酸化グラフェンはアリール炭化水素受容体を介して微生物に依存したタイプ2免疫応答を誘発する
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公開日：2022年12月12日
酸化グラフェンはアリール炭化水素受容体を介して微生物に依存したタイプ2免疫応答を誘発する
Guotao Peng, Hanna M. Sinkko, ...Bengt Fadeel 著者名を表示する
Nature Nanotechnology (2022)この記事を引用する
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指標詳細
概要
腸内細菌は、腸内免疫恒常性の重要な制御因子であるアリール炭化水素受容体（AhR）と相互作用する代謝産物を産生する1,2。本論文では、酸化グラフェン（GO）の経口曝露により、ゼブラフィッシュ成魚の腸内細菌叢の組成が変化し、野生型とahr2欠損動物で有意差があることを示す。さらに、GOは短鎖脂肪酸である酪酸と組み合わせることで、AhR依存的にcyp1aの誘導とlck+細胞の腸へのホーミングを無菌ゼブラフィッシュ幼生で引き起こすことがわかった。GOに対する免疫応答についてさらに理解を深めるため、単一細胞RNA配列解析により、全無胚葉の細胞およびlckを濃縮した細胞のプロファイリングを行った。これらの研究により、無胚芽ゼブラフィッシュに自然リンパ球（ILC）様細胞3が存在することが証明された。さらに、微生物である酪酸の「コロナ」を付与したGOが、制御細胞の属性を持つILC2様細胞の誘導を誘発した。以上のことから、本研究は、ナノ材料がAhR依存的にマイクロバイオームと免疫系のクロストークに影響を与えることを示した。
主な内容
グラフェン系材料を含むナノ材料の利用が拡大していることから、これらの材料が人の健康に及ぼす可能性のある影響を総合的に評価することが必要となっている4。しかし、ナノ材料と免疫系との相互作用は取り上げられているものの、宿主のマイクロバイオームへの影響についてはまだ理解されていない。さらに、グラフェン系材料やその他のナノ材料が、微生物叢やその代謝産物への影響を介して免疫反応を調節するかどうかを検討する研究が必要である。忘れられた臓器」であるマイクロバイオームは、宿主の複数のシグナル伝達経路の制御に関与しており、腸内細菌叢と免疫系の間には双方向のコミュニケーションが存在する5。腸内細菌は、酢酸（AA）、酪酸（BA）、プロピオン酸（PA）などの短鎖脂肪酸（SCFA）を含む多くの代謝物を産生します5。SCFAは、いくつかの異なるメカニズムを通じて、腸内外の宿主細胞にシグナルを送ります2。最近の研究では、BAが肝臓および腸のアリール炭化水素受容体（AhR）およびその標的遺伝子（CYP1A1などのチトクロームP450ファミリーをコードする遺伝子を含む）を調節することが示されており6、また他の研究では、BAがAhR発現または他のAhRリガンドの発現調節に関与しているとされている7,8。AhRは、腸管上皮細胞の再生を制御し、抗炎症反応を仲介し、3型自然リンパ球（ILC3）の偏光を調節する2。また、AhRの活性化は寛容性制御性T細胞（Treg）の誘導を促進する。最近の研究では、AhR経路が消化管におけるILC2-ILC3バランスを制御し、病原体に対する適切な免疫応答を確保していることが示されている9。したがって、腸内細菌叢の変化は、AhRリガンドのプールに変化をもたらし、その結果、宿主の腸管免疫に影響を与える可能性がある。
本研究では、まず、酸化グラフェン（GO）が腸内細菌叢の組成を調節できるかどうか、また、AhRが非暴露動物または暴露動物の細菌叢の形成に役割を果たすかどうかを明らかにした。この目的のために、我々はモデルとしてゼブラフィッシュ（Danio rerio）を使用した10。我々は以前、E3 培地における GO の構造特性について報告した11 （補足図 1 に、他の関連培地における対応する結果を示す）。GO は、動物に暴露する前にエンドトキシンを含まないことを確認した（補足図 2）。野生型（WT）および AhR 欠損ゼブラフィッシュを GO（50 または 500 µg l-1）に 7 日間連続暴露した後、腸を解剖し、16S rRNA 遺伝子配列 解析用のサンプルを採取した（図 1a）。腸の透過型電子顕微鏡（TEM）解析により、GOが腸管内腔に細菌と混在して存在することが示された（補足図3）。高倍率画像では、GOシートが微絨毛に密着していること（低線量）、GOが細胞に取り込まれた形跡があること（高線量）が確認された。粘膜バリアの上皮細胞は、免疫防御の第一線を担っており12、ムチンを分泌する特殊な上皮細胞である杯細胞の過形成は、2型免疫の特徴である13。アルシアンブルーと過ヨウ素酸シッフ試薬を用いて杯細胞の発現を測定したところ、GO（50 µg l-1）に暴露した動物で杯細胞の有意な増加が認められた（補足図4）。さらに、16S rRNA 遺伝子配列の解析により、WT と AhR 欠損（ahr2+/-）のゼブラフィッシュの両方で、腸内細菌叢は Proteobacteria と Fusobacteria の系統が優勢であることがわかった（図 1b）。GOへの曝露により、フソバクテリアからプロテオバクテリアに相対量がシフトし、この効果はAhR欠損動物でより顕著になった（図1c,d）。興味深いことに、16S rRNA 遺伝子配列の解析により、GO をマウスに経口投与（2.5 mg kg-1/day, 7 日間）すると、ファーミキューテスとバクテロイデスの比率が有意に変化することが判明した14。本データでは、腸内細菌叢組成が2つの遺伝子型間（R2、21％；p＝0.0004）および曝露群間（R2、26％；p＝0.0001）で有意に異なっていた（図1eおよび補足表1、2）。WT動物ではGO曝露により微生物叢組成の変動の46%が説明された（図1f）。一方、AhR欠損動物ではGO曝露により変動の34%が説明された（図1g）。GOに曝露したWT動物およびAhR欠損動物における細菌16S rRNA遺伝子配列のアンプリコン配列変異体（ASV）の存在量の差検定を補足図5にまとめている。注目すべきは、WT動物では、高用量曝露によりVibrio、PseudomonasおよびAeromonasが濃縮され、既知のAhRアゴニストに関する先行研究15,16と一致したのに対し、AhR欠損動物では、低用量および高用量の両グループにおいて同様の効果が認められたことである。しかし、腸内細菌叢の個々のメンバーの相対的な存在量は、必ずしもその免疫調節作用と相関していない17。ASVの存在量にオスとメスの差は認められなかった（補足表1）。一方、別の研究18 では、GO の高用量（5 mg l-1）に慢性的に暴露（25 日間）すると、門と属のレベルでゼブラフィッシュの雌雄間に差異が生じることがわかった。つまり、GOへの1週間の曝露は、成体ゼブラフィッシュの腸内細菌叢組成に大きな影響を与え、それがAhRによって調節されたのである。
図1：ゼブラフィッシュ成魚の腸内細菌叢におけるAhR依存的な変化。
図1
a, 成体ゼブラフィッシュ（WTおよびahr2+/-）の7日間曝露レジメンの実験デザイン。 b, 遺伝子型および処理間での腸内細菌叢の最も豊富な細菌フィラ。c, d, GOに暴露したWTとahr2+/-魚におけるFusobacteriota（c）およびProteobacteria（d）の相対的な門の存在比を示す。エラーバーは6個体の平均値±s.d.を表す。処理区間および遺伝子型間の有意差を示す。e, 2つの遺伝子型間の微生物相組成の監視下分析。 f,g, WT（f）およびahr2+/-（g）ゼブラフィッシュの腸内微生物相組成に対するGOの影響。dbRDA、距離ベースの冗長性分析。ASVの存在量の違いを補足図5に示す。クレジット：Fish in a, Adobe Stock.
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マイクロバイオームの重要性をさらに調べるため、WTおよびAhR欠損のバックグラウンドで無菌（GF）ゼブラフィッシュ胚を作製した（補足図6）。これまでの研究で、ゼブラフィッシュ成体腸の細菌群集が3つの主要なSCFAをすべて合成することが示されており19、BAも（ゼブラフィッシュ成体で）in situで検出されたことがある20。重要なことは、ヒト腸管上皮細胞株 HT-29 を用いて、BA のみ（AA や PA ではなく）が AhR の活性化を引き起こすことができることを見出したことである（補足図 7）。同様に、BA が HT-29 細胞で CYP1A1 の発現を誘導することも示されている6。 また、TEM を用いて、GO (30 μg ml-1) が 24 時間暴露後に分化 HT-29 細胞に取り込まれることを示すことができたが、これは、分化 Caco-2 細胞を用いて GI バリアをモデル化した過去の研究とは対照的である21。したがって、GOはin vitroおよびin vivoで腸管細胞に取り込まれ（上に示したように）、したがってこれらの細胞にBAを「送達」する役割を果たすと思われる。GFゼブラフィッシュ幼生（受精後5日（dpf））をGO（5 µg ml-1）に24時間曝露したところ、TEM（図2a）およびラマン分光／顕微鏡（図2b）により明らかになったように、GI管にGOが存在することが確認された。TEM分析では、GOが上皮細胞の微絨毛の表面に位置していることが示された。GO曝露により、ある程度の微絨毛と上皮細胞膜の損傷が認められたが、GI管全体の構造には悪影響はなかった。次に、AhR活性化のマーカーとしてcyp1aの誘導を逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応（RT-qPCR）によりモニターした。この目的のため，胚を GO（10, 30, 50 µg ml-1），BA（0.5, 1.5, 2.5 mM），または指定濃度の GO と BA の組み合わせ（GO+BA）に 24 時間曝露した．陽性対照として，高親和性 AhR リ ガンド 6-formylindolo[3,2-b]carbazole（FICZ）22 を使用した．FICZは従来型（CV）およびGF胚でcyp1aの顕著な誘導を引き起こし、これはahr2-/-胚では無効であった（図2c-f）。GOとBAの単独または併用は、CV胚では全く、あるいはわずかな効果しかなかった。一方、GF胚では、GO+BAへの複合曝露によりcyp1aの有意な（〜20倍）誘導が起こり、これはahr2-/-胚では見られなかった（図2d、f）ことから、AhRの役割が確認された。また、GF条件下で誘導したトランスジェニックTg(cyp1a:GFP)ゼブラフィッシュを用い、GO+BAがGI上皮でcyp1a誘導を引き起こすこと（図2g）、一方、赤蛍光BAが腸内腔で検出されることを示すことができる。FICZも肝臓と腸でcyp1a誘導を促したが、BA単独あるいはGO単独での反応はあまり顕著ではなかった（補足図8、9）。
図 2：GF ゼブラフィッシュにおいて、GO と BA は AhR 依存的な CYP 誘導を引き起こす。
図 2
a, TEM解析により可視化したGO。矢印は、5μg ml-1 の GO を 24 時間曝露した GF ゼブラフィッシュ幼生の腸内で、微絨毛と相互作用している GO シートを示す。5 μg ml-1 の GO に 24 時間暴露した 5 dpf ゼブラフィッシュで解析した。表示されたスペクトルは、全領域スキャンで 10,000 スペクトルの平均を表す。 c,d, WT-CV (c) および WT-GF (d) 幼虫における cyp1a の相対的 mRNA 発現。e,f, ahr2-/- CV (e) および ahr2-/- GF (f) 幼虫における cyp1a の相対的 mRNA 発現。FICZはポジティブコントロールとして用いた。データは3つの独立した実験（n = 3）の平均値±s.d.として示される。スチューデントのt検定（両側）を、対照と指示された処理との比較の分析に使用した（*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001）、およびBA対GO+BAの比較に使用した（#p < 0.05, ##p < 0.001）． g、GO（30μg ml-1）と酪酸レゾルフィン（5μM）の組み合わせに曝露した後、GF条件下でTg（cyp1a：GFP）ゼブラフィッシュ幼虫を用いてcyp1a誘導を視覚化した。） BA（赤）は腸管内腔に、cyp1a誘導（緑）はGI上皮細胞に認められた（補足図8、9に追加の陽性・陰性対照を示す）。上段と下段は2人の異なる個体のものである。擬似3次元画像はZEN3.0の2.5Dツールで作成し、最高強度値はz軸の最大延長で表している。BF、明視野。スケールバー、50μm。
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次に、GO単独または微生物代謝物BAとの組み合わせで、ゼブラフィッシュ胚の免疫応答を誘発するかどうかを検討した（図3a-d）。実際、GO+BAに曝露したGF胚では、lck（リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ）の大幅な誘導（～60倍）が観察されたが、GOまたはBA単独では何の影響も及ぼさなかった。CV胚ではこのようなことはなく、また、AhR欠損ゼブラフィッシュではlckの誘導は検出されなかった。さらに、AA も PA も（単独でも GO との組み合わせでも）、GF ゼブラフィッシュでは lck を上昇させなかった（Fig. 3e）。5 dpf の胚を適用したため、初期幼生期に相当し、免疫応答は主に自然免疫系に起因すると思われる23。したがって、GO+BAは、3つの自然リンパ球（ILC）サブタイプに共通する分子マーカーであるlckの誘導を厳密にAhR依存的に誘発し、これはGFゼブラフィッシュでのみ観察された。さらに、遺伝子発現プロファイリングにより、GF胚ではILC2細胞に対応する転写因子遺伝子、すなわちgata3、stat6、サイトカインコード遺伝子、すなわちil4、il13が発現上昇し（補足図10）、ILC1細胞（tbet、ifn-γ）、ILC3（rorca、il22）細胞に関わる遺伝子は上昇しないことが明らかになった。lckの誘導をin situで確認するため、CVおよびGF条件下で飼育したトランスジェニックTg（lck：GFP）ゼブラフィッシュ幼生をGO＋BAに曝露した。その結果、GO+BAはlck+細胞の腸へのホーミングを促すことがわかった（Fig.3f）。これはGFゼブラフィッシュでのみ観察された（図3gは代表画像、補足図11は腸内の赤色蛍光BAと胸腺およびGI管内のlck（緑）の可視化画像である）。
図3：GOとBAがGF魚のAhR依存的なlck+細胞のホーミングを誘発する。
図3
a-d、GO単独、BA単独またはGO＋BAに示した濃度で曝露したWT-CV（a）、WT-GF（b）、ahr2-/--CV（c）およびahr2-/--GF（d）ゼブラフィッシュ幼生におけるlckの相対的mRNA発現量である。補足図10に、追加の遺伝子プロファイリング結果を示す。データは、3つの独立した実験（n = 3）の平均値±s.d.として示される。スチューデントのt検定（両側）を、対照と示された処理との間の比較の分析に用いた（*p < 0.05、**p < 0.01、**p < 0.001）。 e、WT-GFゼブラフィッシュ幼生におけるGOおよび／または種々のSCFAへの曝露後のlckのPCR分析。AA, 酢酸; BA, 酪酸; PA, プロピオン酸。対照幼虫と曝露幼虫の比較には、Student's t-test (two sided) を用いた (**p = 0.0014)。GF条件下でのGO+BA曝露で腸内のlck+細胞の有意な増加が観察されたが、CVゼブラフィッシュでは観察されなかった。コントロールと処理物の比較解析にはStudent's t-test（両側）を用いた（ns = 有意差なし、**p = 0.0055）。lck+細胞の数は、1群7個体に基づいて定量した。 g, Tg(lck:GFP)ゼブラフィッシュ幼生を用いたlck+細胞の可視化以下のようにCVおよびGF条件下で曝露した。(i) CV魚（コントロール）, (ii) CV魚（GO+BA）, (iii) GF魚（コントロール）, (iv) GF魚（GO+BA）（補足図11に酪酸レゾルフィンを用いた実験を示す）。スケールバー、100μm。
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重要なことは、最近の単一細胞転写解析により、成体ゼブラフィッシュの腸にILC様細胞が存在することが明らかになったことである25。しかし、qPCRによる遺伝子発現のバルク解析に基づいて特定の細胞表現型を帰属させることは困難である。そこで、ゼブラフィッシュ胚におけるILC様細胞を同定し、これらの細胞に対するGO+BAの影響（もしあれば）を明らかにするために、全胚からの細胞とlckに濃縮した細胞について単一細胞RNA配列決定（scRNA-seq）を行った（補足図12a,b）。この目的のために、WT 胚からの細胞、および GF 条件下で飼育し、GO+BA に曝露したか否かの Tg(lck:GFP) 胚から濃縮した lck+ 細胞を集め（補足図 12c、d）、方法に詳述したように 10x Genomics 技術を用いて scRNA-seq にかけた（補足図 13 および 14 は、これらのトランススクリプトミクスデータに対する品質管理 (QC) を示したものである）。ゼブラフィッシュ胚全体のトランスクリプトーム解析により、コントロールサンプルではT細胞とILCの両方のマーカーを持つlck+細胞集団が同定されたが、GO+BA曝露ゼブラフィッシュでは2つの別々のlck+細胞集団が同定され、そのうち1つはT細胞、もう1つはILC様細胞に対応した（補足図15）。さらに、両サンプルの統合解析により、GO+BA曝露幼虫では、膵臓と肝臓のマーカーを発現する細胞集団の拡大が確認された（Extended Data Fig.） これは、腸内にSCFAが「コロナ」のように存在するGOが「食べ物」として感知され、消化酵素（例えば、セリンプロテアーゼ）や脂質代謝に関わる遺伝子の誘導につながることを示唆しているのかもしれない（Extended Data Fig.1）。また、GO+BAに暴露したGF胚では、Tg(cyp1a:GFP)ゼブラフィッシュで得られた結果と同様に、腸の細胞として同定されたクラスタでcyp1aが誘導されることに注目した。しかし、ILCは粘膜バリアに存在するリンパ球のごく一部を構成するのみである26。そこで、我々のアプローチを改良するために、GF Tg(lck:GFP)幼虫からソートしたlck+細胞に対してscRNA-seqを実施した。その結果、ILCのマーカーを示す明確な細胞集団（クラスター）がコントロールに存在することがわかった（図4a）。これは、成体ゼブラフィッシュの腸を解剖してILC様細胞を同定した過去の研究25と一致している。図4bに関連遺伝子を示し、赤枠はクラスタ4（ILC様細胞に対応）を区切ったものである。さらにGO+BAを照射すると、ILC様細胞に対応するクラスターを同定することができ（図4c）、その中にはILC2様細胞（nitr+gata3+il4+il13+ ）、ILC3様細胞（ nitr+rorc+il17a/f1+il22+ ）、さらにILC210細胞27として知られている制御性ILC様細胞の属性をもつILC2細胞（ nitr+gata3+foxp3a+il10+ ）からなることが示された（図4d）。GO+BA曝露幼虫のILC様クラスター（図4c,d、クラスター8）の特徴プロットを図4eに表示した。対照試料の対応する特徴プロットを補足図16に示す（IL-10をコードする遺伝子がこのクラスターに存在しないことに注意）。さらに、曝露幼虫のILC210様細胞に対応する細胞集団の特異的マーカーを補足図17に示す。調節性 ILC 集団が存在するという仮説があるが28 、そのような細胞（つまり FOXP3 を発現する ILC サブセット）は今のところマウスやヒトでは同定されていないことに注意されたい29。しかし、IL-10 を産生する ILC2 細胞は、制御活性と関連している29。したがって、GF ゼブラフィッシュにおいて、il10 と foxp3 とともに ILC2 細胞のマーカーを持つ細胞のサブセットを同定したことは、重要な意味を持ちます。これらの細胞は、IL-33の受容体をコードするil1rl1（st2としても知られる）の発現も確認された（補足図17）。マウスを用いたこれまでの研究で、IL-10産生ILC2細胞は、IL-33やレチノイン酸などのアラミンによる活性化後に生成されることが示されている27。しかし、IL-33 をコードする遺伝子はゼブラフィッシュゲノムに存在しないため、別の「IL-33 様」因子が関与している可能性が推測される。このように、我々の研究は、ゼブラフィッシュ胚におけるILC様細胞の存在を証明し、GO+BAに曝露されたGFゼブラフィッシュにおけるILC系譜内の可塑性を示唆するものであった。これらの細胞の機能的な特徴を明らかにするために、さらなる研究が必要である。
図4：GFゼブラフィッシュから採取したlck+-enriched細胞のscRNA-seq解析。
図4
a,c, 10x RNA-seq データの tSNE 解析の二次元投影で、コントロール（a）および GO+BA 暴露胚（c）における lck+ 細胞の不均質性を示す。 b,d, ドットプロットは、コントロール（b）および GO+BA 暴露幼生（d）における各クラスターでの標的遺伝子の平均発現 レベルを示す。ドットの大きさは、クラスタ内で当該遺伝子を発現している細胞の割合を示している。赤枠は、コントロール（b）のクラスタ4（ILC様細胞に相当）とGO+BA曝露魚（d）のクラスタ8（ILC様細胞に相当）を区切ったものである。e、GO+BA曝露幼虫のILC様クラスタ（cおよびdのクラスタ8）の特徴プロット。このクラスタは、順に、ILC2様細胞（nitr+gata3+il4+il13+） およびILC3様細胞（nitr+rorc+il17a/f1+il22+）、ならびに調節性ILC様細胞（ILC210細胞）の特性を有するILC2細胞（nitr+gata3+foxp3a+il10+）からなっていることが示されている。補足図17に追加情報を、補足図16にコントロールサンプルのILC様細胞マーカーの特徴プロットを示す（aおよびbのクラスタ4に対応）。
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マウスを用いたこれまでの研究により、AhRが腸内のILC3の維持と機能に関与していることが示されている2。しかし、GF条件では後者の細胞の発生に影響を与えなかった（別の著作にレビューあり2）。本研究では、ナノ材料（GO）と微生物代謝物（BA）の組み合わせが、GFゼブラフィッシュにおいてAhR依存的なタイプ2免疫反応を引き起こし、制御細胞の特性を示すILC2様細胞を誘導することを示し、腸管免疫の新しい側面を明らかにした。結論として、本研究は、GOが腸内細菌と免疫系のクロストークに影響を及ぼし、タイプ2免疫応答を誘導することを示した。タイプ2免疫は、蠕虫（ぜんちゅう）感染に対する防御的役割と、喘息などのアレルギー性疾患における病原的役割で最もよく知られている30。今回の発見は、免疫系がGO+BAを病原体として「感知」していることを示唆している。このことは、グラフェン系材料やその他のナノ材料の危険性を理解する上で重要な意味を持ち、腸内マイクロバイオームと自然免疫系との双方向コミュニケーションの結節点にAhRを位置付けることができる。
研究方法
GOの特性評価
Hummers の方法で調製した GO は、Graphenea（スペイン）から入手した。H2OおよびE3培地中のGO懸濁液の完全な物理化学的特性は、既に報告されている11。ここでは、H2Oおよび異なる細胞培養培地、すなわちダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）（HT-29細胞株に使用）およびロスウェルパーク記念研究所（RPMI）（初代マクロファージに使用）中のGO懸濁液に関する情報を提供する。TEM および原子間力顕微鏡は、以前に説明したように実施した11。簡単に言うと、炭素膜でコーティングしたグリッドを、-25 mA の電流で 30 分間グロー放電で前処理した。50 µg ml-1 の溶液 10 マイクロリットルをグリッドに蒸着し、蒸着時間 2 分後に余分な試料を除去した。TEM画像は80 kVで取得し、サイズ分布解析はImageJソフトウェアバージョン1.5を用いて決定した。原子間力顕微鏡画像は，Bruker Multimode 8 原子間力顕微鏡を使用し，OTESPA プローブを用いてタッピングモードで取得した．
エンドトキシンの検出
GO 懸濁液のエンドトキシン含有量は，既報の通り，初代ヒト単球由来マクロ ファージに基づく TNF-α 発現試験により評価した31．この細胞は、カロリンスカ大学病院から入手したバフィーコートから単離された。このサンプルは完全に匿名化されており、データは個々のドナーに遡ることはできない。ヒト単球由来マクロファージをGO（5〜75μg ml-1）に24時間暴露し、細胞生存率をalamarBlue assay（ThermoFisher Scientific）32で評価した。次に、ヒト単球由来マクロファージを、リポポリサッカライド阻害剤ポリミキシンB（10μM）の存在下または非存在下で、GOを25μg ml-1で24時間インキュベートした。リポポリサッカライド（0.01 µg ml-1）を陽性対照として用いた。細胞培養上清を回収し、TNF-α濃度を酵素結合免疫吸着測定法（MabTech社製）で測定した。リポポリサッカライド誘導型TNF-αをもとに標準曲線を作成した。
AhRレポーター細胞
ヒト HT-29 結腸腺癌細胞株から樹立した HT-29-Lucia AhR レポーター細胞は InVivoGen 社から入手した。この細胞は、当初、4.5 g l-1 グルコース、2 mM L-グルタミン、10％牛胎児血清（FBS）、100 U ml-1 ペニシリン、100 μg ml-1 ストレプトマイシンおよび100 μg ml-1 ノルモシンを添加したDMEM中で培養された。少なくとも2回継代した後、増殖培地にゼオシン（100μg ml-1）を補充した。AhR活性測定では、細胞をトリプシンで剥離し、遠心分離して、NormocinとZeocinを含まない試験培地に2.8 × 105 cells ml-1の密度で再懸濁させた。この細胞をAA、BAまたはPA（Sigma-Aldrich）に曝露した；FICZ（Sigma-Aldrich）（200 nM）を陽性対照として使用した。その後、細胞上清を96ウェルプレートに移し、QUANTI-Lucアッセイ溶液を加えた。測定値は、Tecan Infinite F200 プレートリーダーを使用して記録した。
HT-29細胞の分化
HT-29 細胞は、10% FBS、2 mM L-グルタミン、100 U ml-1 ペニシリン、100 μg ml-1 ストレプトマイシン、2 g l-1 グルコースを添加した RPMI 1640 で 21 日間培養した33。細胞培地は細胞がコンフルエントになるまで一日おきに交換した。その後、培地は21日間毎日交換した。その後，分化した細胞を GO（30 μg ml-1）に 24 時間暴露し，細胞を洗浄し，トリプシン-EDTA（0.25%）を用いて 収集し，0.1 M リン酸緩衝液（pH 7.4）中の 2.50 % グルタルアルデヒドで固定した．その後、「超微細構造解析」のセクションに記載したように、サンプルを TEM 解析用に処理した。
ゼブラフィッシュのジェノタイピング
ゼブラフィッシュの飼育および実験は、国の倫理指針に準拠して行われ、本研究はストックホルムの動物実験地域委員会により承認された（倫理許可番号14049-2019）。ahr2 の点変異（ahr2hu3335）を有するゼブラフィッシュ胚は，Wellcome Sanger Institute で作製し，カールスルーエ工科大学の European Zebrafish Resource Center から提供された．子孫は成体まで育て、フィンクリップから単離したDNAでahr2hu3335点突然変異の遺伝子型判定を行った34。DNAはQIAamp DNA Mini Kit（QIAGEN）を用いて抽出し、DreamTaq Green PCR Master Mix（ThermoFisher）を用いて点変異検出プライマー（ahr2-mut-F，TATTGCTAGGCAGAGCAC；ahr2-mut-R，GATGTCTTCTGTGATGATTTCG）により増幅させた。PCR産物はExoSAP-IT Express試薬（Applied Biosystems）で精製し、DNA配列決定のためにABI 3730 PRISM DNA analyser（Applied Biosystems）にロードした。ahr2の点変異についてWT（ahr2+/+）、ヘテロ接合体（ahr2+/-）またはホモ接合体（ahr2-/-）と判定されたゼブラフィッシュをさらなる実験に用いた（ゼブラフィッシュ成体、4.5ヶ月齢；幼生、5dpf）。
ゼブラフィッシュ成体への曝露
異なる遺伝子型（WT、ahr2+/-、ahr2-/-）の成体ゼブラフィッシュを、GO（50 µg l-1または500 µg l-1）に7日間連続的に曝露させた。WTでは雌6匹、雄6匹、他の遺伝子型では雌3匹、雄3匹が含まれた。ゼブラフィッシュは、遺伝子型を決定する前に一緒に飼育し（上記参照）、その後、GOへの曝露の前に1週間別々の生簀で飼育した。7日間の曝露期間中、魚の餌は1日1回、朝に各水槽にほぼ等量ずつ与えた。餌の1時間後に魚水をリフレッシュし、GOを曝露群に添加した。7日目に魚はトリケインで犠牲にし、腸を実体顕微鏡下で解剖し、pH7.4の0.1Mリン酸緩衝液中2.5%グルタルアルデヒドで固定してTEM分析のために4℃で保存した（WT）、または病理学的検査のために4%ホルムアルデヒドで保存するか、その後の16S rRNA遺伝子配列決定のために-80℃で保存した（WT, ahr2 +/-）。高用量GO曝露群のahr2-/-魚の生存率が低下したため、ahr2+/-ゼブラフィッシュを腸内細菌叢組成の解析に使用した。
病理組織学
腸を4％ホルムアルデヒドで24時間以上固定した後、エタノールで脱水し、埋込ステーション（Tissue-Tek, Sakura Finetek）を用いてパラフィンに包埋した。次にパラフィン包埋組織をミクロトーム（Microm HM 360, Marshall Scientific）を用いて切断した。各スライスの厚さは5 µmであった。キシレン 5 分，キシレン 5 分，100%エタノール 3 分，95%エタノール 3 分，蒸留水 3 分の手順で脱パラフィンした．切片は、Olympus SC30デジタルカメラを装備したZeiss Axioplan顕微鏡を用いて、一般的な形態学的検査のためにヘマトキシリンとエオシンで、杯細胞の識別のためにアルシアンブルーと過ヨウ素酸シッフ試薬（ThermoScientific）で染色された。絨毛あたりの杯細胞数は、各条件につき6スライスの平均値として示した。
超微細構造解析
5 dpf 幼児および成体ゼブラフィッシュの腸を解剖し、対照動物および暴露動物の消化管の TEM 解析35 を行った。一次固定後，0.1 M リン酸緩衝液で洗浄し，0.1 M リン酸緩衝液中 2％ 四酸化オスミウム，pH 7.4 で 4℃，2 時間後固定を行った後，段階的にエタノール脱水，段階的にアセトン/LX-112 浸透を行い，最後に LX-112 で埋め込んだ．Leica EM UC7ウルトラミクロトームで半切片と超薄切片を作製した。超薄切片を酢酸ウラニル、クエン酸レイノルズで造影し、100kVで作動する日立HT7700透過型電子顕微鏡で観察した。デジタル画像は、2k × 2k の Veleta 電荷結合素子カメラで取得した。
16S rRNA 遺伝子配列の決定
QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN)を用いて、ゼブラフィッシュの腸サンプルの全DNAを抽出した。次に、フォワードプライマーTCGTCGGCAGCAGATGTGTATAAGACAGCCTACGGNGGCWGCAとリバースプライマーGTCTCGTGGCTCGAGATGTGTATAAGACAGGACTA CHVGGTATCTAATCCを用いて16S rRNA遺伝子のV3およびV4領域をターゲットにバクテリアユニバーサルプライマーでアンプリコンPCRを実施した。PCR反応にはKAPA HiFi HotStart ReadyMix (KAPA Biosystems)を使用した。Index PCRはNextera XT Index Kit（Illumina）を用いて行い、その後AMPure XPビーズでクリーンアップを行った。DNAライブラリーの濃度は、Agilent 2100 Bioanalyser (Agilent Technologies)で定量した。その後、DNAライブラリーをIllumina MiSeqシステムで配列決定し、生のペアエンドリード（2×150 bp）を生成した。
遺伝子配列の解析
前処理
cutadapt (version 2.9) を用いて配列からプライマーを除去し、FastQC (version 0.11.9) で配列の品質をチェックし、multiqc (version 1.9.dev0) で結合した。ASVはDADA2パッケージ36 (version 1.14.1)を用いて、細菌の16S rRNA遺伝子配列から推定した。DADA2パイプラインの残りの機能はデフォルトのオプションで実行したが、サンプル推論、すなわちシーケンスエラーを除去する前に、すべてのサンプルをサンプルごとに処理するのではなく、プールしたことを除いては、デフォルトのオプションで処理した。16S rRNA遺伝子配列のASVは、DADA2用にフォーマットされたSILVA分類学トレーニングデータ（バージョン138）37を使用して分類群に割り当てました。正規化ステップの前に、非細菌配列を削除しました。その後、ASVは累積和スケーリング38を用いて正規化された。前処理からさらに下流の解析までのステップは、R環境（3.6.2, R Core Team, 2019）で行った。
統計解析
前処理され正規化されたデータの教師なし分析および教師あり分析の前に、1つのサンプルにのみ発生するASVを削除した。WTおよびAhR欠損ゼブラフィッシュの腸内細菌叢における全体的な変動を調査するために、Rパッケージvegan39の関数cmdscaleを使用して主座標分析を実施した。次に、動物の性別を考慮し、WTおよびahr2+/-動物の腸内細菌叢に対するGO曝露の影響を調べるために、監視付き解析を用いた。Permutational Multivariate Analysis of variance (PERMANOVA) および Distance-based Redundancy Analysis (dbRDA) は、それぞれRパッケージveganの関数adonisおよびdbrdaを使用して行った。PERMANOVAとdbRDAの解析では、曝露、性別、遺伝子型をカテゴリー変数として適用し、微生物叢の組成を監修した。主座標分析、PERMANOVA、dbRDAでは、標本間ブレイ・カーティス距離を使用した。統計的有意性は、9,999回の無作為並べ替えに基づく。どのASVが暴露と遺伝子型において異なって豊富に存在するかを決定するために、RパッケージmetagenomeSeq（https://cbcb.umd.edu/software/metagenomeSeq から取得）の関数fitFeatureModelを使用した。
GFゼブラフィッシュの作製
GFゼブラフィッシュの生成は、以前に確立されたプロトコールに従った40。簡単に言えば、2 hpfの胚を、アンピシリン（100 μg ml-1）、カナマイシン（5 μg ml-1）およびアンフォテリシンB（250 ng ml-1）を補充した滅菌E3培地でペトリ皿に移し、28℃でインキュベートした。シールドステージ（6 hpf）までの50% epibolyで，胚の表面を0.1%ポリビニルピロリドン-ヨードで正確に2分間消毒し，その後0.003%滅菌漂白剤で18分間浸漬させた．その後，胚を滅菌E3培地で洗浄し，フラスコに移して28℃でインキュベートした．生存率をモニターし，滅菌培地を毎日更新した。4日目に、孵化した胚を無菌性の検証に使用した。ルリアブロスプレートを用いた細菌増殖と、細菌ユニバーサルプライマーを用いたDNA増幅の2つの異なるアプローチにより、グノトビオティックゼブラフィッシュの検証を行った。この目的のために，培養フラスコから 10 個の胚を無作為に選択した．最初のアプローチでは，胚を洗浄し，200μlの滅菌培地でホモジナイズした。次に，100μlのホモジネートをLuria brothプレート上に広げ，37℃で一晩培養した．翌日、細菌のコロニー形成を確認した。第二のアプローチとして，採取した胚のDNAをQIAamp DNA Mini Kit（QIAGEN社製）を用いて抽出した．DNAはDreamTaq Green PCR Master Mix（ThermoFisher）を用いてバクテリアユニバーサルプライマー（515F/806R）により増幅した。PCR産物を電気泳動で分離し、DNAの可視化にはMidori Green Direct (NIPPON Genetics Europe) を使用した。ゲル画像はGel Doc EZ System (Bio-Rad)を用いて撮影した。
ゼブラフィッシュ幼生への曝露
WTおよびahr2-/-成体ゼブラフィッシュを、カロリンスカ研究所のゼブラフィッシュ中核施設の魚類飼育循環系において、14時間：10時間の明暗周期で28.0±0.5℃に維持した。産卵の1日前に雄/雌の2ペアを仕切り付きの1つの交配水槽に配置した。産卵は朝、仕切りを取り外すことで開始された。胚は2時間後に回収し，洗浄後，シャーレに入れたE3培地に移した。同じ発生段階の健康な受精卵を選択し、5 dpfまで育てた。5dpfのゼブラフィッシュ幼生（CV WT，GF WT，CV ahr2-/-，GF ahr2-/-）をGOまたはBAあるいはGO+BAに24時間曝露した．各処理は3反復で行い，各反復試料には10匹の幼生が含まれていた．cyp1a誘導の陽性対照としてFICZ（200nM）を用いた。曝露後、サンプルはTEM解析のために2.5%グルタルアルデヒドで固定し、またはRT-qPCRのために-80℃で保存した（上記詳細）。
ラマンコンフォーカル解析
ゼブラフィッシュ幼生の消化管におけるGOの存在は、ラマン共焦点分析によってモニターした11。簡単に説明すると、GOに24時間暴露した幼虫を洗浄し、0.01%トリカリン溶液で麻酔し、スライドグラス上の1%低融点アガロース中に配置した。その後、サンプルを50℃のプレートヒーター上で乾燥させた。ラマン分析は、共焦点ラマン顕微鏡（WITec alpha300システム）を用いて、波長532 nmのレーザーを積分時間0.5秒、倍率60倍で行った。各サンプルのスキャンエリアは、50 × 50 µm2に調整した。表示されているスペクトルは、全領域のスキャンで記録された10,000のスペクトルの平均を表している。GOは、Dバンド（1,354 cm-1）、Gバンド（1,582 cm-1）、2Dバンド（2,690 cm-1）という特徴的なラマンサインに基づいて検出することができる。
RT-qPCR解析
RNeasy Mini Kit（QIAGEN社製）を用いて、GO+BAに曝露した5dpf幼虫または曝露しなかった幼虫（WT vs ahr-/-）に対してRNAの抽出を行った。RNA濃度はNanoDrop分光光度計（ThermoFisher社製）を用いて定量した。iScript Advanced cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad) を用いて Total RNA (500 ng) を逆転写した．QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) を用いて標的遺伝子の転写を定量した。反応混合物はMaxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (ThermoScientific)を用いて調合した。サーマルサイクリング条件は以下の通りである。95℃×10分、95℃×15秒、60℃×30秒、72℃×30秒の3段階増幅を40サイクル行った。プライマー（補足表3）はシグマ-アルドリッチ社から購入した。各標的遺伝子の転写レベルは、rpl13に対して正規化した。相対mRNA発現量は、2-ΔΔCt法を用いてコントロールに対する相対値を算出した。
Tg(cyp1a:GFP)レポーター株
トランスジェニック Tg(cyp1a:GFP) ゼブラフィッシュ41 は、China Zebrafish Resource Center から提供された。GFゼブラフィッシュの幼生は上記のように作製し、5 dpfでGO (30 µg ml-1)、赤色蛍光性resorufin butyrate (Sigma-Aldrich) (5 µM)、GO と resorufin butyrateの組み合わせに24時間曝露した。曝露後，幼虫を洗浄し，0.01%トリカインで麻酔し，1%低融点アガロース中に配置して共焦点顕微鏡（Zeiss LSM880，ZEISS）で解析した．明視野画像は透過光検出器（T-PMT）を用いて取得した。緑色および赤色蛍光画像は、それぞれcyp1aおよび酪酸を可視化するために488nmおよび561nmの下で捕捉された。画像はZEN 3.0 software, blue edition (ZEISS)で解析された。2.5D view tool (ZEN)を用いて擬似3次元画像を生成し、最高強度値はz軸の最大延長で表した。
Tg(lck:GFP)レポーター株
トランスジェニックTg(lck:GFP)ゼブラフィッシュ42は、European Zebrafish Resource Centerを通じて入手した。5dpfのCVおよびGF幼生をGO (30 µg ml-1)と酪酸 (2.5 mM)の組み合わせで24時間曝露した。曝露後、幼虫を洗浄、麻酔し、共焦点顕微鏡（Zeiss LSM880、ZEISS）による解析のために位置決めし、上記のようにした。腸にホーミングするlck陽性細胞の数は、1グループあたり7匹に基づいて手動で定量化した。GF条件下でのGO、酪酸、lck陽性細胞間の相互作用をよりよく可視化するために、酪酸レゾルフィン（5μM）も適用した。各スライスの 1 µm 間隔で z-stack 解析を行い、Fiji（ImageJ）43 を用いて z projection を作成した。
ゼブラフィッシュの解離とセルソーティング
GF WT (AB) ゼブラフィッシュの幼生を 5 dpf で GO (30 µg ml-1) と BA (2.5 mM) の組み合わせに 24 時間曝露した。GO と BA は曝露前に 1 時間プレインキュベートした。20匹の幼虫を1つの複製として、4つの複製、すなわち合計80匹の幼虫を各条件で使用した。曝露後、ゼブラフィッシュの幼虫は、公表されているプロトコルに従って、単細胞懸濁液のために解離させた44。簡単に言えば、ゼブラフィッシュ幼虫を0.01％トリケインで5分間安楽死させ、1.5 mlのチューブに集め、リン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄した。460μl の 0.25% トリプシン-EDTA (Gibco) と 40μl のコラゲナーゼ (Sigma-Aldrich) (100 mg ml-1) を含むあらかじめ温めた酵素ミックスを 500μl 加えて解離を開始し、続いて P1000 と P200 ピペットチップを用いて組織が見えなくなるまで 30℃の熱ブロック上で機械的に解離した (10 分程度). その後、10% FBSを添加した800μl DMEMを加えて解離を停止させた。細胞ペレットは、1,000 rpm、室温で5分間の遠心分離によって集められ、その後、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄された。その後、細胞を0.5 ml DMEM + 10% FBSに再懸濁した。各条件から4つの複製をこのステップでプールし、40μmのナイロンメッシュでろ過し、DMEM + 10%FBSで追加の洗浄ステップを行った。次に、細胞懸濁液を蛍光DNA色素DRAQ7（Invitrogen）（3μM）で室温で10分間染色し、FCS Expressソフトウェアバージョン7.0（DeNovo Software）で動作する蛍光活性化セルソーティング（BD FACSAria III、BD Biosciences）を用いて非生細胞の排除を可能にするようにした。各サンプルのDRAQ7-細胞は、DMEM＋10％FBSを含むチューブにソーティングし、直ちに氷上に置き、後述のようにscRNA-seq解析のためにさらに進めた。WT胚からの細胞のソーティングに加えて、scRNA-seqのためにlck+細胞を濃縮するために、GFトランスジェニックTg（lck：GFP）ゼブラフィッシュからの細胞もソーティングされた。50匹の幼生を1つの複製として使用し、各条件について4つの複製、すなわち合計200匹の幼生を使用した。曝露、単細胞化、DRAQ7 染色の手順は、WT ゼブラフィッシュと同じであった。ただし、ゲーティング戦略は前方散乱、DRAQ7、GFPに基づくものであった。DRAQ7-GFP+細胞はDMEM+10%FBSを含むチューブにソートされ、直ちに氷上に置かれ、scRNA-seq解析のために処理された。
シングルセルRNA配列決定
10x GemCode Single-Cell Instrument (10x Genomics) にロードしてシングルセルゲルビーズインエマルジョン (GEM) を生成し、Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1 (10x Genomics) でライブラリーを構築した。簡単に説明すると、バーコード付きSingle Cell 3' v3.1 Gel Beads、細胞を含むMaster Mix、パーティションオイルをChromium Next GEM Chip Gに結合してGEMを生成し、GEM生成後、ゲルビーズを溶解してIllumina TruSeq Read 1、10x Barcode、ユニーク分子識別子、ポリ（dT）シーケンスを含むプライマーを放出し、細胞をライジングさせました。バーコード付きの全長cDNAを合成し、精製してPCRで増幅し、ライブラリー構築した。イルミナ増幅で使用したP5およびP7プライマーを含むデュアルインデックスライブラリーを、サンプルあたり推定5,000核について調製した。ライブラリーのペアエンド、デュアルインデックスの配列決定は、NovaSeq 6000配列決定システム（Illumina）を用いて行った。Cell Ranger 6.0.1 (10x Genomics) pipelines (cellranger mkfastq and cellranger count) を使用して、Illumina Base callファイルをFASQT形式に変換し、配列決定リードをゼブラフィッシュ参照ゲノムGRCz11に整列し、特徴バーコードマトリクスを生成した。生成されたFeature-barcode matricesは、その後の解析に使用されました。
10x Genomicsデータの解析
10x Genomicsデータの解析は、Seurat toolkit (version 4.0.6) (available at https://satijalab.org/seurat/index.html) を用いて、R環境 (RStudio, version 4.2.0) の中で行った。QC メトリクス、データの正規化およびスケーリング、可変性の高い特徴の検出など、標準的な前処理ワークフローが適用されました。具体的には、ユニークな特徴数が6,000以上または200未満のChromium Single Cell 3'サンプルはフィルタリングされ、除外された。また、ミトコンドリア含有率は10%未満に設定した。QC後、WTコントロールサンプルの3,115シングルセルとWT GO+BAサンプルの3,012シングルセル（実験1）、Tg(lck:GFP) コントロールサンプルの2,312シングルセルと Tg(lck:GFP) GO+BA サンプル（実験2）の 2,669 シングルセルが下流の解析に使用された。QCを通過した生カウントは、スケールファクター10,000でセンタリングし、対数変換を行った。Seurat の 'FindVariableFeatures' コマンドを使用して、単細胞データに固有の平均-分散関係を直接モデリングすることにより、変動性の高い特徴を検出し、データセットあたり 2,000 の特徴が返された45。主成分分析の前に、データに対して線形変換（スケーリング）が行われた。Seurat の「RunPCA」コマンドを使用して、先に決定した高変量特徴のみを主成分の計算の入力として使用した。JackStrawPlot' と 'ElbowPlot' コマンドは、主成分のランキングを視覚化するために適用された。p 値が低く、特徴の濃縮度が高い有意な主成分を選択し、その後のクラスタリング解析に用いた46。具体的には、1回目と2回目のRNA-seq実験について、それぞれ20個と15個の主成分が同定された。t-stochastic neighbour embedding 変換47 は、Seurat の 'RunTSNE' コマンドで実現した。残りの全細胞と比較した各クラスター内の陽性マーカー遺伝子は、「FindAllMarkers」コマンドを使用して同定した。同定された特徴は、細胞の各クラスタにおいて0.25以上の割合で検出され、クラスタ間でLog2FC閾値0.25の差分発現（平均）があることが必要である。細胞クラスタは、Zebrafish Information Network (https://zfin.org/) と現在の文献25,48,49 に基づいて注釈付けされた。マーカー発現の可視化は、「DoHeatmap」、「VlnPlot」、「FeaturePlot」、「DotPlot」コマンドをそれぞれ用いて、ヒートマップ、バイオリンプロット、フィーチャープロット、ドットプロットで示した。さらにscRNA-seq統合解析を行い、両データセットに存在する細胞型を同定し、刺激に対する細胞型特異的な応答を見出した50。各データセットの正規化および変数特徴の同定は、上記のように独立して行われた。データセット間で繰り返し変数となった特徴は、Seuratの「SelectIntegrationFeatures」コマンドを使用して統合用に選択し、続いて「FindIntegrationAnchors」及び「IntegrateData」コマンドを使用して統合データアッセイを作製した。データのスケーリング、主成分分析、クラスタリング、t-stochastic neighbor 埋め込み変換など、上述の標準的なワークフローも統合データに対して実行された。split.by」引数は2つの条件を並べて可視化するために使用され、「subset」引数は特定のクラスターにデータをプロットするために使用された。両解析で得られたトランスクリプトームデータは、EMBL-EBIのArrayExpressに寄託されている。
統計解析
実験は少なくとも3回行い、各条件についてそれぞれ3連で行った。統計的な差は、スチューデントのt検定（GraphPad Prism version 8.2.0）を用いて分析した。提示されたデータは平均値±標準偏差(s.d.)である。群間または処理間の差は、p < 0.05のときに有意であるとみなした。16S rRNAデータおよびscRNA-seqデータの解析は、上記に記載されている。
報告書の要約
研究デザインに関する詳細な情報は、この論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryに掲載されています。
データの入手方法
16S rRNA遺伝子シーケンスデータはNCBI（アクセッション番号：PRJNA682318）に、2つのscRNA-seqデータセットはArrayExpress（アクセッション番号：E-MTAB-11984およびE-MTAB-11991）に寄託されています。ソースデータは本論文に添付されています。
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謝辞
本研究は、欧州委員会のグラフェンフラグシップ（助成番号：785219および881603）の支援を受けて実施された（B.F.）。TEM解析にご協力いただいたL. Haag氏（Electron Microscopy Core Facility, Karolinska Institutet）、ラマン解析にご協力いただいたJ. Sommertune氏（RISE Research Institute of Sweden, Stockholm）に感謝いたします。また、ゼブラフィッシュの飼育については、Karolinska InstitutetのZebrafish Core Facilityに感謝する。16S rRNA 遺伝子配列の解析には Karolinska Institutet の Bioinformatics and Expression Analysis (BEA) Core Facility に、蛍光活性化セルソーティングには Biomedicum Flow Cytometry Core Facility にご協力をいただいた。SciLifeLab, StockholmのEukaryotic Single Cell Genomics FacilityにはscRNAの配列決定で専門家の協力を、Uppsala Multidisciplinary Center for Advanced Computational Science (UPPMAX) のSwedish National Infrastructure for Computing (SNIC) には計算資源の提供をお願いしました。スウェーデン国立バイオインフォマティクス基盤（NBIS）のR. Francisは、scRNA-seqデータ解析について助言を行った。Graphenea社（スペイン）には、GOサンプルの提供を受けた。また、本研究で用いたTg(cyp1a:GFP)およびTg(lck:GFP)ゼブラフィッシュの提供については、Wellcome Sanger Institute (UK) から、ahr2変異ゼブラフィッシュ系統についてはChina Zebrafish Resource Center (China) および European Zebrafish Resource Center (Germany) から提供を受けたことに謝意を表する。
資金提供
Karolinska Institutetからオープンアクセス資金を提供された。
著者情報
著者および所属
カロリンスカ研究所環境医学研究所、スウェーデン、ストックホルム
Guotao Peng, Hanna M. Sinkko, Harri Alenius & Bengt Fadeel（彭国涛、ハンナ・シンコ、ハッリ・アレニウス、ベングト・フェーデル
ヒトマイクロバイオーム研究プログラム（HUMI）、ヘルシンキ大学、ヘルシンキ、フィンランド
Hanna M. Sinkko & Harri Alenius
カタルーニャ・ナノサイエンス・ナノテクノロジー研究所（ICN2）（スペイン・ベラテラ
ノイス・ロサノ & コスタス・コスタレロス
国立グラフェン研究所、マンチェスター大学生物学・医学・健康学部（英国・マンチェスター
コスタス・コスタレロス
カロリンスカ研究所比較医学部門（スウェーデン・ストックホルム
ラース・ブラウティガム
貢献
G.P.はすべての実験を行い、単一細胞のトランスクリプトームデータを含むデータを解析し、論文を作成した。H.M.S. は H.A. の指導のもと 16S rRNA 遺伝子配列の解析を行い、両者で論文のドラフトを作成した。N.L.はK.K.の指導のもとGOサンプルの特性解析を行い、L.B.はin vivo実験について助言を行った。B.F.は、研究の企画・調整、データ分析、論文執筆を行った。共著者全員が本論文の最終版を承認した。
共著者
Bengt Fadeelにご連絡ください。
倫理的宣言
利害関係
著者らは、競合する利害関係を宣言していない。
査読
査読情報
Nature Nanotechnologyは、Desheng PeiとStefan Oehlersがこの研究の査読に貢献したことに感謝します。
追加情報
出版社からのコメント Springer Natureは、出版された地図や所属機関に関する管轄権の主張に関して中立的な立場を維持しています。
エクステンデッドデータ
Extended Data 図1 野生型（WT）無菌（GF）対照試料とGO+BA試料の統合解析。
(a) tSNE解析の2次元投影図。lck+リンパ球（クラスタ6）および肝臓と膵臓に相当するクラスタ（クラスタ14）を示し、GO+BA魚で顕著に拡大している。以下は、GF対照試料（b、d）とGO+BA試料（c、e）における、脂質代謝（apoda.2）およびタンパク質分解（ela3l、ela2l、ctrb1、prss1、prss59.1、prss59.2）に関わる遺伝子の発現をそれぞれ示す特徴プロットである。
補足情報
補足情報
補足図1-17、表1-3。
報告書の要約。
補足データ1
Supplementary Fig. 2の統計元データ。
補足データ2
Supplementary Fig. 4の統計的出典データ。
補足データ3
補足図7.の統計的出典データ。
補足資料4
補足図10.の統計的出典データ。
ソースデータ
出典データ Fig.
統計的なソースデータ。
ソースデータ Fig.
統計的なソースデータ。
ソースデータ Fig.
統計のソースデータ。
権利と許可
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この記事の引用
Peng, G., Sinkko, H.M., Alenius, H. et al. Graphene oxide elicits microbiome-dependent type 2 immune responses via the aryl hydrocarbon receptor（酸化グラフェンはアリール炭化水素受容体を介して微生物に依存した2型免疫反応を誘発する。Nat. Nanotechnol. (2022). https://doi.org/10.1038/s41565-022-01260-8
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受領日
2020年12月17日
受理済
2022年10月12日
掲載
2022年12月12日発行