ハザ・プレボテラはマウスで生存するために食事由来の微生物がアクセス可能な炭水化物を必要とする
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ハザ・プレボテラはマウスで生存するために食事由来の微生物がアクセス可能な炭水化物を必要とする
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.03.08.531063v1.full
View ORCID ProfileRebecca H Gellman, View ORCID ProfileMatthew R Olm, View ORCID ProfileNicolas Terrapon, View ORCID ProfileFatima Enam, Steven K Higginbottom, View ORCID ProfileJustin L Sonnenburg, View ORCID ProfileErica D Sonnenburg
doi: https://doi.org/10.1101/2023.03.08.531063
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概要
工業化によって腸内細菌叢は変容し、Prevotellaの有病率はBacteroidesに比べて減少している。本研究では、プレボテラが多いタンザニアのハザ族の微生物叢からBacteroidesとPrevotellaの菌株を分離した。植物由来の微生物がアクセスできる糖質（MAC）が、Prevotella copriの生体内での持続に必要であるが、Bacteroides thetaiotaomicronの持続には必要ないことを示した。炭水化物代謝遺伝子の内容、発現、in vitroでの増殖の違いから、HadzaのPrevotella株は植物の炭水化物の分解に特化しており、HadzaのBacteroides株は植物と宿主由来の炭水化物の両方を利用していることが明らかになった。この違いはHadza以外の集団のBacteroidesに反映されている。直接競合する場合、P. copriはB. thetaiotaomicronの存在下でコロニー形成を維持するために植物由来のMACを必要とし、MACなし食はP. copriのコロニー形成をなくすからです。Prevotellaの植物由来MACへの依存とBacteroidesの宿主粘液糖質利用能力は、低MACの工業化食を摂取する集団におけるPrevotellaの有病率の減少を説明できると考えられる。
先住民族との共同研究についての声明 先進国の人々だけを反映し利益を得るのではなく、すべての人間集団を正確に反映する科学的知識を得るためには、先住民族を合法的、倫理的、非搾取的に研究に参加させることが必要である（Abdill et al.、2022； Green et al.、2020）。ここでは、2013/2014年にHadza狩猟採集民から収集した匿名化された糞便サンプルから生きた細菌株を分離しました（Fragiadakis et al., 2019; Merrill et al., 2022; Smits et al., 2017）。サンプルは、タンザニア政府、国立医学研究所（MR/53i 100/83, NIMR/HQ/R.8a/Vol.IX/1542, Tanzania Commission for Science and Technology）の許可を得て、タンザニアの科学者の援助で収集した。タンザニア国立医学研究所との物質移転契約では、収集されたサンプルは学術目的のみに使用されることが明記されています。また、ハザ族にこれらのプロジェクトの結果を伝えるための私たちの継続的な取り組みについては、（Merrill et al., 2022; Olm et al., 2022）をご参照ください。
はじめに
工業化されたライフスタイルは、高度に加工された食品の消費、抗生物質の高い投与率、帝王切開による出産、生活環境の衛生化、動物や土壌との接触の減少によって定義され、これらはすべて人間の腸内細菌叢に影響を与える可能性があります（Sonnenburg and Sonnenburg, 2019）。ある種の分類群は工業化の影響を受け、すなわち、非工業化集団では優勢で豊富であるが、工業化集団では減少または不在である、あるいはその逆である。(De Filippo et al., 2010; Jha et al., 2018; Merrill et al., 2022; Olm et al., 2022; Smits et al., 2017; Vangay et al., 2018; Yatsunenko et al., 2012）. 1000～2000年前の北米の古便のマイクロバイオームは、工業化された腸よりも現代の非工業化された腸に似ている（Wibowo et al., 2021）。工業化された微生物叢は、かつて優勢だった分類群が消滅することによる微生物の絶滅と、優勢でない分類群や新しい分類群の拡大の両方の産物であるようです（Sonnenburg and Sonnenburg, 2014）。
工業化された食事は、非工業化された食事とは大きく異なり、遠位消化管の微生物にとって主要な代謝入力である微生物アクセス性炭水化物（MAC）の量が減少しています（Cordainら、2005； Flintら、2012； SonnenburgとSonnenburg、2014）。一部の腸内常在微生物は、食事性MACsの利用可能性に応じて、グリコシル化が激しい宿主ムチンを炭素源として利用する（Bell and Juge, 2021; Desai et al., 2016; Pudlo et al., 2022; Salyers et al., 1977; Sonnenburg et al., 2005）. 食事MACのシフトは、微生物の相対量を変化させ、炎症や腸内病原体への感受性を高める可能性がある（Desai et al., 2016; Earle et al., 2015; Martens et al., 2018）。マウスモデル、（Sonnenburgら、2016）、および米国に移住するヒト（Vangayら、2018）において、世代を超えて食事性MACの欠如により、分類が失われる。
ヒト集団が工業化されたライフスタイルを採用するにつれて、Prevotellaの有病率は減少し、Bacteroidesの有病率は増加します（De Filippo et al., 2010; Jha et al., 2018; Kaplan et al., 2019）。Bacteroidesがよく研究されている一方で、Prevotella種は、メカニズム調査に利用できるツールが少なく、控えめなままです（Abdill et al., 2022; Accetto and Avguštin, 2015; Li et al.） 両属は、しばしば多糖類利用遺伝子座（PULs）に組織された糖質活性酵素（CAZymes）にコードされる、十分に文書化された糖質利用能力を保有している（Bjursellら、2006；Doddら、2010；Fehlner-Peachら、2019）。腸内プレボテラ種の特性解析は、コロニー形成に関する課題、特に無菌マウスのモノコロニーニングによって制限されてきました。ここでは、これらの障壁を克服し、gnotobioticマウスモデルにおいて、食事とP. copriの有病率の因果関係を確立しました。
産業集団におけるプレボテラの有病率の低下は、個々のマイクロバイオーム内の相対的存在量の低下と関連していると考えられる（Sprockett et al.、2020）。個体内の細菌分類群の存在量が減少すると、母親から乳児への感染の可能性が低下します（Olmら、2022；Sonnenburg and Sonnenburg、2019）。世代を超えて複合的に作用すると、存在量の減少は集団レベルの有病率の低下をもたらし、最終的には分類群の損失や絶滅につながる可能性があります（Vangay et al., 2018; Sonnenburg et al., 2016）。工業化におけるPrevotellaの減少とBacteroidesの増加の要因は、まだ定義されていない。ヒト腸内の優勢なPrevotella種であるP. copriの特定の株の存在量と有病率は、宿主のライフスタイル、特に食事に基づいて集団間で変化します（De Filippis et al., 2019; Tett et al.） ここでは、gnotobioticマウスを使用して、PrevotellaとBacteroidesのコロニー形成を維持するための食事の役割を調査し、食事のMACがBacteroidesとPrevotellaの存在量を制御する上で重要な役割を果たすことを証明する。
研究成果
ハザ族の微生物叢に含まれるBacteroidesとPrevotellaのゲノムは、集団によって有病率が異なる
工業化されていない生活様式の集団のPrevotellaとBacteroidesを比較するために、13人のHadzaから採取した便サンプルから6つのBacteroides株（4種から）と7つのPrevotella copri株を分離して配列決定しました。重要なのは、P. copriは広範なゲノム多様性を包含することが知られている種であり、複数の種への分割が議論されている（Tett et al.、2019）。MiSeq生成ショートリード（146bp）とnanopore生成ロングリード（10-100kb）の両方を用いて、単一分離体ゲノムをアセンブルした（表1）。
Hadzaゲノムの既配列ゲノムとの関連性を判断するために、National Center for Biotechnology Information (NCBI) GenBankに存在する最も近いゲノムとの平均塩基同一性（ANI）距離を計算しました。HadzaのPrevotellaゲノムは、NCBIで完全なゲノムとして分類されたP. copriゲノムとは統計的に異なっていた（p=0.0002; Wilcoxon rank-sums test）。しかし、Hadza Bacteroidesゲノムは、NCBIの完全なBacteroidesゲノムとは統計的に区別されていない（p=0.76; Wilcoxon rank-sums検定）。HadzaのPrevotellaとBacteroidesのゲノムの違いは、Prevotellaゲノムの不足によるものではないと思われる。なぜなら、それぞれの属の公開ゲノム数は同程度（PrevotellaとBacteroides、それぞれ3482と4199）である。また、ヒトの腸内細菌叢ゲノム配列の大部分は、北米とヨーロッパのサンプルから収集されていることも注目に値する（Abdill et al.、2022）。
配列決定されたHadza株と同種の代表的なゲノムを系統的に比較した結果、Hadza Prevotella株とBacteroides株は、タイプ株や他のそれぞれの種とは異なるが、クラスタリングすることが明らかになった（図1A、図S1）。7つのHadza P. copri株はすべて、提案されている4つのP. copriサブグループのうち、10%以上のクレード間遺伝的差異を有するクレードAに属する（Tett et al.、2019）。
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図S1.BacteroidesとPrevotellaの亜種のクラスター化。
図1のゲノム比較に用いたPrevotella（A）およびBacteroides（B）亜種の代表ゲノムの数。亜種インデックス：ゲノムは平均塩基同一性（ANI）98%でクラスタリングされた。各バーは、これらの亜種ビンの1つを示す。青色はこの研究のために分離されたゲノムを示す。
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図1.ハザ・バクテロイデスおよびプレボテラ株は、これまでに配列決定された分離株と関連しており、集団間で有病率が異なる。
(A）PrevotellaとBacteroidesのゲノムの系統樹。本研究の分離株（赤）とGenBankのゲノム（黒）、本研究で後に使用した株（太字）。(B) 採食者（Hadza、Chepang）、農耕者（Rau、Raj、Tharu）、工業化（California）それぞれのPrevotellaとBacteroides亜種の有病率。有病率は、特定の菌株（行）が検出された集団（列）の腸内メタゲノムの割合として定義される。
ヒト集団におけるこれらのゲノムの有病率を理解するために、ネパールで採集生活（Chepang）、最近の農業従事者（Raute、Raj）、長期の農業従事者（Tharu）、産業生活集団（California）というライフスタイル勾配上に住む4集団、ハザ族の成人および幼児におけるプレボテラおよびバクテロイデス有病率を比較しました（図1b）。これらのグループを選んだのは、彼らの多様なライフスタイルと、1サンプルあたり平均23Gbpという卓越したメタゲノム配列決定深度が達成されたためです（Jha et al.、2018；Merrill et al.、2022）。分析した集団のうち、Hadza PrevotellaおよびBacteroides分離ゲノムの有病率は、別の採食グループであるChepangと最も似ており、産業ライフスタイルの個人とは最も異なっています（カリフォルニア）。Prevotellaゲノムは、工業化された集団では稀であるか存在しないが、Hadzaと農耕民族のサンプルではより多く存在し、豊富である。逆に、Hadzaから分離されたゲノムを含むほぼすべてのBacteroidesゲノムは、工業化された集団でより一般的であることがわかった。BacteroidesとPrevotellaの有病率に関連する明確なライフスタイルの変化は、工業的ライフスタイルのどのような側面がこれらの変化を促したのかという疑問を抱かせる。
P. copriの存続には食事性MACが必要である。
工業的なライフスタイルと非工業的なライフスタイルは多くの要因で区別されるが、食事はマイクロバイオームの変化を促す最有力候補となる（Sonnenburg and Sonnenburg, 2014）。ハザ族の食事は、採集した塊茎、ベリー類、バオバブから得られる食事性MACを豊富に含んでいる（Marlowe and Berbesque, 2009）。対照的に、工業化された食事は、高カロリー摂取と脂肪が豊富でMACsが少ない食品に代表されます（Monteiro et al., 2013）。我々は、食事だけでHadza BacteroidesとPrevotellaがマウスにコロニー形成する能力に影響を与えることができるかどうかを考えた。無菌（GF）マウスにHadza B. thetaiotaomicron (Bt) H-2622、またはHadza P. copri (Pc) H-2477のいずれかをコロニー形成させた。マウスを高MAC食で7日間維持した後、MACを含まない食（MACなし）、高脂肪／低MAC食（Western）、または高MAC食で7日間維持のいずれかに切り替えた（図2A）。高MAC食でのBt H-2622のコロニー形成密度（糞便中109 CFU/ml）は、3つの食餌条件すべてで維持された（図2B）。Pc H-2477は、高MAC食ではコロニー形成の程度が低く（107 CFU/ml）、Western食またはMACなし食に変更すると激減し、食餌変更後7日目には糞便中のCFUが検出されなくなった（図2C）。食餌性MAC非存在下でPc H-2477が検出されなかったことは、この単結合状態において他の微生物との競合がないことを考えると、特に顕著であった。これは、食餌の変更により、単結合状態の菌株が明らかに根絶した最初の例である。他の2つのP. copri株（Hadza Pc H-2497とアフリカ出身の個人から分離された非Hadza株Pc N-01）も、食事性MACsがない状態では生体内で消失しており（図S2 A, B）、P. copriの生体内生存は食事性MACsの存在に依存していることを示しています。
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図S2.BacteroidesとPrevotellaのコロニー形成と遺伝子発現の食事駆動型変化。
(A, B) 異なる飼料を与えたモノコロナイズマウスにおけるPc N-01（A）およびHadza Pc H-2497（B）の糞便密度（多重マン・ホイットニー検定、: p ≤ 0.05, **: p ≤ 0.01). 点線は0CFUを示す。MACなしへの飼料変更は0日目に行われた。 (C, D) High MAC in vivo vs. PYG in vitroにおけるPc H-2477（C）またはBt H-2622（D）遺伝子の発現量の差分。y=2での黒線。赤で示したCAZyme遺伝子。 E）Bt H-2622遺伝子のMACなしin vivoとPYG in vitroでの発現の差分。y=2における黒線。赤色で示したCAZyme遺伝子。
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図2.BtとPcのコロニー形成は、食餌依存的に異なる。
(A)グノトビオティック実験の模式図。(B, C) 異なる飼料を与えた単孔式マウス（High MACおよびWestern条件ではn=4/グループ、No MAC条件ではn=5/グループ）におけるBt H-2622（B）およびPc H-2477（C）の糞便密度（多重マン・ホイットニー検定、: p≤ 0.05, **: p≤ 0.01). 代表的な実験、2回繰り返す。点線は0CFUを示す。(D) 生体内で発現量が増加した遺伝子の機能カテゴリー別割合(RAST)。(E）アップレギュレートされたCAZymesの予測される基質カテゴリーの割合。(F) Bt H-2622遺伝子のMACなし飼料とMAC高飼料での発現の違い。
Hadza PcとBtが生体内で持続するために用いる戦略をよりよく理解するために、ペプトン酵母グルコースブロス（PYG）でのin vitro成長に対して高MAC食を与えたPc H-2477またはBt H-2622をモノクロリングしたマウスのセカール内容物の転写プロファイリングデータを解析しました。Bt H-2622とPc H-2477は、高MAC食条件下で多くの遺伝子をin vivoでアップレギュレートした（図S2C、D）。Bt H-2622とPc H-2477の遺伝子のそれぞれ18%と13%が予測される糖質利用タンパク質をコードしているにもかかわらず、in vivoでアップレギュレーションしたものの86%（Bt H-2622）と65%（Pc H-2477）は糖質利用をコードしている（p < 3. 7e-12 for Bt, p < 4.5e-13 for Pc, Fisher's Exact test）、糖質利用がこれらの生物の生体内における主要な代謝機能であることを示している（Fig. 2D）.
グリコシド結合を壊すCAZymesであるグリコシドヒドロラーゼ（GH）とポリサッカライドリアーゼ（PL）を比較すると、Bt H-2622はPc H-2477に比べて、動物由来の糖質利用に専念するGHとPLの割合が高いことがわかった（図2E）。具体的には、高MAC食条件下でのin vivoにおいて、Bt H-2622は、コード化された22個の粘液標的GHのうち8個（3/10 GH18; 5/12 GH20）をアップレギュレートするのに対し、Pc H-2477はGH18をコード化せず、GH20はたった一つであって高MAC食条件下ではアップレギュレートしないことがわかった。粘液糖質を標的とすることに加えて、Bt H-2622は97個の植物標的GHおよびPLのうち40個をアップレギュレートしたのに対し、Pc H-2477は植物標的GHおよびPLのうち38個すべてをハイMAC飼料でアップレギュレートした（図2E）。MAC 無添加飼料では、Bt H-2622 は 2 種類の GH20 を追加発現し（高 MAC 飼料で発現が増加した他のムチン CAZym と共に）、さらに in vitro 条件と比較して 27 種類の植物標的 GH および PL を増加した（図 S2E）。In vivoの高MAC条件とMACなし条件を比較すると、Bt H-2622は3つのGHのみをアップレギュレートし、そのうち2つはムチンを分解する（GH18）（図2F）（Sonnenburg et al., 2005）。これらのデータは、食餌由来のMACがない場合、Hadza Bt H-2622は粘液の炭水化物に依存し、限られたムチン分解能力により、Pc H-2477は食餌由来のMACがない場合にコロニー形成を維持できないことを示した。
炭水化物分解能力はHadza BacteroidesとPrevotellaのミラー工業化株の間で異なる
Hadza PcとBacteroidesの分離株は、対応する種の基準株と同様のGHsとPLsの数と予測される機能を有している（表2）。GHとPLの教師なしクラスタリングにより、Hadza株はそのタイプ株の対応する株とクラスタリングすることが明らかになった（図3A）。Hadza株内にコードされるGHとPLの総数を非Hadza株と比較すると、これらの遺伝子の総数や基質特異性の分布は、同じ種の株間で類似していることがわかった（図3B）。
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図3.ハザ・バクテロイデスとプレボテラでは、グリコシド水解酵素（GH）と多糖類リアーゼ（PL）の分布が異なる。
(A)CAZyファミリーで示したゲノムあたりのGHとPLの数（行）；CAZyファミリーは少なくとも4つのゲノムで解析された場合に表示される。(B）ゲノムサイズ（Mb）に対して正規化したGHとPLの数（予測される基質で色分け）。(C) 各ゲノムに含まれるGHとPLの割合を、予測される基質で色分けして示した。(D) ゲノムあたりのムチン分解GH18とGH20の遺伝子数。
ハザ菌のBacteroidesとPrevotellaは、ハザ菌でない菌株の糖質分解能力を反映しているが、BacteroidesとPrevotellaの間には大きな違いが存在する。ゲノムサイズで補正しても、BacteroidesはPrevotella株よりも多くのGHとPLをコードしている（Bacteroidesの平均GH/PLは251/21、Prevotellaは101/5、Welch Two Sample t-test p = 0.00561）(Table 2, Figure 3B) 。植物性糖質または動物性糖質を標的とすると予測されるBacteroidesのGHとPLの割合は同等である（それぞれ平均34%と37%）が、Prevotellaがコードする糖質分解は動物性糖質よりも植物性に偏っている（それぞれ平均44%と19%）（図3C）。Bacteroidesはまた、より幅広いGHおよびPLファミリーをコードする（ゲノムあたり平均68のCAZymeファミリー）のに対し、Pc分離株はゲノムあたり平均40のCAZyファミリー（図S3A）、産業生活由来のBacteroidesおよびPrevotella株について以前に報告された分布（Fehlner-Peach et al, 2019）と一致しています。また、2つの属は、予測されるムチン分解能力も異なる。CAZymeファミリーGH18およびGH20は、腸管粘液の内側に見られる炭水化物を標的とする（Luis et al.、2021）。すべてのHadza Bacteroides分離株は11-14個のGH20と1-13個のGH18 CAZymを保有しているが、Hadza Prevotella分離株は1〜2個のGH20のみを含み、Pc H-2497の1株のみが単一のGH18を含む（図3D, S3B）.
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図S3.Hadzaと参照単離株の拡張CAZymeデータ。
(A) ゲノムあたりの全GHとPLの数。カラーグラデーションは、各ゲノムに存在する各ファミリーの個々のCAZymeの生の数を示す。Hadza分離株は黒色、参照株は灰色で示す。 (B)すべての推定ムチン分解GHファミリーのGHの個数。
HadzaのBacteroidesとPrevotella分離株のCAZyme含有量は、Hadza以外の分離株と同様であった。Hadza Bacteroides分離株は、Hadza Prevotella分離株と比較して、植物および動物由来の炭水化物を含む幅広い基質分解能力を持ち、全体としてより多くのGHとPLを含む。HadzaのBacteroides株とPrevotella株の間のこの違いは、Hazda以外の株で見られるものと同様であり、PrevotellaニッチはBacteroidesと比較して植物炭水化物への依存度が高いことを示唆している（Gálvez et al., 2020）。
Btの存在下でPcのコロニー形成を維持するには、食餌性MACは十分である。
Hadza BacteroidesおよびPrevotella分離株が植物および粘液由来の炭水化物を利用する能力に違いがあるかどうかを調べるために、植物炭水化物イヌリン、豚胃ムチン糖鎖、豚腸ヘパリン、または果糖を唯一の炭素源として含む培地でHadzaおよびタイプ株のBacteroidesおよびPc分離株を培養した。イヌリンを利用する能力は菌株によって幅があり、これまでの研究結果と一致している（Fig. 4A）（Sonnenburgら, 2010）。しかし、ムチン存在下での増殖は属によって分かれており、Bacteroidesのほとんどの分離株はムチン上でよく増殖するが、P. copriの分離株はそうではなかった（Fig. 4A）。これらのデータは、Pcゲノムにムチン分解能力がないこと、および宿主が唯一の炭水化物源である場合、Pcのコロニー形成がin vivoで失われることと一致するものである。
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図4.MACの再導入はP. copriのコロニー形成を維持するのに十分である。
(A）糖質を1種類添加したYCFAで24時間培養したBacteroidesおよびPrevotella分離株の規格化最大OD600。(B) No MAC-gまたはInulin-g食を与えたモノコロナイズマウスにおけるPc H-2477の糞便CFU（平均＋s.e.m.、各群n=5マウス、多重マン・ホイットニー検定、*: p ≦ 0.05, **: p ≦ 0.01). 点線は0CFUを示す。代表的な実験、3回繰り返す。(C) Pc H-2477とBt H-2622によるバイコロナイゼーションの模式図。(D) Bt H-2622に対するPc H-2477の比率（平均＋s.e.m.、n=5マウス/群、K-S検定）。点線は等量であることを示す。網掛けは、High MAC食の投与を示す。代表的な実験、2回繰り返す。
食餌由来のMACの欠如が、in vivoでのPc H-2477コロニー形成の喪失に関与しているかどうかを決定するために、Pc H-2477でモノコロニー化したマウスに高MAC食を与え、その後、高MAC食のMAC含量に一致するように唯一の発酵性糖質として34重量％のイヌリンを含むカスタム食（カスタム食は結合剤にゼラチンを使用しているので「-g」で表記； Inulin-g ）またはMACなし食（No MAC-g ）（図）に変更した。4B）（DubosとPierce、1948）。MAC-gなし飼料では、Pc H-2477のコロニー形成は維持されず、1週間以内に菌株は検出されなくなった（図4B）。しかし、Pc H-2477はイヌリン-g食の存在下で、高MAC食で観察されたのと同様のレベルまでコロニー形成を維持した（図2C、4B）。これは、Pc H-2477が生体内でコロニー形成するためには、食事性MACsが必要であることと一致した。
我々は、食餌性MACが、マウスにPcとBtを共存させたときの相対的な存在量にどのような影響を与えるかを知りたいと考えた。GFマウスにPc H-2477とBt H-2622を共培養し、高MAC食を7日間与えた後、高MAC食を維持、MAC-gなし食、またはInulin-g食に2週間切り替え、その後1週間はすべてのマウスに高MAC食を与えた（図4c）。食餌切り替え前（0日目）、マウスはPc H-2477とBt H-2622の両方を保有していた。しかし、MACなし食に切り替えてから7日後、Pc H-2477はBt H-2622と比較して存在量が劇的に減少した。Pcの減少はイヌリン食でも起こったが、その減少はMACなし食ほど深刻ではなく、イヌリンがこの株をサポートしていることを示していた（図4D）。マウスを高MAC食に戻したところ、イヌリン-g食を与えたマウスは、ベースラインのPc H-2477と、実験期間中高MAC食を与えたマウスと同等の相対量を取り戻した（図4E）。MAC-gなし食から高MAC食に切り替えたマウスでは、Pc H-2477のコロニー形成が検出されたが、高MAC食で7日後、低いままであった。これらのデータは、Bt存在下でのPcのコロニー形成に食事性MACが必要であることと一致しており、Bacteroidesとの競争下でイヌリンのような単一のMAC源よりも、高MAC食の多様な糖質（小麦、トウモロコシ、オーツ、アルファルファ由来）の方がPcコロニー形成をよりよくサポートしていることを示していると思われる。さらに、高MAC食を長期間摂取しない場合、高MAC食を再導入したときにPcが再び豊富な量を獲得する能力が制限される。
考察
宿主のライフスタイルに基づくBacteroidesまたはPrevotellaに支配されたマイクロバイオームのトレードオフはよく説明されているが、その根拠はよく分かっていない（Gorvitovskaia et al., 2016; Yatsunenko et al., 2012）。ここでは、BacteroidesとPrevotellaのHadza分離株が、ゲノムワイド平均ヌクレオチド同一性と炭水化物利用の点で非Hazda分離株と劇的に異なるわけではないことを示し、ライフスタイルによるそれらの相対存在量と有病率の違いは、集団特有の菌株自体の固有の特性ではなく、環境の違いに起因することを示唆した。さらに、プレボテラがコロニー形成を維持するためには、食餌性MACsが重要であることを示した。唯一の微生物であっても、食餌性MACsを除去するとプレボテラは駆逐される。一方、バクテロイデス属は、植物と宿主由来の両方の炭水化物を利用できるため、MACがなくてもコロニー形成を維持でき、低MACの工業化食でもコロニー形成を継続できる。我々のデータは、異食モデルにおいて食事性MACsが存在する場合、ハザ族のマイクロバイオームで見られるように、ハザ族のBacteroidesとPrevotellaが共存できることを実証している。しかし、食事性MACsを除去すると、Prevotellaが急激に減少し、MACsを再導入しても回復が遅くなる。イヌリンという単一のMACsが食事に含まれていれば、コロニー形成の中間レベルを維持するのに十分であり、その後、より完全なMACsが利用できるようになると回復することがわかった。これらのデータは、ハザ族におけるPrevotellaの存在量の季節的パターンを彷彿とさせ、彼らの食事の季節性によって存在量が循環する。
これらのデータを総合すると、工業化以前のヒトのマイクロバイオームにはBacteroidesとPrevotellaの両種が存在していたというモデルと一致する。食生活が高MACの採集食品から低MACの工業生産食品に移行するにつれ、プレボテラの存在量と有病率が低下し、一部の個体では絶滅するまでになった（Merrill et al.、2022年）。工業化されたマイクロバイオームにおけるPrevotellaの消失とBacteroidesの増加により、ヒトの生理学にどのような影響があるのかは、依然として重要な問題である。
著者寄稿
R.H.G., M.R.O., N.T., F.E., and S.K.H. が実験を行い、データ解析を設計・実行した。R.H.G.、J.L.S.、E.D.S.は本研究の構想を練り、原稿を執筆した。
情報開示
Novome BiotechnologiesとInterface Biosciencesの共同設立者、株主、科学諮問委員会委員を務める。
スターメソッド
キーリソース表
インラインで見る
リードコンタクトと材料入手
すべての情報およびリソースに関するリクエストは、リードコンタクトのErica Sonnenburg（erica.sonnenburg{at}stanford.edu）に向けて発信され、対応されます。
データおよびコードの利用可能性
データセットと解析用コードは https://github.com/SonnenburgLab/ で入手可能です。WGSの生データファイルは公開データベースにアップロード中であり、この原稿の公開と同時に自由に利用できるようになる予定です。
実験モデルの詳細
細菌培養
本研究で分離されなかった細菌は、DSMZ（P. copri DSM 18205）、またはATCC（他のすべての参照株）から購入した。グリセロールストックは、10%脱脂ウマ血を含むBrain Heart Infusionプレート（BHIBA）上で打栓し、37℃で24-48時間嫌気培養を行った。BacteroidesおよびPrevotella株の増殖および培養はすべて、87%N2、10%CO2、3%H2を含むCoy嫌気槽で嫌気的に行われた。
マウスの飼育
すべてのマウス実験は、Stanford Institutional Animal Care and Use Committee に従って行われた。マウスは、周囲湿度20.5 □℃、12時間の明暗サイクルで維持し、自由食を与え、すべての実験の期間、フレキシブルフィルムのgnotobiotic isolator（クラスバイオロジカルクリーン）で維持された。gnotobiotic実験にはSwiss-Websterマウスを使用し、無菌マウスの無菌性は16S PCR増幅と糞便の嫌気性培養により確認した。サンプルサイズは、子ネズミの数に基づいて選択され、実験内で性別と年齢をコントロールした。研究者はサンプル収集の間、盲検化されていなかった（Pruss and Sonnenburg, 2021）。
メソッドの詳細
糞便サンプルからの菌株分離
菌株分離のためのサンプルは、Bacteroides属またはPrevotella属のいずれかの16S存在量に基づいて、以前に報告されたサンプルから選択した（Smits et al., 2017）。すべての分離は、YCFA-グルコースおよびYCFA-バオバブ寒天を用いた嫌気性条件下で実施した。最初のプレートからの可視コロニーは、コロニーPCRを介して同定し、BBEおよびLKVプレート（Anaerobe Systems）に再プレートした。
全ゲノムシークエンス
ゲノムDNAは、MasterPure Gram Positive DNA Purification Kitを使用して24時間培養した単離培養物から抽出した。ロングリードシーケンスはNanopore MinIONを、ショートリードシーケンスはIllumina MiSeqを使用して実施した。ショートリードの配列品質はFastqcを用いて "fastqc --nogroup -q "というコマンドで評価し、アダプターのトリミングはBBToolsを用いて "bbduk.sh -Xmx2g -eoom ref=adapters, phix threads=8 ktrim=r k=23 mink=11 edist=2 entropy=0.05 tpe tbo qtrim=rl minlength=100 trimq=30 pigz=t unpigz=t samplerate=0.25。"とコマンドで実行。ゲノムのカバレッジが100倍以上ある場合は、"bbnorm.sh target=100 min=2 "というコマンドでリードを正規化した。ショートリードとロングリードのハイブリッドアセンブリは、SPAdesを使用して、コマンド "spades.py -careful --cov-cutoff auto -k 21,33,55,77,99,127" (Prjibelski et al., 2020)を使用して行った。
RagOUTは、Bacteroidesについては同じ種のマッチした参照ゲノム（表1）、PrevotellaについてはPc H-2477（Kolmogorovら、2018）のいずれかを使用して染色体レベルのスキャフォールドに使用しました。
アセンブリ品質はQuast (Mikheenko et al., 2018)を用いて評価した。遺伝子アノテーションはRASTtk (Brettin et al., 2015)を用いて実施した。
ゲノムを亜種にクラスタリングする
すべてのパブリックなBacteroidesとPrevotellaのゲノムは、プログラムncbi-genome-download (https://github.com/kblin/ncbi-genome-download)を使用して、2021年1月26日にNCBI GenBankからダウンロードした。Bacteroidesについては、RefSeqで「代表ゲノム」とされたゲノム（n=53）、Genbankでアセンブリレベル「完全ゲノム」または「染色体」とされたゲノム（n=71）すべてを、さらなる解析のために保持した（総ゲノム数1,229個のうち保持ゲノム数は113個）。Prevotellaについては、利用可能なすべてのパブリックゲノムを保持した（n=368）。パブリックゲノムは、FastANI (Jain et al., 2018)に従って≧98%のANIと≧65%のアライメントカバレッジを持つゲノムが同じ「亜種」とみなされるように、dRep v3.2.1(Olm et al., 2017) を用いてコマンド「dRep dereplicate -S_algorithm fastANI - sa 0.98 -SkipMash -nc 0.65」を使用して、研究で回収した分離ゲノムと共にクラスタリングした。これらの特定の閾値は、報告されたANIおよびアライメントカバレッジ値のヒストグラムに基づいて手動で選択された。代表的なゲノムは、dRepのデフォルトのスコアリングシステムを使用して、以下の調整を加えて選ばれました：Refseqで「代表ゲノム」としてマークされた公開ゲノムには、さらに50ポイントが与えられ、本研究で回収されたゲノムには、さらに200ポイントが与えられました。
亜種の有病率の評価と系統解析
メタゲノミックリードは、Merrill et. al. (Merrill et al., 2022) からダウンロードした（他のすべての集団）。メタゲノミックリードは、Bowtie2（Langmead and Salzberg, 2012）を用いてPrevotellaおよびBacteroides亜種代表ゲノムにマッピングし、得られた.bamファイルはinStrain（Olm et al., 2021）を用いてプロファイリングされた。ゲノム幅65%以上で検出されたゲノムは、メタゲノムに「存在」しているとみなした。各集団における各ゲノムの有病率は、そのゲノムが検出されたメタゲノム数の割合として算出した。少なくとも1つのメタゲノムで検出されたBacteroidesおよびPrevotella亜種の代表ゲノムについて、GTOree v1.5.36 を用い、コマンド "GToTree -H Bacteria" ですべての系統樹を作成した。各ツリーには、異なる属のアウトグループも1つずつ含まれた。木の葉はGTDB taxonomy release 202 (Chaumeil et al., 2020)に基づいてラベル付けし、場合によってはゲノムをGenBankに寄託されているのとは別の属に属するものとして分類しているものもある。木はiTol (Letunic and Bork, 2021)を用いて可視化した。
CAZymeアノテーション
CAZymeのアノテーションは、各単離株に対して行われた。NCBIで入手可能なPrevotella copriの追加20株（アセンブリレベルは可変）についても、単離株と2つのモデル株との比較のためにアノテーションを行った。すべてのアミノ酸配列は、まずBlastP（バージョン2.3.0+）（Camachoら、2009）を用いて、CAZyデータベース（2021年9月）（Drulaら、2022）に保存されている全長配列と比較された。100%のカバー率、50%以上の配列同一性、E値≦10-6を得たクエリーは、最も近い参照ホモログと同じドメイン構成で自動的にアノテーションされた。残りのすべての配列は、各仮定モジュールの存在を確認するために、人間のキュレーションを受けた。このプロセスにおいて、キュレーターは、(i)全長タンパク質、モジュールのみ、または特徴付けられたモジュールのみのいずれかのライブラリに対するBLAST、および各CAZy（サブ）ファミリーについて社内で構築したモデルに対するHMMER version 3.1 (Mistry et al., 2013) を含むバイオインフォーマティクスツールに頼ることができた。(ii)（サブ）ファミリー間で異なる適切なカバー、配列同一性およびE値の閾値を示す人間の専門知識、最終的には触媒アミノ酸保全の確認に頼る。単離株のCAZymeレパートリーの階層的クラスタリングは、ComplexHeatmap (Gu, 2022)を用いて実施した。予測される基質の割り当ては、以前に発表された作品（Desai et al., 2016; Smits et al., 2017）からコンパイルした。
インビトロ多糖類増殖アッセイ
グリセロールストックを10%脱血ウマ血液を含むBrain Heart Infusionプレート上に打ち出し、37℃で24時間嫌気培養を行った。分離株はBHI-S（Bacteroides）およびYCFA-G（Prevotella）中で一晩継代した。16時間後、Bacteroidesは1:50、Prevotellaは1:10に希釈し、透明な平底96ウェルプレートに200uLの培地を入れた。成長培地は、YCFAバックグラウンドに0.5%の炭水化物を加えたもので、例外としてイヌリンは1.5%の濃度で添加された。OD600は、BioTek Epoch2プレートリーダーを使用して48時間、15分ごとに測定し、各測定前に30秒間振とうした。正規化ODは、各炭水化物条件について、対応する多糖類で増殖した各単離株の生のOD600から平均ブランクOD600を差し引くことによって計算した。最大ODは、最初の24時間における最も高い正規化ODとして計算された。
Gnotobioticマウスのコロニー形成と菌数測定
B. thetaiotaomicron H-2622のコロニー形成には、BHI-Sで16時間培養した3mL培養液300uLをマウスに飲ませた。P. copriのコロニー形成には、YCFACで16時間培養し、BHIBAで48時間培養したP. copriを10〜15芝（マウス1匹あたり〜）懸濁した3mL培養液300uLをマウスに投与した。Prevotellaのコロニー形成のため、投与12時間前にマウスケージから餌を除去し、寝具を交換した。プレボテラを投与する前に、マウスは300uLの10%炭酸水素ナトリウム水溶液でガベージされた。餌は投与2時間後に戻した。
バイコロナイゼーション実験では、まずマウスにPc H-2477をコロニー形成させ、7日後にBt H-2622をギャベッジした。バイコロナイゼーションは5-7日間安定させた後、食餌を切り替えた。個々のマウスから糞を採取した。1μlの糞の2つの生物学的複製物を200μlの滅菌PBSに再懸濁し、1：10に連続希釈し、各希釈液2μlをBHIBA上にプレーティングした。37□℃で36時間嫌気性増殖させた後、CFUをカウントした。
In Vivoコンペティションアッセイ
個々のマウスから糞を採取した。DNeasy PowerLyzer PowerSoil kit（Qiagen）を用いて、糞便ペレットの2生物学的複製物からゲノムDNAを抽出した。PcおよびBt DNAの濃度は、種特異的なqPCRプライマー（Key Resources Table）を用いて評価した。qPCRは、Brilliant III, Ultra Fast SYBR Green QPCR Master MixおよびBio Rad CFXサーモサイクラーを用いて実施した。Bt H-2622およびPc H-2477のゲノムDNAを使用して、各プライマーペアの標準曲線を作成した。標準曲線は、サンプル中のBtまたはPc DNAの絶対量の算出に使用された。各プライマーペアの効率値（E）は、Ct値に対するlog10（DNA投入量）の10（1/-勾配）として計算した。競合指数は、以下の式で計算した。 Pcプライマーペア/Btプライマーペア。競合指数が1であれば、存在量が等しいことを示す。
マウスの飼料
イヌリン-gおよびNo MAC-g飼料は、No MAC飼料（TD.150689）の炭水化物含有量に合わせ、AIN-93G Basal Mix（CHO、セルロースフリー）32％および炭水化物68％を使って作成した。Basal Mixと炭水化物成分は、水（Basal Mix 250gパッケージあたり1100ml）とバインダーとして5％の牛ゼラチンの混合液に懸濁させました。炭水化物（100％グルコース、MAC-gなし；50％グルコースと50％イヌリン、Inulin-g）およびゼラチンをMilliQ水に別々に溶解し、オートクレーブで処理した。組織培養フード内で炭水化物溶液にゼラチンミックスとAIN-93G Basal Mix (CHO, Cellulose Free) (TD.200788) を加え、4℃にて固化させた。飼料は主要資源表に記載されている。コロニー形成後1週間後に標準チャウを除去し、目的の試験飼料に交換し、寝床を交換した。ゼラチンチャウは、チャウが乾燥したため、3日ごとに交換した。
RNAseq
RNeasy PowerMicrobiome Kit（Qiagen）を用いて、マウスの糞便内容物およびin vitroの培養物からRNAを抽出した。リボソームRNAの枯渇は、RiboMinus™ Transcriptome Isolation Kit (Invitrogen)を用いて行った。TruSeq® Stranded Total RNA Library Prep Human/Mouse/Ratキットを用いてcDNAライブラリーを構築した。シーケンスはNovaSeq SPフローセルを用いて実施した。
生リードの品質は、コマンド「multiqc」(Ewels et al., 2016)を用いてMultiqcで評価した。アダプタは、Trimomaticとコマンド「trimomatic PE ILLUMINACLIP - PE.fa:2:30:10 LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36 」（Bolger et al.、2014）を使用してトリミングした。HiSAT2コマンド「hisat2-build」でインデックスを生成し、「hisat2 -p 8 --dta -x」でインデックスにリードをアライメントして、Pc H-2477およびBt H-2622ゲノムにリードを揃えた（Kim et al.、2019年）。SAMtoolsを使用して、" samtools sort -@ 8 -o "と" samtools index "のコマンドで.bamファイルを生成した（Danecek et al.、2021）。Stringtieコマンド "stringtie", "stringtie-merge", "stringtie -e -B -p 11 -G" (Pertea et al., 2016) を用いて転写物をアセンブルした。差分発現はDESeq2 (Love et al., 2014)を用いて解析しました。
謝辞（Acknowledgements
Bryan Merrill、Madeline Topf、Michelle St.Ongeの技術サポート、Gabriela Gall Rosaの解析支援、Samuel Lancaster、Brittany Sison、Audrey ZhangのRNAseqデータ処理支援、Michael FischbachとNiokhor DioneのP. copri N-01提供、Brian YuとRose Yanの配列決定サポート、David Schneiderのアドバイスと組織培養フード使用、Bernard HenrissatのCAZyme注釈への助⾔を得た。
R.H.G.は、NIH/NHGRI T32 training grant (5T32HG000044-23) およびBlavatnik Family Fellowshipの支援を受けています。この研究は、J.L.S.へのNIHからの助成金（R01-DK085025、DP1-AT009892）の支援を受けています。J.L.S.はChan-Zuckerberg Biohubの研究者である。
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投稿日：2023年03月09日
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