ゴールドナノスフィアは腸内細菌叢依存的にTMAO代謝を制御することで骨粗鬆症を軽減させる

発行：2023年4月11日
ゴールドナノスフィアは腸内細菌叢依存的にTMAO代謝を制御することで骨粗鬆症を軽減させる

https://jnanobiotechnology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12951-023-01872-9?utm_source=dlvr.it&utm_medium=twitter

Gold-nanosphere mitigates osteoporosis through regulating TMAO metabolism in a gut microbiota-dependent manner - Journal of Nanobiotechnology

Yueqi Chenさん、
チュアン・ヤン
...
フェイ・ルオ
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Journal of Nanobiotechnology 21巻、記事番号：125（2023） この記事を引用する
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アブストラクト
骨粗鬆症（OP）は、骨量の減少と骨の脆弱性の増加を特徴とする代謝性骨疾患である。破骨細胞と骨芽細胞によって調節される骨の恒常性の不均衡は、骨粗鬆症の最も重要な病理学的変化である。ナノメディシンは、その高い効率性、精密性、副作用の少なさから、新しい治療戦略として、ドラッグデリバリーや標的療法に応用されています。金ナノ粒子（GNP）の一種である金ナノスフェア（GNS）は、優れた抗菌・抗炎症作用を持ち、眼病や関節リウマチの治療に応用されている。しかし、骨粗鬆症に対するGNSの効果については、未だ不明な点が多い。本研究では、GNSが腸内細菌叢依存的に卵巣摘出術（OVX）誘発の骨粗鬆症を有意に予防することを明らかにした。16S rDNA遺伝子配列解析により、GNSは腸内細菌の多様性と細菌叢の構成を著しく変化させることが示された。さらに、GNSはOVXマウスのTMAO関連代謝物の存在量を減少させた。TMAO濃度が低ければ、炎症反応を抑制することで骨量減少現象を緩和できるかもしれない。そこで、OVXマウスにおけるサイトカインプロファイルの変化について検討した。GNSは、血清中の腫瘍壊死因子α（TNF-α）、インターロイキン（IL）-6、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）を含む破骨細胞形成促進性または炎症性サイトカインの放出を阻害した。結論として、GNSは、腸内細菌叢の破壊されたホメオスタシスを制御することにより、関連するTMAO代謝を減らし、炎症性サイトカインの放出を抑制することにより、エストロゲン欠乏症による骨損失を抑制することが示された。これらの結果は、腸内細菌叢調節因子としてのGNSの骨粗鬆症に対する保護作用を示し、「腸-骨」軸の制御に関する新しい知見を提供した。
はじめに
骨粗鬆症は、骨基質の破壊と骨強度の低下を特徴とする一般的な代謝性骨格障害であり、骨の脆弱性と骨折のリスクを増大させます[1]。過去10年間で、骨粗鬆症は、世界中で約2億人が罹患する公衆衛生問題として浮上した。閉経後の女性の半数以上が、高齢者の死亡原因の多くを占める椎体変形や股関節骨折などの骨粗鬆症関連骨折を獲得する可能性があります[2]。閉経後骨粗鬆症と加齢性骨粗鬆症は、骨粗鬆症の最も一般的な臨床サブタイプであり、過剰な破骨細胞形成と重度の骨浸食に関連する病態生理学的変化を伴う[3]。破骨細胞は単球／マクロファージ系細胞から分化し、骨ホメオスタシスにおける骨吸収の調節に関与する可能性がある[4]。骨粗鬆症の現在の治療戦略は、主に抗骨吸収剤（エストロゲン、ビスフォスフォネート）と同化剤（テリパラチド、アバロパラチド）に焦点を当てていますが、大きな副作用と長期的有効性の証拠不足のためにいくつかの制限があります。最近の研究では、腸内細菌が骨代謝や骨粗鬆症の進行の調節に関与している可能性があることが示されている。骨粗鬆症患者の腸内細菌集団の組成、構造、多様性は、Fusobacterium、Dialister、Faecalibacterium、Tolumonasの増加、BacteroidesとRoseburia属の減少など著しく変化し、ディスバイオシス状態に至る[5、6]。前臨床動物モデルでは、腸内細菌叢の変化が骨組織の質と強度を低下させることが証明されました。腸内細菌叢の枯渇は、破骨細胞の数をネガティブに調節し、骨浸食を防ぐ可能性があります [7, 8]。さらに、卵巣摘出（OVX）マウスの食事にプロバイオティクスを補充することで、骨粗鬆症の悪い進行を逆転させることができました。また、エストロゲン欠乏症による骨粗鬆症を予防するためには、健常者の胃腸管フローラが必要であることがヒトで検証された[9, 10]。腸内細菌叢が産生する豊富な細胞シグナル分子や代謝産物は、「腸-骨」軸の連関効果をもたらす可能性がある。例えば、腸管内腔細菌叢が産生する酪酸は、PTHの同化作用における骨髄（BM）由来の制御性T細胞（Treg）の増加を仲介し、それによって骨形成を活性化する [11]. 食事性コリンの腸内細菌依存性代謝物であるトリメチルアミン-N-オキシド（TMAO）は、心血管疾患、癌、腎臓病などの複数の疾患と密接な相関があることが実証されています[12、13]。TMAOが骨の健康維持に関与していることを示唆する証拠はいくつかありますが、その基礎となるメカニズムはまだ不明です。
TMAOは、肝フラビンモノオキシゲナーゼ（FMO1およびFMO3）によるトリメチルアミン（TMA）の酸化に由来します。TMAOとTMAの生成は用量依存的であり、腸内細菌叢の組成と密接に関係している[14]。TMAは、食事に含まれるカルニチン、ホスファチジルコリン/コリン、ベタイン、ジメチルグリシン、エルゴチオニンなどの栄養基質の代謝によって生成されます。Clostridia、Proteus、Shigella、Aerobacterなど多くの細菌種が大量のTMAを産生する可能性があります[15]。一般に、食事の変化、腸内細菌叢の異常、または腸-血液バリアの障害は、TMAO濃度を増加させる。最近の研究では、高濃度のTMAOは骨粗鬆症の骨密度（BMD）と負の相関があることが判明しています[16]。D-ガラクトース/亜硝酸ナトリウム処理は、ビフィドバクテリウムの存在量に劇的な影響を与え、ファーミキューテス/バクテロイデーテスの異常な比率をもたらし、TMAOレベルを増加させ、最終的に老化に関連する骨粗鬆症に寄与する [17]. 骨粗鬆症は慢性炎症性疾患であり、インターロイキン（IL）-1、腫瘍壊死因子α（TNF-α）、IL-6などの炎症性サイトカインがエストロゲン欠乏時の骨量減少加速の主要メディエーターとして機能しています［18、19］。また、TNF-α、sTNF-R p75、IL-1βなどの炎症性サイトカインの増加は、血漿中のTMAO濃度と正の相関があることが多くの研究で示唆されており、TMAOと低級炎症の密接な関係が明らかになっています［20、21、22］。したがって、骨粗鬆症において腸内環境の異常を回復させ、TMAOの存在量を減少させることは、その臨床症状を緩和する可能性があります。しかし、TMAOが骨代謝に及ぼす影響や、その根底にある分子メカニズムを調査するための研究はほとんど行われていません。
ナノ材料は、その血管新生や抗炎症作用により、いくつかの深刻な疾患に対する新しい治療戦略となっている。銀や二酸化チタン（TiO2）などの多くのナノ粒子（NP）は、腸内に蓄積することで腸内細菌群に影響を与えることが証明されている[23,24,25]。光学特性、生体適合性、表面吸着能、低生体毒性に優れた金ナノスフェア（GNS）は、細胞誘導、薬剤担体、臨床診断、抗体標識などに広く応用されています。Saima Hameedらは、GNSがEscherichia coli、Pseudomonas aeruginosa、Staphylococcus aureusに対して抗菌活性を示すことを証明した [26] 。メタゲノム解析は、GNSが微生物群集構造に効果的に影響を与え、プロテオバクテリア、バクテロイデーテスおよびファーミキューテスの存在量を高め、アクチノバクテリアの存在量を減少させることを明らかにした [27]. さらに、GNSは劇的な血管新生作用と抗炎症作用を示し、炎症抑制のための臨床試験で広く応用されている[28]。したがって、我々は、GNSが腸内微小生態系障害を改善し、炎症反応を改善することで、骨粗鬆症の病的症状を緩和することができると仮定した。
この仮説を検証するため、OVX誘発骨粗鬆症マウスモデルを構築し、マイクロバイオームとメタボロームの解析を組み合わせることで、腸内フローラの構成とTMAO代謝に対するGNSの調節機能を検討しました。その結果、GNSはOVX誘発骨粗鬆症マウスを緩和し、腸内細菌叢を有意に改善し、制御不能となったTMAO代謝を回復させることが示唆されました。さらに、TNF-α、IL-6、G-CSFなどの炎症性サイトカインの減少が、GNSの骨粗鬆症に対する保護効果に関与している可能性がある。これらの結果から、腸内細菌叢と微生物のTMAO代謝物が、GNSの骨粗鬆症治療に対する保護効果に関与していることが証明された。腸内細菌とTMAOのダイナミックなバランスを維持することは、骨粗鬆症の治療戦略として有望であると考えられる。
材料と方法
GNSの合成とキャラクタリゼーション
本実験で使用したGNSは、武漢MICE生物技術有限公司から購入したものである。Ltd.から購入し、クエン酸還元法により合成された。具体的な調製方法は、補足資料と方法に記載されている。このGNS試料を超音波分散法により水中に分散させた後、電位プールに入れ、Zetasizer Nano ZS90でゼータ電位を測定した。また、走査型電子顕微鏡（Crossbeam 340, Zeiss）を用いて、ナノ粒子の大きさと均質性を測定した。GNSサンプルは、自然乾燥のためにカーボンコートされた銅グリッド上に置かれ、その後、2％酢酸ウラニルで染色された。画像は、後方散乱電子（BSE）検出器を用いて、10または15kV、30Paの条件で取得した。平均的なナノ粒子サイズをサンプルのサイズとして選択した。
動物および治療法
実験用マウスはすべて6-8週齢のC57BL/6J雌マウス（体重18-22g）で、陸軍医科大学の動物センターから取り寄せた。これらのマウスに関するすべての実験は、実験動物の世話と使用に関する規則を遵守し、陸軍医科大学から許可を得た（No.AMUWEC20210609）。マウスは6つのグループに割り当てられた： OVXマウス（n＝5）、GNSで処理したOVXマウス（n＝5）、ABX（OVX）マウス（n＝3）、ABX（OVX＋GNS）マウス（n＝5）、FMT（OVX）マウス（n＝4）およびFMT（OVX＋GNS）マウス（n＝4）。GNSは、0.01 mg/g bw/日、ストック濃度1 mg/ml、容量0.01 ml/g bwで56日間にわたって投与された。対照群には、等容量の正常な生理食塩水を投与した。動物は午前9時から正午の間に投薬された。
抗生物質（ABX）群には、OVX手術前にABXのカクテル（バンコマイシン100mg/kg；硫酸ネオマイシン200mg/kg；メトロニダゾール200mg/kg；およびアンピシリン200mg/kg）が7日間投与された。その後、マウスは、次の8週間を通して、バンコマイシン（500mg/L）、メトロニダゾール（1g/L）、アンピシリン（1g/L）および硫酸ネオマイシン（1g/L）を含む飲料水中のABXを受けた。抗生物質含有水は、1日おきに交換した。糞便微生物叢移植（FMT）の手順の詳細な図は、次のセクションにある。
糞便微生物叢移植の様子
FMTは、以前に使用した改良法に従って実施した[29,30,31]。具体的には、ABX投与（vancomycin 100 mg/kg; neomycin sulfate 200 mg/kg; metronidazole 200 mg/kg; and ampicillin 200 mg/kg）を7日間受け、腸内細菌叢を枯渇させた。続いてOVX手術を行い、マウス骨粗鬆症モデルを確立した。その後8週間、マウスを「FMT（OVX＋GNS）」と「FMT（OVX）」と称する2群にランダム化した。2群には、OVX＋GNSマウス（「OVX＋GNSドナー」と称する）およびOVXマウス（「OVXドナー」と称する）由来の糞便（生理食塩水に懸濁、200μl/マウス）をそれぞれ1日おきに経口投与した。糞便懸濁液の具体的な調製工程は、ドナーマウスから採取した糞便をプールし、生理食塩水で1：10（w／v）に希釈した後、ボルテックスで2分間ホモジナイズして糞便懸濁液を得る。その後、糞便懸濁液を500×gで3分間遠心分離し、粒子状物質を除去した。上澄み液は嫌気条件下で吸引し、糞便叢の変化を防ぐために10分以内にマウスに経口投与する必要があることに注意することが重要である。これらのマウスはすべて、OVX手術後56日目に安楽死させ、その後の解析のために大腿骨を得た。また、さらなる解析のために糞便サンプルも採取した。
μCTおよび組織学的解析
μCTにはBruker Micro-CT Skyscan 1272システム（Kontich, Belgium）を適用し，等方性ボクセルサイズは5.0μmであった．採取した骨組織を4％ポリオキシメチレンで固定し、60kVのX線管でスキャンした（166μA、積分時間1700ms）。海綿骨は86-255で閾値処理した（8ビットグレースケールビットマップ）。大腿骨全体のスキャンで使用した等方性ボクセルサイズは148μmで、再構成にはNrecon（Ver.1.6.10, Kontich, Belgium）を使用した。処理・解析ソフトはCT Analyser（Kontich, Belgium, Ver.1.15.4.0）である。
GNSの副作用を評価するために、肝臓と腎臓の組織サンプルを10％ホルマリンで一晩固定した。その後、パラフィンに包埋し、H&E染色のために切片にした。
サイトカインマイクロアレイアッセイ
サイトカインマイクロアッセイを実施するために、マウスの血清サンプルを採取した。具体的な詳細な実験工程は以下の通りである。ビーズを1400rpmで30秒間振とうし、アッセイバッファーで希釈した後、再度1400rpmで30秒間振とうした。ビーズ50 µlを96ウェルプレートの各ウェルに添加し、プレートを3回洗浄した。96ウェルプレートに標準品とサンプルをそれぞれ50μlずつ加え、パラフィルムで覆い、室温の暗所で850rpmで30分間振とうした。その後、インキュベートした96ウェルプレートから試料を捨て、プレートを3回洗浄した。検出抗体は、説明書に従い、抗体希釈液で希釈した。希釈した検出抗体を各ウェルに25μl加え、パラフィルムでプレートを覆い、暗所、室温で30分間、850rpmで振とうした。その後、インキュベートした96ウェルプレートから検出抗体を廃棄し、プレートを3回洗浄した。Streptavidin-PEは、説明書に従って抗体希釈液で希釈した。希釈したストレプトアビジン-PEを各ウェルに50μlずつ加え、パラフィルムを貼り、暗条件下で850rpm、室温で10分間振とうする。プレートを3回洗浄し、各ウェルに125 µlのアッセイバッファーを加えてビーズを再懸濁させ、プレートをパラフィルムで覆い、暗黒下で850 rpm、30秒間室温でシェイクする。最後に、Bio Plex 200 マシンを使用してデータを取得した。
16S rDNA遺伝子ハイスループットシーケンス
まず、OVXマウスおよびOVX＋GNSマウスの腸内細菌叢の全DNAを、E.Z.N.A. ®Stool DNA Kit (D4015, Omega, Inc., USA)を用いて、メーカーの指示に従い抽出を行った。ブランクには無核水を使用した。DNAサンプルは50μlのElution bufferで溶出し、LC-Bio Technology Co., Ltd（中国、杭州）によるPCR測定まで-80℃で保存した。その後、2%アガロースゲル電気泳動で、PCR産物の量と質を評価した。PCR産物はAMPure XTビーズ（Beckman Coulter Genomics, Danvers, MA, USA）で精製し、Qubit（Invitrogen, USA）で定量化した。アンプリコンプールのサイズはAgilent 2100 Bioanalyzer（Agilent、米国）で、量はLibrary Quantification Kit for Illumina（Kapa Biosciences, Woburn, MA, 米国）で評価した。サンプルはLC-Bioが提供するIllumina NovaSeqプラットフォームでシーケンスし、詳細な解析方法は補足資料と方法に示されている。
糞便中TMAOメタボロミクス定量解析
50mgの糞便からなるサンプルを、アセトニトリル、メタノール、水（2：2：1）からなる1mlの抽出液に加え、同位体標識した内部標準混合物を加え、製造者のプロトコル（Biotree Biomedical Technology Co, Ltd., Shanghai, China）に従って抽出した。LC-MS/MS 分析は、UPLC BEH Amide カラム (2.1 mm × 100 mm, 1.7 μm) を備えた UHPLC システム (Vanquish, Thermo Fisher Scientific) に Q Exactive HFX 質量分析計 (Orbitrap MS, Thermo) を結合して実施しました。詳細な方法は、補足資料と方法に示されている。
マイクロバイオーム-メタボローム統合解析
本研究では、マイクロバイオーム-メタボローム統合解析により、腸内細菌叢とTMAO関連代謝物との相互作用を探索した。この解析プロセスでは、メタボロームスクリーニングで得られた分化した二次代謝物と16S rDNAシーケンス解析で得られた有意に分化した細菌属についてスペアマン相関解析を行い、分化した代謝物と分化した細菌属の関係性を求めました。算出された結果をもとに、適切なスクリーニング条件を選択し、最終的に分化した代謝物と分化した細菌属の相関図とネットワーク図を得ることができました。
酵素結合免疫吸着法(ELISA)
血清中のCTX-1（I型コラーゲンのC-テロペプチド）の定量は、Mouse CTX-1 ELISA Kits（NBP2-69074, Novus, USA）を用いて、メーカーのプロトコルにしたがって検討しました。洗浄液で洗浄後、各ウェルにA液50μlとB液50μlを加え、波長450nmの分光光度計で混合液の光学濃度を測定した。血清CTX-1濃度は標準曲線を用いて算出し、ソフトウェアGraphpad Prism 7で解析した。
統計解析
本研究では、データの正規性と分散の均質性に基づいた適切な統計手法により、異なるグループ間の有意差の有無を判定した。μCTの定量分析において、F検定が有意でない場合は、ソフトウェアGraphpad Prism 7.0を用いて、Student's t-test（不対、両側）により、異なるグループ間の比較を算出した。F検定が有意であった場合は、Welchの補正を加えた非対称t検定により異なるグループ間の比較を行った。細菌のα多様性、β多様性は、得られたASV（feature）配列とASVアバンダンステーブル解析に基づき決定した。α-多様性は、QIIME2によって算出されたChao1、Observed species、Shannon、Simpsonによって示された。β多様性はQIIME2により算出され、主に3種類の距離（weighted-unifrac、unweighted-unifrac、bray-curtis）を含んでいる。関連するグラフはRパッケージで作成した。細菌の分類学的分析および2群間の比較は、細菌の門、クラス、目、科、属のレベルに基づき、ウィルコクソン順位和検定（フィルター閾値：p値<0.05）で行った。さらに、正規化相対存在量行列に基づいてソフトウェアnsegata-lefse（094f447691f0）を用いて線形判別分析（LDA）スコアを算出し、グループ間の細菌群集の優位性を決定することに寄与した。糞便TMAOメタボロミクス定量解析の過程で、主成分分析（PCA）および潜在構造判別分析への直交投影（OPLS-DA）をSIMCA16.0.2ソフトウェアパッケージ（Sartorius Stedim Data Analytics AB, Umea, Sweden）で実行しました。VIP > 1.0 および p < 0.05 (Student's t-test) の代謝物は、有意差を有するとみなされた。すべてのデータは平均値±標準誤差で表示された。p値＜0.05は有意とみなし、NSは有意でないと表現した。また、p<0.01およびp<0.001はおよびとして表示されました。
完成した詳細な試薬情報および関連するハイシーケンス法または解析手順は、補足資料と方法に記載されている。
結果および考察
GNSの合成と特性評価
この主な実験デザインは、図1Aによく示されている。詳細な化学合成の手順は、補足資料と方法に記載されている。ナノ粒子のサイズと均質性を測定するためにSEMを使用し、代表的なSEM画像はGNSが均一に分布し、この実験で使用したGNSの粒子サイズは約60nmであることを証明した（図1Bおよび1C）。また、ゼータ電位値はGNSで約-24.6mVであった（Fig. 1D）。
図1
GNSの特性評価と主な実験デザイン。
(A) 本研究の詳細な実験手順。
(B) 走査型電子顕微鏡によるGNSの特性評価。
(C) GNSの粒度分布。
(D)GNSのゼータ電位。
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GNS投与はOVX誘発骨粗鬆症の病態を緩和した
OVX誘発マウス骨粗鬆症モデルは、骨損失、骨微細構造変性、骨脆弱性の増加といった骨粗鬆症の典型的な臨床表現型をシミュレートするために広く使用されてきた[32]。したがって、GNSが骨粗鬆症の治療効果を持つかどうかを調べるために、OVX骨粗鬆症マウスが採用された。マウスは、OVX群（対照群）とOVX + GNS（0.01 mg/g）群の2群に分けられた。OVX＋GNS群には0日目から56日目までGNS懸濁液を胃内投与し、対照群には通常生理食塩水を投与した（図2A）。組織学的解析（H&E染色）により、GNSはマウスの腎臓および肝臓に悪影響を及ぼさず、良好な生体親和性を有することが示された（補足図S1A、1B）。安楽死後、解剖した大腿骨の海綿骨と皮質骨の輪郭を描き、μCTを用いた解析を行った。大腿骨の代表的なµCT画像と再構成された海綿体構造から、GNSがOVXマウスの骨損失を減弱させることが示された（図2B）。定量化分析でも同じ傾向が見られた。GNSは、骨量／組織量比（BV／TV、p＜0.01）、海綿体数（Tb.N、p＜0.01）、海綿体厚（Tb.Th、p＜0.05）および海綿体分離（Tb.Sp、p＜0.05）の著しい増加（図2C〜2F）。興味深いことに、2つのグループ間でBMDに有意な差はなかった（p＞0.05）（図2G）。さらに、皮質骨の厚さ（Ct.Th、p＞0.05）および皮質骨面積（Ct.Ar、p＞0.05）を含む皮質骨の関連指数も試験した（図2Hおよび2I）。さらに、骨代謝バイオマーカー（BTM）は、骨代謝の過程から得られる副産物の一種で、尿や血清で測定することができる[33]。血清中のCTX-1は、骨浸食の進行を反映する骨吸収関連バイオマーカーとして知られていた。そこで、血清中のCTX-1の濃度を測定したところ、GNSはCTX-1のレベルを顕著に低下させ、さらにGNSの骨喪失に対する保護効果を示唆した（p < 0.05）（図2J）。これらの結果から、GNSの投与は、OVX誘発の骨粗鬆症をin vivoで有意に改善することが示された。
図2
GNS投与はOVX誘発実験的骨粗鬆症を改善した。
(A) 実験的骨粗鬆症モデルを構築し、骨粗鬆症に対するGNSの改善効果を評価するために、6-8週齢の雌性C57BL/6Jマウスを卵巣摘出で選び、OVXまたはOVX＋GNS群にランダムに割り付けた。OVX群およびOVX＋GNS群には、それぞれ0日目から56日目まで生理食塩水およびGNSを胃内投与した。
(B）大腿骨縦断面、大腿骨遠位部の横断面、ROIの海綿体構造を再構築した代表的なµCT画像。
(C-I）BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp、BMD、Ct.ThおよびCt.Arの定量的解析。
(J）血清中の骨代謝マーカーCTX-1の濃度の定量的解析。(A-J) n = 5マウス。
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GNSは腸内細菌叢依存的にOVX誘発の骨粗鬆症を抑制した
骨粗鬆症の病態は複雑であり、完全には解明されていないが、腸内細菌叢が破骨細胞形成、腸管カルシウム吸収など様々な様式で骨粗鬆症の進行に影響を与えることが複数の証拠によって証明されている。OVX誘発骨粗鬆症に対するGNSの保護効果が腸内細菌叢と関連しているかどうかを検証するために、GNS投与前に四重抗生物質カクテル（バンコマイシン100 mg/kg、硫酸ネオマイシン200 mg/kg、メトロニダゾール200 mg/kg、アンピシリン200 mg/kg）を用いて、疑似無胚葉マウス（PGF）モデルを実施しました（図3A）。図3Bに示すように、ABX（OVX）群のμCT画像は、ABX（OVX＋GNS）群とほとんど区別がつかなかった。BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp、CTX-1の変化を含むGNSの骨粗鬆症に対する有益な効果は、腸内細菌が存在しない場合には完全に消失した（図3C-3J）。
図3
OVX誘発骨粗鬆症に対するGNSの保護効果は、腸内細菌叢の枯渇により消失した。
(A) 腸内細菌叢枯渇実験の模式図である。
(B）大腿骨縦断面、大腿骨遠位部の横断面、ROIの海綿体構造を再構築した代表的なµCT画像。
(C-I）BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp、BMD、Ct.ThおよびCt.Arの定量的解析。
(J）血清中の骨代謝マーカーCTX-1の濃度の定量的解析。(A-J) n = 3および5マウス/グループ。
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GNSが腸内細菌叢依存的にOVX誘発骨粗鬆症を抑制するかどうかをさらに確認するため、OVX群およびOVX＋GNS群の細菌叢を、前述のように腸内細菌叢枯渇野生型（GD WT）マウスに隔日でガベージにより移植した（図4A）。BMDおよびCt.Arは、FMT(OVX)群と比較してFMT(OVX + GNS)群で顕著に増加したが（図4Gおよび4I）、他の指標およびμCT画像は両群間で有意差を示さなかった（図4B-4F、4H）。これらの有意差のない結果は、FM移植実験中に腸内細菌叢が消失したことに起因すると考えられる。また、すべての指標で骨粗鬆症寛解の方向に同じ傾向を示したが、その差は有意ではなかった。これらの結果から、GNSは腸内細菌叢依存的にOVX誘発の骨粗鬆症を減弱させることが明らかとなった。
図4
糞便微生物叢移植は、OVX誘発実験的骨粗鬆症を緩和させた。
(A) FMT実験の模式図である。
(B）大腿骨縦断面、大腿骨遠位部の断面図、ROIの海綿体構造を再構成した代表的なµCT画像。
(C-I）BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp、BMD、Ct.Th、Ct.Arの定量解析（A-I）n＝4マウス／群。
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GNS投与により、腸内細菌叢の多様性と組成が顕著に変化した
腸内細菌異常症は骨粗鬆症の病的要因であり、GNSは腸内細菌叢依存的に骨粗鬆症を抑制することから、便中細菌の16S rDNA遺伝子配列解析を用いて腸内細菌叢の多様性と組成に対するGNSの調節作用を検討した。図5Aに示すように、OVX群とOVX＋GNS群の糞便から合計6124の特徴が得られ、そのうち1403の特徴は両群に共通していた。これらの特徴には、277種、205属、68科、36目、23綱、14門が含まれていた。これらの特徴量を用いて、グループ間の細菌の多様性と差異を明らかにした。
図5
GNS投与により、腸内細菌叢の多様性と組成が顕著に変化した。
(A）OVX群とOVX＋GNS群で重複する特徴をベン図で示した。(B）β多様性のBray-Curtis距離に基づく複数サンプルPCoA。
(C) Weighted-UniFrad距離のPCoA。
(D) Unweighted-UniFrad距離のPCoA。
(E）OVX群およびOVX＋GNS群における機能的なクラスタリングを有する微生物群の存在量を示す棒グラフである。
(F）OVX群およびOVX＋GNS群における腸内細菌叢の門分類学的レベルの棒グラフ。
(G）OVX群とOVX＋GNS群の間の細菌フィラの相対的な存在量を示すサーコスプロットである。異なる色のリボンは特定の門を表し、リボンの幅は門の存在量に正比例する。リボンは細菌分類をそれぞれのサンプルと結びつけている。
(H) 各グループにおけるBacteroidota、Proteobacteria、Epsilonbacteraeotaの相対的な存在量を棒グラフで表示した。(A-H) n = 10 サンプル/グループ。
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我々は当初、腸内細菌叢の組成と構造を効果的に反映しうる2群間のβ多様性を調査した。Bray-Curtis distance (p = 0.003), Weighted-UniFrac distance (p = 0.017), Unweighted-UniFrac distance algorithms (p = 0.012) に基づく主座標分析 (PCoA) は、両群間で明確に分離したクラスターを示し、OVX + GNS群とOVX群の微生物相の異なる組成を示唆しました（図5B - 5D）。続いて、異なる方法論による一般化線形モデルを用いて、腸内細菌関連α多様性を測定しました。希薄化曲線は平坦になる傾向があり、このテストがサンプル中の腸内細菌叢の情報を効果的に反映できることが示された（補足図S2A）。また、Chao1、Observed species、Shannon、Simpsonを含むこれらのα多様性指標は統計的に差がなく（p＞0.05）、腸内フローラの種の豊かさはOVX群とOVX＋GNS群の間で同様であることを示唆した（補足図 S2B）。また、表現型予測では、グラム陽性菌、好気性菌、移動元素含有菌濃縮型、グラム陰性菌、嫌気性菌、潜在的病原性菌がOVX + GNSマウスで減少していることが示された（図5E）。2群間の腸内細菌叢の具体的な変化を調べるため、各群の分類群の相対存在量を異なる水準で評価した。図5Fおよび5Gに示すように、門レベルでは、BacteroidetesとFirmicutesがほぼすべてのサンプルで比較的高い割合を占めた。主要な門として、OVX群とOVX + GNS群の腸内細菌叢におけるBacteroidetesの割合はそれぞれ64.97%と56.27%だった（p = 0.11）（補足図S2C）。また、Firmicutesは2番目に多い門で、2つのグループでそれぞれ12.12％と21.11％を占めた（p = 0.07）（補足図 S2D）。興味深いことに、OVX＋GNS群におけるFirmicutesとBacteroidetesの比率（F/B）は、OVX群よりも有意に高く（p < 0.05）、GNSに対するBacteroidetesの感度が高いことが示された（補足図S2E）。さらに、Differentiated-abundance解析の結果、GNS投与によりBacteroidotaのレベルは有意に低下したが（p = 0.02）、proteobacteria（p = 0.05）およびEpsilonbacteraeota（p = 0.0002）のレベルが上昇した（図5H）。
クラスレベルでは、GNS処理後にBacilli（p = 0.023）、Campylobacteria（p = 0.0002）、Coriobacteriia（p = 0.013）クラスの存在量が増加する傾向を確認した（補足図S3A〜3D）。また、オーダーレベルでは、GNS投与により、Campylobacterales（p = 0.0002）、Lactobacillales（p = 0.023）、Anaeroplasmatales（p = 0.032）、Coriobacteriales（p = 0.01）のレベルが著しく増加することがわかった（補足図S4A-4E）。科レベルでは、OVX＋GNSマウスでは、Lactobacillaceae（p＝0.0233）、Helicobacteraceae（p＝0.0002）、Atopobiaceae（p＝0.0413）、Marinifilaceae（p＝0.019）家が充実し、Prebotellaceae（p＝0.0052）家は減少した（補足図S5A-5 F）．
さらに、属レベルで種分布を解析したところ、2群は腸内細菌叢の組成や構造が著しく異なることがわかった（図6Aおよび6B）。GNS投与マウスではHelicobacter属（0.08% vs. 3.58%, p < 0.001） とLactobacillus属（1.88% vs. 9.49%, p < 0.05） が比較的高い割合を占めており、OVX + GNS群ではAlloprevotella属 (2.57% vs. 0.46%) が少ない存在度を示していました（図6C～6E）。GNS投与後にどのような細菌が変化し、OVX誘発骨粗鬆症の進行に重要な役割を果たしているかを確認するため、線形判別分析（LDA）効果量（LEFSe）およびクラドグラム（各レベルの最大相対存在量差に基づく）を行い、OVX群とOVX + GNS群のリーディングポジションを占める細菌群集の有意差を検討しました。解析の結果、OVX群では、Prevotellaceae科（下位属のAlloprevotellaを含む）、Bacteroidota門（Bacteroidia綱からBacteroidales目）、Eubacterium_coprostanoligenes_group属が腸内細菌症を促進する重要な細菌種であることが示されました。また、ラクトバチルス目（ラクトバチルス科、ラクトバチルス属を含む）、ヘリコバクター科（ヘリコバクター属を含む）、コリオバクテリア目（アトポビウス科、オルゼネラ属を含む）、 OVX＋GNS群では、Odoribacter属を含むMarinifilaceae科、およびActinobacteriaとProteobacteriaの門が比較的高い存在度を示し、GNSを介した骨粗鬆症緩和の重要なタイプの細菌と考えられる（図）。6F). 具体的なスコアとしては、OVX＋GNS群では、Lactobacillus属のLDAスコアが4.53（p = 0.02）と最も高く、次いでHelicobacterのLDAスコアが4.17（p = 0.00015）であることがわかった。OVX群では、Alloprevotella属のLDAスコアが4.06（p = 0.0007）と最も高く、Bacteroidales（LDAスコア = 3.13; p = 0.02）、Eubacterium_coprostanoligenes_group（LDAスコア = 3.03; p = 0.007 ）と続いた（図6G）。ヒートマップに示すように、OVX＋GNS群ではLactobacillus属とHelicobacter属が顕著に濃縮され、OVX群ではAlloprevotella属とBacteroidalesが高い割合を占めており、これはLEFSe解析結果と一致した（図6H）。結論として、GNS治療は腸内細菌叢の多様性と構成に影響を及ぼした。
図6
OVX群およびOVX＋GNS群の糞便微生物叢組成を属分類学的レベルで示した。
(A）OVX群およびOVX＋GNS群の属分類学的レベルの棒グラフである。相対的な存在量は各サンプルについてプロットされている。
(B)属レベルの分類学的構成を比較した棒グラフ。すべての細菌属がOVXグループとOVX＋GNSグループの間で有意差を示した。
(C）各グループにおけるHelicobacter属の相対的存在量をバープロットで表示した。
(D) 各群におけるLactobacillus属の相対的な存在量を棒グラフで示した。
(E) 各グループにおけるAlloprevotella属の相対的存在量を棒グラフで表示した。
(F）LEfSeに基づく分類学的クラドグラムは、OVX群とOVX＋GNS群のマイクロバイオームコミュニティ間の分類学的関連性を示す。黄色のノードは、2つのグループ間で種に有意な差がないことを表示した。青色のノードは、GNS + OVXグループで濃縮された分類学的タイプを表しています。OVX群で存在量の多い種は赤で色分けした。
(G) LEfSeスコアは、2つのグループ間の種における統計的な差異を図示した。
(H)選択された最も差分量の多い特徴を属レベルでヒートマップ化したもの。青色、白色、赤色はそれぞれ、少ない、中間、高い存在量を表す。(A-F) n = 10サンプル/グループ。
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GNS処理により、代謝物TMAOの存在量が減少した。
これまでの16S rDNA遺伝子配列解析の結果、GNSはTMAO量と関連するLactobacillus属の量を有意に増加させ、AlloprevotellaとBacteroidalesの量を減少させることが示された[34,35,36]。上記のように、腸内細菌叢の代謝物は骨のホメオスタシスの維持に重要な役割を果たし、高いTMAOレベルは骨粗鬆症患者の骨損失と関連することが証明されている。腸内細菌叢の変化がTMAOの産生に影響するかどうかを調べるため、メタボローム解析を行い、ベタイン、コリン、クレアチニン、カルニチン、TMA、TMAOなどのTMAO関連代謝物の存在量を確認しました。微生物の多様性と組成の変化と一致して、OVX＋GNS群とOVX群では、異なるTMAOプロファイルが見られた。直交部分最小二乗判別分析（OPLS-DA）では、2つのグループ間でTMAOの明確なクラスタリングを示した（補足図S6A）。主成分分析（PCA）でも同様の傾向が見られた（補足図S6B）。これらの代謝物のうち、TMAO前駆体のクレアチニン（p = 0.048）、L-カルニチン（p = 0.041）、TMAO（p = 0.016）はOVX + GNS群で低値を示していた。ベタイン、コリン、TMAは両群間で有意な差は認められなかったが、OVX＋GNS群の糞便中のTMAO関連代謝物の総量はOVX群に比べ有意に減少した（図7AおよびB）。TMAOのレベルの変化がGNS治療による腸内フローラの変化と密接に関連しているかどうかを調べるために、FMTグループ間で標的TMAO定量分析を行った。案の定、OPLS-DAとPCAにより、2群間で明確に分離したクラスターが確認された（補足図S6C-6D）。また、FMT（OVX＋GNS）群のTMAO関連代謝物の生成量は、FMT（OVX）群のそれよりも有意に低かった（図7C）。FMT（OVX＋GNS）群のクレアチニン（p＝0.023）、TMAO（p＝0.045）の濃度は、FMT（OVX）群に比べ顕著に低い値であった。ベタイン、コリン、L-カルニチン、TMAは両群間で有意差を認めなかったが、FMT（OVX＋GNS）群の総TMAO関連代謝物はFMT（OVX）群のそれよりも顕著に低かった（図7D）。結論として、GNS投与は、腸内細菌叢の多様性、群集構造および組成を調節することにより、代謝物TMAOの存在量を減少させることが明らかとなった。
図7
GNS投与により、腸内細菌叢由来のTMAO関連代謝物の産生が減少した。
(A）OVX群とOVX＋GNS群のTMAO関連代謝産物のヒートマップ。青色、白色、赤色はそれぞれ存在量が少ない、中間、高いことを表す。
(B）OVX群とOVX＋GNS群の糞便からのベタイン、コリン、クレアチニン、TMA、TMAO、L-カルニチンなどのTMAO関連代謝物の濃度を示したもの。
(C）FMT（OVX）群とFMT（OVX＋GNS）群間のTMAO関連代謝産物のヒートマップ。
(D）FMT（OVX）群とFMT（OVX＋GNS）群間の糞便からのベタイン、コリン、クレアチニン、TMA、TMAOおよびL-カルニチンを含むTMAO関連代謝物の濃度である。(A-D) n = 5マウス/グループ。
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腸内細菌叢と代謝物TMAOの関連性をより明確にするため、マイクロバイオーム-メタボローム統合解析を行い、TMAO関連代謝物と有意な相関を示した特定の微生物叢の属を探し出しました。関連性解析のヒートマップに示すように、17属がTMAO関連代謝物と有意な相関を示しました。これらの属のうち、12属がTMAO関連代謝物と正の相関を示し、5属が負の相関を示しました。OVX群とOVX+GNS群の菌叢存在量（平均存在量>0.01%）と分布の違い（p<0.05）を組み合わせて、TMAO関連代謝物のレベルと著しい正の相関を示したAbsiella属、Prevotellaceae_未分類、Erysipelotrichaceae_未分類、Candidatus_Arthromitus、Barnesiellaの5属を特定しました。Prevotellaceae_unclassified、Erysipelotrichaceae_unclassified、Candidatus_Arthromitus、Barnesiella属はTMAOレベルと正の相関があり、Absiellaはコリンレベルとの正の相関があった。また，Mediterraneibater属，Acetivibrio属，Eubacterium属]_ruminantium_groupは，TMAやクレアチニンと広く正の相関があったが，存在量が少ない（平均存在量<0.01%）ため，TMAO関連代謝への影響は小さいと思われた．
また、Millionella属、Helicobacter属、Enterorhabdus属、Olsenella属、Dubosiella属は、TMAOと顕著な負の関係を示した（図8A）。最後の4属は、存在量が多い（0.01%以上）ため、TMAO関連代謝物の産生をより強く抑制する効果を示すと考えられる。これらの属のほぼすべてがTMAOレベルと有意に関連していることに注目したが、これはおそらくTMAOが代謝の最終産物であることに起因している。細菌属とTMAO関連代謝物の相関をさらに表示するために、17属とTMAO代謝物のすべての関連ルールに従って、関連ネットワークを構築した（図8B）。結論として、これらの結果は、腸内細菌叢とTMAO代謝産物との関連について適切な情報を提供し、in vitroでのさらなる調査に役立つものであった。
図8
マイクロバイオーム-メタボローム統合解析により、腸内細菌が産生するTMAOと特定の細菌属が関連づけられました。
(A) 6つのTMAO関連代謝物と細菌属の関連ヒートマップ。色分けは、6つのTMAO関連代謝物と示された腸内細菌属の間のスピアマン相関係数の中央値を表し、差がある場合はそれを示す： *, p < 0.05; **, p < 0.01.
(B）TMAO-代謝物と17の細菌属のアソシエーションネット図。図中の異なるノードは、異なる細菌属または代謝産物を表す。細菌属の形状は円形、代謝物の形状は三角形である。細菌属と代謝物の間の線は相関関係を表し、実線は正の相関関係、破線は負の相関関係を表している。
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GNSは炎症性サイトカインの放出を抑制し、OVX誘発の骨粗鬆症を減弱させる
前述のように、骨粗鬆症は慢性炎症性疾患であり、IL-1、IL-6、TNF-αなどの炎症性サイトカインが破骨細胞の分化・活性化を促進し、骨芽細胞の分化を阻害することで骨量減少を加速させます[37,38,39]。さらに、TMAOレベルは炎症性サイトカインのレベル上昇と関連することが証明されています。そこで、GNSが血清中の様々なサイトカインの変化を誘導するかどうかを調べるために、Luminexサイトカインマイクロアレイアッセイを実施した。ヒートマップに示すように、炎症性サイトカインであるIL-6、TNF-α、およびG-CSFは、OVX＋GNS群ではOVX群と比較して顕著に減少した（p＜0.05）（図9A）。また、ボルケーノプロットでは、GNSによって誘導された分化発現サイトカイン（DEC）がヒートマップと一致することが示された（図9B）。結論として、GNS投与は炎症性サイトカインの放出を顕著に抑制し、これはTMAOの減少に関連していると考えられる（図10）。
図9
GNS投与はOVXマウスの炎症性サイトカインプロファイルを有意に変化させた。
(A）Luminexで測定した血清からのサイトカインレベルのヒートマップ表示（OVXグループ、n = 5; OVX + GNSグループ、n = 5）。
(B）Luminexビーズベースイムノアッセイで測定された血清中のサイトカイン変化のボルケーノプロット。
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図10
微生物叢のホメオスタシスとTMAO代謝の調節を介したOVX誘発骨粗鬆症に対するGNSの保護効果に関する我々の提案メカニズムの模式図。メカニズム的には、GNSの投与は腸内細菌叢の動的バランスに影響を与え、TMAO産生を負に制御して、血清中の炎症性サイトカインまたは破骨細胞形成前サイトカインの放出を減少させることができる。
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結論
2億人以上の人々が骨粗鬆症に苦しんでおり、これは世界中で深刻な公衆衛生上の課題となっており、新規かつ効果的な薬剤が望まれている[40]。本研究では、GNSが腸内細菌叢依存的にOVX誘発骨粗鬆症の病的特徴を顕著に緩和できることを見出した。GNSの投与により、骨粗鬆症に関連する腸内細菌叢の組成と多様性が調整され、TMAO関連代謝物の存在量が減少し、さらに骨代謝における炎症性サイトカインのレベルが低下し、最終的に骨粗鬆症の症状が改善されました。また、この腸内フローラ依存的なメカニズムを証明するために、FMTを実施した。これらの結果を総合すると、GNSは腸内細菌叢の調節を通じて骨粗鬆症を効果的に改善することが証明され、新規の有望な薬剤となる可能性があることがわかった。
OVXマウスモデルは、操作の簡便さとヒトの閉経後骨粗鬆症に類似した表現型から、骨粗鬆症の最も一般的な動物モデルである[41]。OVXは腸内細菌叢の変化をもたらすことがいくつかの研究で証明されており、VerrucomicrobiaとDeferribacteresの存在量が少なく、Candidatus SaccharibacteriaとTenericutesの存在量が多くなっています [42]．したがって、OVXマウスは、骨粗鬆症における腸内細菌叢障害を標的とした薬理戦略の研究に理想的なモデルである。OVX誘発骨粗鬆症の典型的な表現型を確保するため、モデル全体の構築時間を延長し、術後8週目にµCT解析を実施しました。GNSは新規ナノフェーズ材料として、in vitroでは細菌叢の制御機能を示すが、in vivo、特に腸内細菌叢における抗菌作用はほとんど検討されていない。そこで、我々は当初、骨粗鬆症の管理におけるGNSの治療可能性をin vivoで研究した。予想通り、GNS投与によりOVX誘発骨粗鬆症マウスの腸内細菌叢の多様性と組成が変化し、腸内細菌叢の枯渇は骨粗鬆症の症状に対するGNSの改善を完全に除去できたことから、腸内細菌叢はGNSの治療効果に重要な役割を果たすと考えられた。
最近の研究では、骨粗鬆症患者では微生物叢の多様性が低下し、その結果、ディスバイオシスの状態にあることが示されている[5]。前臨床動物モデルでは、微生物叢の異常が骨代謝に影響を与え、骨組織の質、ひいては強度を低下させることが証明されました[7]。実際、腸内細菌叢には何百もの細菌属が含まれ、食材からエネルギーを取り出す能力を高め、上皮の成長を制御し、病原体のコロニー形成を防止し、その他多くの利益をもたらしています[43]。さらに、腸内細菌叢は、骨や脳などの遠隔臓器に強力な制御効果を誘導する可能性がある。腸内細菌叢は、腸管バリア透過性、栄養吸収、代謝産物生産、免疫反応、内分泌系などの複数の経路を通じて骨基質代謝を制御しており、これは「微生物叢-腸-骨軸」と呼ばれている[44]。微生物異常症は、多くの代謝物、サイトカイン、および炎症細胞の骨髄への輸送において腸内細菌叢による骨代謝に影響を与え、患者の全体的な炎症状態に影響を与える可能性があり、これは「微生物叢-腸-骨軸」のアンバランスの共通の現れである［45］。例えば、破骨細胞形成性サイトカインの産生は、エストロゲン欠乏下では常に亢進していたが、無菌（GF）マウスではこの現象は起きない。CONV-Rマウスの腸内細菌叢をコロニー化すると、性ステロイド欠乏に対する骨格系の感受性を回復させることができ、「微生物-腸-骨軸」において腸内細菌叢が不可欠な役割を果たすことが示された [46]。プロバイオティクスやプレバイオティクスの利用は、SCFA産生、炎症反応、その他の経路に影響を与えることで骨の健康を守ることが証明されている[10]。そこで、GNS投与後の腸内細菌叢の多様性と組成の変化を16S rDNAシークエンスで検討した。β多様性については、OVX＋GNS群マウスはPCoAによりOVX群マウスと有意なクラスタリング分離を示し、GNS投与がバイオーム構造を著しく変化させることが示された。さらに、OVX + GNS群とOVX群の間でLEfSe解析を行い、GNS処理によって媒介される優勢な細菌を明らかにした。GNSは、TMAO関連代謝物の産生を促進することが知られているAlloprevotellaとBacteroidalesの存在比を有意に減少させました。したがって、我々の結果は、GNSが腸内細菌叢の組成と構造に影響を与えることによって、骨粗鬆症に起因する腸内細菌異常症を制御することを証明した。
マッチドケースコントロール研究により、TMAO血清レベルの高さは、高齢者における股関節骨折および骨粗鬆症のリスク上昇と関連していることが判明した[47]。また、TMAO処理は骨髄間葉系幹細胞（BMSCs）の脂肪形成を促進し、骨形成を減弱させ、活性酸素の放出とIL-1β、IL-6、TNF-αなどの炎症性サイトカインの産生を促進させる[16]。OVX＋GNS群の変化した細菌属がTMAO代謝に関連し、骨粗鬆症患者ではTMAO濃度が上昇することを踏まえ、OVX＋GNS群とOVX群のTMAO濃度を評価しました。TMAOを標的としたメタボローム解析の結果、GNS投与により微生物叢由来のTMAOの産生が顕著に抑制されることが明らかになりました。さらに、FMTでも微生物叢由来のTMAOが緩和され、GNS治療におけるTMAOの重要な役割がさらに示唆されました。続いてサイトカインマイクロアレイアッセイを行ったところ、GNSは破骨細胞形成促進作用を直接示す炎症性サイトカインIL-6、TNF-α、G-CSFのレベルを有意に低下させることを見出した。炎症性サイトカインの減少は、TMAOのダウンレギュレーションに起因していると考えられる。GNS-TMAOによる炎症性サイトカインの減少の具体的なメカニズムについては、今後さらに研究する必要がある。
一方、本研究には多くの限界がある：（i）GNSはBV/TV、Tb.N、Tb.Thの有意な増加をもたらし、Tb.Spの減少をもたらした。興味深いことに、OVX群とOVX＋GNS群の間でBMDに差がなかったが、これは海綿体構造の変化がBMDの変化に先行していたためと考えられる。なお、BMDとは、皮質骨と海綿骨の骨量を複合的に反映した単位面積当たりの骨塩量のことである。従って、皮質骨の骨量の変化が軽微であれば、両群間のBMDに有意差はないと考えられる。(ii)FMTは対照群に比べ、BMDとCt.Arが顕著に増加しただけで、他の指標は両群間に差がない。FMT実験中に腸内細菌叢が消失し、FMT群では有意な結果が得られないと考えられる。また、腸-骨調節軸は、骨粗鬆症ではより多くのステップを必要とし、大腸炎の腸内細菌叢調節のような直接的なものにはなり得ない。最近の研究では、腸のホメオスタシスにおける一過性の摂動（OVX手術など）が、異種移植された微生物叢の長期安定性に影響を与えることが示された。レシピエントマウスの腸内細菌叢はドナーマウスのものと同様の恒常性を維持することができず、FMT前の初期状態に戻ってしまう可能性がある[48]。したがって、FMT後の同種腸内細菌叢の安定性に長期的に注意を払い、必要に応じて反復移植を実施する必要がある。(iii) 腸内細菌叢の骨粗鬆症に対する他の調節経路についても研究する必要がある。例えば、腸内細菌が細胞外小胞を介して関連するシグナル伝達経路を直接制御し、それによって骨ホメオスタシスの変調に影響を与える可能性がある。(iv) 腸-骨軸には、短鎖脂肪酸や胆汁酸などの他の代謝経路が存在する可能性があり、これらも探索する必要がある。(v) 骨粗鬆症におけるTMAO代謝を調節する特定の細菌属は不明であり、in vitroおよびin vivoでの他の有意義な実験によって検証する必要がある。(vi) GNSと性能を比較するために、他のタイプのナノ粒子を選択する方がよく、GNSの良好な生体適合性と抗炎症活性を検証するのに役立つ。(vii） 上述のように、破骨細胞は骨髄性造血前駆体由来の多核巨細胞で、骨芽細胞と共に骨の健康を維持している。破骨細胞が過剰に活性化すると、骨吸収が激しくなり、骨量が減少する[49, 50]。破骨細胞形成におけるTMAOの制御的な役割はまだ不明であり、このトピックに関するさらなる研究のための貴重なポイントになるかもしれません。以上のことから、GNSの投与は、腸内細菌叢をリモデリングすることにより、OVX誘発の骨粗鬆症を改善する可能性があることがわかった（図10）。この潜在的な保護メカニズムは、低いTMAO存在量によって媒介される炎症性サイトカインのレベルの減少に関連していた。この結果は、GNSが効果的な腸内細菌叢調節因子としての役割を果たし、骨粗鬆症に対するGNSの新しい生化学的メカニズムを明らかにするものであった。GNSが腸内細菌叢に影響を与える具体的なメカニズムについてはさらなる研究が必要であるが、GNS由来の新規薬剤を発見・開発するための重要な基盤が保たれている。
データ提供
本研究の結果を裏付けるデータは、論文およびその補足資料の中で入手できます。生データは、合理的な要求があれば、対応する著者から入手可能である。
略語
ABXのこと
抗生物質
BM
骨髄（こつずい
BMD
骨密度
BMSCsのこと：
骨髄間葉系幹細胞（こつずいかんようけいさいぼう
BTMのことです：
骨代謝バイオマーカー
BV/TV：
トラベキュラーボーン体積率
Ct.Ar：
皮質骨面積
Ct.Th：
皮質骨の厚さ
CTX-1：
I型コラーゲンのC-テロペプタイド
DECs（デック）：
分化発現サイトカイン
ELISA（エリサ）：
酵素結合免疫吸着法（Enzyme-linked immunosorbent assay
FCMのこと：
フローサイトメトリー
FM
糞便微生物叢（ふん便びせいぶつそう
G-CSFのこと：
顆粒球コロニー刺激因子（Granulocyte colony-stimulating factor
GNPのこと：
金ナノ粒子
GNSのこと
ゴールドナノスフィア
H&E：
ヘマトキシリンとエオシン
IL
インターロイキン
LEfSe：
線形判別分析効果量
NLRP3：
ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン様受容体タンパク質3
OPLS-DA：
潜在構造判別分析への直交投影法
OTUsの略：
観察された分類学的単位
OVXです：
卵巣摘出術
PCAです：
主成分分析
PCoAです：
主座標分析
PGFです：
擬似胚胎
SEMのこと：
走査型電子顕微鏡
Tb.N：
トラベキュラーナンバー
Tb.Th：
トラベキュラー厚さ
Tb.Sp：
トラベキュラーセパレーション
TMAのことです：
トリメチルアミン
TMAOのこと：
トリメチルアミンN-オキシド
TNF-αのこと：
腫瘍壊死因子α（Tumor necrosis factorα
トレグ（Treg）：
レギュラトリーT細胞
TiO2（ティオツー）：
二酸化チタン。
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謝辞
査読の過程で本原稿を改善するために尽力してくださった各編集者と専門家査読者に感謝します。また、16S-rDNAバイオインフォマティクスはWenjuan Sun氏（LC-Bio Technology co,ltd.）、TMAOメタボロームバイオインフォマティクスはShan Wu氏（Biotree Biomedical Technology）から支援をいただいた。また、模式図に使用されているオリジナル要素は、Servier Medical Art (http://smart.servier.com/)から入手したものです。
資金提供
本研究は、中国国家自然科学基金（CDは助成番号82172489）、重慶市革新的指導人材プロジェクト（FLは425Z2P12I）、第三軍医科大学優秀人材プロジェクト（FLは助成番号XZ-2019-505-021）により支援されました。
著者情報
著者ノート
Yueqi ChenとChuan Yangは、この仕事に等しく貢献した。
著者と所属
中華人民共和国重慶市第三軍医科大学（陸軍医科大学）西南病院整形外科部
陳岳綺、戴奇潔、譚樹林、杜蝉、羅菲菲
中華人民共和国重慶市第三軍医科大学（陸軍医科大学）医用材料科学科
チュアン・ヤン
貢献度
Y.-Q. Chen, C.-Dou and F. Luoは、実験の設計と原稿の構想を行った。Y.-Q. ChenとC.Yangは、ほとんどの実験を行い、結果を分析した。C. Yangはスキームを設計し、原稿の図作成を支援した。Q.-J. DaiとJ.-L. Tanは、マイクロCTデータおよびその他の統計解析に協力した。Y.-Q. Chen、C. Yang、C.-Douが原稿執筆をサポートした。Y.-Q. Chen、C.-DouおよびC.-Douは原稿執筆に協力した。Chen、C.-Dou、F.Luoがプロジェクトを指揮した。Y.-Q. ChenとC. ChenとC.Yangは、この仕事に等しく貢献した。
対応する著者
Yueqi Chen、Ce DouまたはFei Luoに対応する。
倫理に関する宣言
利益相反行為について
著者らは、利益相反がないことを宣言する。
倫理的要求事項への適合性
動物実験は、ARRIVEガイドラインに準拠して報告された。すべての実験手順は、倫理委員会（No.AMUWEC20210609）により承認された。本研究におけるすべての実験は、国の法律、実験動物センターのガイドライン、および米国国立衛生研究所のGuide for the Care and Use of Laboratory Animals（第8版）に従って実施されました。
追加情報
出版社ノート
シュプリンガー・ネイチャーは、出版された地図や機関所属の管轄権主張に関して中立を保っています。
電子補足資料
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補足資料1
権利と権限
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Chen, Y., Yang, C., Dai, Q. et al. Gold-nanosphere mitigates osteoporosis through regulating TMAO metabolism in gut microbiota-dependent manner. J Nanobiotechnol 21, 125 (2023). https://doi.org/10.1186/s12951-023-01872-9
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2023年1月26日受理
2023年3月24日受理
2023年4月11日発行
DOIhttps://doi.org/10.1186/s12951-023-01872-9
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金ナノスフェアー（GNS）
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