T細胞におけるPARP2のダウンレギュレーションは、リポ多糖誘導性の大腸の炎症を改善する
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オリジナル研究論文
Front. 免疫学、2023年6月30日
炎症
第14巻-2023年｜https://doi.org/10.3389/fimmu.2023.1135410
T細胞におけるPARP2のダウンレギュレーションは、リポ多糖誘導性の大腸の炎症を改善する
Máté Bencsics1、Bálint Bányai1、Haoran Ke1、Roland Csépányi-Kömi1、Péter Sasvári1、Françoise Dantzer2、Najat Hanini2、Rita Benkő1、Eszter M. Horváth1*。
1ハンガリー、ブダペスト、センメルワイス大学、生理学教室
2フランス、ストラスブール、CNRS/ストラスブール大学、バイオテクノロジーおよび細胞シグナル伝達、UMR7242
はじめに ヘルパー17型T細胞（Th17）のアップレギュレーションと制御性T細胞（Treg）のダウンレギュレーションを伴うT細胞依存性の炎症反応は、腫瘍壊死アルファ（TNFa）の産生増加を伴う炎症性腸疾患（IBD）の特徴である。T細胞応答を調節することで、炎症が緩和され、腸管障害が軽減される可能性がある。ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ-2(PARP2)は、T細胞亜集団の発達、分化、反応性に関与している。我々の目的は、盲腸と大腸のリポ多糖（LPS）誘発炎症反応におけるT細胞特異的PARP2ダウンレギュレーションの潜在的な有益性を調べることであった。
方法 コントロールマウス（CD4Cre; PARP2+/+）およびT細胞特異的コンディショナルPARP2ノックアウトマウス（CD4Cre; PARP2f/f）において、TNFa産生増加を特徴とする局所炎症反応を誘導するために低用量LPSを腹腔内注射した。TNFa、IL-1b、IL-17レベルはELISAで測定し、酸化・硝酸ストレスは免疫組織化学で推定し、大腸組織サンプルのPARP1活性、p38 MAPKおよびERKリン酸化、NF-kB発現はウェスタンブロットで調べた。全身および局所のT細胞サブポピュレーション、Th17およびTregの変化も、フローサイトメトリーおよび免疫組織化学を用いて調べた。
結果 対照動物では、LPSはTNFa産生の増加を伴う腸炎を誘発したが、T細胞特異的PARP2ノックアウト動物ではTNFa産生の有意な増加は観察されなかった。LPSによるTNFa産生上昇の消失は、IL-1b産生上昇の消失とIL-17産生抑制を伴い、炎症反応の顕著な抑制を示した。酸化的硝酸ストレスとPARP1活性化の増加は、ERKとNF-kBの活性化の変化とともに、これらの組織では見られなかった。腸粘膜の抗炎症性Treg細胞数の増加は、末梢循環のTreg数の減少とともに観察された。
考察： 我々の結果は、T細胞特異的PARP2ダウンレギュレーションがLPS誘発大腸炎を改善することを確認した。LPS処理後のTNFa産生低下、IL-17産生低下、腸管制御性T細胞数の増加は、IBDにみられる炎症過程においても有益であると考えられる。酸化的硝酸ストレスとPARP1の活性化を減少させることにより、T細胞特異的PARP2ダウンレギュレーションも腸組織障害を緩和する可能性がある。
1 はじめに
炎症性腸疾患（IBD）は慢性の自己炎症性疾患であり、クローン病（CD）と潰瘍性大腸炎（UC）の2つのサブタイプがある（推定有病率はそれぞれ0.3%）(1, 2)。この領域における集中的な研究にもかかわらず、IBDの病因は未だ完全には解明されておらず、臨床医とその患者にとって利用可能な治療法の選択肢は限られている。IBDと診断される患者数が増加していることも、この疾患の理解を深め、より効率的な治療法を導入することの重要性を強調している(3, 4)。
IBD患者では、腸粘膜に慢性的な病的炎症が存在し、数回の急性増悪により粘膜の損傷と腸管透過性の亢進が起こる(5-7)。免疫反応は正常な腸内細菌叢によって誘発される。酸化的・硝酸的ストレスの増加は、腸炎症のもう一つの特徴であり、炎症性シグナル伝達とともに、さらなる細胞傷害とポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ1および2（PARP1およびPARP2）の活性化を引き起こす(8, 9)。
T細胞特異的免疫応答はIBDの発症に不可避な役割を担っている。粘膜と固有層で活性化したサプレッサーT細胞とヘルパーT細胞は炎症性サイトカインを産生し、炎症を維持する。TNFαの産生亢進はIBD患者に共通する特徴であり、免疫学的治療の標的となる。IL-17はTNFαとともに炎症性遺伝子発現の病的制御に重要な役割を果たしている。このような炎症環境では、ヘルパーT細胞17（Th17）のアップレギュレーションと制御性T細胞（Treg）のダウンレギュレーションが観察され、炎症の維持と拡大にさらに寄与する可能性がある。T細胞機能の調節は、IBDの研究と治療における新しい分野である。
最近の研究によると、アデノシン二リン酸リボシルトランスフェラーゼ(ADPRT)酵素スーパーファミリーの一員であるPARP2は、免疫反応に決定的な影響を及ぼし、T細胞の恒常性維持に重要な役割を果たしている(10)。PARP2は、ADPRT酵素スーパーファミリーの中でもより特徴的なメンバーであるPARP1と同様に、DNA損傷時に活性化される。どちらの酵素もニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD+）からポリ（ADP-リボース）（PAR）ポリマーを合成し、主に核タンパク質に結合させる。PARP1とPARP2はヘテロ二量体化し、いくつかの共通の核内結合パートナーを共有しているが、その特徴と機能は似ているが完全には重複していない。PARP1がDNAニックを標的とするのに対し、PARP2はDNAギャップを好む。PARP1はヒストンH1を優先的に修飾するが、PARP2では主にヒストンH2Bが主要なアクセプターである(8, 11, 12)。ADPRT酵素スーパーファミリーの中で最も触媒活性の高いPARP1はクローン病においてその役割が広く研究されていたが、PARP2はほとんど研究されていなかった。
最近の知見では、PARP2はT細胞の恒常性維持に重要な役割を果たしていることが示唆されている。PARP2はT細胞の発生にも関与しており、グローバルPARP2ノックアウトマウスが報告されている。これらのマウスでは、二重陽性T細胞の生存率が低下したために胸腺内の胸腺細胞数が減少したが、二重陰性T細胞の成熟や細胞増殖には有意な低下は見られなかった(10)。実験的自己免疫性脳脊髄炎モデルでは、PARP2欠損マウスは中枢神経系へのTh1とTh17の浸潤が減少しており、T細胞亜集団の遊走と活性化にPARP2が関与していることを示している(13)。T細胞のホメオスタシスに影響を及ぼすPARP2によって制御される分子標的は、あまり特徴付けられていない。骨髄・破骨細胞特異的コンディショナルPARP2ノックアウトマウスモデルでは、乳癌転移モデルにおいて、CCL3などの様々なケモカインの産生低下が観察され、Tregの増加とTh1の減少を伴っていた(14)。グローバルPARP2ノックアウトマウスと同様に、T細胞特異的コンディショナルPARP2ノックアウトマウスでは、二重陽性T細胞の減少により、脾臓のT細胞の総数が減少した。一方、より成熟した単一陽性（CD4またはCD8）T細胞数には変化はみられなかった。これらのマウスのT依存性抗原に対するT細胞応答は変化せず、ワクチン接種の有無にかかわらず、ワクシニアウイルス感染によって誘導される免疫反応も最小限の変化しか示さなかった(15)。
我々の目的は、大腸におけるTNFαの増加を特徴とするリポ多糖（LPS）誘発炎症反応におけるT細胞特異的PARP2欠損の潜在的有用性を調べることであった。
2 方法
2.1 動物
Dantzer教授とストラスブール大学から提供されたT細胞特異的PARP2ノックアウトマウスを基に、我々のグループはコントロールマウス（CD4Cre; PARP2+/+）とT細胞特異的コンディショナルPARP2ノックアウトマウス（T-cell-PARP2-KO）（CD4Cre; PARP2f/f）の交配系統を確立した。本研究は、EU指令2010/63/EUおよび米国国立衛生研究所発行のGuide for the Care and Use of Laboratory Animals（NIH Publication No.85-23、1996年改訂版）に準拠した。本研究は、動物実験に関する科学倫理委員会（ハンガリー）およびセンメルワイス大学機関倫理委員会（文献番号PE/EA/1652-7/2018）の審査および承認を得た。動物は12時間明暗サイクルの標準的な条件下で飼育し、実験期間中は標準的な実験用ラットの餌と水を自由に摂取させた。
2.2 腸炎症の誘発
実験は14～18週齢の雄マウスを用いて行った。コントロール（CD4Cre；PARP2+/+）およびT細胞特異的PARP2ノックアウト（T-cell-PARP2-KO）動物をさらに2群に分け、一方にLPS注射（大腸菌LPS 2 mg/kg投与、濃度1 mg/ml）を腹腔内投与し、他方は無処置のままとした。各群（コントロール、コントロール＋LPS、T細胞-PARP2-KO、T細胞-PARP2-KO＋LPS）は12匹で構成された。これらの処置の後、6時間の観察期間が設けられた（研究者が継続的に同席し、30分ごとに状態を評価）。深麻酔下（2,2,2-トリブロモエタノール、0.375mg/g腹腔内）、動物の血液を下大静脈のカニューレから採取した。動物の循環系を生理食塩水で灌流した。その後、動物の盲腸と結腸からサンプルを採取した。これらの組織は、リン酸緩衝ホルムアルデヒドに入れるか、液体窒素でスナップ凍結し、-80℃で保存した。
2.3 T細胞亜集団の決定
ヘパリン化血液サンプル中のT細胞亜集団の相対数は、4チャンネルフローサイトメトリーにより決定した。抗体はThermo Fisher Scientific社（Waltham, MA, USA）から入手し、CD3（ANTI-MO CD3 17A2 FITC 100UG; 11-0032-82; RRID: AB_2572431）、CD4（ANTI-MO CD4 RM4-5 PERCP-CYN5. 5 100UG; 45-0042-82; RRID: AB_1107001）、CD25（ANTI-MO CD25 PC61.5 PE 100UG; 12-0251-82; RRID: AB_465607）およびCD196（ANTI-MO CD196 SIRX6 EF660 100UG; 50-7196-82; RRID: AB_11219682）抗原を同定した。CD3およびCD4陽性T細胞集団の同定後、Th17/Th（CD3+ CD4+ CD196+/CD3+ CD4+）およびTreg/Th（CD3+ CD4+ CD25+/CD3+ CD4+）の比率を、それらの特異的細胞膜マーカーをマーキングすることにより決定した。欠測値は、総細胞数が少ないためである。
2.4 腸局所炎症のマーカー
2.4.1 炎症性サイトカイン、炎症
動物の結腸から採取した深部凍結腸組織サンプルを、プロテアーゼ-ホスファターゼ阻害剤カクテル（Roche, Basel, Switzerland）を含むRIPA緩衝液（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA）中で、組織ホモジナイザーを用いて一定冷却しながらホモジナイズした。得られたホモジネート上清のタンパク質濃度は、BCAアッセイ（Thermo Fisher Scientific）を用いて定量した。盲腸および結腸ホモジネートからの炎症性サイトカイン濃度は、ELISA法（IL17 - Invitrogen Mouse IL-17 ELISA Kit BMS6001、TNFα - Invitrogen Mouse TNFα ELISA Kit BMS607-3、IL1β - Invitrogen Mouse IL-1 beta ELISA Kit BMS6002）（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて測定し、総タンパク質含量で正規化した。N=10-12/群。欠測値はタンパク質濃度が低いため。ヘマトキシリン-エオジン染色した組織切片で、炎症スコアシステム（補足表2）に従って粘膜炎症のレベルを調べた（16）。免疫組織化学のために、盲腸と結腸の腸組織サンプルを4%中性緩衝パラホルムアルデヒド溶液で固定し、パラフィンに包埋し、厚さ5μmの組織切片をスライスした。脱パラフィン後、TNFαの上皮局在を免疫組織化学的に解析した（pH6クエン酸緩衝液で17分間抗原回収、TNFα抗体、SAB4502982、Sigma-Aldrich、St. Louis, MO, USA; RRID : AB_10746474 二次標識はHRP結合抗ウサギポリクローナル馬抗体(MP-7401-15, Vector Laboratories, California, USA)で行い、褐色のジアミノベンジジン(DAB, SK-4100, Vector Laboratories, California, USA)で可視化した。青色ヘマトキシリン（H-3404, Vector Laboratories, California, USA）を対比染色として用いた。免疫標識した腸管組織切片の画像は、Nikon Eclipse Ni Microscope（Nikon Instruments, Amstelveen, The Netherlands）に20×対物レンズを装着し、Nikon DS-RI2カメラ（Nikon Instruments）とNIS-Elements BRイメージングソフトウェア（Nikon Instruments）を用いて撮影した。
2.4.2 細胞内炎症シグナル伝達
細胞内炎症シグナル伝達のメンバーを、1群につき4～5匹の動物でウェスタンブロッティングにより調べた。ライセートの上清を還元SDSサンプルバッファー中、100℃で5分間煮沸し、各サンプルの等タンパク質量を4-15%(w/v)勾配ポリアクリルアミドゲル(Bio-Rad, Hercules, California, USA)で測定し、分離したタンパク質をニトロセルロースメンブレン(Bio-Rad, Hercules, California, USA)に転写した。EveryBlotブロッキングバッファー（Bio-Rad, Hercules, California, USA）で10分間ブロッキングした後、膜を以下のモノクローナル抗体とインキュベートした：p38 MAPK（#9212S; RRID: AB_330713）, phospho-p38 MAPK（#4511S; RRID： AB_2139682), p44/42 ERK (#4695S; RRID: AB_390779), phospho-p44/42 ERK (#4370S; RRID: AB_2315112), NF-κB p65 (#8242S; RRID: AB_10859369), (Cell Signaling, Danvers, MA, USA)を1:1000希釈で4℃で一晩処理した。結合した抗体は、1:5000希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギ-IgG（ロバ由来）二次抗体（GE Healthcare, Chicago, Illinois, USA, NA934V）を用いて増強化学発光で検出した（1時間、室温）。α-平滑筋細胞アクチンは、抗アクチン抗体（ab7817, Abcam, Cambridge, United Kingdom; RRID: AB_262054）を用いて検出した。バンド強度はImageJソフトウェア（ver.1.53o）で定量した。フィルムはTIFフォーマットで1インチあたり600ドットでスキャンした。各バンドを個別に選択し、ピーク面積を取得し、各ヒストグラムの任意の面積値として3回定量した。データの正規化には、ハウスキーピングタンパク質としてアクチンを用いた。複数の膜のデータを正規化後に解析した。
2.4.3 腸組織における酸化的硝酸ストレスとPARP活性化
組織PARP活性（タンパク質のPAR化レベル）は、1群につき6～8匹の動物でウェスタンブロッティングにより調べた。ライセートの上清を還元SDSサンプルバッファー中で95℃、5分間煮沸し、各サンプルの等タンパク質量を4-12%(w/v)勾配ポリアクリルアミドゲルで測定し、分離したタンパク質をニトロセルロース膜（Invitrogen）に転写した。膜の非特異的標識は、10%脱脂乾燥乳溶液で室温でインキュベート（1時間）することにより防止した。その後、膜を抗PAR抗体（1:1000、1%牛乳中、ab14459、Abcam、Cambridge、UK；RRID: AB_301239）と一晩（4℃で）インキュベートした。洗浄手順の後、膜を西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体（1% 乳中1:1000）（ヤギ抗マウスHRP Invitrogenカタログ#31460）と1時間（室温）インキュベートした。α-平滑筋アクチンをローディングコントロールとして用いた（ab7817 1:10000 in 1% milk; Abcam, Cambridge, United Kingdom; RRID: AB_262054）。Super Signal West Pico Plus（Thermo Fisher Scientific）の化学発光基質を用いて免疫反応性タンパク質のバンドを発現させた。Bio-Rad Image Lab Software（Bio-Rad Laboratories）を用いて、発現したバンドの強度を解析し、調整した積分密度を測定した。各サンプル内で、主要ターゲットのバンドの強度を、同じブロット上のα-平滑筋細胞アクチンのそれに対して正規化した。複数の膜のデータを正規化後に解析した。
タンパク質PAR化の上皮局在は、あらかじめホルマリン固定しパラフィン包埋した結腸切片の免疫組織化学染色（0,15％PBSプロテイナーゼK抗原回収12分間、抗PARマウスモノクローナル抗体（ab14459, 1:500, Abcam; RRID: AB_301239）によって解析した。上皮の硝酸ストレスは、4-5匹/群のマウスで、3-ニトロチロシン（3-NT）ニトロソアミンストレスマーカーの免疫組織化学的標識（0,15%PBS proteinase K抗原回収12分間、3-ニトロチロシン抗体06-284ウサギポリクローナル1:250、Merck, Massachusetts, USA; RRID: AB_310089）によっても推定した。制御性T細胞の腸内局在は、FoxP3（pH3クエン酸緩衝液抗原回収17分、FoxP3（14-5773-82）ラットモノクローナルIgG2aκ抗体1： 500, Invitrogen, Massachusetts, USA; RRID: AB_467576、アイソタイプコントロール (14-4321-82) ラット IgG2a κ抗体 1:500, Invitrogen, Massachusetts, USA; RRID: AB_470105)。免疫組織化学の間、二次標識はHRP結合抗ウサギポリクローナル馬抗体（MP-7401-15, Vector Laboratories, California, USA）によって達成され、これは褐色ジアミノベンジジン（DAB, SK-4100, Vector Laboratories, California, USA）によって可視化された。青色ヘマトキシリン（H-3404, Vector Laboratories, California, USA）を対比染色として用いた。免疫標識した腸組織切片の画像は、Nikon Eclipse Ni Microscope（Nikon Instruments, Amstelveen, The Netherlands）に20×対物レンズを装着し、Nikon DS-RI2カメラ（Nikon Instruments）とNIS-Elements BRイメージングソフトウェア（Nikon Instruments）を用いて撮影した。NT標識の場合、染色強度は粘膜の褐色（DAB）の非較正光学濃度を測定することで推定した。FoxP3の場合、陽性に染色された細胞を腸管断面全体で数え、その数をImageJソフトウェア（National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA）を用いて上皮面積で正規化した。
2.5 統計解析
統計解析は、GraphPad statistical software package（GraphPad Software, La Jolla, CA）を用いて行った。統計的プローブは、Tukeyのポストホックテストを伴う二元配置分散分析に基づき、非ガウス分布（Shapiro-Wilk検定）を持つ変数は、分析のために対数変換した。p<0.05は統計的に有意とみなされた。データは、正規分布変数の場合は平均±標準偏差（SD）、非ガウス分布の場合は中央値［IQR］で示した。Nは3～5回の独立した実験から得られた1群あたりの動物数を表す。各分析の生データは補足表1にある。
3 結果
3.1 結腸および盲腸における局所炎症反応
3.1.1 炎症性サイトカイン、酸化的硝酸ストレスおよび炎症
TNFα産生亢進はIBDの特徴であり、LPSによる炎症反応と共通する特徴であることから、まず、LPS処理の有無にかかわらず、T細胞特異的PARP2ダウンレギュレーションがこのサイトカインの腸管組織濃度に及ぼす潜在的影響を検討した。大腸において、TNFαの組織レベルは、LPS処理なしで測定した場合、コントロール群とT細胞-PARP2-KO群で同程度であった。コントロール動物ではLPS処理によりTNFα濃度の上昇が予想されたが、T細胞-PARP2-KO動物ではTNFαの誘導は検出されなかった（図1A）。盲腸においても、LPS処理によりコントロールマウスではTNFα濃度が著しく上昇した。対照的に、T細胞-PARP2-KO動物では、LPS投与後にTNFα濃度が低下した。これらのマウスは、コントロール動物に比べ、当初はTNFαの基礎レベルが高かった（図1B）。腸壁におけるTNFαの局在を免疫組織化学で調べると、粘膜と免疫細胞が陽性に染色された（図1C、D）。他の特徴的な炎症性サイトカインであるIL-1βは、同様の傾向を示したものの、結腸では遺伝子型やLPS処理に関連した差は認められなかった（図1E）。盲腸では、コントロール群ではLPS処理によりIL-1ß濃度が上昇したが、T細胞-PARP2-KO動物では有意ではなかった（図1F）。IL-17はTh17優位の免疫応答の重要な制御因子であるが、コントロールマウスの大腸ではLPS処理による変化は見られなかった（図1G、H）。T細胞-PARP2-KOマウスの大腸組織では、LPS投与後にIL-17濃度が低下した（図1G）。TNFαと同様に、IL-17濃度もコントロールマウスと比較して、無処置のT細胞-PARP2-KOマウスで高かった（図1H）。酸化的硝酸ストレスの増加もまた、炎症過程の特徴である。我々は、3-ニトロチロシン（NT）の免疫組織化学的標識により、局所的な上皮硝酸ストレスを推定した。大腸では、LPS投与は両群とも硝酸ストレスの有意な上昇を誘導しなかった（図1I、J）。NT染色強度はLPS注射後、対照動物の盲腸で有意に増加したが、これはT細胞におけるPARP2のダウンレギュレーションによって消失した（図1K, L）。LPSによる組織の炎症は、対照動物の結腸（図1M、N）と盲腸（図1O、P）の両方でヘマトキシリン-エオジン染色した組織切片の評価によっても裏付けられたが、T細胞-PARP2-KO動物では顕著な炎症の徴候は観察されなかった。
図1
図1 コントロールマウスとT細胞-PARP2-KOマウスのLPS処理有無による組織炎症反応。(A）大腸におけるTNFαの組織濃度。LPS投与はコントロール群でのみTNFα濃度を上昇させた。(B）盲腸におけるTNFαの組織濃度。LPS投与は遺伝子型特異的にTNFα濃度の変化を引き起こした；コントロール群では上昇を引き起こしたが、T細胞-PARP2-KO群では減少をもたらした。(C, D) 抗TNFα抗体で標識した結腸および盲腸組織の代表画像。褐色のジアミノベンジジンは特異的染色を表し、青色のヘマトキシリンはカウンター染色として機能する。(E) 結腸におけるIL-1βの組織濃度。有意な変化は観察されなかった。(F）盲腸におけるIL-1βの組織濃度。TNFαと同様に、LPS投与後のIL-1ßレベルの増加はコントロール群でのみ検出された。(G）結腸におけるIL-17の組織濃度。コントロール群ではLPSに対するIL-17濃度の変化は認められなかったが、T細胞-PARP2-KOマウスでは顕著な減少が観察された。(H）盲腸におけるIL-17の組織濃度。T細胞-PARP2-KOマウスではIL-17濃度が高い。線は中央値[IQR]を表す。二元配置分散分析（遺伝子型とLPS処理）とTukeyのポストホック検定を対数変換したデータに対して行った。: p<0.05, : p<0.01, : p<0.001; N=10-12/group. (I）結腸における3-ニトロチロシンの免疫組織化学的標識の評価。LPS処理後、どのグループでも有意な増加は観察されなかった。(J）抗ニトロチロシン抗体で標識した結腸の代表的画像。褐色のジアミノベンジジンは特異的染色を表し、青色のヘマトキシリンはカウンター染色として機能する。スケールバーは100μm。(K）盲腸における3-ニトロチロシンの免疫組織化学的標識の評価。LPS投与により、コントロール群でのみ硝酸ストレスが増加した。(L）抗ニトロチロシン抗体で標識した盲腸の代表像。(M, O）。結腸と盲腸の組織学的炎症スコア。二元配置分散分析（Two-way ANOVA）により、LPS投与後に炎症が増加することが示されたが、これはコントロール群でのみ有意であった。(N, P)。ヘマトキシリン・エオジン染色による結腸と盲腸の代表的組織切片。線は平均値±SD 二元配置分散分析（遺伝子型とLPS処理）とTukeyのポストホックテスト, *: p<0.05,: p<0.01,: p<0.001, N=2-6匹/群.
3.1.2 大腸における炎症性シグナル伝達
LPS処理に対するコントロール動物とT細胞-PARP2-KO動物の反応経過を多様化させる可能性のあるシグナル伝達機構を大腸で調べた。PARP1の活性化は、抗PAR抗体で染色した膜上の総タンパク質PAR化レベルを測定するウェスタンブロット分析によって調べた。113-120kDaのタンパク質の線は酵素活性を反映する酵素の自己PAR化であり、64kDaの線は一般的なタンパク質のPAR化を反映する最も強い標識であった。LPS処理後のコントロール群では、PARP1の自己PAR化レベルの有意な上昇が観察されたが、T細胞-PARP2-KOマウスではPARP1活性に顕著な変化は見られなかった（図2A、C）。一般的なタンパク質のPAR化も、LPS処理後のコントロール動物で上昇した（図2B、C）。PARの免疫組織化学的標識は核局在を示し、ウェスタンブロットでは64kDaのタンパク質PAR化と同様の傾向を示した（図2D）。NF-κB発現の他の2つの重要な制御因子であるERKとp38 MAPKの活性化を、それらのリン酸化レベルを測定することにより調べた。LPS処理後、T細胞-PARP2-KO動物はコントロールマウスに比べ、ERKリン酸化レベルが有意に低かった（図2E, H）。MAPKリン酸化については、有意差は認められなかった（図2F, I）。同様に、NF-κB発現の場合も実験群間に差は見られなかった。しかし、二元配置分散分析により、遺伝子型とLPS処理との間に有意な交互作用があることが明らかになり、コントロール群とT細胞-PARP2-KO群ではLPS投与に対する反応が異なることが示唆された。
図2
図2 大腸における炎症性シグナル伝達。(A) PARP1の活性化。113-120kDにおけるPARの活性化；抗PARウエスタンブロットのデンシトメトリー分析を行い、正規化した積算ODをプロットした。PARP1の自己PAR化度はLPS処理対照動物で最も高かった。(B）一般的なタンパク質のPAR化。64kDaでのPAR化。有意差は認められなかった。(C）抗PAR抗体で染色した膜の代表的ウェスタンブロット像。(D）抗PAR抗体で染色した代表的な結腸組織切片。褐色のジアミノベンジジンは特異的染色を表し、対比染色は青色のヘマトキシリンである。スケールバーは100μm。(E）ERKリン酸化。T細胞-PARP2-KOマウスはコントロールと比較して、LPS処理後のERKリン酸化レベルが低かった。(F) p38 MAPKリン酸化。有意差は認められなかった。(G）NF-κB発現。二元配置分散分析により、遺伝子型とLPS処理との間の相互作用が証明された。(H）ホスホ-ERK抗体とERK抗体で染色した代表的なウェスタンブロット像。(I）ホスホMAPK抗体およびMAPK抗体で染色した代表的なウェスタンブロット像。(J）NF-κB抗体とアクチン抗体で染色した代表的なウェスタンブロット像。線は平均値±SD、二元配置分散分析（遺伝子型とLPS処理）とTukeyのポストホックテスト、：p<0.05、N=4-8匹/群。
3.2 全身性T細胞反応
末梢血T細胞亜集団の変化を調べ、全身性T細胞応答を特徴付けた。フローサイトメトリーで測定した全T細胞数に対するヘルパーT細胞の比率（Th/T: CD3, CD4/CD3）は、コントロールと比較してT細胞-PARP2-KOマウスで低かった。LPS処理により、遺伝子型とは無関係にTh/T比が増加した（図3A）。Treg/Th細胞の比率（CD3,CD4,CD25/CD3,CD4）は、LPS処理なしでも両遺伝子型とも同程度であった。コントロールマウスではLPSによる変化は認められなかったが（6.9±2.2；6.7±1％）、T細胞-PARP2-KO群では有意な減少が観察された（6.6±2.2 vs. 3.6±1.8％、p＜0.05）（図3B）。Th17/Th比（CD3,CD4,CD196/CD3,CD4）は1％以下であり、検出可能な差は認められなかった（図3C）。
図3
図3 コントロールマウスとT-Cell-PARP2-KOマウスにおける末梢血中のT細胞亜集団の比率（LPS処理の有無による）。(A）全T細胞数（Th/T）と比較したヘルパーT細胞の比率。T細胞-PARP2-KO群ではTh/T比が低く、LPS処理により遺伝子型によらずTh/T比が上昇した。(B）ヘルパーT細胞と比較した制御性T細胞の比率（Treg/Th）。LPS処理により、T細胞-PARP2-KO群でのみTreg/Th比が減少した。(C）ヘルパーT細胞と比較したTh17細胞の比率（Th17/Th）。Th17細胞数が少ないため、有意差は検出されなかった。線は平均値±SD、Tukeyのポストホックテストによる二元配置分散分析 : p<0.05; N=6-9匹/群。
3.3 大腸における制御性T細胞
末梢循環におけるTreg細胞数の減少は、LPS処理後のT細胞-PARP2-KOマウスにおける腸の炎症反応の抑制を伴っていた。このことは、LPS投与後の炎症反応が、T細胞-PARP2-KOマウスにおいて、これらの細胞の腸組織へのリクルートを誘導していることを示唆しているのかもしれない。盲腸では、FoxP3陽性細胞数はLPS処理後のT細胞特異的PARP2 KO動物で顕著に増加したが、対照マウスでは変化しなかった。大腸では有意な変化は認められなかった（データは示さず）（図4）。
図4
図4 大腸粘膜における制御性T細胞。(A）盲腸における1mm2あたりのFoxP3陽性細胞数。制御性T細胞数はT細胞-PARP2-KO群でのみLPS処理後に増加した。(B）FoxP3標識大腸切片の代表画像。褐色のジアミノベンジジンは特異的染色を表し、対比染色は青色のヘマトキシリンである。青い矢印は陽性に染色された細胞を示す。スケールバーは50μm。線は平均値±SD、二元配置分散分析、: p<0.05, **p<0.001; N=3-4匹/群。
4 考察
これまでの研究で、化学的および遺伝学的に誘導された大腸炎モデル動物の炎症を起こした結腸において、粘膜タンパク質のPARP化レベルまたは生体外酵素活性が上昇し、PARP1活性が上昇していることが示された。PARP1阻害の有益な効果は、ジニトロベンゼンスルホン酸（DNBS）やトリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）で誘発された急性・慢性大腸炎や、IL-10ノックアウトマウスで発症した自然発症の慢性大腸炎など、様々な動物モデルでも確認されている（17-20）。一方、数少ないヒトでの研究は、PARP1の病態におけるより複雑な役割を示唆していた。1988年、Markowitzらは、IBD患者の単核球が過酸化水素によるPARP1活性化の減少を示し、その一親等の近親者の関与さえも示唆した。彼らは、DNA修復の障害が疾患の病因に関与している可能性を示唆した(21)。数年後、クローン病患者においてPARP1（ジンクフィンガーモチーフF1およびF2）に対する自己抗体が同定され、特異的自己抗体のレベルはクローン病活動性指標（CDAI）と相関を示した(5, 22)。小児患者の大腸組織におけるPARP1の活性化を検討した我々の以前の研究では、PARP1のmRNA発現の上昇が観察されたが、PARP1蛋白レベルおよび活性は低下していた(23)。
IBDにおけるPARP2の役割についてはあまり知られていない。ある研究では、アンチセンスヌクレオチドによるPARP2の発現阻害が、IL-10欠損マウスの大腸炎の改善にも有効であることが示されている。PARP1と2はともにT細胞の発生と制御に関与しているが、PARP2はT細胞のホメオスタシスにおいてより重要な役割を担っている。PARP2のダウンレギュレーションは、急性および慢性の炎症刺激に対するT細胞の反応を変化させる可能性がある(15, 24)。IBDや他の自己免疫疾患における病態の重要な構成要素であるTh1とTh17の浸潤は、PARP2のダウンレギュレーションによって抑制される(13)。T細胞特異的PARP2ノックアウトマウスも免疫反応に変化を示す(15)。
本研究では、T細胞特異的PARP2のダウンレギュレーションは、低用量LPSの腹腔内投与によって誘発される腸の炎症反応を弱めるのに十分であった。PARP2の機能が損なわれていない対照動物は、予想通りTNFαとIL-1βの増加を示した。一方、T細胞-PARP2-KO動物では、TNFα、IL-1β、IL-17を含む炎症性サイトカインレベルは、LPS誘導に応答して著しく減少するか、あるいは変化しなかった。エフェクターT細胞はIBDの病因に重要な役割を果たすいくつかの炎症性サイトカインを産生する。TNFαは最もよく知られた免疫反応の重要なメディエーターの一つであり、IBDの特異的免疫療法、例えばインフリキシマブの標的として頻繁に用いられている。IL-17はTh17細胞の活性化に影響する重要なサイトカインであり、クローン病の2つの重要な特徴である慢性炎症と肉芽腫形成に寄与している(6, 7)。
我々の結果は、T-cell-PARP2-KOマウスにおいて、LPS処理後の腸の炎症反応が減少していることを証明するものであり、このことは細胞の炎症カスケードの活性化を評価することによって確認された。NTの免疫組織化学的標識によって推定される粘膜の酸化的-硝酸的ストレスは、LPS後のこれらの動物では増加しなかった。PARP1活性化もこのパターンに従った。LPS投与はコントロールマウスではPARP1活性化を誘導できたが、T細胞-PARP2-KO動物では誘導できなかった。PARP1活性化以外にも、MAPK経路は炎症性遺伝子転写因子NF-κBの発現調節にも関与している(25, 26)。我々のモデルでは、T細胞-PARP2-KOマウスは、コントロールと比較して、LPS誘発ERKリン酸化レベルが低かった。このような2つの遺伝子型の違いにより、LPS投与後のNF-κB発現は遺伝子型に依存して変化した。
一般に、LPS投与は2つの主要な方法でT細胞の活性化を誘導する。LPSは抗原提示細胞上のToll様受容体（TLR）によって認識され、古典的なT細胞活性化を引き起こすか、あるいはナイーブT細胞上のT細胞受容体に依存しないバイスタンダーT細胞活性化を誘導する。どちらの経路もサイトカイン産生とTh細胞応答をもたらす。我々は、遺伝子型に関係なく、LPS投与6時間後にTh/T細胞比の増加を見いだし、すべての動物でTh活性化が存在することを示唆した。腹腔内LPSも同様の経路で腸炎を引き起こす。組織常在マクロファージはLPSを認識し、Toll様受容体4（TRL4）に結合し、TNF産生をもたらす。腸管上皮細胞はNFκBシグナルによってTNFシグナルに反応し、カスパーゼ依存性のアポトーシスを活性化する。さらに最近の報告では、LPSが上皮細胞のTRL4に直接結合し、その結果上皮細胞からPGE2が分泌され、それに続いて白血球が活性化するという経路が示唆されている(27, 28)。
PARP2は胸腺と末梢の両方でT細胞の成熟に決定的な影響を及ぼす。胸腺では、PARP2は二重陽性の胸腺細胞の生存に重要であるため、PARP2のノックダウンはT細胞数の減少につながる(29)。T細胞-PARP2-KOマウスにおけるTh/T比の低下は、LPS処理後のこれらの動物の腸内サイトカイン産生の弱さに関与しているかもしれない。一方、T細胞-PARP2-KOマウスはTh/T比が低いにもかかわらず、LPS処理なしでも同様のサイトカイン産生パターンを示した。
Th17細胞自体もLPSを直接認識し、サイトカインの中でも特にIL-17産生を誘導することができる(30)。末梢循環におけるTh17細胞の数が少ないため、本研究ではその変化は検出できなかった。それにもかかわらず、T細胞-PARP2-KOマウスでは、LPS処理後のIL-17産生が低下しており、Th17細胞の局所活性化が低下していることが示唆された。これはTh17細胞の活性化が阻害された結果、あるいは制御性T細胞による抑制の結果である可能性がある。トレグもTLR4を選択的に発現するため、TCRが関与していない場合は、LPSによって直接活性化されることがある(30)。対照動物では、LPS処理6時間後にTreg数の有意な変化は認められなかったが、T細胞-PARP2-KOマウスの粘膜では増加が認められた。これは、LPS刺激に反応して局所Tregの拡大が亢進したことと、腸管外Tregのリクルートが相加的に起こった結果と考えられる。これと並行して、LPS投与後、これらのマウスの末梢循環におけるTregの数が減少していることがわかり、Tregのリクルートメントが増加していることが示唆された。
結論として、LPSの腹腔内注射は実験動物に急性大腸炎を誘発することができた。T細胞特異的PARP2ノックアウトマウスで見られたTNFα産生の上昇の抑制とIL-17の組織濃度の低下は、腸の炎症反応におけるPARP2抑制の保護効果を示唆しているのかもしれない。T細胞におけるPARP2のダウンレギュレーションはまた、酸化的硝酸ストレスの軽減とPARP1の活性化をもたらし、ERKとNF-κBの活性化の変化を伴っていた。末梢T細胞反応と腸内Treg遊走の違いも、これらの動物における炎症反応の減少に関与している可能性がある。この結果は、T細胞におけるPARP2抑制がLPS誘発大腸炎を予防することを示唆している。LPS誘発大腸炎における細胞性および体液性の変化は、IBD、特に発病時(27)および急性増悪時にみられる変化と類似していることから、T細胞特異的PARP2阻害はこれらの病態において有益である可能性がある。PARP1酵素とPARP2酵素の両方を阻害する選択性の異なるいくつかのPARP阻害剤は、主にBCRA変異を有する様々な固形癌の治療に用いられている。これらのPARP阻害剤は、炎症性疾患やIBDを含む他の適応症への使用の可能性も示唆されている(31)。一方、汎用のPARP阻害剤は副作用や変異原性の可能性から、数十年にわたり腫瘍学以外の分野への応用には疑問が投げかけられてきた。われわれの結果によれば、T細胞におけるPARP2酵素のみの抑制は、腸の炎症においても治療の可能性がある。最近、標的薬物送達システムの研究分野が急速に発展していることから（32）、近い将来、T細胞特異的なPARP阻害が利用できるようになるかもしれない。
データの利用可能性に関する声明
本研究で発表された原著論文は、論文／補足資料に含まれている。その他のお問い合わせは、対応する著者にお願いします。
倫理声明
動物実験は、Scientific Ethical Committee on Animal Experimentation（ハンガリー）およびSemmelweis UniversityのInstitutional Ethics Committee（参照番号PE/EA/1652-7/2018）により審査・承認された。
著者の貢献
著者らは本研究および最近の原稿に以下のように貢献した： MB：文献検索、実験、データ収集、データ解析、図表作成、原稿執筆。BB：文献検索、実験、データ収集、データ解析、図、画像、原稿校閲。HK：文献検索、実験、データ収集、データ解析、原稿執筆。RC-K：データ収集、データ解析、原稿査読、資金提供。PS：データ収集、データ解析、原稿査読。FD：動物モデル、コンセプト立案、原稿執筆。NH: 動物モデル、コンセプト立案、原稿の査読。RB：文献検索、実験、データ収集、原稿の査読。EH：研究デザイン、文献検索、コンセプト立案、実験、データ収集、データ解析、原稿執筆、資金提供。すべての著者が論文に貢献し、提出された原稿を承認した。
資金提供
本研究は、ハンガリー国立研究・開発・革新局NKFIH-FK129206（EH）、NKFIH-FK128376（RC-K）、TKP2021-EGA-24（RC-K）、Semmelweis大学（EH:STIA-18）の支援を受けた。
利益相反
著者らは、本研究が利益相反の可能性があると解釈される商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言する。
発行者注
本論文で表明された主張はすべて著者個人のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本論文で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張も、出版社によって保証または支持されるものではない。
補足資料
本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2023.1135410/full#supplementary-material に掲載されている。
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キーワード：大腸炎、IBD（炎症性腸疾患）、PARP（ポリADPリボース）ポリメラーゼ、PARP2、Tリンパ球、制御性（Treg）細胞
引用 Bencsics M, Bányai B, Ke H, Csépányi-Kömi R, Sasvári P, Dantzer F, Hanini N, Benkő R and Horváth EM (2023) T細胞におけるPARP2のダウンレギュレーションは、リポ多糖誘導性の大腸の炎症を改善する。Front. Immunol. 14:1135410.
受理された： 2022年12月31日；受理された： 2023年6月12日；
発行：2023年6月30日
編集者
Jia Xiao, 済南大学, 中国
査読者
Ainhoa Madariaga, スペイン、ホスピタル12デ・オクトゥブレ研究所
Ren Mao, 中山大学第一付属病院、中国
Copyright © 2023 Bencsics, Bányai, Ke, Csépányi-Kömi, Sasvári, Dantzer, Hanini, Benkő and Horváth. 本記事は、クリエイティブ・コモンズ 表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス記事です。原著者および著作権者のクレジットを明記し、学術的に認められている慣行に従って本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製を許可する。これらの条件に従わない使用、配布、複製は許可されない。
*文責 Eszter M. Horváth, horvath.eszter@med.semmelweis-univ.hu
免責事項：本論文で表明されたすべての主張は、あくまで著者個人のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本記事で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のあるいかなる主張も、出版社によって保証または支持されるものではありません。
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