TIRおよびSTING免疫応答を中和するバクテリオファージ抗防御遺伝子

Bacteriophage anti-defense genes that neutralize TIR and STING immune responses

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TIRおよびSTING免疫応答を中和するバクテリオファージ抗防御遺伝子
Peiyin Ho, Yibu Chen, Subarna Biswas, Ethan Canfield, ORCID プロフィールを見るDouglas E. Feldman
doi: https://doi.org/10.1101/2022.06.09.495361
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10000042
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要約
感染した細菌のプログラムされた細胞自殺は、頓挫感染（Abi）として知られ、バクテリオファージウイルスやその他の侵入性遺伝子要素の集団全体への拡散を防ぐための中心的な免疫防御戦略として機能している。多くのアビシステムは、感染時に生成される特注の環状ヌクレオチド免疫メッセンジャーを利用して、同種の死滅エフェクターを迅速に動員している。我々は、バクテリオファージのヌクレオチジル転移酵素（NTase）の大ファミリーを同定した。NTaseは、競合する環状ジヌクレオチド（CDN）リガンドを合成し、STING CDNセンサードメインと結合して活性化するNAD枯渇型TIRエフェクターを阻害している。ウイルスNTase遺伝子は、他の抗防御遺伝子を含むゲノム領域内に配置されており、機能スクリーニングを通じて、TIR-STING細胞毒性から保護する抗TIR防御（Atd）遺伝子候補を見出した。その結果、ウイルスMazG様ヌクレオチドピロホスファターゼAtd1が飢餓状態のアロモン（p）ppGppを枯渇させ、アロモンで活性化された宿主毒素MazFがTIRによる感染中止の主要な実行役であることが明らかになった。ファージNTaseとAtd1のようなカウンターディフェンスは、ウイルスの増殖を確実にするために宿主の生存能力を維持し、TIRやSTING免疫反応を調節するツールとして利用される可能性がある。

はじめに
細菌は、ウイルス（ファージ）や他の移動性遺伝要素（MGE）からの攻撃の脅威に常にさらされており、この脅威を軽減するために制限酵素からCRISPR/CAS適応免疫に至るまで多くの防御機構を進化させてきた。頓挫感染（Abi）として知られるプログラムされた細菌細胞の自殺は、個体の生存を犠牲にして、ウイルスのコロニー全体の伝播を阻止し、集団レベルの免疫を達成するために感染細胞が採用する主要な戦略である（Chopinら、2005; Lopatinaら、2020）。

オペロンに連動する毒素-抗毒素（TA）系に関する初期の研究、およびレトロンに関するより最近の発見は、アビ免疫応答の根底にある制御論理を明らかにした。制限酵素やCRISPR/Casは、同調的に活性化するが、宿主ではなく外来核酸の特定の配列に限定して標的化する（Haurwitzら、2010；Jinekら、2012；Pingoudら、2005）のに対し、細胞毒性が強いAbiシステムは、まずMGEの細胞への侵入を感知することで活性化する必要がある。TAシステムは、不安定な抗毒素と、ファージ感染などの複数のストレス因子の収束により、TAオペロンの転写をダウンレギュレートし、抗毒素が急速に失われ、致死性毒素が活性化することで武装する（Harmsら、2018; Jurėnasら、2022）。レトロンも同様に、特定のファージタンパク質との係合によってその毒性が解放されるまで不活性コンフォメーションに保持される（Millman et al.、2020）。

ヌクレオチドに基づく免疫アラームシグナルは、異なるAbiシステム間の中心的なメカニズムとして浮上してきた。III型CRISPR-Cas、Pycsar、および環状ジヌクレオチドベースの抗ファージシグナリングシステム（CBASS）は、ファージ感染時に構成ヌクレオチジルトランスフェラーゼ（NTase）およびヌクレオチドサイクラーゼの活性化を通じてトリガーされる（Kazlauskieneら、2017; Talら、2021; Whiteleyら、2019）。これらの酵素によって生成された環状ヌクレオチドメッセンジャーは、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、孔形成毒素、ならびにサーチュインおよびToll-インターロイキン-1受容体（TIR）ドメインのNAD切断酵素などの同族の死エフェクターを動員する（Kazlauskiene et al, 2017; Lowey et al., 2020; Ofir et al., 2021）、広範なSTING（インターフェロン遺伝子の刺激因子）ドメインなどのエフェクター連動環状ヌクレオチドセンサーに直接結合することによって。多くのウイルスは、環状ヌクレオチドを迅速に切断して不活性化する特殊なヌクレアーゼを展開し、宿主免疫応答を消滅させる（Athukoralageら、2020年；Hobbsら、2022年）。他のウイルスコード化タンパク質は、ヌクレオチド免疫メッセンジャーを隔離する分子「スポンジ」として機能する（Leavittら、2022年）。

現在、ウイルスがどのように既知の多数のAbiシステムを回避するかについての理解は限られており、ウイルスがシグナルの分解や遮断以外の防御戦略を採用しているかどうかはほとんど分かっていない。これは、実験的に特徴付けられた抗CRISPRの大規模なレパートリーとは対照的であり、その多くは絶妙な特異性でCRISPR/Casサブタイプを不活性化する（Bondy-Denomyら、2015；Marinoら、2018）。ここで、我々は、リンクしたSTING CDNセンサードメイン（TIR-STING）を含むTIRデスエフェクターの活性化を損なうCDN競合リガンドを生成するウイルスコード化NTaseのファミリーを明らかにする。我々は、NTaseをコードするウイルス遺伝子が既知の抗TIR防御遺伝子に近接していることを示し、プラスミドベースの機能スクリーニングにより、新規のウイルス抗TIR防御（Atd）候補遺伝子を同定した。その結果、ファージMazGに類似したヌクレオチドピロホスファターゼAtd1が飢餓状態のアロモン（p）ppGppを枯渇させ、TIRによる感染阻害がアロモン活性化型宿主毒素によって行われていることが明らかになった。

研究成果
シホビル、ミオビル、ポドビルなどのファージゲノムのバイオインフォマティクス解析により、Polβ NTaseスーパーファミリーのミニマルNTase（MNT）（4）と近縁で、カナマイシンNTase（KNT）とは遠い関係にあるNTaseが予測される遺伝子群が大量に見つかった（図 1A）。ファージNTasesはMNTに見られるような触媒部位GS-x-AY[GAN]T-x4-SDxDをそのまま持っているが、MNTのGSモチーフのすぐC-末端に位置しているほぼ不変のチロシン（Y）残基がない（図1B、部位1）。さらに、ファージNTaseは、MNTではなく、SDxDモチーフの約60残基C-末端に位置する保存されたNP-x-h2[DE]配列を含む（図、1B、サイト2）。この配列の相違は、ファージNTaseがNTaseスーパーファミリーの中で異なるクレードを構成しているという提案を支持するものである。

図1.
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図1.
ファージヌクレオチド転移酵素はCDN産物を合成する。
(A) DNAポリメラーゼ-βスーパーファミリー内のファージNTase、MNT、KNTクレードのデンドログラム（タンパク質配列のアライメントを用いて構築）。開いた紫色の円はAv05、塗りつぶした紫色の円はBCP1ファージNTアーゼを示す。

(B) 2つの部位におけるNTaseの配列の分岐を示す配列LOGO図。赤いアスタリスクは主要な触媒部位を示す。

(C) 野生型および変異型BCP1ファージNTaseによって生成された生成物を示すMALDI-MSクロマトグラムの重ね合わせ。3'3'cGAMPとcAAに相当する質量を持つ主要な生成物を示す。挿入図は、より広いm/z範囲にわたる野生型BCP1 NTaseのクロマトグラムを示す。結果はn=3実験の代表値である。

(D) Av05ファージNTaseが生成する反応生成物を示すMALDI-MSクロマトグラム。結果はn=2実験の代表値である。

図S1も参照。

ファージNTaseの酵素機能を調べるために、BacillusファージBCP1とEnterobacteriophage Av05から精製した組み換えNTaseをrNTPs存在下でインキュベートした。野生型BCP1 NTaseは、触媒部位変異体（SDWD→AAWA）ではなく、3'3'cGAMPとcyclic di-adenylate（cAA）を主要生成物とし、MALDI-MSプロファイリングで決定した（図1C、S1A、S1B）。Av05 NTaseも同様に3'3cGAMPとcAAを生成し、さらにcyclic uridine-adenylate (cUA) の質量と一致する生成物を生成した（図1DおよびS1C）。これらの結果から、CDN産物を合成できるNTaseファミリーの範囲が拡大された。

3'3'cGAMPは宿主CBASS死滅エフェクターを動員する免疫アラーム信号として働くが（Cohen et al., 2019; Lowey et al., 2020; Whiteley et al., 2019）、ウイルスファミリー間でNTaseが広く分布することから、ファージのCDN合成が適合性優位性を与える可能性があることが示された。この提案に沿って、3'3'cGAMPは、異なる種のTIR-STINGエフェクターに含まれるSTING CDNセンサードメインに様々な親和性で結合し、活性化リガンドサイクリックジグアニル酸（cGG）の競合阻害剤として作用し得る（Morehouse et al.、2020）。そこで我々は、酵素活性の指標として蛍光基質ε-NADの開裂を用い、TIR-STINGに対するファージNTasesの影響を探ることにした。S. falciparum (Sf) TIR-STINGとcGG、BCP1およびAv05 NTasesの共培養により、初期のε-NAD開裂速度が濃度依存的に阻害されたが、BCP1触媒変異体はTIR-STING NADase活性に影響を及ぼさなかった（図2A）。大腸菌に導入すると、BCP1とAv05ファージのNTaseは、コロニー形成単位（CFU）アッセイによって決定されるように、SfTIR-STINGの毒性効果から宿主を保護したが、BCP1触媒変異体はそうしなかった(図2B)。一方、BCP1 NTaseは、SfSTIR-STINGと比較して3'3'cGAMPに対して100倍低い親和性を示すCapnocytophage granulosa（Cg）TIR-STINGの酵素活性をほとんど阻害せず（図S2A）、CgTIR-STINGからホストを保護することはできなかった（図S2B）。これらの結果を総合すると、ファージNTasesは、TIR-STING免疫エフェクターを阻害する戦略として、3'3'cGAMPなどの競合CDNリガンドを生成することが示唆される。

図2.
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図2.
ファージヌクレオチジルトランスフェラーゼはTIR-STINGデスエフェクターの活性を低下させる。
(A)NAD+加水分解アッセイ。S. falciparum (Sf) TIR-STING NAD+開裂活性は、10倍の濃度範囲で野生型または触媒的に不活性な形態のBCP1およびAv05ファージNTasesの非存在下または存在下で、蛍光基質ε-NADを用いて測定された。グラフは、n=4実験からのs.d.を伴う平均値を示す。

(B）SfTIR-STINGとBCP1またはAv05 NTaseの野生型または触媒変異体、またはベクターコントロールの示された組み合わせで形質転換した大腸菌の相対生存率を示すCFUアッセイ。結果はn=3実験の代表値である。

図S2も参照。

ファージ抗制限および抗CRISPR遺伝子は、より大きな抗防御遺伝子クラスター内に一緒に配置されることが多い（Marinoら、2018；Pinilla-Redondoら、2020）。そこで、ファージNTaseに隣接する遺伝子のバイオインフォマティクス解析を実施した。240のファージNTaseのセット（表S1）から出発し、1958のフランキングオープンリーディングフレーム（ORF）を特定し、332の密接に関連する配列のクラスターを包含した。その結果、宿主の制限酵素を阻害するDNAアデニン・シトシンメチル化酵素や、TIR NADaseの代謝産物枯渇作用を緩和するNAD+生合成酵素を発見しました（図3A）。このことから、これまで認識されていなかったアンチディフェンス遺伝子が、NTaseをコードする遺伝子の近傍に配置されている可能性が示唆された。

図3.
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図3.
機能的スクリーニングにより、TIR-STING毒性から保護するファージMazG様ヌクレオチドピロホスファターゼ、Atd1を同定した。
(A）抗制限DNAメチルトランスフェラーゼおよびNAD生合成酵素に近接したNTaseを含むファージゲノム座位の例。

(B) プラスミドを用いた機能性スクリーニングの模式図。NTaseをコードする遺伝子にゲノム的に近接していることに基づいて選択したファージ遺伝子のプラスミドライブラリーを、空ベクター（EV）または誘導性TIR-STINGプラスミドと共に大腸菌宿主に形質転換させた。培養サンプルは誘導の直前または一晩の増殖後に取り出した。その後、各株および各時点におけるファージライブラリー内の遺伝子の相対的な代表性を、ディープシークエンスによって決定した。

(C) TIR-STINGを共発現する宿主細胞におけるファージ遺伝子の平均濃縮度を示すボルケーノプロットで、EV対照に対して正規化した。TIR-STINGを共発現している宿主で有意に濃縮されたファージ遺伝子は紫色で表示されている（P < 0.05）。Atd1はオレンジ色の輪郭で示されている。

(D) 上段はAtd1とMazGタンパク質の模式図である。双子の触媒モチーフは赤いアスタリスクで示されている。下は、ファージとバクテリアのMazGファミリーメンバーの多重配列アライメント。保存された触媒残基は青色でハイライトされている。

(E) Atd1のppGppおよびGTP基質に対する活性を、様々な濃度で測定したピロホスファターゼアッセイ。網掛け部分はppGppに対するAtd1のKmの95%信頼区間を示している。各基質について、2回の独立した実験の結果がプロットされている。

図S3も参照。

追加の抗防御遺伝子候補を同定するために、TIR-STING死エフェクターと共発現すると選択的に濃縮され、空ベクター対照の存在下では濃縮されないファージORFのプラスミドベースの機能スクリーニングを実施した。我々はまず、176の配列クラスターを代表する257のNTase隣接ORFを含む誘導性ファージORFライブラリーと、TIR-STINGをコードする第2の誘導性プラスミドまたは空のベクターコントロールを大腸菌に共形質転換させた。次に、各形質転換株を液体培養に接種し、その後、誘導条件下での増殖に移行させてから細胞を回収した（図3B）。入力プラスミドライブラリーと出力プラスミドライブラリーのファージ挿入領域をPCRで増幅し、次世代シーケンサーで入力と出力のプラスミドライブラリーにおける個々の挿入物の代表性を比較した。

このアプローチにより、TIR-STINGを共発現する細菌宿主では有意に濃縮されるが、空のコントロールプラスミドでは濃縮されない6つのファージ遺伝子を同定した。これは、これらの遺伝子がTIR-STING毒性に対する保護を与え、したがって生存優位性を提供することを示唆している（図3C）。ほとんどのORFは、以前に特徴付けられたどのタンパク質とも検出可能な配列類似性を示さなかったが、MazG様ヌクレオチドピロホスファターゼの触媒ドメインをコードするPectobacteriumファージPcCB7Vからの遺伝子は、スクリーニングにおいて著しく濃縮された（図3Cおよび3D）（Leeら、2008年）。大腸菌では、mazGはストレス誘導型TA自殺モジュールであるmazEFオペロン内のrelAの下流に配置されている。MazFは安定なエンドリボヌクレアーゼ毒素であり、その同族であるアンチトキシンMazEとの直接的な相互作用を通じて阻害される、不安定なタンパク質である（Gross et al.、2006）。栄養不足の条件下で、RelAは飢餓状態のリボソームAサイトの脱アシル化tRNAを感知し、アラーモンヌクレオチドのグアノシン五リン酸（pppGpp）および四リン酸（ppGpp）-総称して（p）ppGpp-を合成して、ストリンジェント応答の一環として転写をグローバルにダウンレギュレートしている。その結果、MazEアンチトキシンが急速に失われ、プロミスキャスMazFエンドリボヌクレアーゼ毒素が活性化される（Culviner and Laub, 2018; Engelberg-Kulka et al. , 2005).

我々がAtd1（抗TIR防御1）と仮に命名したファージMazG様タンパク質がスクリーニングでヒットしたことから、（p）ppGppの酵素的枯渇がTIR媒介の細胞自殺を減弱させる可能性が示唆された。この可能性と一致して、精製野生型Atd1は、約50μMの見かけのKmでppGpp基質の脱リン酸化を刺激した（図3EおよびS3A）、この値は、対数増殖中の（p）ppGppの細胞内濃度以上であるが、ストリンジェント応答の誘導後に最大酵素活性を可能にするであろう（Krielら、2012年；Varikら、2017年）。一方、同じ反応条件下で、rNTPsまたはcGGの脱リン酸化にはAtd1の影響は見られなかった（図3EおよびS3B）。

次に、RNAベースの蛍光（p）ppGppセンサー（Sunら、2021）を利用して、TIR-STING発現の細胞内アラモンプールへの影響をモニターした。ライブセルイメージングにより、TIR-STINGの誘導に伴う著しい蛍光活性化が明らかになった（図4A）。グルコースを与えた対照細胞に対するシグナル強度は平均2.7倍増加し、飢餓の化学誘導物質であるα-メチルグルコース（αMG）に曝露した細胞で見られた増加と同様である（図4Aおよび図4B）。逆に、ファージMazGはα-MGに1時間暴露した後のレポーターの蛍光を抑制した（図4Cと4D）。これらの結果から、TIR-STINGは細胞内の(p)ppGppプールの急激な増加を引き起こし、この反応はAtd1によって抑制されることがわかった。

図4.
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図4.
Atd1が飢餓状態のアロモン(p)ppGppを枯渇させる。
(A) グルコースを含む培地で培養した生菌、または解糖阻害剤α-MGで処理して飢餓を誘導した後、またはTIR-STINGまたはコントロールベクターを誘導した後、RNAベースの蛍光センサー（緑）および細胞質RFP（赤）を用いて細胞内の(p)ppGppレベルを可視化したもの。スケールバー、50 µm。結果はn=3実験の代表値である。

(B) グルコースで培養し、化学飢餓剤α-MGで処理し、またはTIR-STINGを誘導した生細胞における(p)ppGppセンサー信号強度のバイオリンプロット。破線は四分位を示す。

(C) グルコースを含む完全培地で培養した細胞、またはAtd1非存在下、α-MGで飢餓を誘導した細胞における細胞性(p)ppGppセンサー（緑）および細胞質RFP蛍光（赤）。スケールバー、50μm。結果はn=3実験の代表値である。

(D) Atd1または空のコントロールベクター存在下、α-MG処理後の生細胞における(p)ppGppセンサーのシグナル強度のバイオリンプロット。破線は四分位を示す。

TIR-STING毒性に対する(p)ppGppとストリンジェント応答の寄与を評価するために、TIR-STINGを発現するmazG、relAおよびmazEF変異体の生存率を、野生型の親コントロール株と比較して測定・比較するCFUアッセイを実施した。アミノ酸飢餓に対する過敏性を与えるmazGの欠損は、TIR-STING発現時の生存率を親株に対してさらに4倍低下させた（図5Aおよび図5B）。逆に、relAまたはmazEFの変異による不活性化は、TIR-STINGの毒性から細胞生存率を保護した（図5Aおよび図5B）。MazEのタンパク質分解を阻害してMazF毒素を不活性コンフォメーションに維持する（Engelberg-Kulkaら、1998）バクテリオファージ・ラムダRexBも、Atd1と同様にTIR-STINGを共発現する細胞の生存率を上げ、一次スクリーニングからの結果を検証した（図5Aおよび図5B）。

図5.
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図5.
TIR依存的な頓挫感染の促進におけるRelAとMazF毒素の役割。
(A) mazG、relA、mazEFの遺伝子不活性化、RexB、Atd1の発現がTIR-STING細胞傷害に与える影響を示すCFUアッセイ。結果はn=4反復実験の代表値である。

(B) CFUアッセイ結果の定量化。棒グラフは平均値、エラーバーはn=4実験からのs.d.を示す。

(C)ファージプラーク形成アッセイ。Atd1非存在下または存在下で、レトロン-TIR防御系を発現する大腸菌または空ベクターコントロールを有する大腸菌からそれぞれ増殖させた細菌ローンを、T5ファージの10倍連続希釈液を含む液滴に感染させた。結果はn=3反復実験の代表値である。

(D) ファージNTaseとAtd1による宿主免疫の抑制を示すモデル。TIRとSTINGドメインを含む免疫エフェクターによって組織化された感染反応の頓挫という異なるポイントで介入している。

注目すべきは、Atd1がTIRドメインの死滅エフェクターであるretron-TIR (Gao et al., 2020) の毒性も無効化し、Atd1を発現しない対照株に比べてT5バクテリオファージによるプラーク形成を10倍も回復させたことである（図5C）。これらの結果は、Atd1がTIRドメインを含むエフェクターを利用する異なる防御システムから保護することができることを示している（図5D）。

考察
感染阻害は、宿主の自己破壊を前提とした免疫戦略であり、個々の細胞の生存を犠牲にして、細菌集団全体に広がるウイルスや他の侵入性遺伝要素を迅速に消滅させるように設計されている（Lopatina et al.、2020）。今回、我々は、広く分布し、高度に保存されたTIRおよびSTINGドメインを含む細胞障害性Abiエフェクターに対抗するウイルス防御遺伝子を明らかにした。これらの抗Abiシステムは、STING受容体を「妨害」する競合阻害剤CDNの産生と、(p)ppGppアラーモン分子の酵素的枯渇によって、NAD加水分解TIR酵素による代謝物枯渇とそれに続く細胞毒の動員に対する宿主応答を損なわせる、異なる核酸中心のメカニズムで作動する。

我々は、宿主のCBASS防御システム内にコードされた細菌CD-NTaseによって生成される免疫メッセンジャーとして働く同じCDNであるcAAと3'3'cGAMPを主要生成物として合成するウイルスコード化NTaseの大きなファミリーを特定する（Whiteley et al.、2019）。ウイルスNTaseは、polβ型NTaseスーパーファミリー内の細菌および古細菌MNTと密接に関連している一方で、アミノグリコシド抗生物質に対する耐性を付与するカナマイシンNTaseとより遠い配列関係を示す（Pedersenら、1995年）。これらの結果は、CDNを合成することが知られているNTaseファミリーの範囲を拡大し、細菌のMNT酵素も同様にCDN産物を生成する可能性を示唆するものである。CBASSおよびPycsar系にそれぞれ含まれるCD-NTaseおよびヌクレオチドサイクラーゼとは対照的に（Cohenら、2019；Talら、2021；Whiteleyら、2019）、ファージNTaseは既知の環状ヌクレオチドのセンサーまたはエフェクターのドメインを含むオペロン内でコードされない。むしろ、3'3'cGAMPを生成することによって、ウイルスNTaseは、宿主STING受容体（その多くは、異なるCDNに結合することができるが、cGGによって選択的に活性化される）を競合的に阻害することができる（Morehouseら、2020年）。このシグナル妨害戦略が、TIR-STINGだけでなく、広く普及しているSAVED、patatin、SLOGドメインを含むものなど、他のクラスのヌクレオチド感知エフェクターにも及ぶかどうかを決定することが重要である（Duncan-Lowey et al, 2021; Lowey et al, 2020; Ofir et al, 2021）。さらに我々の結果は、これまで認識されていなかったTIR NADase駆動の細胞死がストリンジェントな応答アラームである (p)ppGpp の生成に依存していることを利用した、第2のウイルス抗殺生システムの一般設計を明らかにしている。我々は、ウイルスのMazG様タンパク質Atd1が、細胞の(p)ppGppプールを枯渇させ、MazEFを含む宿主TA自殺モジュールの動員を阻害することを示す。このように、必須代謝産物であるNAD+とNADPの枯渇は代謝停止を引き起こすと考えられているが（Morehouseら、2020）、TIRエフェクターの最大限の毒性には、二次的死経路の組み合わせ的関与が必要であると思われる。TIRの下流における細胞傷害性シグナルの伝達は、ここに示すように、宿主代謝ストレス経路の活性化を通じてのみならず、さらに、NAD切断産物シクリックADPリボース（cADPR）の生成を通じて起こり、それ自体が下流の免疫エフェクターを動員するメッセンジャーとして作用し得る（Essumanら、2017; Essumanら、2018; Ofirら、2021)。

ファージゲノム内の抗Abi遺伝子近傍の同定は、新しいクラスの免疫モジュレーターの系統的なスクリーニングと同定のための道を開くものである。細菌のAbi防御の多様性、およびTIRやSTINGなどの主要なエフェクタードメインの保存とモジュール性（Gaoら、2020；Ofirら、2021）は、免疫シグナル伝達と細胞生存の工学的制御における抗Abiシステムの可能性を浮き彫りにしています。

研究方法
NTase酵素の進化的およびLOGO配列解析
シホビル科、ミオビル科、ポドビル科のバクテリオファージ遺伝子のうち、ヌクレオチジル転移酵素として注釈され、触媒モチーフをそのまま含むものをクエリー配列として、繰り返しBLASTp検索を実施した。進化解析はMEGAソフトウェア（Tamura et al., 2021）を用いて最尤法とJTT行列ベースモデル（Jones et al.） 対数尤度が最も高い木を示す。ヒューリスティック探索の初期木は、JTTモデルを用いて推定した対距離の行列にNeighbor-JoinとBioNJアルゴリズムを適用し、対数尤度の値が優れているトポロジーを選択することで自動的に得られた。木はiTOL v6 (Letunic and Bork, 2021)を用いて可視化した。木は縮尺して描かれ、枝の長さは部位ごとの置換数で測定される。NTase触媒ドメインのLOGO配列分析は、WebLogo (Crooks et al., 2004)を用いて行った。

組換えタンパク質の発現と精製
BCP1およびAv05ファージNTase、SfおよびCg TIR-STING、ならびにAtd1をコードし、N末端TEV切断部位を含む合成遺伝子断片（gBlocks、IDT）をGibsonアセンブリ（NEBuilder HiFi, New England Biolabs）を介してBamHI/NotI消化のpGEX4-1（GE Healthcare）に直接クローニングするか、PCRによってN末端のTwinStrep（TS）またはストレプトアビジン結合ペプチド（SBP）タグを付け、NdeI/XhoI消化のpET30aベクター（ミリポアシグマ）へ導入した。変異誘発はQ5 Site-Directed Mutagenesis kit (New England Biolab)を用いて行った。すべてのコンストラクトは、両鎖のサンガーシークエンスによって確認された。プラスミドをBL21 (DE3) Rosetta 2コンピテントセル(MilliporeSigma)に形質転換した。細菌培養物をA600が0.4-0.5になるまで培養し、0.1 mM IPTGで30℃、16時間誘導した。細菌ペレットを、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル、5 mMフッ化ナトリウム、1 mMオルトバナジン酸ナトリウム、リゾチーム (0.2 mg/ml) およびDNase I (10 μg/ml) を加えた氷冷PBSに再懸濁し、バースト間に30秒冷却しながら15秒間に5-6回超音波処理を施した。可溶性タンパク質（5 ml）を250 μlの磁性グルタチオン樹脂（ThermoFisher）またはストレプトアクチン樹脂（IBA Life Sciences）と共に4℃で2時間、穏やかに回転させてインキュベートした。樹脂を溶解バッファーで3回洗浄し、溶出バッファー（50 mM Tris-HCl pH 8.0, 200 mM NaCl, 5% glycerol, 10 mM desthiobiotin or glutathione）で30分間2回溶出し、プールして5%グリセロールを含むTBSに4℃で一晩透析をした。サンプルは分注し、-80℃で保存した。

ヌクレオチド合成アッセイ
In vitro生化学反応は、1uMの精製酵素を20μlの最終容量のNTase反応バッファー（50mM Tris pH 8.0, 50mM KCl, 5mM Mg(OAc)2, 1mM DTT, 5% glycerol, 125μM rNTPs）中で37℃で3時間実施した。反応は80 µlのアセトニトリルでMALDI-MS分析用に脱タンパクし、分析前に-20℃で保存した。

MALDI-MS分析
サンプルはZipTip C18マイクロピペットチップ（MilliporeSigma）を用いて脱塩、濃縮した後、96スポットの鋼板ターゲットにスポットし、α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸（HCCA）マトリックス溶液で覆った。質量分析はMicroflex MALDI-TOF質量分析計（Bruker Daltonics）を用いて行い、正イオンのスペクトルを記録した。マススペクトルの解析にはPolytools(2.0)ソフトウェアを使用した。

TIR NADaseアッセイ
インビトロTIR NADaseアッセイは、本質的に記載されたように実施した。簡単に言えば、精製TIR-STING(0.5μM)を、0.25mM ε-NAD基質を含み、125μM rNTPsを補充したTIR反応緩衝液(20mM HEPES-KOH pH 7.5, 100mM KCl)で、精製Av05 NTaseまたはBCP1 NTase 0.125,0.25,1.25 μMの野生型もしくは変異型の増加量の存在下または不在下にインキュベートした。） 反応は96ウェルプレートで行い、cGG（40 nM）の添加により開始し、Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Reader (BioTek) を用いて、300 nmで励起し410 nmで蛍光モードで連続的に読み取った。初期反応速度は、cGG添加直前と10分後の値を用いて計算した。

菌体CFUアッセイ
relA、mazG変異株および野生型親株の大腸菌は、慶應ストレインコレクション（Horizon Discovery社）から入手した。mazEF変異株と親株は、Dr. Hanna Engelberg-Kulkaから寛大な贈与を受けたものである。一晩培養した細胞を、0.25%カザミノ酸（CAA）と0.5%グルコースを含む5 mlのM9培地で1:20に希釈した。培養は、200rpm、37℃で対数期初期（OD600 0.2-0.3）まで振とう培養した。その後、細胞をM9最小培地で洗浄し、連続希釈し、0.25% CAAと0.25%グルコース、または1%グリセロール、0.7%アラビノース、さらにpETベクター誘導用に0.5 mM IPTGを含むM9寒天プレートにプレーティングした。プレートは37℃で一晩インキュベートし、誘導条件と栄養制限条件下での細胞のコロニー形成能力を比較し、グルコースを含むプレート上で増殖した生存細胞の総数で正規化することにより、細胞の生存率を評価した。

ファージNTaseに隣接するORFの計算機による解析
ファージNTaseをNCBI Proteinでコンパイルし、Jalview (Waterhouse et al., 2009)を用いて整列させ、無傷の触媒モチーフ（GSおよびDXD）が存在することを確認した。ファージNTasesの4つの遺伝子内に位置するタンパク質コードORFをwebFlaGs (Saha et al., 2021)を用いて同定し、対応するタンパク質配列をNCBI Batch Entrezを用いてダウンロードした。冗長性を減らすために、MMseqs2 (Hauser et al., 2016; Mirdita et al., 2019) の linclust オプションを使用して、パラメータ --min-seq-id 0.98 -c 0.98 で非常に類似した配列（少なくとも98%の配列同一性とカバレッジ）を破棄し、得られた配列を MMSeqs2 のカスケードクラスター化オプションを使用して相同性に基づいてクラスター化して、332クラスタに分布する1603個の ORFs リストを得ました。200 アミノ酸長以下の未同定 ORF（176クラスターを代表する257のORF）を機能スクリーニング研究に選定した。

ファージORFライブラリスクリーニング
NdeIおよびNotIサイトを挟むpET-SUMO2ベクターと相同性のある20〜25 ntのフランキング領域を持つファージORFをコードする二本鎖遺伝子断片およびプールされた一本鎖DNAオリゴヌクレオチドはIDT（eBlocksおよびoPools）より購入した。ssDNAオリゴは、3'フランキング領域に相補的なプライマー（sparQ HiFi PCR Master Mix, Quantabio）の等温伸長によりdsDNAに変換し、DNAスピンカラムで生成物を精製した。プールしたORFをDNAアセンブリー（NEBuilder HiFi）によりpET-SUMO2に挿入し、大腸菌（NEB DH5α）へ形質転換した。コロニーをプレートから掻き取り、組み合わせ、10ml液体培養物に接種した。次に、プールしたORFライブラリーをコードするプラスミドDNAを調製し、Flag-TIR-STINGをコードするpET30aまたは空ベクターコントロールと共にBL21 (DE3) Rosetta 2コンピテントセル（MilliporeSigma）を形質転換するのに使用した。100 µlの一晩培養液を1:20に希釈し、0.25% CAAと1%グリセロールを添加したM9培地で培養し、0.5mM IPTGの添加によりA600=0.3-0.4で誘導した。サンプルは誘導直前と誘導後18時間に採取した。プラスミドDNAをミニプレップで回収し、pET-SUMO2のORF挿入部位を挟むプライマーを用いてPCRでライブラリー挿入物を増幅した。イルミナシーケンス用のバーコードライブラリーはsparQ DNA Library Kit（Quantabio）を用いて作製し、50 bpリードはHiSeq3000シーケンスシステムを用いて生成した。

ピロホスファターゼアッセイ
ホスファターゼ反応は、96ウェルプレートで、1μgの精製Atd1タンパク質とppGpp、NTPs、またはcGGを含むピロホスファターゼ反応バッファー（50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 250 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM TCEP）中で37℃、1時間半実施された。反応は10 µlの氷冷した20 mM EDTAを加えて停止した。各反応のリン酸濃度は、PiPer Pyrophosphate Assay Kit (ThermoFisher)を用いて、製造者の説明書に従って測定した。Synergy H1 Hybrid Plate Readerを用い、565 nmで吸光度を測定した。

ライブセルイメージング
S2蛍光センサープラスミド（Sunら、2021）を有する大腸菌BL21（DE3）細胞を、0.25％CAAおよび0.5％グルコースを添加したM9培地でA600が0.2〜0.4となるように増殖させた。細胞を短時間ペレット化し（8,000 x g、45秒）、次に化学飢餓を誘導するために2.5%α-MGの非存在下または存在下で0.25%CAA、0.5%グルコースおよび0.5mM IPTGを含むM9培地にシフトし；または栄養欠乏とpBADベクターからのTIR-STINGの発現とを共に誘導するために1%グリセロール、0.5mM IPTGおよび0.75%アラビノースを含むM9培地とした。細胞は、記載されているように誘導培地にシフトした1時間後にDFHBI-1T色素とインキュベートされた（Sunら、2021年）。画像は、Zeiss LSM 880 Airyscan共焦点顕微鏡を使用して取得し、ImageJ（1.53r）ソフトウェアを使用して定量化した。

ファージプラークアッセイ
Shigella dysenteriae NCTC2966 (Addgene #157883) または空ベクターコントロール (pACYC184) からの retron-TIR で形質転換した大腸菌 K-12 株 MG1655のシングルコロニーから培養した細菌一晩培養物をLB培地で培養し、A600 が 0.4-0.5 になるまで37℃、200 rpmでシェーカーで培養した 1:100 希釈物を使用した。次に、あらかじめ温めたトップアガー（M9 salt, 0.25% CAA, 1% glycerol, 0.75% agar）3mlと0.15mlの菌培養物を混合し、25 ug/mlクロラムフェニコールが入った寒天プレートに均一に流し込んだ。T5 ファージ (ATCC 11303-B5) をダブルアガーオーバーレイ法で増殖させ、LB培地にプラークを掻き出した。ファージ試料を遠心分離して細胞残渣をペレット化し、上清を0.22μmの滅菌フィルターで濾過した。ファージ希釈用緩衝液（20 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 8 mM MgS04）で連続希釈し、各希釈液4 µlを冷却した寒天上層に滴下した。プラークは37℃で16時間形成させた。

著者による貢献
P.H.は、生化学的アッセイと細菌細胞を用いた実験を行い、次世代シーケンサーのライブラリーを作成した。E.C.は、質量分析計の分析を指揮した。Y.C.とS.B.はバイオインフォマティクスの解析を行った。P.H.とD.E.F.はデータ解析と原稿執筆を行った。

利害関係者の宣言
著者らは、競合する利害関係を宣言していない。

謝辞
このプロジェクトは、NIHの助成金5R21AA027535-02、米国癌協会のIRG-16-181-57、USC病理学教室から一部支援を受けています。MALDI-MS実験に協力いただいたAlireza Abdolvahabi博士、有益な議論をいただいたAaron Whiteley博士に感謝する。また、公開すべき利益相反はない。

参考文献
↵Athukoralage, J. S., McMahon, S. A., Zhang, C., Grüschow, S., Graham, S., Krupovic, M., ... White, M. F. (2020). 抗CRISPRウイルスリングヌクレアーゼは、III型CRISPR免疫を破壊する。Nature, 577(7791), 572-575. https://doi.org/10.1038/s41586-019-1909-5CrossRefPubMedGoogle Scholar
↵Bondy-Denomy, J., Garcia, B., Strum, S., Du, M., Rollins, M. F., Hidalgo-Reyes, Y., ... Davidson, A. R. (2015). 抗CRISPRタンパク質によるCRISPR-Cas阻害の複数のメカニズム。Nature, 526(7571), 136-139. https://doi.org/10.1038/nature15254CrossRefPubMedGoogle Scholar
↵Chopin, M. C., Chopin, A., and Bidnenko, E. (2005). 乳酸球菌におけるファージ頓挫感染：テーマによるバリエーション。Curr Opin Microbiol, 8(4), 473-479. https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.06.006CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
↵Cohen, D., Melamed, S., Millman, A., Shulman, G., Oppenheimer-Shaanan, Y., Kacen, A., ... Sorek, R. (2019). サイクリックGMP-AMPシグナルは、ウイルス感染から細菌を保護する。Nature, 574(7780), 691-695. https://doi.org/10.1038/s41586-019-1605-5Google Scholar
↵Crooks, G. E., Hon, G., Chandonia, J. M., and Brenner, S. E. (2004). WebLogo: A sequence logo generator. Genome Res, 14(6), 1188-1190. https://doi.org/10.1101/gr.849004Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
↵Culviner, P. H., and Laub, M. T. (2018). E. coli Toxin MazFのグローバル分析により、mRNAの広範な切断とrRNA成熟およびリボソーム生合成の阻害が明らかになりました。Mol Cell, 70(5), 868-880.e810. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2018.04.026CrossRefPubMedGoogle Scholar
ȕDuncan-Lowey, B., McNamara-Bordewick, N. K., Tal, N., Sorek, R., and Kranzusch, P. J. (2021).エフェクターを介した膜破壊。エフェクターを介した膜破壊は、CBASS抗ファージ防御における細胞死を制御する。Mol Cell, 81(24), 5039-5051.e5035. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2021.10.020CrossRefPubMedGoogle Scholar
mazEF: a chromosomal toxin-antitoxin module that triggers programmed cell death in bacteria（mazEF：細菌のプログラム細胞死を誘発する染色体毒素-抗毒素モジュール）。J Cell Sci, 118(Pt 19), 4327-4332. https://doi.org/10.1242/jcs.02619Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
バクテリオファージ・ラムダのrexBは、抗細胞死遺伝子である。https://doi.org/10.1073/pnas.95.26.15481Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
↵Essuman, K., Summers, D. W., Sasaki, Y., Mao, X., DiAntonio, A., and Milbrandt, J. (2017). SARM1 Toll/Interleukin-1 レセプタードメインは内在性NADを保有する。Neuron, 93(6), 1334-1343.e1335. https://doi.org/10.1016/j.neuron.2017.02.022CrossRefPubMedGoogle Scholar
↵Essuman, K., Summers, D. W., Sasaki, Y., Mao, X., Yim, A. K. Y., DiAntonio, A., and Milbrandt, J. (2018). TIRドメインタンパク質はNADの古代のファミリーである。Curr Biol, 28(3), 421-430.e424. https://doi.org/10.1016/j.cub.2017.12.024CrossRefPubMedGoogle Scholar
↵Gao, L., Altae-Tran, H., Böhning, F., Makarova, K. S., Segel, M., Schmid-Burgk, J. L., ... Zhang, F. (2020). 原核生物における抗ウイルス免疫の多様な酵素活性による媒介。Science, 369(6507), 1077-1084. https://doi.org/10.1126/science.aba0372Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
このように、原核生物は多様な酵素活性を持ち、抗ウイルス作用を発揮する。MazG --a regulator of programmed cell death in Escherichia coli（大腸菌におけるプログラム細胞死の制御因子）. https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2005.04956.xCrossRefPubMedGoogle Scholar
↵Harms, A., Brodersen, D. E., Mitarai, N., and Gerdes, K. (2018). 毒素、標的、およびトリガー。毒素・抗毒素生物学の概要(An Overview of Toxin-Antitoxin Biology). Mol Cell, 70(5), 768-784. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2018.01.003Google Scholar
↵Haurwitz, R. E., Jinek, M., Wiedenheft, B., Zhou, K., and Doudna, J. A. (2010).配列および構造特異的なRNA。CRISPRエンドヌクレアーゼによる配列・構造特異的RNAプロセッシング。Science, 329(5997), 1355-1358. https://doi.org/10.1126/science.1192272Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
↵Hauser, M., Steinegger, M., and Söding, J. (2016). MMseqs software suite for fast and deep clustering and searching of large protein sequence sets（大規模なタンパク質配列セットの高速かつ深いクラスタリングと検索のためのMMseqsソフトウェアスイート）。Bioinformatics, 32(9), 1323-1330. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btw006CrossRefPubMedGoogle Scholar
↵Hobbs, S. J., Wein, T., Lu, A., Morehouse, B. R., Schnabel, J., Leavitt, A., ... Kranzusch, P. J. (2022). ファージの抗CBASSおよび抗Pycsarヌクレアーゼは細菌の免疫を破壊する。Nature, 605(7910), 522-526. https://doi.org/10.1038/s41586-022-04716-yCrossRefPubMedGoogle Scholar
このような場合、「anti-CBASS」と「anti-Pycsar」という2種類のヌクレアーゼが、細菌の免疫機能を阻害します。適応性細菌免疫におけるプログラム可能な二重RNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼ。Science, 337(6096), 816-821. https://doi.org/10.1126/science.1225829Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
↵Jones, D. T., Taylor, W. R., and Thornton, J. M. (1992). タンパク質配列から突然変異データマトリックスを迅速に生成する。https://doi.org/10.1093/bioinformatics/8.3.275CrossRefPubMedGoogle Scholar
↵Jurėnas, D., Fraikin, N., Goormaghtigh, F., and Van Melderen, L. (2022). 細菌毒素・抗毒素系の生物学と進化(Biology and Evolution of bacterial toxin-antitoxin systems). Nat Rev Microbiol, 20(6), 335-350. https://doi.org/10.1038/s41579-021-00661-1CrossRefPubMedGoogle Scholar
↵Kazlauskiene, M., Kostiuk, G., Venclovas, Č., Tamulaitis, G., and Siksnys, V. (2017). III型CRISPR-Casシステムにおける環状オリゴヌクレオチドシグナル伝達経路。Science, 357(6351), 605-609. https://doi.org/10.1126/science.aao0100Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
このような場合、「GTPのホメオスタシスを直接制御する」ことが重要です。(p)ppGppによるGTPホメオスタシスの直接制御：生存率とストレス抵抗性の重要な構成要素。https://doi.org/10.1016/j.molcel.2012.08.009CrossRefPubMedGoogle Scholar
大腸菌の結晶構造解析 ↵キム、M、H、カン、B、S、キム、J、S、キム、G、H、キム、Y、G、およびキム、K、J（2008）。栄養ストレス応答制御因子Escherichia coli MazGの結晶構造。J Biol Chem, 283(22), 15232-15240. https://doi.org/10.1074/jbc.M800479200Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
↵Letunic, I., and Bork, P. (2021). Interactive Tree Of Life (iTOL) v5: 系統樹の表示とアノテーションのためのオンラインツール。Nucleic Acids Res, 49(W1), W293-W296. https://doi.org/10.1093/nar/gkab301CrossRefGoogle Scholar
↵Lopatina, A., Tal, N., and Sorek, R. (2020). Abortive Infection: 抗ウイルス免疫戦略としてのバクテリアの自殺。Annu Rev Virol, 7(1), 371-384. https://doi.org/10.1146/annurev-virology-011620-040628Google Scholar
↵Lowey, B., Whiteley, A. T., Keszei, A. F. A., Morehouse, B. R., Mathews, I. T., Antine, S. P., ... Kranzusch, P. J. (2020).の項参照。CBASS免疫は、CARF関連エフェクターを使って3'-5'-および2'-5'-結合した環状オリゴヌクレオチドシグナルを感知し、細菌をファージ感染から保護する。Cell, 182(1), 38-49.e17. https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.05.019CrossRefPubMedGoogle Scholar
↵Marino, N. D., Zhang, J. Y., Borges, A. L., Sousa, A. A., Leon, L. M., Rauch, B. J., ... Bondy-Denomy, J. (2018). 広範なタイプIおよびタイプVのCRISPR-Cas阻害剤の発見。Science, 362(6411), 240-242. https://doi.org/10.1126/science.aau5174Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
↵Millman, A., Bernheim, A., Stokar-Avihail, A., Fedorenko, T., Voichek, M., Leavitt, A., ... Sorek, R. (2020). 細菌レトロンは抗ファージ防御に機能する。Cell, 183(6), 1551-1561.e1512. https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.09.065Google Scholar
↵Mirdita, M., Steinegger, M., and Söding, J. (2019). 高速でインタラクティブな配列検索のためのMMseqs2デスクトップおよびローカルWebサーバーアプリ。Bioinformatics, 35(16), 2856-2858. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bty1057CrossRefPubMedGoogle Scholar
↵Morehouse, B. R., Govande, A., Millman, A., Keszei, A. F. A., Lowey, B., Ofir, G., ... Kranzusch, P. J. (2020). バクテリアに由来するSTING環状ジヌクレオチドセンシング。Nature, 586(7829), 429-433. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2719-5Google Scholar
↵Ofir, G., Herbst, E., Baroz, M., Cohen, D., Millman, A., Doron, S., ... Sorek, R. (2021). 免疫シグナル分子を介した細菌TIRドメインの抗ウイルス活性。Nature, 600(7887), 116-120. https://doi.org/10.1038/s41586-021-04098-7CrossRefPubMedGoogle Scholar
↵Pedersen, L. C., Benning, M. M., and Holden, H. M. (1995). カナマイシンヌクレオチジルトランスフェラーゼの抗生物質およびATP結合部位の構造的検討。Biochemistry, 34(41), 13305-13311. https://doi.org/10.1021/bi00041a005CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
また、このような酵素は、細胞内にも存在する。II型制限酵素：構造と機構。Cell Mol Life Sci, 62(6), 685-707. https://doi.org/10.1007/s00018-004-4513-1CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
⅛Pinilla-Redondo, R., Shehreen, S., Marino, N. D., Fagerlund, R. D., Brown, C. M., Sørensen, S. J., ... Bondy-Denomy, J. (2020). 複数の抗CRISPRの発見により、移動性遺伝要素における抗防御遺伝子のクラスタリングが浮き彫りに。Nat Commun, 11(1), 5652. https://doi.org/10.1038/s41467-020-19415-3Google Scholar
↵Saha, C. K., Sanches Pires, R., Brolin, H., Delannoy, M., and Atkinson, G. C. (2021).FlaGsとwebFlaGsの発見。FlaGs and webFlaGs: Discing novel biology through the analysis of gene neighbourhood conservation（FlaGsとwebFlaGs：遺伝子近傍保存の分析による新しい生物学の発見）。バイオインフォマティクス, 37(9), 1312-1314. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btaa788Google Scholar
↵Sun, Z., Wu, R., Zhao, B., Zeinert, R., Chien, P., and You, M. (2021). RNAベースの蛍光センサーを用いたグアノシン四リン酸および五リン酸（p）ppGppのライブセルイメージング*. Angew Chem Int Ed Engl, 60(45), 24070-24074. https://doi.org/10.1002/anie.202111170CrossRefPubMedGoogle Scholar
↵Tal, N., Morehouse, B. R., Millman, A., Stokar-Avihail, A., Avraham, C., Fedorenko, T., ... Sorek, R. (2021). サイクリックCMPとサイクリックUMPは、ファージに対する細菌の免疫を媒介する。Cell, 184(23), 5728-5739.e5716. https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.09.031CrossRefPubMedGoogle Scholar
↵Tamura, K., Stecher, G., and Kumar, S. (2021). MEGA11：Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 11. Mol Biol Evol, 38(7), 3022-3027. https://doi.org/10.1093/molbev/msab120CrossRefGoogle Scholar
↵Varik, V., Oliveira, S. R. A., Hauryliuk, V., and Tenson, T. (2017). HPLCを用いた細菌のハウスキーピングヌクレオチドおよびアラモン・メッセンジャーppGppおよびpppGppの定量化. Sci Rep, 7(1), 11022. https://doi.org/10.1038/s41598-017-10988-6CrossRefPubMedGoogle Scholar
このような場合、「Jalview」は、「JALVIEW」と同じような機能で、「JALVIEW」と「JALVIEW」の2つのバージョンがあります。Jalview Version 2--a multiple sequence alignment editor and analysis workbench. Bioinformatics, 25(9), 1189-1191. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btp033CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
↵Whiteley, A. T., Eaglesham, J. B., de Oliveira Mann, C. C., Morehouse, B. R., Lowey, B., Nieminen, E. A., ... Kranzusch, P. J. (2019). バクテリアのcGAS様酵素は多様なヌクレオチドシグナルを合成する。Nature, 567(7747), 194-199. https://doi.org/10.1038/s41586-019-0953-5Google Scholar