに表現するための包括的な分類として、「欧米化」と「非欧米化」という用語を使用する。
要するに、医薬品へのアクセスが比較的制限され、カロリーおよび脂肪の摂取量が少なく、地産で加工度の低い食品の消費量が多く、および/または野生動物や家畜に接する機会が多い集団から参加者を登録したコホートを、本明細書では「非西洋化」コホートと呼ぶ。逆に、より工業化された国々では、異種生物や汚染物質への暴露が比較的多く、脂肪や保存可能な超加工食品に富む高カロリー食を摂取し、抗生物質やその他の医薬品をより多く利用し、使用しているコホートを「欧米化」コホートと呼ぶ。これらの定義によると、集団間の独特で特徴的な因子を完全に捕らえることができない、やや単純化された分類であることが認められるが、我々は14の非西洋化集団と55の西洋化集団のデータセット、および非西洋化集団と西洋化集団の両方からのサンプルを含む3つのデータセットを分析した（表S1）。
食事データの収集と分類
PREDICT 1（英国）では、過去1年間の食品の平均摂取量を把握するように設計された131項目の修正European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition（EPIC）食物摂取頻度調査票（FFQ）を使用した。
PREDICT 2（米国）の参加者は、同様に検証されたDHQ-III FFQを用いて調査され、食品および飲料に関する135の項目と栄養補助食品に関する26の質問が含まれた。
PREDICT 3 US21、UK22A、およびUS22Aコホートの参加者については、短期間の食事記録データがZOE携帯電話アプリケーションを介して収集された。PREDICT 3 UK22AおよびUS22Aでは、264項目のFFQを用いて調査も行われた。食品項目（FFQおよび記録されたものの両方）は、次のような階層的ツリー構造に従って配列された栄養情報のデータベースから成る「フードツリー」にマッピングすることにより、食品群に組み立てられた；レベル1（9食品群）；レベル2（52食品群）；レベル3（195食品群）。英国の食品は、食品組成統合データセット（CoFID）にマッピングされた。
米国の食品も同様に USDA FNDDS データベースにマッピングした。
レベル3の食品は、コホート間の比較を可能にするために、栄養科学者によって集計され、調和された。短期および長期の食事データから、植物性食事指数（PDI）の3つのバージョン、すなわち、総合PDI（omprehensive PDI）、健康的PDI（hPDI）、不健康的PDI（uPDI）、および健康的食事指数（Healthy Eating Index：HEI）を計算した。
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oPDI食事指標は、植物性食品にプラスの点数を、動物性食品にマイナスの点数を割り当てている。hPDIでは、健康的な植物性食品（全粒穀物、果物/野菜、ナッツ/豆類、油、お茶/コーヒー）はプラス点、健康的でない植物性食品（ジュース/甘味飲料、精製穀物、ポテト/フライドポテト、お菓子）と動物性食品はマイナス点となる。uPDIでは、あまり健康的でない植物性食品はプラス、動物性食品と健康的な植物性食品はマイナスとなる。HEI-2015は、個人の食事が食事ガイドラインにどの程度合致しているかを測定する。ガイドラインは13の食品グループと栄養素を対象としており、そのうち9つの適正（奨励）成分と4つの中庸（推奨）成分を合計したものが、食事全体の質を表している。
超加工食品の摂取量を評価するため、保存がきき、食味がよく、エネルギー密度が高く、工業的工程を経て精製された原材料から作られた食品と定義し、NOVAの確立された基準に従って食品を分類した。
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未加工または最小限の加工食品、加工された料理素材、加工食品、超加工食品（ベーコン、コーラ、エナジーバー、アイスクリームなど）。最後に、自己申告による回答に基づいて、個人を確立された食事体系（すなわち、雑食、ベジタリアン、ビーガン）に層別化した。
代謝マーカーの収集
PREDICT試験では、性別、年齢、身長、体重、BMI、血圧、空腹時HbA1c（％）、総コレステロール、C-ペプチド、GlycA、THR、ASCVDリスク、空腹時および食後グルコース、高比重リポ蛋白コレステロール（HDL-C）、トリグリセリド（TG）濃度などの心代謝マーカーが選択された。PREDICT 1では、性別、年齢などの記述情報は自己申告であった。身長、体重、血圧は受診時（0日目）に測定され、内臓脂肪量の測定には標準的な製造者の推奨に従って二重エネルギーX線吸収測定（DEXA）スキャンが用いられた（DXA；Hologic QDR 4500 plus）。参加者はまた、クリニック受診時（0日目）にウェアラブルCGM装置（Abbott Freestyle Libre Pro（FSL）；Abbott社、Abbott Park、IL、US）を装着した。BMI（kg/m2）は、18.5≦BMI＜25kg/m2の「健康体重」、25≦BMI＜30kg/m2の「過体重」、BMI≧30kg/m2の「肥満」に分類した。空腹時GlycAは、ハイスループットNMRメタボロミクス（Nightingale Health社製）2016パネルを用いて測定した。空腹時および食後の静脈血はクリニックで採取し、血漿グルコースと血清総コレステロール、HDL-C、TGはAffinity 1.0を用いて測定し、全血HbA1c（％）はViapathを用いて測定した。10年アテローム性動脈硬化性心血管疾患（ASCVD）リスクは、2019年ACC/AHAガイドラインに従って算出した。
T2Dと高脂血症は、健康アンケートで自己申告した。その後13日間にわたり、自宅で追加データを収集した。大栄養素（脂肪、炭水化物、蛋白質、食物繊維）の含有量が異なる8種類の標準化された食事（7種類を重複して摂取）に対する食後反応を、既述のように持続グルコースモニター（CGM）および乾燥血液スポット（DBS）分析を用いて測定した。
PREDICT 2およびPREDICT 3試験はPREDICT 1試験の後に実施され、完全な遠隔試験であった。PREDICT 2および3では、人口統計学的情報、心代謝系血中バイオマーカー、標準化試験食に対する食後反応が収集されたが、PREDICT 1とは若干の相違があった。身長、体重、血圧は自己申告とし、総コレステロール、HDL-C、TG、HbA1cの空腹時および食後の反応は、市販の検査機関（CRL、Eurofins Biomnis）がDBSを用いて自宅で採取した全血フィンガープリックサンプルを用いて評価した。CGMは参加者が自宅で装着した。PREDICT 2および3では、標準化された食事（メタボリックチャレンジ食、中程度の脂肪と炭水化物の朝食および昼食）のうち、より少ない選択がテストされた。極端な外れ値による潜在的なノイズに対処するため、それぞれ1パーセンタイル以下と99パーセンタイル以上の値をフィルタリングで除外した。サンプルの収集、処理、および解析の詳細については、以前に説明されている。
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定量化と統計解析
ブラストシスチス保菌の予測
MetaPhlAn 4を用いて、全検体で種レベルのプロファイリングを行った。
(バージョン4.β.1、データベースvJan21_CHOCOPhlAnSGB_202103)を用いて、デフォルトのパラメータで全サンプルについて種レベルのプロファイリングを行った。その後、先行研究と同様に、ランダムフォレストベースの機械学習アルゴリズムを学習させた、
種レベルの細菌および古細菌の相対存在量のみを用いて、Blastocystis保菌を予測するための学習を行った。各モデルにおいて、データを80/20の比率でランダムにトレーニングセットとテストセットに分割してクロスバリデーション（CV）を行い、これを100回繰り返した。また、LODO（leave-one-dataset-out）分類フレームワークを適用し、各トレーニングコホートをトレーニングから除外し、その後の予測モデリングを行った。モデルは、受信者動作特性曲線下面積（AUC）の中央値を用いて評価した。
サンプル数の少なさによるバイアスを避けるため、健康な成人から少なくとも50検体、(i)ブラストシスチス有病率20％以上、または(ii)50検体以上のブラストシスチス陽性検体を有するコホートのみを機械学習の枠組みに含めた。さらに、利用可能なMetaPhlAn 4プロファイルのないデータセット（すなわち、TaralloS_2021、SardiNIA、GacesaR_2022）は除外した。
統計解析
マン・ホイットニーのU検定は、scipy Pythonライブラリの関数mannwhitneyuを用いて行った。
そうでない場合は、本文中に明示されており、対になった標本が利用可能な場合、 scipy Python ライブラリの関数 wilcoxon を用いて Wilcoxon 符号順位検定を適用した。
特に指定がない限り、公称p値は Benjamini-Hochberg 手法を用いて多重仮説検定のために補正した。
statsmodels Python ライブラリの関数 fdrcorrection を用いた。
偽発見率（FDR）補正p値はq値として報告された。Mann-Kendall 検定は、単調トレンドの有無を評価するために使用した（R パッケージ funtimes の notrend_test (test="MK") 関数）。
). hPDIスコアとBMI値は、傾向検定に十分なポイントを持つように10進数に分割した（図2B、4A、4B）。効果量は、pingouin Pythonライブラリのcompute_effsize関数を用いて算出した。
特に断りのない限り、図中のq値は以下のようにアスタリスクで表されている： ∗=q-value<0.1、∗∗=q-value<0.01、∗∗=q-value<0.001、∗∗∗=q-value<0.0001。
Pythonで地理空間データを扱うためにGeoPandas v0.11.0を使用した。各国の等高線を含む世界地図は、GeoPandasのデータセット "naturalearth_lowres "からダウンロードした。2021 US Divisions Cartographic Boundary File (shapefile, 1:500,000 resolution) はhttps://www.census.gov/ からダウンロードした。mapshaper Interactive web interface(www.mapshaper.org)を使用して、より見やすくするために、太平洋区分から "アラスカ"、"プエルトリコ"、"ハワイ "の各州を削除し、シェープファイルをGeoJSON形式に変換した。
図 2Cのヒートマップを作成するために、各コホートにおける各食品の25 パーセンタイル、50 パーセンタイル、および75パーセンタイルを計算し、個人の相対的な食品消費量に基づいて 4 つの四分位に分けた。各四分位群内でBlastocystis有病率を計算し、それに応じてセルを着色した。食事データの離散的な性質により、3つの四分位値のうち2つの四分位値のカットオフ値が同じであったため、1つの四分位値が空になってしまったケースがいくつかあった。この問題に対処するため、Blastocystisの有無で層別化した隣接する2つの四分位群に無作為に個人を分割した。空白の四分位がQ2またはQ3のいずれかであり、どちらも隣接する2つの四分位（すなわち、Q2はQ1とQ3、Q3はQ2とQ4）を持つ場合、より多くの個体がいる隣接する方を無作為に分割するために選択した。食品は、すべてのPREDICTコホートにおいて芽球菌陽性または陰性の個体で一致して高いかどうかに基づいて分類した。次に、すべてのPREDICTコホートにわたる、Blastocystis陽性個体と陰性個体間の消費量の差の合計で食品を並べ替え、全体の最大値で正規化した。
図5Bのヒートマップでは、ML解析に使用した21のデータセットにわたる平均パーセンタイルランクを考慮し、CV MLモデルからの特徴インポータンスに従って、上位にランクされた100のSGBを選択した（Blastocystisキャリッジの予測を参照）。各データセットおよび上位100個のSGBのそれぞれについて、相対存在量の値をマン・ホイットニーのU検定で比較し、ブラストシスチス陽性個体と陰性個体間の平均相対存在量のLog2Fold Changeを計算した。低い有病率または低いサンプルサイズによるバイアスを避けるため、SGBは、(i) ブラストシスチス陽性個体および陰性個体の少なくとも5％に存在し、そのような個体の総数が10を超える場合、または(ii)SGBが少なくとも50のブラストシスチス陽性サンプルおよび陰性サンプルに存在する場合にのみ検査した。次に、SGBをデータセット間の平均Log2FCに従って並べ替えた。視覚的な目的のために、100個のSGBのうち30個だけを選び、21個のデータセットすべてで検査され、絶対平均Log2FCが0.5以上のものを選んだ。ブラストシスチス陰性サンプルにおいて相対存在量が高い（すなわち、平均Log2FCがマイナス）9つのSGBのみがこれらのフィルターを通過した。そして、残りの21個を最も正の平均Log2FC値を持つものとして選択した。白抜きは、Mann-Whitney U検定（q値＞0.1）のFDR補正後、統計的に有意差がないことを示す。
メタアナリシス
ランダム効果モデルを用いてメタアナリシスを実施し、連続指標としてのBMIとブラストシスチスの存在との関連、および集積データセットにおける慢性疾患参加者対健常/対照参加者のサンプリングの可能性の強さを評価した。BMIメタ解析では、性別、年齢、およびBMIに関する情報が入手可能な健康な成人（12歳以上）を対象とした。BMIが18.5kg/m2未満であると報告した少数の患者は除外した。
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(PREDICT 1ではn=22、PREDICT 2ではn=14、PREDICT 3 US21ではn=50、PREDICT 3 US22Aではn=54、PREDICT 3 UK22Aではn=120）。Blastocystis陽性10検体未満、Blastocystis陰性10検体未満の研究も除外した（24データセットから総検体数n=36,065
). 健常/疾患のメタ解析では、年齢、性別、BMI情報がある成人（12歳以上）を対象とし、低体重者は除外した。さらに、少なくとも10個のBlastocystis陽性サンプルと10個のBlastocystis陰性サンプルを有し、少なくとも健常者／対照者から10個のサンプルと疾患者から10個のサンプルを有するコホートに解析を限定した（8つの疾患カテゴリーにまたがる17の研究からn=44,906 [症例13,548例、対照31,358例]、表S5）。8つの疾患カテゴリーとは、冠動脈疾患、脳血管疾患、心不全を含むアテローム性動脈硬化性心血管疾患（ASCVD）、2型糖尿病（T2D）、耐糖能異常、メタボリックシンドロームを含む糖尿病、高脂血症、炎症性腸疾患（IBD）、土壌伝染性蠕虫感染症（STH）、前駆腺腫を含む大腸がん（CRC）、喘息、片頭痛である。
各分析および各研究について、性別、年齢、BMI（後者ではBMIのみ）を考慮したブラストシスチスの有無に関するロジスティック回帰モデリングを行った。BMIメタ解析では、BMIをロジスティック回帰モデルの連続予測因子として使用し、健常/疾患メタ解析では、参照健常/対照個体と比較して慢性疾患を有する個体からのサンプルである可能性を評価するためにロジスティック回帰を使用し、健常個体に対する疾患個体の対数オッズ比係数を各研究から標準誤差とともに抽出し、Paule-Mandel式で研究間分散を推定しながら、(https://github.com/waldronlab/curatedMetagenomicDataAnalyses)で利用可能なプログラムで合成した。単一研究のp値はt統計量の係数の極値として計算され、メタアナリシスの係数のp値はZスコアの極値確率として計算された。
その他のリソース
PREDICTコホートは以下の臨床試験の一部である。PREDICT 1ClinicalTrials.govID： NCT03479866(https://clinicaltrials.gov/study/NCT03479866); PREDICT 2ClinicalTrials.govID： NCT03983733(https://clinicaltrials.gov/study/NCT03983733); PREDICT 3： P3 米国プロトコール番号（IRB）： Pro00044316；P3英国倫理審査参照： HR-23/24-28300;ClinicalTrials.govID： NCT04735835(https://clinicaltrials.gov/study/NCT04735835)。
謝辞
PREDICTプログラムの参加者に感謝する。この研究は、Wellcome Trust、Medical Research Council、Versus Arthritis、EU Horizon 2020、Chronic Disease Research Foundation、National Institute for Health Research Clinical Research Network、King's College Londonと提携したGuy's and St Thomas' NHS Foundation Trustを拠点とするBiomedical Research Centreから資金提供を受けているZoe Ltd.とTwinsUKの支援を受けた。L.H.N.はマサチューセッツ総合病院/チェン研究所医学部門Transformative Scholarである。この研究の一部は、L.H.N.への米国消化器病学会研究財団の研究奨学金、L.H.N.へのクローン病・大腸炎財団キャリア開発賞、L.H.N.へのNIH/NIDDK K23DK125838の支援を受けている。本研究は、N.S.に欧州研究評議会（ERC-STG project MetaPG-716575およびERC-CoG microTOUCH-101045015）、N.S.に欧州連合（EU）のHorizon 2020プログラム（ONCOBIOME-825410 project、MASTER-818368 project、IHMCSA-964590）の支援を受けた、 欧州連合（EU）のHorizon Europeプログラム（DOMINO-101060218）、欧州連合（EU）のNextGenerationEU（INEST）からN.S.、米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）の国立がん研究所（1U01CA230551）からN.S.、R35 CA253178からA.T.C、 MBSおよびMLVSは、NIH U01CA176726およびU01CA167552の支援を受けた。内容はあくまで著者の責任であり、必ずしも米国国立衛生研究所の公式見解を表すものではない。Lifelines Biobankイニシアチブは、オランダ保健福祉スポーツ省、オランダ経済省、フローニンゲン大学医療センター、フローニンゲン大学、およびオランダ北部州によって実現された。著者らは、Lifelines Cohort Study、Lifelinesにデータを提供している研究センター、およびすべての研究参加者に謝意を表する。J.F.は、Dutch Heart Foundation IN-CONTROL（CVON2018-27）、ERC-CoG（No.101001678）、NWO-VICI助成金VI.C.202.022、Stichting AmmodoによるAMMODO Science Award 2023 for Biomedical Sciences、オランダ教育文化科学省によるNWO Gravitationプロジェクト（024.003.001）であるNetherlands Organ-on-Chip Initiativeの支援を受けている。A.Z.は、オランダ心臓財団IN-CONTROL（CVON2018-27）、ERC-StG（No.715772）、NWO-VIDI助成金016.178.056、NWO Gravitation助成金Exposome-NL（024.004.017）の支援を受けている。A.T.C.はAmerican Cancer Society Research Professor Awardの一部支援を受けている。
著者貢献
本研究の企画・監督： T.D.S.、N.S.、F.A.、解析を行った： E. Piperni；データ解析、ソフトウェア、サンプル処理に貢献した： L.H.N.、P.M.、H.K.、E.Pasolli、S.A.-S.、A.A.、K.M.B.、A.B.-M.、S.M.、M.V.-C.、E.B.、F.B.、R.D.、E.F.、F.G.、G.H.、E.R.L.、M.L.、M.M.、A.M.、 L.J.M.、M.Pala、M.Pitzalis、J.W.、J.F.、A.Z.、F.C.、S.E.B.、D.E.、A.T.C.、C.H.、T.D.S.、N.S.、F.A.；原稿執筆・編集： 原稿執筆・編集：E. Piperni、L.H.N.、S.M.C.、C.H.、T.D.S.、N.S.、F.A.
利益申告
G.H.、J.W.、T.D.S.はZOE社の共同設立者である。G.H.、J.W.、R.D.、F.G.、K.M.B.、A.A.およびE.R.L.は、ゾーイ社の従業員である、または過去に従業員であった。N.S.、F.A.、S.E.B.およびT.D.S.はZOE社のコンサルタントである。T.D.S.、R.D.、J.W.、G.H.、N.S.、S.E.B.はZOE Ltd.のオプションを受けている。他のすべての著者は、競合する利害関係を宣言していない。ZOE Ltd.は、ブラストシスチスに関する以下の特許出願を保有している：米国特許出願中17/203,678、欧州特許出願中21713392.5および24386003.8、PCT（世界）特許出願中PCT/EP2022/076241。
補足情報
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表S1. 図1および表1に関連する、大陸別にグループ化した全データセットおよび国でのブラストシスチス有病率、大陸間および米国の区分および州内での有病率の比較、さまざまな年齢区分におけるさまざまな身体部位およびヒト腸管でのブラストシスチス有病率（生活様式別に区分）。
最初の表は、本研究に含まれるすべてのデータセットを検体の出身大陸別に分類したものである。2大陸からのサンプルで構成される5つのデータセットが2回報告されている（すなわち、CosteaPI_2017、Obregon-TitoAJ_2015、PehrssonE_2016、PREDICT 1、RampelliS_2015）。全体のブラストシスチス有病率およびST特異的有病率は、健常成人（12歳以上）を対象として算出されている。この表では、健康体重または過体重のBMIを有する個人の全体的なブラストシスチス有病率も報告している。図1Aには、健常成人サンプルが10個以上のデータセットが含まれている。2番目の表は、本研究に含まれる古代ヒト腸内メタゲノムサンプルを含む7つのデータセットを報告している。3番目の表は、健常成人について計算した、解析した各国における全体のブラストシスチス有病率とST特異的有病率を報告している。サンプル数が10未満の国は図1Aから除外した（アイスランドなど）。第4表と第5表は、各大陸におけるBlastocystis有病率に関するFisher検定の結果を、それぞれ「1対1」と「1対その他すべて」で報告している。すべてのp値はBenjamini-Hochberg法を用いて多重検定で補正した。第6表と第7表は、米国の各部門（および州）におけるブラストシスチス有病率、およびBMIとhPDIの中央値を報告している。データは、PREDICTコホートの健常成人サンプルで、米国の区分情報があるものである（PREDICT 1n=97、PREDICT 2n=879、PREDICT 3 US21n=7,782、US22An=5,777、合計n=14,535）。8番目の表は、ヒトのさまざまな部位におけるブラストシスチスの有病率を示しており、ブラストシスチスは便検体でのみ検出されたことを示している。最後の表は健常人の検体のみを含み、異なる年齢カテゴリーにおけるブラストシスチス有病率を報告している。凡例：新生児：年齢（y）＜1；小児： 1 <= 年齢（y） < 12; 学童： 12 <= 年齢（歳）< 19; 成人: 19 <= 年齢（歳）< 65; 高齢者: 年齢（歳）> 65。
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表S2. 解析した全動物データセットにおけるブラストシスチス有病率、およびブラストシスチスが少なくとも1回検出された動物種（図1mmc2に関連）この表は、本研究に含まれる全動物データセットの全体的なブラストシスチス有病率およびST特異的有病率を、異なる種およびプロファイリングされたサンプル数とともに報告している。Anas creccaを除き、ブラストシスチスが検出されたすべての種は霊長類以外の動物である。
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表S3. 図2に関連する食餌嗜好情報が利用可能な個体におけるブラストシスチス有病率この表は、異なる食餌療法を行った個体におけるブラストシスチス有病率を報告するもので、10サンプル未満のグループは図2Aから除外した（すなわち、MBS / MLVSのビーガン）。
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表S4. 一卵性双生児および二卵性双生児におけるBlastocystis存続に関する縦断的解析およびBlastocystis存在に関する解析、STARに関連Methods利用可能なサンプリング時点の数および計算に従って被験者をグループ化した縦断的解析： Baは、検討したすべての時点でBlastocystisが存在する；Bnは、検討した時点でBlastocystisが存在しなかった；Bfは、検討した時点でBlastocystisが少なくとも1回は検出された。Blastocystisが検出された場合、それは通常経時的に保持される。下の表は、一卵性双生児（MZ、一卵性双生児）と二卵性双生児（DZ、二卵性双生児）の比較で、全体的なブラストシスチス有病率、双子の両方がブラストシスチス陽性であるペアの割合（すなわち、 双生児の両方がブラストシスチス陽性であるペアの割合（すなわち、ブラストシスチス陽性の一致）、および少なくとも1組の双生児が陽性であれば、そのペアの双方がブラストシスチス陽性である確率（すなわち、ペアワイズ一致率、両方がブラストシスチス陽性であるペアの数を少なくとも1組が陽性であるペアの数で割ったもの）。また、兄弟ペア（すなわち、DZペアとMZペアの両方）対無作為にマッチさせた参加者ペア（「偽」双生児ペア）における一致率も報告している。
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表S5. 図4に関連する、症例対照メタ解析に含まれるデータセットのリスト年齢、性別、BMI情報を持つ成人のみを対象とし、サンプル収集時にBMI＜18.5kg/m2と報告した人は除外した。ブラストシスチス陽性10検体以上、ブラストシスチス陰性10検体以上、健常者10検体以上、疾患者10検体以上のデータセットを対象とした。疾患カテゴリー 「動脈硬化性心血管系疾患（ASCVD）」には冠動脈疾患（CAD）、脳血管疾患（CVD）、心不全（HF）を含み、「糖尿病」には2型糖尿病（T2D）、耐糖能異常（IGT）、メタボリックシンドローム（MS）を含む； 炎症性腸疾患（IBD）；高脂血症；土壌伝染性蠕虫（STH）；腺腫を含む大腸がん（CRC）；喘息；片頭痛。
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表S6. クロスバリデーション設定におけるランダムフォレスト分類モデルにおける特徴の重要度によってランク付けされた上位100のSGB。CV ML分類モデルにおける特徴の重要度に従って上位にランク付けされた100のSGB（データセット間の平均パーセンタイルランク）について、ブラストシスチス陽性サンプルとブラストシスチス陰性サンプルにおける平均種の相対存在量間の図5Log2Fold Changeに関連。SGBは、各データセットにおいて、Blastocystis陽性および陰性サンプルの少なくとも5%に存在し、そのようなサンプルの合計が10を超える場合、またはBlastocystis陽性および陰性サンプルの少なくとも50に存在する場合にのみテストされた。
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表S7. PREDICT3 UK 23A RTコホートにおけるブラストシスチス有病率およびメタゲノムサンプリング間の経過時間（図6に関連）最初の表は、PREDICT3 UK 23A RTコホートにおけるブラストシスチスSTの有病率を、個別化食事介入プログラム（PDP）の前後、それぞれ「ベースライン」および「介入後」に報告している。
2番目の表は、参加者がPDPに従ったサンプリング時間間の経過時間（日および月）を報告している。