COVID-19はヒト経鼻マイクロ光コヒーレンストモグラフィー画像によって毛様体機能障害を引き起こす
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手紙
COVID-19はヒト経鼻マイクロ光コヒーレンストモグラフィー画像によって毛様体機能障害を引き起こす
. 2023 Nov 1;69(5):592-595. doi:10.1165/rcmb.2023-0177LE
Kadambari Vijaykumar1,2,*,Hui Min Leung3,4,*,Amilcar Barrios3,4,Courtney M Fernandez-Petty 2,George M Solomon1,2,Heather Y Hathorne 2,Justin D Wade 2,Kathryn Monroe 2,Katie Brand Slaten 2 、 Qian Li 2,Sixto M Leal Jr 1,Derek B Moates 1,Hannah M Pierce 1,Kristian R Olson3,4,5,Paul Currier 5,Sam Foster 5,Doug Marsden5,6,Guillermo J Tearney3,4,‡,Steven M Rowe1,2,‡,§.
pmcid: pmc10633845 pmid:38195114
旧バージョンあり： 本論文は、2022年7月11日にbioRxivに投稿されたプレプリント「 COVID-19 Causes Ciliary Dysfunction as Demonstrated by Human Intranasal Micro-Optical Coherence Tomography Imaging 」に基づいています。
編集者へ：
コロナウイルス病（COVID-19）の原因ウイルスである重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）は、鼻上皮の繊毛細胞に高発現しているACE2受容体を介して結合する。マイクロ光コヒーレンストモグラフィー（μOCT）は、呼吸器上皮の機能的動態を決定できる低侵襲の鼻腔内イメージング技術であり、上皮解剖学、繊毛運動、粘液輸送の可視化と定量化が可能である。われわれは、COVID-19における呼吸器上皮細胞の機能障害は、μOCTによって容易に可視化される特徴である繊毛細胞の機能低下と粘膜繊毛の異常として現れるという仮説を立てた。SARS-CoV-2に罹患した18歳未満の症候性外来患者を、症状発現後14日以内に募集し、ウイルス伝播のリスクを最小化するために、特注の陰圧隔離ブース内でμOCT撮影を行った。機能的繊毛の著しい減少、毛様体拍動頻度（CBF）の低下、毛様体活動の異常が明らかになった。その他の異常としては、粘液ラフトの存在、変性した上皮、免疫細胞浸潤の増加があった。われわれの結果は、軽症だが症状のあるCOVID-19の患者が呼吸器粘膜の機能的異常を示すことを示しており、ウイルス性疾患と疾患伝播における粘膜繊毛の健康の重要性を強調している。毛様体イメージングは、COVID-19の初期の発症機序の調査を可能にし、疾患の進行と治療反応の評価に有用であろう。
上気道は、COVID-19の原因ウイルスであるSARS-CoV-2の複製と伝播の入り口であることが示唆されているため、繊毛鼻上皮の機能的病態生理をよりよく見極める必要がある(1-4)。In vitroの文献によれば、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス、ライノウイルス、ライノエンテロウイルス、コロナウイルスなどの一般的な呼吸器ウイルスは、それぞれ繊毛細胞の傷害に寄与する可能性がある(5-7)。SARS-CoV-2では、軸索の喪失、残った基底小体の誤配向、粘膜毛様体クリアランスの障害などが報告されており（8-11 ）、分化前駆細胞による置換が起こっている（1 ）が、インフルエンザや百日咳などの感染症では（5,12,13 ）、炎症性サイトカインが介在する毛様体活性の低下や、毒素が介在する直接的な毛様体傷害が、毛様体傷害のメカニズムであると推測されている。鼻腔内μOCTは嚢胞性線維症患者において、機能的な微小解剖学的特徴を明らかにし、気道表面液の減少、毛様体周囲層の深さ、毛様体被覆率（pCC）と呼ばれる毛様体拍動の活性面積、CBF、粘液毛様体輸送速度（MCT）の遅延などの病態生理を確認するために使用されている（14）。われわれは、COVID-19における呼吸器上皮細胞の機能障害は、毛様体異常として現れると仮定し、経鼻μOCTイメージングを使用して、SARS-CoV-2感染の機能的帰結を特徴付けるために、症状のあるCOVID-19患者を分離する方法を考案した。われわれの結果は、軽症の患者であっても鼻腔上皮の毛様体機能が著しく低下していることを示しており、疾患の発症に寄与し、おそらく患者を二次感染に導きやすくするメカニズムに光を当てている。これらの研究結果の一部は、プレプリントの形で以前に報告されている（bioRxiv, 11 July 2022,http://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.07.08.499336v1 ）。本研究は、The Partners Institutional Review Board, Massachusetts General Hospital（プロトコール#2016P000272、AME#21で承認された隔離ブース、2020年8月）およびUniversity of Alabama at Birmingham Institutional Review Board（プロトコール#F160125001）の承認を得た。被験者全員が参加前に書面によるインフォームドコンセントを行った。
結果
2020年10月から2021年4月にかけて、COVID-19陽性が判明している36名の被験者をスクリーニングした。RT-PCRでCOVID-19が確認された13名の被験者が登録され、健常対照被験者8名と比較して最終解析に組み入れられた。COVID-19群の被験者の平均年齢は35歳で、54％が女性、69％が白人であった（表1）。疲労が最も多く報告された症状であり、ウイルス量の中央値は4.28 log10コピー/mlであった（データ補足の表E1参照）。長期追跡調査において臨床的な疾患の進行は認められなかった。μOCT画像検査は、COVID-19に罹患した被験者全員を対象に、感染力のピーク期間（平均10.2±2.2日）に合わせて、症状発現から14日以内に隔離卓上ボックス（図1A ）で実施した。
表1.
人口統計学的および臨床的ベースライン特性
被験者の特徴 COVID-19を発症した被験者（n= 13） 健常対照被験者（n= 8）
年齢、年（±SD） 35 ± 8.4 31 ± 6.9
性別 女性n(%) 7 (54) 4 (50)
人種：白人/黒人/アジア人,n 9/3/1 6/2/0
喫煙の有無,n 0 0
BMI、kg/m2（±SD） 41.2±18.1
医療従事者、n 4 0
罹病期間、日（±SD）* 10 .15 ± 2.2 該当なし
略語の定義 BMI = 体格指数（体重（キログラム）を身長（メートル）の2乗で割ったもの）、COVID-19 = コロナウイルス疾患、N/A = 該当なし。
*
罹病期間は症状発現から画像診断までの日数とした。
図1.
微小光干渉断層計（μOCT）による画像診断とその結果。(A ）コロナウイルス感染症（COVID-19）試験対象者の隔離ブースとデモ写真。(A.1) 個人保護ブースは閉鎖型陰圧HEPAろ過ユニットで、グローブポートとインターホン通信アクセスがある。(A.2）撮影は、被験者をボックス内に座らせ、眼科用ヘッドレストにあごを乗せ、オペレーターがグローブポートを通して外部から被験者と連絡を取りながら行った。(B）COVID-19では機能的微細解剖学的測定に異常があることを示す。健常対照被験者（青）とCOVID-19被験者（赤）のpCC、CBF、毛様体周囲層深度（PCL）、MCT測定値の散布図を示す。各データ点は個人ごとの平均測定値を表し、バーは平均値を示す。Mann-Whitney検定によるデータの比較： *P＜0.05および**P＜0.01。(C ）COVID-19の被験者における複数のμOCT画像異常を示す。(C.1）COVID-19患者における粘液ラフトの有病率の増加を示す散布図（健常対照群［青い点］11.6％±10.9％ vs COVID-19患者［赤い点］35.9％±26.7％；P= 0.0282）。各データポイントは、被験者ごとに粘液ラフトが確認されたμOCT動画の割合の平均測定値を示す。棒グラフは平均値を示す；マン・ホイットニー検定によるデータの比較： *P< 0.05. PCL層が均一で、上皮が保たれ、粘液貯留が少ない（青矢印）健常対照被験者（C.2-C.4）と、粘液ラフトが大きく、より明瞭である（赤矢印）、上皮が変性し、毛様体被覆が消失している（緑矢印）COVID-19被験者（C.5-C.12）。CBF = 毛様体拍動頻度；HEPA = 高効率微粒子空気；MCT = 粘液繊毛輸送速度；pCC = 毛様体被覆率。
COVID-19は粘液の蓄積と鼻上皮の破壊を引き起こす。
μOCTイメージングにより、COVID-19の患者では粘液の蓄積、上皮の剥離、免疫細胞浸潤の増加が容易に同定された。粘液分泌は急性感染によって刺激され、病的状況下では粘液斑に凝固する性質があり、本研究ではこれを粘液ラフトとして定量化した。粘液ラフトは、その下にある上皮との間に存在するわずかな分離（μOCT画像では暗色領域）によって区別された。上皮に付着している粘液筏の場合、上皮の裏打ちに大きく突出した伸展部が存在することで、変性した上皮と区別した。COVID-19では、有意に多くの粘液ラフトが認められ（被験者あたりの粘液ラフトの割合、対照11.6％±10.9％ vs COVID-19：35.9％±26.7％；P= 0.0282）、しばしば下層の上皮の破壊と関連していたが、健常対照被験者では、下層の鼻上皮の連続性は保たれており、COVID-19では粘液の過剰分泌が下層の上皮の傷害と関連していることが示された（図1CおよびE2）。
COVID-19は毛様体被覆の深刻な喪失をもたらし、CBFを減少させ、不規則な毛様体拍動パターンを引き起こす。
COVID-19患者では、毛様体被覆率が著しく低下していた（pCC、対照群57.4％±36.11％ vs COVID-19群18.1％±23.62％；P= 0.009）が、pCCと撮影時のウイルス量（r= 0.41）または罹病期間（r= 0.002）との間に直接的な相関は認められなかった（図E1）。繊毛が完全に消失している領域が頻繁に認められたため、COVID-19の被験者の大部分において運動性粒子の運動を確認することは困難であった。定量化が可能であれば、統計的に有意ではなかったものの、COVID-19コホートでは粘膜繊毛輸送速度が顕著に低下していた（対照群7.2±2.9mm/分、n=7 vs. COVID-19コホート1.6±0.3mm/分）。μOCTでは、COVID-19患者のCBFが著しく低下していることが示された（対照群12.32±2.58Hz vs. COVID-19群7.57±2.56Hz；P= 0.011）。健常者の毛様体波形解析では、比較的一貫した周波数と振幅の規則的でリズミカルなパターンが検出されたが、COVID-19患者では、不規則な振幅を伴う顕著に不規則な拍動パターンが認められた（図E3）。
考察
繊毛の構造的完全性と協調運動は、気道の主要な防御機構である粘膜繊毛クリアランスを最適化するために不可欠である(15)。COVID-19の臨床症状は、無症状から肺炎や呼吸不全に至るまで、細胞障害性細胞効果やウイルスを介したサイトカイン応答など、様々なメカニズムで起こる(16)。ウイルス量は重症度に対する一貫した予後の可能性を示すことができず(17,18)、機能的パラメータが疾患の層別化に有望である可能性を強調している。われわれは、急性COVID-19患者において、残存する繊毛拍動の異常と協調運動の喪失を伴う運動性繊毛の広範な喪失のin vivo証拠を初めて報告した。軽症の患者しか含まれていないにもかかわらず、感染性のピーク期間内に撮像した場合、粘膜繊毛器官における重度の繊毛細胞異常と機能欠損が認められた。
これらの結果は、様々なCOVID-19モデルで毛様体傷害が共通の病理学的特徴として報告されている研究を補完するものである（1,8,11,19,20 ）。いくつかのin vitroおよびin vivoの研究で、SARS-CoV-2ウイルスが繊毛細胞に感染しやすいことが証明されており、これらのモデル系では顕著な繊毛異常(8-10)と粘膜繊毛クリアランスの障害(11,20)によって証明されている。In vitroでは、SARS-CoV-2感染による毛様体機能障害の原因として、ユビキチンを介した毛様体タンパク質の損失が示唆されている(21)。我々は運動性繊毛の広範な喪失を観察し、これは残存する繊毛拍動の異常と協調運動の喪失を伴っていた。粘液ラフトが付着した粘液層の細胞炎症も顕著であった。これらの特徴は、in vitroで証明された粘液クリアランスの遅延に寄与していると考えられる。シリアンハムスターの摘出気管を用いたμOCT研究では、毛様体減少に伴うMCTの著しい減少が記録されている。これらの研究は、MCTをより容易に測定できる上皮の広範な調査に適した実験室条件の恩恵を受けている(20)。COVID-19患者の所見は、嚢胞性線維症患者のμOCT画像とは対照的であった。嚢胞性線維症患者では、MCT率が有意に低下しており、毛様体周囲液層の枯渇および高粘性粘液の存在と相関していた。いくつかの呼吸器ウイルスによる粘液分泌過多の根底にある病態は、炎症性サイトカインとケモカインの過剰産生に起因している。同様に、SARS-CoV-2に感染すると炎症反応が活性化し、呼吸器粘膜分泌物が増加することが知られている(22)。我々のCOVID-19コホートで観察された上皮傷害と炎症細胞数の増加の定性的証拠は、COVID-19における粘液分泌過多のこの機序を間接的に支持している。
われわれの知見はサンプル数が少ないという制約があり、軽症の被験者ではさまざまな機能障害を認めたが、その経過は自己限定的であったため、疾患の進行や将来の合併症のリスクを識別することはできなかった。MCT測定では、追跡可能な粘液粒子を定義するために繊毛上皮を可視化する必要があるため、これを正確に測定できる症例数が限られ、最適なデータ抽出ができなかった。本研究が実施された時点では、疾患の経過を通じた連続的な画像診断や侵襲的な生検の実施が不可能であったため、機能的・微細解剖学的変化の縦断的な進行や病理組織学的な相関についてコメントすることはできない。
われわれの研究は、COVID-19の早期発症機序の調査におけるμOCT画像の使用を強調している。無症状の人もウイルスを増殖させることが知られているため、これらの人では繊毛細胞の実質的な傷害が起こっている可能性が高いと思われる。これらの所見は、SARS-CoV-2感染を軽減するために、疾患の初期段階で繊毛細胞を標的とする役割をさらに検討する必要性を裏付けるものであり、他のウイルス性呼吸器疾患における繊毛イメージングの応用可能性を強調するものである。
参加者
COVID-19に罹患した18歳未満の症候性外来患者を、症状発現後7日以内に募集した。危険因子およびCOVID-19症状を含む詳細な病歴を聴取した。21日後の臨床転帰を含む長期追跡調査を行った。
全身保護ブースの設計、撮影手順、およびμOCT画像解析
COVID-19予防のために、研究対象者を研究スタッフから隔離するために、カスタマイズした陰圧式全身保護ブースを設計・製作した。μOCTプローブを下肉孔領域に操作しながら、リアルタイム画像を可視化し、既報の方法(14)に従い、各耳介の鼻甲介と鼻底の約5カ所の離散的な部位からデータを取得した。本研究で得られた正常対照被験者におけるμOCTの結果は、嚢胞性線維症および慢性副鼻腔炎の対照被験者を含む異なる研究から得られた複合解析の平均値と同様であり、統計学的な差はなかった（N= 34；複合対照平均値 vs. COVID-19対照被験者：毛細血管周囲層深さ、5.95 vs. 5.8mm；CBF、14.85 vs. 12.32Hz；MCT、8.5 vs. 7.2mm/分）。詳細な方法と統計解析はデータ補足に掲載されている。
謝辞
謝辞
本研究に参加した被験者とその家族に感謝する。
脚注
米国国立衛生研究所助成金P30DK072482、R35 HL135816およびR35 HL135816-04S1（S.M.R.）。 National Institutes of Health grant UL1TR003096（University of Alabama at Birmingham）、Cystic Fibrosis Foundation grant ROWE19RO、ROWE17XX1、TEARNE16XX0、University of Alabama at Birmingham COVID-19 Research Awardによる機関資源、Mike and Sue Hazard FamilyおよびRemondi Family Foundations（G.J.T.）。
著者貢献： K.V.、H.M.L.、G.M.S.、G.J.T.、S.M.R.が研究計画を立案した。K.V.、G.M.S.、H.Y.H.、J.D.W.、K.M.、K.B.S.、S.M.R.は実験実施とデータ取得に参加した。K.V.、H.M.L.、A.B.、C.M.F.-P.、G.M.S.、G.J.T.、S.M.R.がデータ解析を行った。S.M.L.、D.B.M.、H.M.P.がウイルス学的検査と解析を行った。K.R.O.、P.C.、S.F.、D.M.、G.J.T.およびS.M.R.は、個人防護ブースの設計および開発に参加した。原稿はK.V.、H.M.L.、Q.L.、S.M.R.が作成した。著者全員が必要な修正を行い、提出前に最終稿を承認した。
本レターにはデータ補足があり、本号の目次（www.atsjournals.org）からアクセスできる。
著者の情報開示は、本レターの本文とともにwww.atsjournals.org。
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