幼若マウスの敗血症モデルにおいて糞便微生物叢移植により回復した腸内細菌叢の保護効果

はじめに 糞便微生物叢移植（FMT）によりバランスのとれた健康な腸内細菌叢を回復させることは、現時点ではエビデンスが不足しているにもかかわらず、敗血症の治療選択肢となる可能性を秘めている。本研究では、幼若マウスを用いた敗血症モデルを用いて、腸内細菌叢との関連から敗血症に対するFMTの効果を検討することを目的とした。

方法 3週齢の雄マウスを抗生物質投与群（ABX）、ABX-FMT群、対照群の3群に分けた。ABX群とABX-FMT群には抗生物質を7日間投与した。ABX-FMT群では、その後7日間にわたり経口投与でFMTを行った。14日目に、すべてのマウスは、腹部敗血症を誘発するために盲腸結紮穿刺（CLP）を受けた。血中サイトカインレベルと糞便微生物叢の組成を分析し、CLP後7日間の生存率をモニターした。

結果当初、糞便微生物叢はバクテロイデーテス門とファーミキューテス門が優勢であった。抗生物質摂取後は、真菌類が極端に優勢となった。FMTは抗生物質が誘発した糞便内不健全症の回復に成功した。CLP後、ABX-FMT群と対照群ではバクテロイデーテス門が極めて優勢となった。微生物叢のα多様性は抗生物質摂取後に減少し、FMT後に回復し、CLP後に再び減少した。ABX群では、インターロイキン-1β（IL-1β）、IL-2、IL-6、IL-10、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、腫瘍壊死因子-α、C-X-Cモチーフケモカインリガンド1の濃度が、他の群に比べてより急速に、より高い程度で増加した。ABX群の生存率は他の群（85.7％）に比べ有意に低かった（20.0％）。

結論 FMTによる微生物叢の回復が敗血症に対する防御効果を示した。本研究は、幼若マウス敗血症モデルにおけるFMTの有効性を独自に検証するものであり、重症小児の臨床研究に示唆を与える可能性がある。

1 はじめに

健康な腸内細菌叢は宿主と共生し、病的微生物のコロニー形成を抑制し、免疫調節と恒常性維持に寄与している(1)。腸内細菌叢は、腸の状態に限らず様々な疾患で変化を起こす。腸内細菌叢の組成や多様性の好ましくない不均衡は、敗血症を含む重篤な疾患に関与していると考えられている(2)。腸内細菌叢が疾患の進行に影響を及ぼす正確なメカニズムは完全には解明されていないが、これらの不均衡が健康や疾患に重大な影響を及ぼすことは明らかである。腸粘膜の完全性が損なわれると、腸内細菌叢の移動が起こり、病気の発症をさらに助長する可能性がある(3)。

重篤な疾患患者に頻繁に使用される抗生物質は、宿主の微生物叢を一時的に変化させ、免疫に影響を及ぼす(3)。小児集中治療室（PICU）患者の58〜74％が抗生物質を投与されている(4 -6)。89％が抗生物質を投与されているPICU患者の微生物叢を健康な小児および成人のそれと比較した研究では、PICU患者では微生物叢の多様性と量が減少していることがわかった。微生物叢の50％以上が支配的な病原体で構成され、微生物叢の地域差は減少していた(7)。

敗血症は経済的負担が大きいにもかかわらず致死率が高く、世界中で年間500万人が死亡している(8,9)。医療設備の整った国であっても、敗血症による死亡率は依然として高く、特に小児の死亡率は21～40％である(10)。侵襲性感染に対する宿主の免疫調節障害は、敗血症のメカニズムとして知られている(11)。敗血症ガイドラインでは、予防、早期の抗生物質投与、効果的な灌流維持が強調されている(12 -14)。しかし、これらのガイドラインには過去10年間、画期的な変化は見られない(15)。免疫学における非臨床研究では、敗血症に対する潜在的な治療法が提唱されているが(16)、最近の大規模臨床研究では、これらのアプローチの多くは概して効果がないことが判明している(15)。したがって、敗血症の新たな治療法を発見するためには、さらなる研究が早急に必要である。

微生物叢と疾患との関連は、敗血症の代替治療法を提供する可能性を秘めている。特にPICU患者の抗生物質使用率が高いことを考慮すると、健康な微生物叢を維持または回復させることが敗血症治療に寄与するかどうかを明らかにすることは極めて重要である。

健康な腸内細菌叢を維持・回復するための治療法としては、経腸栄養やプレバイオティクスやプロバイオティクスの補充がかなり以前から提案されているが（17,18 ）、糞便微生物叢移植（FMT）は、健康な腸内細菌叢に似た組成と多様性をより直接的に獲得できるようである（19 ）。マウスの鼻腔に肺炎球菌を接種した研究では、抗生物質投与後のFMT群では、肺細菌数、腫瘍壊死因子α（TNF-α）、インターロイキン-10（IL-10）レベルが正常化した（20）。しかし、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）性大腸炎患者を対象とした研究や限られた症例報告を除けば、重症患者を対象としたFMTに関する大規模な臨床研究はこれまで行われていない(21 -24)。

クロストリジウム・ディフィシル大腸炎に対して行われたFMTの重篤な合併症はまれである(25)。しかし、特に免疫不全患者や、FMT中に上部消化管経由で微生物を吸引した場合には、ドナー微生物からの転座感染のリスクがある。また、大腸内視鏡によるFMTを実施する場合には、手技による合併症の可能性も考慮しなければならない。したがって、臨床研究をデザインするためには、より多くの実験的エビデンスが不可欠である。特に、小児敗血症におけるFMTの研究では、具体的な適応、時期、期間、投与量、潜在的な重篤な合併症に関する事前の調査が必要である。

本研究では、抗生物質による既存の腸内細菌叢の破壊に続いて、FMTにより治療的に獲得した腸内細菌叢が、幼若マウスの敗血症モデルにおいて保護効果を発揮するかどうかを調べることを目的とした。得られた知見を既存の非臨床および臨床研究と比較し、敗血症を含む重篤な疾患を有する小児を対象とした臨床研究のデザインに役立てる。

2 方法

本研究の実験過程は、韓国ソウル大学広域河川免疫学研究所と共同で実施した。マウス臓器組織の病理染色および顕微鏡判読は、韓国のKorea Non-Clinical Technology Solution Centerの協力を得て実施した。研究デザインの概略を図1に示す。詳細な方法はオンラインサプリメントに記載されている。

図1

図1. 試験デザイン。ABXは抗生物質治療；CLPは盲腸結紮穿刺；FMTは糞便微生物叢移植。

2.1 実験動物

米国マサチューセッツ州ウィルミントンのCharles River Laboratoriesから入手した、特定病原体を持たない3週齢の雄性C57BL/6NCrlOriマウスを用いた。3日間の馴化期間の後、動物実験はソウル大学医科大学のInstitutional Animal Care and Use Committee（SNU-191010-5-1およびSNU-210514-1）に従って実施した。

成長期のマウスの生存率に直接影響する可能性のある体重の停滞や減少を防ぐため、実験開始から盲腸結紮穿刺（CLP）処置まで高脂肪食（TD.06414、Envigo、インディアナポリス、米国：脂肪60％、タンパク質20％、炭水化物20％；5.1kcal/g）を投与した。その後、すべてのマウスを標準食に切り替えた。

2.2 抗生物質投与

ABX群またはABX-FMT群のマウスには、実験開始（0日目）から7日間、4種類の抗生物質（アンピシリン1g/L、ネオマイシン1g/L、ストレプトマイシン1g/L、バンコマイシン0.5g/L；いずれもSigma Aldrich, St.）

2.3 FMT

対照群のマウスを移植ドナーとした。排便時に無菌条件下で採取した新鮮な糞便ペレットを、PBS1mLあたり1個の割合でリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に懸濁し、ボルテックスした。FMTは、抗生物質の摂取が終了した実験8日目（7日目）から、1日1回、7日間連続で投与した。ABX-FMT群のレシピエントマウスは30分間絶食した後、少なくとも3匹のドナーマウスの糞便上清を体重に基づいて500mg/kgの用量で経口投与した。一方、ABX群または対照群マウスは、同じく30分間絶食させた後、ダルベッコPBSを経口投与した（500mg/kg）。

2.4 CLP法

FMT終了後、実験15日目（14日目）に、一般的なガイドライン（26,27 ）に従い、すべてのマウスにCLPを行った。術後、赤外線ランプを用いてCLP後6時間まで体温を維持した。各被験者の死亡は、CLP後3、4、6、18、24時間後に確認され、その後CLP後7日目（21日目）まで24時間ごとに確認された。CLP後24時間に発生した死亡は、CLPによる敗血症に起因するものとした。

2.5 採血と炎症バイオマーカーの分析

採血はCLP直前、CLP後6時間および12時間の計3回行った。IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、インターフェロン-γ（IFN-γ）、TNF-α、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、およびC-X-Cモチーフケモカインリガンド1（CXCL1）を含むサイトカインは、Bio-Plex 200システム（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）を用いたマルチプレックスイムノアッセイで定量した（28）。

2.6 採便と細菌DNA抽出、PCR増幅、塩基配列決定

全マウスの便を0日目、7日目、14日目、16日目に採取した。DNA 抽出は QIAamp DNA Stool Mini Kit（Qiagen、Germantown、MD、USA）を用い、製造者の指示に従った（29,30 ）。抽出されたDNAの収量は、Thermo Fisher Scientific社（米国マサチューセッツ州ウォルサム）のNanoDrop 2000分光光度計とQubit 3.0蛍光光度計を用いて測定した(29)。

抽出したDNAは、細菌16S rRNA遺伝子のV3およびV4領域をターゲットとするアンプリコンPCRの鋳型として使用した。16Sメタゲノムシーケンシングライブラリーは、Illumina 16S Metagenomic Sequencing Library Preparationプロトコル（Illumina、米国カリフォルニア州サンディエゴ）(29)に従って調製した。Each PCR was duplicated using primer pairs with Illumina overhang sequences and inner tags: forward 5’-CGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3’ and reverse 5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3. 2×250bpのIllumina MiSeqペアエンドシーケンス実行後、ベースコールを行い、同じバーコードを持つリードを収集し、装置上でそれぞれのサンプルに割り当て、Illumina FASTQファイルを作成した(29)。

2.7 小腸の抽出と組織学的検査

CLP後7日目に生存マウスを犠牲にした後、小腸を外科的に分離し、PBSで洗浄し、10％中性緩衝ホルマリン（Sigma、HT501128）で固定した。その後、自動組織処理とパラフィン包埋を行い、ミクロトームを用いてパラフィンブロックを3μm厚に切片化した。切片をスライドガラスにマウントし、ヘマトキシリン・エオジン（H&E）で染色した。染色した小腸を光学顕微鏡（BX53、オリンパス、日本）で観察した。小腸および腸間膜で観察された病変は記録され、その重症度に基づいて半定量的に評価され、最小、軽度、中等度、重度の4段階に分類された。

2.8 統計分析

データは平均値±標準偏差で示した。統計解析にはGraphPad Prism version 9.5.1（GraphPad Software, Boston, MA, USA）を使用した。アルファ多様性（シャノン指数およびシンプソン指数）はExcel（Microsoft, Redmond, WA, USA）を用いて評価した。ベータ多様性は、XLSTATバージョン2023.2.1（Lumivero, Denver, CO, USA）を用いて、非類似度のブレイ・カーティス距離またはユークリッド距離に基づく非計量多次元尺度法（NMDS）プロットにより解析した。Kaplan-Meier生存曲線をlogrank（Mantel-Cox）検定を用いて比較した。

2つの平均値の比較には両側Welchのt検定を用い、3つ以上の平均値間の差の分析にはDunnettのT3多重比較検定を用いたBrown-Forsythe/Welch分散分析を用いた。特定のグループ間の差を明確に対比するために、ウェルチのt検定の結果は結果のセクションで強調されている。このアプローチは、細菌の相対存在量、シャノン指数、サイトカインレベルの分析にも適用された。2つの平均値間の有意な比較については、エクセルで効果量（Cohen's d）とその95%信頼区間を計算した。病的炎症の重症度をグループ間で比較するために、Mann-Whitney U検定を用いた。統計的有意性はp<0.05とした。

3 結果

3.1 初期糞便微生物叢

すべての被験者の初期糞便微生物叢（0日目）は、バクテロイデーテス（Bacteroidetes）（60.7％）、ファーミキューテス（Firmicutes）（28.8％）、プロテオバクテリア（Proteobacteria）（3.7％）、疣贅菌（Verrucomicrobia）（2.5％）を含む優占門（＞1％）を示した。0日目の便微生物叢の門、クラス、属、種レベルの組成は、各群間で差はなかった（図2）。

図2

図2. 群別および実験日別にプロットした糞便微生物叢の組成。(A）糞便微生物叢の門レベルでの組成。(B）クラスレベルでの糞便微生物叢の組成。(C）属レベルでの糞便微生物叢の組成。(D）種レベルでの糞便微生物叢の構成。ABXは抗生物質治療、FMTは糞便微生物叢移植。

3.2 抗生物質摂取7日後の糞便微生物叢

抗生物質を混合した水の摂取量を測定した結果、ABX群のマウスはアンピシリン、ネオマイシン、ストレプトマイシンを98.6mg/kg/日、バンコマイシンを49.3mg/kg/日、ABX-FMT群はアンピシリン、ネオマイシン、ストレプトマイシンを105.8mg/kg/日、バンコマイシンを52.9mg/kg/日、いずれも7日間摂取した。

抗生物質摂取の影響を評価するため、7日目の糞便微生物叢を分析した（図2）。注目すべきことに、0日目と7日目の間の糞便微生物叢の有意差はABX群で観察された。7日目、ABX群は0日目と比較して、p:ファーミキューテス属、c:バチルス属、g:エンテロコッカス属、ラクトコッカス・フジエンシス属、膣コッカス・ペナイ属を含む様々な分類群において高い相対存在量を示した。逆に、p:Bacteroidetes、p:Tenericutes、p:Actinobacteria、c:Clostridia、Bacteroides vulgatus、Bacteroides stercorirosoris、Parabacteroides goldsteinii、Pediococcus argentinicus、Lactobacillus johnsoniiを含む分類群の相対存在量は、0日目と比較して7日目に低かった（図3Aおよび補足表S1）。ABX-FMT群では、0日目から7日目にかけての糞便微生物叢の変化はABX群と同様であった（図3Aおよび補足表S2）。逆に対照群では、p:Proteobacteriaの相対量が0日目に比べて7日目に低下した以外は、糞便微生物叢に有意な変化は認められなかった（図3Aおよび補足表S3 ）。

図3

図3. 各群の糞便微生物叢における各優占門の相対存在量。棒グラフは各群の平均値を示し、エラーバーは平均値に1標準偏差を加えた値を示す。Y軸は各門の相対的存在量を表す。(A）各群における糞便微生物叢の各優占門の存在量の経時的変化。(B）7日目の糞便微生物叢を構成する各優占門の相対存在量を各群間で比較したもの。(C）14日目の糞便微生物叢を構成する各優占門の相対量を各群間で比較。ABX：抗生物質治療、FMT：糞便微生物叢移植。アスタリスクは統計的有意性を示す： *p< 0.05、***p < 0.01、***p < 0.001、***p < 0.0001（両側Welchのt検定による）。

全群の0日目の微生物叢と対照群の7日目の微生物叢が類似していることから、7日目の対照群とABX群またはABX-FMT群の区別は、抗生物質投与前後でABX群で観察された前述の変化を反映していた（図3Bおよび補足表S4 ）。

3.3 FMT7日後の糞便微生物叢vs. 抗生物質摂取後の介入なし

ABX-FMT群では、7日間の抗生物質摂取後に7日間のFMTを行ったが、糞便微生物叢に最も複雑な変化がみられた（図2）。14日目には、p:Bacteroidetes、p:Proteobacteria、p:Tenericutes、p:Actinobacteria、c:Clostridia、Bacteroides vulgatus、Bacteroides stercorirosoris、Parabacteroides goldsteinii、Alkaliphilus crotonatoxidansを含む様々な分類群の相対量が7日目に比べて顕著に増加した。逆に、14日目には、ABX-FMT群の糞便微生物叢におけるp:Firmicutes、c:Bacilli、g:Enterococcus、Lactococcus fujiensis、およびVagococcus penaeiの相対存在量は、7日目に比べて低下した（図3Aおよび補足表S2）。

それ以上の介入を行わなかったにもかかわらず、ABX群では糞便微生物叢にさらなる変化がみられた（図2）。14日目には、ABX群の糞便微生物叢において、p:Verrucomicrobia、p:Actinobacteria、c:Clostridia、g:Rubritalea、Akkermansia muciniphila、Escherichia albertiiの相対量が7日目に比べて顕著に増加した。逆に、ABX群の糞便微生物叢におけるp:ファーミキューテス属、c:バチルス属、g:エンテロコッカス属、ラクトコッカス・フジエンシス属、およびヴァギコッカス・ペナエイ属の相対量は、7日目に比べて14日目に低かった（図3Aおよび補足表S1）。

14日目、FMT-ABX群の糞便微生物叢は対照群（FMTドナー）のそれと酷似していた。対照的に、ABX群とABX-FMT群の間の糞便微生物叢には顕著な差が明らかになった。具体的には、ABX群ではABX-FMT群および対照群に比べ、p:Bacteroidetes、g:Alkaliphilus、g:Lactobacillus、Bacteroides vulgatus、Bacteroides stercorirosoris、Parabacteroides goldsteiniiを含む様々な分類群の相対存在量が低かった。逆に、14日目のp:Verrucomicrobia、p:Proteobacteria p:Actinobacteria、c:Clostridia、g:Rubritalea、g:Prosthecobacter、Akkermansia muciniphila、Escherichia albertiiの相対量は、ABX群ではABX-FMT群および対照群に比べて高かった（図3Cおよび補足表S5）。

3.4 抗生物質摂取後のCLP誘発敗血症における糞便微生物叢、その後のFMTの有無FMT7日後vs. 抗生物質摂取後の介入なし

CLPの2日後である16日目に、対照群ではそれまでの14日間には見られなかった糞便微生物叢の変化が現れた（図2）。ABX群の糞便は死亡率が高く、16日目に生存していた被験者の排便がなかったため採取できなかった。16日目、対照群ではp:Bacteroidetesと Bacteroides vulgatusの相対量が14日目に比べて増加していた。逆に、p:Firmicutes、p:Actinobacteria、Parabacteroides goldsteinii、Alkaliphilus crotonatoxidans、Pediococcus argentinicus、Lactobacillus johnsoniiの相対量は、14日目に比べて16日目に減少した（図3Aおよび補足表S3）。この期間中、ABX-FMT群における糞便微生物叢の変化は対照群と同じであった（図3Aおよび補足表S2 ）。

3.5 糞便微生物叢の多様性の違いと変化

対照群では、シャノン指数とシンプソン指数が0日目、7日目、14日目と比較して16日目のみ低く、CLP後のα多様性の減少を示していた（図4A ）。ABX-FMT群とABX群では、7日目のこれらの指数が0日目に比べて低下しており、抗生物質摂取後のα多様性の減少が示唆された。ABX-FMT群では、7日目に比べて14日目の指標が上昇し、FMT後の回復を示した。しかし、CLP後、ABX-FMT群では、対照群と同様に、シャノン指数が再び低下した。ABX群では、14日目の指数は0日目の指数より低いままであった（図4B、C）。

図4

図4. 糞便微生物叢のシャノン指数とシンプソン指数。データは個々の値として示され、長短の横棒は平均値＋1標準偏差を表す。Y軸はパネルによってシャノン指数またはシンプソン指数を表す。(A）対照群のシャノン指数とシンプソン指数の経時変化。(B）ABX-FMT群のシャノン指数とシンプソン指数の経時的変化。(C）ABX群のシャノン指数とシンプソン指数の経時的変化。(D）7日目と14日目の各群間の糞便微生物叢のシャノン指数またはシンプソン指数の比較。ABXは抗生物質治療、FMTは糞便微生物叢移植。アスタリスクは統計的有意性を示す： *p< 0.05、***p < 0.01、***p < 0.001、***p < 0.0001（両側Welchのt検定による）。

0日目には、3群間でシャノン指数とシンプソン指数に差はなかった。7日目には、ABX-FMT群とABX群の両方が対照群より低い指数を示した。FMT後14日目には、ABX-FMT群は対照群と比較してシャノン指数とシンプソン指数に差は見られなかった。しかし、ABX群の指数はABX-FMT群および対照群よりも低いままであった（図4D）。

Bray-Curtis距離またはユークリッド非類似度距離に基づくNMDSプロットは、上記のようにABX群と対照群の対比を描写した。プロットはまた、時点によってABX-FMT群とABX群または対照群との類似性または非類似性を示した（図5）。

図5

図5. 糞便微生物叢全体のβ多様性。(A）非類似度のBray-Curtis距離に基づくノン・メトリック多次元尺度プロット。(B）非類似度のユークリッド距離に基づくノン・メトリック多次元尺度構成図。ABX：抗生物質治療、D0：0日目、D7：7日目、D14：14日目、D16：16日目、FMT：糞便微生物叢移植。

3.6 CLP後の血清サイトカイン濃度の変化

CLP前の時点で、ABX-FMT群の2人の被験者のサンプルはエラーにより除外された。CLP前の時点で、ABX-FMT群の7人の被験者のうち2人のほとんどのサイトカインの血清濃度は、他の5人の被験者と有意な差を示した： IL-1β（除外された2人の平均[pg/ml]、1393.8；他の5人の平均[pg/ml]、3.8）、IL-6（9486；0.1）、IL-10（9669；6.8）、TNF-α（196；0）、GM-CSF（874；0）、およびCXCL1（24330；9.1）。したがって、これらの検体は汚染や劣化の可能性があるため信頼性が低いと判断し、ABX-FMT群のすべてのCLP前サイトカインの分析から除外した。

CLPの直前に測定されたIL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α、GM-CSFの濃度は、ABX群では非常に低く、対照群では高かったが、この差は統計的に有意ではなかった。ABX群では、IL-1β（CLP前vs.6時間、p＝0.0111；6時間vs.12時間、p＝0.0122）、IL-6（p＜0.0001；p＝0.0379）、IL-10（p＝0.0101；NS）、IFN-γ（p＝0.0017；NS）、TNF-α（p＝0. 0486；NS）、GM-CSF（p＝0.035；p＝0.0456）、およびCXCL1（p＜0.0001；p＜0.0001）は、IL-10、IFN-γ、およびTNF-αを除いて、CLPの6時間後に増加したが、その後6時間にわたって減少した。ABX-FMT群では、ABX群と比較してサイトカインの増加がより緩やかで比較的小さかった。IL-1β（p＝0.0002）、IL-2（p＝0.0022）、IL-4（p＝0.0192）、IL-6（p＝0.0083）、IL-10（p＝0.0126）、IFN-γ（p＝0.0428）、TNF-α（p＝0.02）、GM-CSF（p＝0.0021）、CXCL1（p＝0.0092）の濃度は、CLP前よりもCLP12時間後の方が高かった。このうち、IL-6（p＝0.0469）、IL-10（p＝0.0034）、CXCL1（p＝0.0065）の濃度は、CLP後6時間は上昇したが、その後の6時間は低下しなかった。対照群では、CLP後12時間で、IL-6 (p= 0.0323)、IL-10 (p= 0.0011)、CXCL1 (p= 0.0004)の濃度がCLP前と比較して上昇し、IFN-γ (p= 0.0337)はCLP後6時間よりも高い濃度を示した(図6)。

図6

図6. CLP直前から12時間後までの各群の血中サイトカイン濃度（pg/ml）の変化。灰色の横棒は平均値を示し、縦線は平均値に1標準偏差を加えた値を示す。サンプルサイズ：CLP前のABX-FMT群（n＝5、サンプルエラーのため2人を除外）を除き、全群の全時点でn＝7。ABXは抗生物質治療；CLPは盲腸結紮穿刺；CXCL1はC-X-Cモチーフケモカインリガンド1；FMTは糞便微生物叢移植；GM-CSFは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子；IFNはインターフェロン；ILはインターロイキン；TNFは腫瘍壊死因子。アスタリスクは統計的有意性を示す： *p< 0.05、***p < 0.01、***p < 0.001、***p < 0.0001（両側Welchのt検定による）。色つきの点線は同一グループ内での時間間の比較を表し、黒の実線は同時刻でのグループ間の比較を表す。

CLPの6時間後、IL-1β（ABX対コントロール、p＝0.0116；ABX対ABX-FMT、p＝0.0116）、IL-2（p＝0.0172；p＝0.0230）、IL-6（p＝0.0086；p＝0.0001）、IL-10（p＝0. 0113；p＝0.0115）、GM-CSF（p＝0.0362；p＝0.0359）、TNF-α（NS；p＝0.0497）、およびCXCL1（p＜0.0001；p＜0.0001）は、ABX群の方が対照群またはABX-FMT群よりも高かった。CLPの12時間後、ABX群のIL-6（p＝0.0392；p＝0.0388）、IL-10（p＝0.0452；p＝0.0428）、CXCL1（p＝0.0489；p＝0.0482）の濃度は、対照群またはABX-FMT群の濃度を上回った。CLPの12時間後にABX-FMT群のIL-2濃度が対照群のそれよりも高かったこと（p= 0.0487）以外は、各時点での各サイトカイン濃度にABX-FMT群と対照群の間に有意差は認められなかった（図6）。

サンプルサイズが小さいためか、標準偏差が比較的大きいものがあったため、統計的有意差（p< 0.05）に達した比較について、Cohenのdとその95％信頼区間を用いて効果量を推定した。そのような比較はすべて大きな効果量（Cohenのd > 0.8）を示し、群間に実質的な差があることを示した（補足表S6 ）(31)。

3.7 CLP誘発敗血症による死亡率

CLP後の生存率は、ABX群、ABX-FMT群、対照群でそれぞれ20.0％（5人中1人）、85.7％（7人中6人）、85.7％（7人中6人）であった（ABX対対照、p＝0.0267；ABX対ABX-FMT、p＝0.0461）（図7）。ABX群ではCLP後3時間以内に死亡した2例が生存解析から除外された。

図7

図7. Kaplan-Meier生存曲線。サンプルサイズ：ABX群ではn=5（早期死亡2例は脱落）、その他の群ではn=7。ABX、抗生物質治療；FMT、糞便微生物叢移植、*p < 0.05。

3.8 小腸の病理組織学的評価

各腸の組織学的所見を表1に詳しく、表2にまとめ、図8に写真で示した。生存率が最も低かったABX群では、1匹のマウスの小腸と腹膜の2回の顕微鏡検査で好中球、マクロファージ、リンパ球、形質細胞の浸潤が確認され、炎症の程度は軽度、中等度が1回ずつ認められた。ABX-FMT群では、6匹のマウスの12回の顕微鏡検査で、好中球とマクロファージが各9回、リンパ球が6回、好酸球と形質細胞が各1回観察された。この群では、炎症の程度は、なし3例、軽微2例、軽度6例、中等度1例であった。対照群では、6匹のマウスから12回の顕微鏡検査で、マクロファージが8回、好中球とリンパ球が各6回、形質細胞が5回、好酸球が1回観察された。このグループの炎症の程度は、なし4例、軽微4例、軽度2例、中等度2例であった。Mann-Whitney検定では、群間の炎症に有意差は認められなかった。

表1

表1. 小腸の病理組織学的所見。

表2

表2. 小腸および腹膜に観察された炎症性病変の組織学的重症度レベル。

図8

図8. 炎症細胞の浸潤の程度を示す各群の代表的組織像。(A）粘膜固有層における炎症細胞の浸潤。(B）腹膜炎を示す腸間膜の炎症細胞浸潤。注釈：好中球（太い短矢印）、形質細胞（長矢印）、マクロファージ（太い開矢印）、リンパ球（矢頭）。染色： H&E。倍率：400倍： ×400倍；スケールバー＝25μm。ABX：抗生物質治療；FMT：糞便微生物叢移植。

4 考察

本研究では、幼若マウスにおける腸内細菌叢異常に対する抗生物質の影響と、敗血症に対するFMTの保護的役割について検討した。幼若マウスはマイクロバイオームの多様性が低く、敗血症感受性が高いことが特徴であり、小児科研究における臨床的関連性を考慮して選択された。

この研究のために標準食を用いた予備実験では、CLP後48時間以内にかなりの数のマウスが死亡したため、生存解析から除外した。いずれの抗生物質投与群も、特に抗生物質投与中は摂餌量と体重増加率が低下した。体重が20gを超えるマウスでは、体重と予期せぬ早期死亡や最終的な生存率との間に明確な関連性は認められなかったにもかかわらず、CLP当日の体重が19～20g未満のグループのマウスは死亡率が高かった。体重不足に関連する懸念に対処するため、初期体重が9g以上のマウスを登録すること（3週齢の雄マウスの平均体重が約12g、平均から2標準偏差を引いた値が約7gであることを考えると、特に排他的な選択ではない）（32 ）（2）、経口投与前の絶食時間を短くすること（3）、体重に応じて麻酔量を調整すること（4）、CLP後の保温など、いくつかの対策が実施された。しかし、低体重のマウスでは原因不明の早期死亡が続いた。本試験で高脂肪食を導入したところ、0日目、7日目、14日目の各群間、および生存マウスと死亡マウスの間に体重差はなく、これらの課題を軽減することができた（補足表S7 ）。

本研究におけるFMT法は、これまでに発表された研究に基づいて設計された。ヒトの場合、FMTは通常、十二指腸または空腸にチューブを通す方法（33 ）、大腸内視鏡検査（34 ）、経口カプセル（35 ）で行われ、5～300 gの提供糞便を1回または複数回投与する（36 -38 ）。上部消化管アプローチはより簡単で苦痛も少ないが、逆流や誤嚥性肺炎のリスクが高い場合は避けるべきである。下部消化管へのアプローチでは大腸内視鏡検査が必要であり、腸の準備と腸穿孔のリスクが伴う。

マウスを用いた過去の研究では、50～200mg/kgの糞便を1～10回、1～数日の間隔で投与している。マウスでは経鼻十二指腸チューブの挿入が困難なため、上部消化管へのアプローチには、胃酸と酵素の影響を受ける経口ガベージを用いた(39,40)。下部消化管へのアクセスには、軽い麻酔をかけた浣腸法が採用された (41,42)。本試験では、FMTの効果を高めるため、500mg/kgの高用量を経口経口投与で7回行い、菌の生着に成功した。

各時点の糞便微生物叢は、先行する介入に基づく明確な特徴を示した。この研究から、糞便微生物叢には4つのタイプがあることが明らかになった(1)： CLP前の対照群ではバクテロイデーテス門とファーミキューテス門に支配された健康な微生物叢が持続していた(2)、ABX群とABX-FMT群では7日目に抗生物質誘発性の細菌叢が形成され、主に真菌類に属していた(3)、 (4)ABX-FMT群と対照群の16日目のCLP後の微生物叢は、主にバクテロイデーテス門であった（図2）。

CLP前の対照群の微生物叢は健康な腸内細菌叢と考えられた。これを検証するには、高脂肪食の影響を考慮しなければならない。約2ヶ月間の高脂肪食はマウスの腸内細菌叢を変化させるが、この研究では2週間の高脂肪食は大きな変化を起こさないと仮定した。ある研究では、肥満マウスはバクテロイデーテス（Bacteroidetes）属が少なく、ファーミキューテス（Firmicutes）属が多いことを示したが、このパターンは今回の対照群では見られなかった(43)。これまでの研究は成体マウスを対象としており、健康なマウスの糞便微生物叢の組成は研究によって異なるが、バクテロイデーテス（Bacteroidetes）属とファーミキューテス（Firmicutes）属が一貫して優勢な門であり、ヒトと類似しており、本研究における対照群の糞便微生物叢の組成と一致している（44,45 ）。さらに、対照群は高脂肪食にもかかわらずCLP前の糞便微生物叢に変化を示さなかったことから、この食事が微生物叢を有意に変化させなかったことが示唆される。高脂肪食は0日目に最初の糞便サンプルを採取する前の3日間の馴化期間中に提供されたが、微生物叢が馴化期間中にのみ有意に変化し、その後の14日間では変化しなかった可能性は低い。

この健康な腸内細菌叢は、すべてのマウスで0日目に、対照群では7日目と14日目に観察された。FMTによって、それはレシピエントの腸内で再構成され、元の組成を再現した。CLPの直前にこの糞便微生物叢を持つマウスは高い生存率を示した。この微生物叢は主にバクテロイデーテス（Bacteroidetes）とバクテロイデス（Bacteroides）から構成されており、特に炎症性腸疾患に対する抗炎症作用で知られている(46,47)。バクテロイデス属（Bacteroides vulgatus）はヒトの腸内細菌叢に広く存在し、一般的に大腸の健康に有益である(48)。研究により、炎症や腸管傷害を軽減するバクテロイデスの役割が示されているが、ヒトの免疫への影響は菌株によって異なる可能性がある(49 -51)。

バクテロイデスは、他の腸内細菌叢のメンバーとともに、パターン認識受容体（PRR）によって認識されるフラジェリン、ペプチドグリカン、リポテイコ酸、LPSなどの微生物関連分子パターン（MAMP）を産生する。PRRシグナル伝達の正確な制御は、健全な恒常性の維持に不可欠である(52)。ペプチドグリカンを含むMAMPsは全身循環に放出され、自然免疫細胞を刺激して病原体に効率的に反応させることができる(53)。バクテロイデス属細菌のLPSの化学分析から、免疫調節作用に重要な特異的構造的特徴が明らかになり、in vitroでヒトマクロファージを活性化し、病原体の侵入を防ぐことが示唆された(54)。

腸内常在菌であるバクテロイデスは、食物繊維やレジスタントスターチなどの多糖類をオリゴ糖や単糖に分解し、様々な腸内微生物によって発酵され、酢酸、プロピオン酸、酪酸などの短鎖脂肪酸（SCFA）を産生する。これらのSCFAは、腸細胞のエネルギー源として機能し、抗炎症作用を持ち、腸管免疫を調節し、腸の恒常性を維持する(55)。

バクテロイデス門（Bacteroidetes）ポルフィロモナド科（Porphyromonadaceae）のパラバクテロイデス・ゴールドスタイン（Parabacteroides goldsteinii）は、本研究で観察された健康な微生物叢の中で2番目に優勢な種として浮上した。ヒトにとって有益な常在菌として認識されており、慢性閉塞性肺疾患などの炎症性疾患に対する保護作用を示す(56,57)。

抗生物質は一般に、感受性の高い微生物を排除することで腸内細菌叢に好ましくない変化を引き起こし、耐性株の過剰増殖と優占を可能にする。このような破壊は、偏性嫌気性菌の消失とSCFAの減少をもたらし、潜在的病原体にとって好都合な環境を作り出す(58,59)。この研究では、初期糞便微生物叢における2つの優占門のうちの1つであるファーミキューテス門が、全群で有意に変化していることが観察された。抗生物質投与後、Clostridia属とBacilli属の間で顕著な不均衡が生じ、Bacilli属が全属の90％を占める支配的な属となった。主に真菌類を構成する3属はLactococcus属、Enterococcus属、Vagococcus属で、Lactococcus fujiensisが最も優勢であった。このような微生物叢組成の急激な変化には、抗生物質耐性株が寄与していると推測される。さらに、未分類種の増加も観察され、微生物叢のさらなる変化が示唆された。

抗生物質投与中止後、ABX群の糞便微生物叢は、かつては優勢であった真菌類がクロストリジウム属に置き換わり、VerrucomicrobiaとProteobacteriaが顕著に増加するなど、著しい変化を示した。ABX群の死亡率の高さは、これらの微生物に関連している可能性がある。しかし、Verrucomicrobiaの病原性を決定するのは複雑である。Akkermansia muciniphilaはムチンを分解する常在菌で、抗炎症作用がある(60,61)が、CLP-死亡率の高い群のマウスで高い存在度を示し、粘液タンパク質を減少させることで腸粘膜のバリアを損ない、炎症に関与している可能性が示唆された(62)。

Brucella、Rickettsia、Bordetella、Neisseria、Escherichia、Pseudomonas、Shigella、Salmonella、Yersiniaなど多くのヒト病原体が存在するプロテオバクテリアは、Verrucomicrobiaと比較して、腸管外疾患や腸疾患においてより重要な役割を果たしているようである(63)。高脂肪食と抗生物質摂取後に肝部分切除を行ったマウスの研究では、シュードモナス敗血症に起因する高い死亡率が観察され、シュードモナスを含む抗生物質耐性のプロテオバクテリアが糞便中に多く存在した(64)。最近発見されたEscherichia albertiiは、世界的に感染性下痢症の原因となっている可能性があり(65)、この研究では優勢な種の中で最も病原性が高いようである。Escherichia albertiiの分泌物は、毒素や接着・浸潤に関与するタンパク質などの毒性成分から構成されており、免疫反応を引き起こす。これらの成分は炎症や免疫活性化を引き起こし、感染が拡大すると全身に影響を及ぼす可能性がある(66,67)。腸間膜リンパ節や肝臓への移行がラットモデルで観察されたことから、ABX群マウスのほとんどで致死的な敗血症の原因微生物である可能性が高いことが示唆された(66)。

CLP後、生存率の高いABX-FMT群と対照群の糞便微生物叢には同様の変化が生じた。これまで優勢であったバクテロイデーテス（Bacteroidetes）とファーミキューテス（Firmicutes）の2つの門のうち、バクテロイデーテスだけが過剰に優勢となり、その結果、α多様性が大幅に減少し、宿主の生存率が高いにもかかわらず、このマイクロバイオームは病的マイクロバイオームに類似したものとなった。ABX群の糞便はCLP後に採取できなかったため、生存率の低いABX群の糞便微生物叢と比較することはできなかった。

敗血症モデルマウスの研究から、腸および腹膜病原体が血流感染のリザーバーとして機能することが明らかになり、CLP後24～48時間の糞便微生物叢の変化は、腹膜洗浄液および血液中の微生物叢の変化を反映していた(68)。16日目の糞便微生物叢におけるBacteroides属（Bacteroides vulgatusまたはBacteroides stercorirosoris）の優勢な存在は、ABX-FMT群と対照群における敗血症への関与を示唆している。ABX群については、CLP直前の糞便微生物叢に基づくと、CLP後の糞便微生物叢に関する情報がないため、敗血症に関与した病原体がClostridia、Verrucomicrobiae、Gammaproteobacteriaのいずれに属するかは不明である。しかし、他のグループとは対照的に、バクテロイデーテス門に属する病原体の可能性は非常に低いと推測される。

CLP直後のサイトカイン濃度の変化は、各群の生存成績と一致していた。ABX群では、他の群に比べ、ほとんどの炎症性サイトカインがより急速かつ顕著に増加し、より強い炎症反応が示唆された(69)。抗炎症性サイトカインであるIL-4とIL-10は、炎症反応のバランスを維持し、敗血症時の過剰な炎症による組織障害や臓器不全を予防する上で重要な役割を果たしている(70,71)。IL-4濃度に群間で有意差は認められなかったが、生存率が比較的高かったABX-FMT群では、CLP後の経時的なIL-4およびIL-10濃度の上昇が認められ、これらのサイトカインが炎症反応の調節に寄与している可能性が示唆された。逆に、ABX群ではIL-10濃度が他の群と比べて有意に高かったことから、過剰な抗炎症反応が免疫抑制につながった可能性が懸念される。

生存率の高い群と低い群との間で微生物叢に顕著な差があることから、腸内細菌叢の差に由来する敗血症を引き起こす病原性微生物の量と病原性の差が、観察されたサイトカイン応答の差に寄与している可能性がある。しかし、Welchのt検定によるサイトカイン解析では、有意な比較の中には、Cohenのdの95％信頼区間の下限が0.5を下回るものもあり、効果量の推定値にばらつきがあることが示された。このばらつきは、信頼区間が広くなりやすいサンプルサイズの小ささ（各群7例、ABX-FMT群ではCLP前に2例が除外されている）によるものと思われる。したがって、これらの比較結果は慎重に解釈されるべきである（補足表S6）。

小腸および腹膜の組織学的変化は、単純H&E染色を用いて評価した。臓器摘出の時期が死亡マウスごとに異なり、死亡に至る病理学的変化が広範囲に及ぶ可能性があることから、死亡マウスをすべて含めた場合、群間の比較は困難であった。そのため、CLP後7日間生存したマウスのみを解析し、ABX群からは1匹のみを試験に組み入れた。病理所見では、ABX群では軽度から中等度の炎症のみが認められ、炎症が全くない例や極小の例はなかった。一方、ABX-FMT群と対照群では、いくつかの症例で炎症が全くないか、あってもごくわずかで、軽度から中等度の炎症も観察された。ABX群ではサンプル数が限られていたため、統計学的有意性を決定することはできなかった。

この研究にはいくつかの限界がある。

第一に、雄マウスは一般的に約6～8週齢までは幼若とみなされるが(72)、一部のマウスは研究終了までに思春期を迎えた可能性があり、結果に影響を与える可能性がある。我々の実験では、抗生物質投与、FMT、CLPはすべてマウスが6週齢に達する前に行われた。しかし、CLP後のモニタリング期間中、マウスは6週齢を超えていたため、生殖腺の発達を評価することで、性的に成熟したマウスを解析から除外することができたかもしれない。

第二に、ABX群からCLP後の糞便を採取していないため、死亡率の高い群の糞便微生物叢の理解に限界がある。

第三に、高脂肪食は群間に有意差をもたらさず、敗血症のプロセスを阻害しないと仮定したが、この研究結果の一般化可能性には議論の余地がある。この研究では、抗生物質摂取またはFMTの各7日間が、群間で異なる条件を作り出すのに十分であると考えられた。従って、今後の研究では、標準的な食餌条件下で低体重の問題を防ぐために、より高齢の幼若マウスを登録し、試験終了まで幼若の状態を維持するために治療期間を短縮する必要がある。

第四に、サンプルサイズが比較的小さかったため、統計解析に限界があった。効果量の推定精度を向上させ、不確実性を減らすために、今後の研究ではより大きなサンプルサイズを含めるべきである。より大きなサンプルサイズでこれらの調査結果を再現することは、観察された効果を検証し、その実際的な意義についてより明確な洞察を提供するのに役立つだろう。

第五に、H&E染色の限界により、観察された小腸と腹膜における免疫細胞の浸潤は、各群における免疫反応の複雑さを十分に捉えていない可能性がある。H&E染色は、組織構造と炎症の一般的な概観を提供するが、好中球、マクロファージ、リンパ球、形質細胞などの特定の免疫細胞タイプを正確に同定・鑑別することや、免疫細胞のサブタイプを正確に同定したり、それらの機能状態を評価したりすることには限界がある。免疫組織化学染色やフローサイトメトリーを追加することで、免疫細胞の構成、活性化状態、組織内の相互作用についてより詳細な知見を得ることができ、H&E染色から得られた知見を補完することができる。

最後に、偽手術を行った対照群がなかったため、より説得力のある再現性のある結果を得ることができなかったかもしれない。今後の研究にこのようなグループを含めることで、所見の妥当性が強化される可能性がある。

小児におけるFMTの安全性は、臨床経験を通じて部分的に証明されている(73 、74)。しかし、成人と同様に、FMTの適応は主にクロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）性大腸炎などの腸疾患に限られている。成人と小児の腸内細菌叢の違いが知られているにもかかわらず、小児におけるFMTは主に成人から提供された糞便を利用している。成人の腸内微生物の移植が小児の免疫や代謝に及ぼす長期的な影響に関する研究は目立って少ない。本研究で示されたように、年齢が一致したドナーからのFMTの有効性は、臨床の場で小児から提供された糞便を用いた研究を積極的に推進するための基盤となりうる。

さらに、FMTを含む既存の臨床研究または非臨床研究では、通常、その効果を確実にするために、少なくとも1日間は抗生物質の同時使用を除外していることに留意すべきである。しかし、継続的な抗生物質治療を必要とする重症患者の腸内細菌叢の回復をFMTの目的とする場合、FMTを抗生物質投与と同時に行うことの安全性と有効性を評価する予備的研究が必要である。このような条件下では、抗生物質投与期間を超えてFMTを実施しなければならないことを考えると、このようなアプローチの費用対効果を検討することも極めて重要である。さらに、適用を容易にするために、グラム染色や糞便の細菌培養などの簡単な検査で、関連する患者を迅速に特定することができる(75)。

結論として、この研究は、FMTによって抗生物質によって誘発された糞便中の細菌叢異常をドナーの微生物叢に置き換えることに成功し、敗血症に対する防御効果をもたらしたことを強調している。また、幼若マウス敗血症モデルにおけるFMTの有効性を独自に確認し、重症の小児を対象とした臨床研究戦略の可能性を示唆している。

データの利用可能性に関する声明

本論文の結論を裏付ける生データは、著者らにより、不当な予約なしに入手可能である。

倫理声明

動物実験はSNU-191010-5-1およびSNU-210514-1により承認された。本研究は、現地の法律および施設要件に従って実施された。

著者貢献

YH：執筆-校閲・編集、執筆-原案、視覚化、検証、監督、ソフトウェア、資源、プロジェクト管理、方法論、調査、資金獲得、形式的解析、データ管理、概念化。SK：執筆-校閲・編集、方法論、調査。HS：執筆-校閲・編集、方法論、調査。HK：執筆-校閲・編集、方法論。JP：執筆-校閲・編集、監督、プロジェクト管理、資金獲得。

資金提供

著者は、本論文の研究、執筆、および/または発表のために金銭的支援を受けたことを表明する。本研究の一部は、2019年度ソウル大学小児病院財団からの助成金（Kim Ki Eon Fund）の支援を受けた。

利益相反

著者らは、本研究が潜在的な利益相反と解釈され得る商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言する。

発行者注

本論文で表明された主張はすべて著者個人のものであり、必ずしも所属団体、出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本論文で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張も、出版社によって保証または支持されるものではない。

補足資料

本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2024.1451356/full#supplementary-materialに掲載されている。

参考文献

1. Ducarmon QR, Zwittink RD, Hornung BVH, van Schaik W, Young VB, Kuijper EJ. 腸内細菌叢と腸内細菌感染に対するコロニー形成抵抗性。Microbiol Mol Biol Rev. (2019) 83. doi: 10.1128/MMBR.00007-19

幼若マウスの敗血症モデルにおいて糞便微生物叢移植により回復した腸内細菌叢の保護効果

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