全身性硬化症におけるTh17/Tregの不均衡の制御による皮膚線維症の抑制
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公開日: 2025年1月9日
全身性硬化症におけるTh17/Tregの不均衡の制御による皮膚線維症の抑制
関口明子、下川智香子、…茂木精一郎 著者を表示
Scientific Reports 15巻、論文番号：1423（2025） この記事の引用
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要約
全身性硬化症（SSc）は、皮膚および内臓の線維化を特徴とする特発性全身性結合組織疾患であり、その発症機序におけるTh17細胞と制御性T細胞（Treg）のアンバランスが注目されている。マウスに自然に寄生するヘリコバクター・ポリギュラス（Hp）は、宿主においてTregを誘導することが知られている。我々は、Hpが誘導するTregがブレオマイシン誘発性皮膚線維症に及ぼす影響を調査し、SScの線維症におけるTh17/Tregバランスの役割を明らかにすることを目的とした。Hp感染は、ブレオマイシン誘発性皮膚線維症の進行とCD3+ T細胞およびCD68+ マクロファージの浸潤を抑制した。フローサイトメトリー分析により、Hp感染はTregを増加させ、ブレオマイシン誘発性Th17細胞の誘導を抑制することが明らかになった。Tregを除去すると、これらの効果が相殺されたことから、Hp誘発性Tregがブレオマイシン誘発性皮膚線維症と炎症を予防している可能性が示唆された。腸内細菌叢の分析により、Tregと正の相関関係にある細菌は、マウスのTh17細胞および皮膚線維症と負の相関関係にあることが示された。 線維症が重度のSSc患者では、腸内細菌叢のプロフィールが明らかに異なっていた。 これらの結果は、腸内細菌叢の変化がSScにおけるTh17/Tregの不均衡およびその進行の一因となっている可能性を示唆している。 Tregを増強してTh17/Tregの不均衡を調整することが、SScにおける線維症抑制のための有望な戦略となる可能性がある。
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はじめに
全身性硬化症（SSc）は、皮膚および内臓における線維症の発症、免疫異常、血管障害を特徴とするびまん性結合組織疾患である1。病態生理学の理解が進んでいるにもかかわらず、SScの根底にある正確なメカニズムは依然として不明である。SScにおける血管障害および線維症の誘因となるのはT細胞異常であるという見解が広く受け入れられている。最近の研究では、特にこの点においてTh17細胞と制御性T細胞（Treg）の役割が強調されている2,3。
Th17細胞は主にインターロイキン（IL）-6に応答して分化し、レチノイン酸関連オーファン受容体ガンマt（RORγt）の発現とIL-17の分泌を特徴とする。これらの細胞は、さまざまな自己免疫疾患の発症に関与していることが示されています4,5。 SScでは、患者の末梢血、皮膚、および肺におけるTh17細胞の割合とサイトカインレベルが、健常人と比較して上昇していることが研究により示されています。 さらに、これらの増加は疾患の活動性と過剰なコラーゲン産生と相関しています。 したがって、Th17細胞は、SScにおける炎症、線維化、および自己免疫の促進に重要な役割を果たしていることが広く認識されています6,7。
Treg細胞は、主要な転写因子であるフォークヘッドボックスタンパク質3（Foxp3）の発現により識別され、免疫の自己寛容を維持し、自己免疫反応と防御免疫反応の両方を調節する上で重要な役割を果たしています。 Treg細胞は、さまざまなメカニズムを通じてエフェクターT細胞と抗原提示細胞を積極的に抑制することで、調節機能を発揮します。これには、TGF-βやIL-10などの免疫抑制性サイトカインの分泌、代謝性アデノシンの生成、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4（CTLA-4）などの表面分子を介した細胞間相互作用などが含まれます8。Treg細胞が免疫調節において重要な役割を果たしていることは広く認められているものの、SScにおけるTreg細胞の頻度に関する研究では、健康な人と比較して高いレベルを示すものもあれば、低いレベルを示すものもあり、相反する結果が報告されています9,10。しかし、ほとんどの研究では、頻度に関わらず、SScにおけるTreg細胞の抑制機能が低下しているという点で一致している11。最近の研究では、自己免疫疾患においては個々のT細胞サブセットよりもTh17/Tregのバランスが重要であることが強調されている12,13。しかし、SScにおけるこの不均衡に特化した研究は限られており、そのメカニズムや臨床的意義の詳細な理解はまだ不足している。
蠕虫は、ヒトやその他の動物に寄生する多細胞生物であり、宿主の免疫応答を調節する高度な能力で知られている14。一般的に、寄生虫に対する免疫は、強力なTh2型免疫応答に依存している15。しかし、寄生虫は、この反応を転換または抑制するさまざまなメカニズムを進化させ、それによって自身の生存を確保している14,16。注目すべきは、寄生虫によって引き起こされる免疫反応には、宿主のTreg細胞の分化と増殖が含まれており、これは炎症や自己免疫疾患に著しい影響を与える可能性がある。疫学調査では、寄生虫感染の発生率は、世界規模で免疫介在性疾患の発生率と負の相関関係にあることが実証されている17。さらに、マウスにおける回虫（Heligmosomoides polygyrus）の感染は、Treg細胞の数を増加させ、アレルギーや自己免疫疾患の様々な動物モデルにおける症状を緩和することが示されている18,19。 このような寄生虫による免疫調節は、宿主の免疫系に対する直接的な影響と腸内細菌叢を介した間接的な影響の両方を通じて起こる可能性がある16。腸内細菌叢は、その酵素の副産物とともに、代謝や免疫反応などの宿主の生理機能に著しい影響を与えている。
これらの知見は、免疫介在性疾患におけるTreg細胞の役割を調査する上で、寄生虫感染症が貴重なモデルとなり得ることを示唆している。本研究では、ブレオマイシン誘発性皮膚線維症の進行に対する、寄生虫感染によるTreg細胞増殖の影響を調査し、SScにおける線維症の病態におけるTh17/Tregの不均衡の役割、および新たな治療戦略のターゲットとしての可能性を解明することを目的としている。
結果
寄生虫感染は、マウスのブレオマイシン誘発性皮膚線維症および炎症を抑制した
皮膚線維症に対する寄生虫感染の影響を調査するため、Hp感染の既往歴のあるマウスとないマウスにおけるブレオマイシン誘発性皮膚線維症の進行を比較した。ブレオマイシン注射開始から14日後、H&E染色により、Hpに感染した既往歴のあるマウスでは、感染歴のないマウスと比較して、ブレオマイシンによる皮膚肥厚の進行が有意に抑制されていることが明らかになった（図1A、B）。マッソン・トリクローム染色により、Hpに感染したマウスでは、感染していない対照マウスと比較して、ブレオマイシンによって誘発された線維化が抑制されていることが確認された（図1A）。さらに、ブレオマイシンによって引き起こされた皮膚コラーゲンレベルの上昇は、Hp感染マウスでは非感染マウスと比較して有意に少なかった（図1C）。免疫組織化学的染色により、ブレオマイシン注射によりHp感染マウスに誘導されたαSMA+筋線維芽細胞の数は、感染していないコントロールと比較して有意に少ないことが示された（図1D）。ブレオマイシンを投与したマウスは、SSc患者の炎症の側面を模倣することが知られており、これは線維症の誘導と関連している可能性がある20,21。したがって、次に、ブレオマイシン誘発性炎症に対するHp感染の影響を調べた。ブレオマイシン注射開始から5日後、免疫組織化学的染色により、Hp感染マウスの皮膚におけるCD3+ T細胞およびCD68+ マクロファージの浸潤が、感染していない対照群と比較して有意に少ないことが示された（図1E）。
図1
図1
線虫感染は、マウスのブレオマイシン誘発性皮膚線維症および炎症を抑制した。 (A) Hp感染または非感染マウスにブレオマイシンまたは対照用PBSを皮下注射し、14日後に採取した皮膚切片のH&E染色（上段）またはマッソン・トリクローム染色（下段）の代表的な画像。 スケールバー＝50μm。 (B) マウスの病変皮膚の真皮厚の定量化。値は、各群9匹のマウスからランダムに選んだ6～8の顕微鏡視野で測定した。 (C) 直径5mmの皮膚切片における可溶性コラーゲンの相対量。各群10匹のマウス。 (D) 皮膚切片の免疫化学染色画像の代表例。αSMA陽性筋線維芽細胞の数を示している。右のパネルは真皮におけるランダムに選んだ6つの顕微鏡視野における陽性細胞の定量化を示している。各群7～10匹のマウス。スケールバー＝50μm。（E）Hp感染または非感染マウスにブレオマイシンまたはコントロールのPBSを皮下注射し、5日後に採取した皮膚切片の代表的な免疫化学染色画像。CD3+ T細胞（上）およびCD68+ マクロファージ（下）の数を表す。右のパネルは、真皮の6つのランダムな顕微鏡視野における各陽性細胞の定量化を示す。n＝8～10匹/群。スケールバー＝50μm。値は平均値±SEMを表す。**P <0.01および****P <0.0001。（B-E）については、一元配置ANOVAに続いてTukey-Kramer検定を用いた。Hp：ヘリゴモイドポリギルス；BLM：ブレオマイシン；Ctl：コントロール。
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CD4+制御性T細胞は、ブレオマイシン誘発性皮膚線維症および炎症に対する寄生虫感染の抑制効果に必要である
次に、ブレオマイシン誘発性線維症および炎症の進展に対するHp感染の抑制効果における制御性T細胞の役割を明らかにするために、制御性T細胞の枯渇の影響を調べた。Treg細胞は一般的にCD3+CD4+CD25+Foxp3+ T細胞として特徴づけられるが、CD8+ Treg細胞（CD3+CD8+CD44+CD122+Ly49+）というサブセットもマウスおよびヒトで確認されており、自己免疫疾患と関連していることが報告されている19,22。CD4+Treg細胞を含むCD25-発現細胞と、CD8+Treg細胞を含むCD122-発現細胞を枯渇させるため、それぞれ抗CD25抗体、抗CD122抗体を腹腔内投与した。ブレオマイシン投与開始14日後、抗CD25抗体を投与したマウスでは、Hp感染によるブレオマイシン誘発性線維症の発症抑制効果は認められなかったが、抗CD122抗体を投与したマウスでは抑制効果が維持された（図2A-C）。ブレオマイシン注射によって引き起こされたαSMA+筋線維芽細胞の浸潤に対するHp感染の抑制効果は、抗CD25抗体を投与したマウスでは観察されなかったが、抗CD122抗体を投与したマウスでは維持された（図2D）。ブレオマイシン投与開始5日後の免疫組織化学染色では、抗CD25抗体投与マウスでは、Hp感染によるブレオマイシン誘発CD3+ T細胞およびCD68+マクロファージの浸潤抑制効果が認められなかったが、抗CD122抗体投与マウスでは抑制効果が維持されていた（図2E）。これらの結果は、Hp感染によるブレオマイシン誘発性皮膚線維症および炎症の抑制効果には、特にCD4+制御性T細胞であるTreg細胞が必要であることを示唆している。
図2
図2
CD4+制御性T細胞は、ブレオマイシン誘発性皮膚線維症に対する寄生虫感染の抑制効果、およびTh17/Tregの不均衡の調整に必要である。(A) 抗CD25抗体、抗CD122抗体、またはコントロールのPBSを腹腔内投与したHp感染または非感染マウスにブレオマイシンまたはコントロールのPBSを皮下注射し、14日後に採取した皮膚切片のH&E染色の代表的な画像。スケールバー＝50μm。 (B) マウスの病変皮膚の真皮厚の定量化。値は、各群n=5のマウスにおける6つのランダムな顕微鏡視野で測定した。 (C) 直径5mmの皮膚切片における可溶性コラーゲンの相対量。各群n=10のマウス。 (D) αSMA+筋線維芽細胞の数を表す皮膚切片の代表的な免疫化学染色画像。右のパネルは真皮における6つのランダムな顕微鏡視野における陽性細胞の定量化を示す。各群n=4-5のマウス。スケールバー＝50μm。（E）抗CD25抗体、抗CD122抗体、またはコントロールのPBSを腹腔内投与したHp感染または非感染マウスにブレオマイシンまたはコントロールのPBSを皮下注射し、注射開始から5日後に採取した皮膚切片の代表的な免疫化学染色画像。CD3+ T細胞（上段）およびCD68+ マクロファージ（下段）の数を示している。右のパネルは、真皮の6つのランダムな顕微鏡視野における各陽性細胞の定量化を示す。n＝5匹/群。スケールバー＝50μm。（F,G）抗CD25抗体、抗CD122抗体、またはコントロールのPBSを腹腔内投与したHp感染または非感染マウスにブレオマイシンまたはコントロールのPBSを皮下注射し、14日後に鼠径リンパ節を採取し、ゲートしたCD4+ T細胞中のTreg細胞（F）をCD25+Foxp3+細胞として、またTh17細胞（G）をTh17+細胞としてフローサイトメトリーで定量化した。122抗体またはコントロールのPBSを腹腔内投与した。 値は平均値±SEMを表す。 *P <0.05、**P <0.01、***P <0.001および****P <0.0001。 (B-G)については、一元配置ANOVAに続いてTukey-Kramer検定を用いた。 Hp、ヘリゴモナス・ポリギルス；BLM、ブレオマイシン；Ctl、コントロール。
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線虫感染によって誘導されたCD4+Treg細胞は、ブレオマイシン誘発性SScマウスモデルにおけるTh17/Tregの不均衡を調節する
次に、ブレオマイシン誘発性SScマウスモデルにおけるTh17とCD4+Treg細胞のバランスに対するHp感染の影響を調べた。まず、ブレオマイシンの投与によってTh17細胞の数が増加することを、マウスの鼠径リンパ節のフローサイトメトリー分析によって確認した。CD4+CD25+Foxp3+ Treg細胞は、Hp感染したブレオマイシン誘発性SScモデルマウスにおいて、非感染対照群と比較して有意に増加していました（図2F）。重要なのは、ブレオマイシンによって誘導されたCD4+CD17+ Th17細胞の数は、Hp感染マウスでは非感染対照群と比較して有意に少なかったことです（図2G）。注目すべきことに、抗CD25抗体処理によりTreg細胞が減少したマウスでは、ブレオマイシンによって誘導されたTh17細胞の増強に対するHp感染の抑制効果は観察されなかった。これらの知見は、Hp感染がTreg細胞の誘導を介してブレオマイシンによって誘導されたTh17細胞の増殖を抑制している可能性を示唆している。
ブレオマイシン誘発性皮膚線維症における腸内細菌叢とSScマウスモデルにおけるTh17/Tregバランスとの関連性
Hp感染がブレオマイシン誘発性皮膚線維症とTh17/Tregの不均衡に及ぼす調節効果のメカニズムを特定するため、腸内細菌叢の変化を調査した。Treg細胞数、皮膚厚、Th17細胞数の3つの主要パラメータに注目し、それらの相関関係をマウスの糞便細菌叢と分析した。細菌の多様性のパターンは、皮膚厚とTh17細胞数に類似していました（図3A）。マウスのTreg細胞数は、Akkermansia、RF39、Alistipes、Escherichia-Shigellaの多様性と強い正の相関を示しました。一方、皮膚厚とTh17細胞数は、これらの細菌とむしろ負の相関を示しました（図3A）。また、Hp感染マウスではこれらの細菌の数が増加するが、抗CD25抗体を投与したマウスでは増加しないことが観察された（図3B）。これらの結果は、これらの細菌が、おそらくTreg細胞の調節を介して、Hp感染によるブレオマイシン誘発性皮膚線維症およびTh17/Treg不均衡に対する調節効果に潜在的に寄与している可能性を示唆している。
図3
図3
ブリーオマイシン誘発性皮膚線維症とSScマウスモデルにおけるTh17/Treg不均衡における腸内細菌叢の関連性。 (A,B) 抗CD25抗体またはコントロール用PBSを腹腔内投与したHp感染または非感染マウスに、ブリーオマイシンまたはコントロール用PBSを皮下注射してから14日後に採取した糞便中の細菌属の調査。(A) 糞便細菌属の存在量とTreg細胞数、皮膚厚、Th17細胞数との相関関係を、それぞれ色調のカラー・スケールで表したピアソンの相関係数に基づく相関の強さを示すヒートマップ。 (B) Treg細胞数と正の相関関係にあるマウス糞便中の細菌の存在量。 n＝各群5～6匹。 値は平均値±SEMで表す。*P < 0.05、***P < 0.001。 (B) については、一元配置分散分析（ANOVA）に続いてTukey-Kramer検定を行った。 Hp：Heligmosomoides polygilus；BLM：ブレオマイシン；Ctl：コントロール；Treg：制御性T細胞
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SSc患者の腸内細菌叢の特徴の分析と臨床症状との比較
SSc患者が、疾患の病態生理に寄与する可能性のある独特な腸内細菌叢パターンを有しているかどうかを明らかにするために、36人のSSc患者の糞便細菌叢を調べ、20人の健常者の糞便細菌叢と比較した。階層的クラスタリングにより、分岐距離の閾値に従って参加者を4つのグループに分けた（図4A）。グループAはSSc患者のみで構成され、主座標分析（PCoA）プロットの右上部に独立したクラスターを形成した（図4B）。これらの結果は、SSc患者は腸内細菌叢の特徴に基づいて2つのグループに分類できることを示唆している。
図4
図4
SSc患者の腸内細菌叢の特徴。 (A,B) サンプル間のOTU分布から算出したBray-Curtis距離に基づく階層的クラスタリングツリー（A）および主座標分析（PCoA）プロット（B）に、36人のSSc患者と20人の健康な個人の糞便細菌叢を示す。(C) グループAのSSc患者の腸内細菌叢の減少により特徴づけられるビフィズス菌の相対的豊富度。 (D) 線虫感染によるTh17/Tregバランス調節を介したブレオマイシン誘発性皮膚線維症の抑制モデル。値は平均値±SEMを表す。 (C) には一元配置分散分析（ANOVA）に続くTukey-Kramer検定を用いた。 *P < 0.05および****P < 0.0001。 SSc、全身性硬化症； PCoA、主座標分析； OTU、オペレーショナル・タクソノミカル・ユニット； Treg、制御性T細胞； HV、健康なボランティア。
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グループAのSSc患者の特徴を明らかにするために、臨床的特性を調べ、グループAに含まれない患者のそれらと比較した（表1）。36人のSSc患者のうち、7人がグループAに属していた。びまん性皮膚SSc（dcSSc）の頻度は、グループAの患者の方が他のグループの患者よりも有意に高かった（85.7%対44.8%、P < 0.05）。さらに、総皮膚スコアもグループAの患者の方が他のグループの患者よりも有意に高かった（19.1±3.1 vs. 7.5±0.9、P < 0.01）。合併症に関しては、指潰瘍（DUs）および間質性肺疾患（ILD）が、グループAの患者において他のグループの患者よりも高頻度で発生しました（DU 71.4% vs. 27.6% (P < 0.05)、ILD 85.7% vs. 41.4% (P < 0.05))。これらの結果は、重症の皮膚硬化、間質性肺疾患、およびデュシェンヌ型筋ジストロフィーなどの特徴を持つSSc患者は、他のSSc患者や健康な人とは異なる独特な微生物叢を有している可能性があることを示唆している。また、グループAの特徴的な細菌を調べたところ、グループAのSSc患者は、他のグループの患者と比較してビフィズス菌のレベルが低いことが分かった（図4C）。
表1 A群に含まれる、または含まれないSSc患者の人口統計学的および臨床的特性の比較。
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考察
Th17細胞が、増殖性および炎症性サイトカインのカスケードを開始することで、SScにおける線維症の進行に重要な役割を果たしていることを示す証拠が増えている。in vitro 研究では、IL-17 がマウスの線維芽細胞において TGF-β や CTGF などの主要な線維化メディエーターの発現を促進し、これらの細胞におけるコラーゲン合成の増加につながることが示されている2。活動期の SSc 患者の Th17 細胞が産生する IL-17 は、線維芽細胞の増殖、コラーゲンの産生および分泌を誘導することが示されている23。マウスモデルを用いた研究により、IL-17Aノックアウトマウスでは2つの線維症動物モデル（ブレオマイシン誘発およびタイトスキン（TSK））において皮膚線維症の改善が認められることが明らかになっている。さらに、ブレオマイシンを投与したIL-17Aノックアウトマウスでは、皮膚におけるTGF-βおよびCTGFの発現が抑制された。SScにおけるTh17細胞は内皮細胞にも影響を及ぼす。SSc患者の血清由来のIL-17Aは、内皮細胞における細胞間接着分子1（ICAM-1）および血管細胞接着分子1（VCAM-1）の発現を誘導することが示されており、さらに、C-Cモチーフケモカインリガンド20（CCL-20）およびC-X-Cモチーフケモカイン受容体4（CXCR-4）の発現も誘導し、内皮細胞の炎症を引き起こすことが分かっている6,24。内皮細胞の損傷はフィブリン沈着と関連しており、血管内腔の狭窄や血管閉塞を引き起こし、微小血管障害の一因となる。広範な微小血管障害は慢性の組織低酸素症を引き起こし、それによって組織線維症が悪化する。さらに、血管から細胞外マトリックス（ECM）への白血球および炎症性サイトカインの遊走は、ECM線維症を悪化させる。したがって、IL-17AはSScで観察される炎症および線維症の両方において中心的な役割を果たしている。実際、IL-17A受容体拮抗薬であるブロダルマブはSSc患者の線維症を抑制することが示されており、有望な治療選択肢であると考えられている25。
最新の証拠によると、Th17細胞とTreg細胞は、その相互作用を通じて自己免疫反応を制御していることが示されている26,27,28。一般的に、抗原によって活性化されたナイーブT細胞は、TGF-βの存在下でRORγtとFoxp3の両方を発現する。Foxp3はRORγtの転写活性化を抑制し、Treg細胞の増殖を促進することで、自己免疫の異常な活性化を防止する27,28。しかし、IL-6、IL-1、IL-21などの炎症性サイトカインが存在すると、ナイーブCD4+T細胞はTh17細胞への分化が誘導され、Treg細胞への分化が阻害される26,27。さらに、IL-6を含むサイトカイン環境は、特定の制御性T細胞のIL-17産生細胞への分化を促進し、Th17細胞に類似したものになる可能性があることが研究で示されている29,30。IL-6はSScの病態形成に重要な役割を果たしており、病気の初期段階では患者の血液および組織中で増加していることから31、SScにおけるTh17/TregバランスはTh17サブセットに偏り、広範な線維化と持続的な炎症の一因となっていることが予想される26,32。本研究では、蠕虫によって誘導されたTreg細胞を用いて、SScにおける線維症の病態におけるTh17/Treg細胞バランスが果たす役割を調査した。その結果、線維症のマウスモデルでは、Th17/TregのバランスがTh17に偏って崩れていることが示された。さらに、Treg細胞の増加により、この不均衡を調整し、線維症の進行を抑制できる可能性がある。これらの知見は、Treg細胞の増加によるTh17/Tregの不均衡の調整が、SScにおける線維症の新たな有望な治療戦略となり得ることを示す証拠となる。
腸内細菌は宿主との共生過程でさまざまな代謝物を産生し、それらの代謝物は宿主細胞とコミュニケーションをとる分子として免疫系にも影響を及ぼす。短鎖脂肪酸（SCFA）は、特定の細菌による食物繊維やレジスタントスターチの醗酵によって産生される主な代謝物であり、酢酸、プロピオン酸、酪酸などがある。SCFAはTreg細胞の分化と移動を促進することが知られており34,35、全身性エリテマトーデス（SLE）、関節リウマチ（RA）、多発性硬化症（MS）などのさまざまな自己免疫疾患に対する抗炎症作用があることが報告されている36,37,38。腸内細菌叢の解析を行ったところ、線虫感染SScモデルマウスにおいて、Treg細胞数と正の相関を示した属である Akkermansia属、RF39およびAlistipes属は、SCFAの産生を介して宿主の免疫に影響を与えることが報告されている39,40,41。これらの細菌とTh17細胞数および皮膚厚との負の相関を考慮すると、ブレオマイシン誘発性のTh17/Tregの不均衡および皮膚線維症に対する、蠕虫感染によるTreg誘導を介した調節効果は、これらの細菌が産生するSCFAによって媒介される可能性がある。さらに、Treg細胞の枯渇は細菌の数を減少させ、これはHp感染によって増加した。Treg細胞の枯渇は腸管免疫系の調節を損ない、過剰な免疫反応を引き起こし、腸内微生物叢の構成を変化させる可能性がある。寄生虫感染が宿主のTreg反応を誘導する別のメカニズムには、寄生虫自身による代謝産物および免疫調節因子の分泌が関与している。例えば、Hpは数百種類のタンパク質をその排泄/分泌産物として分泌しており、その一部はナイーブCD4+ T細胞からin vitroでTreg細胞の分化を誘導することが示されている42。さらに分析を進めたところ、H. polygyrus TGF-βミミック（Hp-TGM）と呼ばれる活性タンパク質が特定された。このタンパク質は、TGF-β受容体に結合してSmadシグナル伝達を誘導することで、TGF-βの機能を模倣する43。これらの免疫調節因子は、樹状細胞やマクロファージなどのバイスタンダー細胞とも相互作用し、Treg細胞の誘導を助ける44。これらの因子が腸内細菌叢の変化と相まってTreg誘導に寄与している可能性がある。これらのメカニズムをより包括的に調査するには、さらなる研究が必要である。
マウスモデルにおいてTreg細胞と強い正の相関を示した細菌がSSc患者では減少しているのではないかという期待を持って、SSc患者の腸内細菌叢を分析したものの、これらの細菌とSScとの間に有意な関連性は認められなかった。しかし興味深いことに、重度の線維症患者は軽度の疾患患者や健常者と比較して、明らかに異なる細菌叢パターンを示しており、これはSScにおける線維症と細菌叢の関連性を裏付けるものである。今回の研究では、この腸内細菌叢の変化が SSc の引き金となっているのか、病気の進行に寄与しているのか、あるいは単に病気の結果として生じているのかを特定することはできませんでした。 しかし、腸内細菌叢を介した免疫調節が SSc 線維症の臨床応用に潜在的な可能性を持つという証拠は得られました。 例えば、SCFA を産生し、Treg 細胞を誘導することで宿主免疫を調節する細菌であるビフィズス菌の減少が観察されました。この微生物叢の不均衡を是正し、よりバランスの取れた微生物叢を回復させることが、SSc線維症の治療に役立つ可能性がある。この可能性を探るには、さらなる研究が必要である。
この研究にはいくつかの限界がある。まず、SSc線維症の病態に関与するTh17/Tregバランスを分析するには、リンパ節のみを調べるだけでは不十分である。リンパ組織と線維組織では結果が異なる可能性がある。第二に、本研究では、Hp感染がブレオマイシン誘発性Th17/Treg不均衡および皮膚線維症に及ぼす調節効果に関連する可能性のある細菌の候補がいくつか特定されたが、それらの細菌が関与しているかどうかは検証されていない。免疫機能および線維症の調節における特定の細菌の役割を直接評価するためには、今後の研究では無菌マウス、糞便微生物移植、または選択的細菌減少法を使用することが考えられる。第三に、腸内細菌叢とSSc患者におけるTh17/Tregの不均衡との関連性は、本研究では調査されておらず、今後の研究の興味深い課題として残っている。
最後に、Treg細胞の誘導によるTh17/Tregの不均衡の調整により、SScにおける皮膚線維症を抑制する機序モデルを提案する（図4D）。ブレオマイシンはTh17細胞を誘導し、Th17/TregバランスをTh17側にシフトさせ、SScで観察されるTh17/Tregの不均衡を模倣する。Th17細胞はIL-17を産生し、線維芽細胞を活性化してコラーゲン産生と線維化を促進する。寄生虫感染はナイーブT細胞のTreg細胞への分化を促進し、Th17細胞への分化を阻害することで、ブレオマイシン誘発性線維症の進行を抑制する。このメカニズムは、宿主の腸内細菌叢の変化によっても媒介される可能性がある。結論として、我々は、Th17/Tregの不均衡がSScにおける線維症の病因に関与しており、Treg細胞を増強することでこの不均衡を改善し、線維症の進行を抑制できるという証拠を示した。Th17/Tregの不均衡の制御に焦点を当てたSSc線維症に対する新たな治療戦略が期待される。
方法
患者
6人の女性と10人の男性、平均年齢63.7±11.2歳（平均±標準偏差）の日本人SSc患者36人と、年齢、人種、性別をマッチさせた健常者20人が本研究に参加した。すべてのSSc患者は、米国リウマチ学会/欧州リウマチ学会の2013年分類基準45を満たしていた。腸内細菌叢の分析のため、患者および健常者全員から糞便サンプルを採取した。17人の患者はLeRoyら46の分類に従って限局性皮膚SSc（lcSSc）と分類され、19人はびまん性皮膚SSc（dcSSc）と分類された。皮膚硬化は修正Rodnan皮膚厚スコア47を用いて評価した。間質性肺疾患（ILD）は、高解像度コンピューター断層撮影スキャンで確認できる両側性の間質性線維症またはガラス陰影として検出された。肺動脈性肺高血圧症（PAH）は、心エコー検査で右室収縮期圧の上昇として、その後、心臓カテーテル法で平均肺動脈圧の上昇として定義された。胃食道逆流症（GERD）は、内視鏡検査および/またはGERDの症状によって決定された。本研究は群馬大学倫理委員会（IRB2019-037 (1734)）の承認を得て実施された。被験者はすべて成人であり、研究参加に先立ち、書面によるインフォームドコンセントに署名した。本研究はヘルシンキ宣言の原則に従って実施された。
ブレオマイシン誘発皮膚線維症モデル
8週齢のC57BL/6マウスにブレオマイシンを注射して皮膚線維症を誘発した。ブレオマイシン（日本化薬、東京、日本）を1mg/mlの濃度で300μlを週5回、2週間注射した。これは、以前に報告された方法と同じである21,48。ブレオマイシンの処置のコントロールとして、300 µlのPBSを注射した。Hp感染の影響を調べるため、ブレオマイシン注射の2週間前に、マウスに200 L3幼生を経口感染させた。C57BL/6マウスはSLC（静岡、日本）から購入した。マウスは群馬大学生命科学研究支援センターの特定病原体フリーの条件下で飼育した。各実験の終了時には、マウスを二酸化炭素を用いて安楽死させた。すべての動物実験は群馬大学動物実験委員会の承認を得た。動物実験で使用したすべての方法は、関連するガイドラインに従って実施した。本研究の実験手順および報告は、ARRIVEガイドライン（http://arriveguidelines.org）に従って実施した。
寄生虫感染
Hpは、生きたマウスの継代により維持した。実験感染では、感染マウスの糞便中の卵を蒸留水に浸した濾紙上で培養し、卵を孵化させて感染性L3幼生へと成長させた。マウスには、以前に報告された方法19と同様に、200個のL3幼生を経口感染させた。感染は、糞便中の卵の検出によりモニタリングした。
組織学的検査および免疫蛍光染色
パラフィンに包埋したマウスの皮膚組織の4µm厚切片をヘマトキシリン・エオジン（H&E）またはマッソン・トリクロームで染色した。皮膚線維症は、無作為に選択した6つの顕微鏡視野における真皮の厚さ（表皮-真皮接合部から真皮-皮下接合部までの距離として定義）を測定することで、ImageJソフトウェア（バージョン1.8.0、米国国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ）を使用して定量化した。免疫組織化学的染色では、マウスの皮膚の組織切片を121℃で10分間、圧力鍋で処理して抗原を回収した。ペルオキシダーゼブロッキング（Dako、Glostrup、デンマーク）で5分間、プロテインブロック（Dako）で10分間ブロッキング処理した後、切片を抗αSMA抗体（Sigma-Aldrich、ミズーリ州セントルイス）、抗CD3抗体（Abcam、英国ケンブリッジ）、抗CD68抗体（Bio-Rad、カリフォルニア州ハーキュリーズ）とともにインキュベートした。洗浄後、切片を西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ポリマー結合二次抗体（ENVISION+；Dako）とともにインキュベートした。最後に、3,3′-ジアミノベンジジン四塩酸塩で発色させた。各染色法における陽性細胞は、無作為に選択した6つの顕微鏡視野における細胞数を数えることで評価した。
コラーゲン含有量の定量的評価
皮膚中の総可溶性コラーゲンは、メーカーのプロトコールおよび前述のプロトコール21に従って、Sircolコラーゲンアッセイ（Biocolor、アントリム州、英国）を用いて定量した。
生体内細胞枯渇
生体内でCD4+制御性T細胞を含むCD25を発現する細胞、またはCD8+制御性T細胞を含むCD122を発現する細胞を枯渇させるため、マウスに抗CD25抗体（7D4）または抗CD122抗体（TMβ-1）をそれぞれ500 µg、または対照としてPBSを、ブレオマイシン注射開始の1日前、3日後、5日後に腹腔内注射した。両抗体は、久枝 良雄博士（国立感染症研究所寄生動物部、東京）よりご提供いただいた。
フローサイトメトリー
マウス鼠径リンパ節の単細胞懸濁液を抗CD16/32（93；eBioscience）とともにインキュベートし、Fc受容体をブロックした。細胞は、ペルチェ蛍光共鳴エネルギー移動（PerCP-Cyanine5）、アロフィコシアニン（APC）またはフィコエリトリン（PE）に結合した以下のモノクローナル抗体で染色した（TONBO biosciencesまたはBioLegend）：抗マウスCD4（GK1.5）、抗マウスCD25（PC61.5）、抗マウスIL-17RB（9B10）。細胞内染色には、上述の方法で染色した細胞を BD Cytofix/Perm（BD Bioscience）で固定および透過処理し、抗マウス Foxp3（3G3）抗体で染色した。 蛍光抗体はすべて 1/50 に希釈して使用した。 染色した細胞を FACSverse（BD Bioscience）で流し、FACSDiva（BD Bioscience）でデータを取得した。データ解析には FlowJo 9.1 ソフトウェア（TreeStar）を使用した。
16S rRNA シークエンシングによる腸内細菌叢解析
糞便 DNA の抽出は、以前の研究を若干修正して行った49。マウスまたはヒトの糞便ペレットを、10mM Tris-HCl（pH 8.0）および 10mM EDTA を含む TE10 バッファーに懸濁した。糞便懸濁液を15mg/mlのリゾチーム（和光）とともに37℃で1時間インキュベートした。精製されたアクロモペプチダーゼ（和光）を2000ユニット/mlの最終濃度になるように加え、37℃で30分間インキュベートした。1% (wt/vol) のドデシル硫酸ナトリウムと1mg/mlのプロテアーゼK（メルク・ジャパン、東京 ）を懸濁液に添加し、55℃で1時間インキュベートした。遠心分離後、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（25:24:1）溶液を用いて細菌DNAを精製した。DNAはエタノールと酢酸ナトリウムの添加により沈殿させた。TEバッファー中の細菌DNAに、最終濃度が1mg/mlとなるようにRNase A（和光）を添加した。断片化した低分子DNAを除去するために、RNase処理後にポリエチレングリコール（PEG 6000）沈殿を行った。
V4可変領域（515 F–806R）は、Kozichらの方法に従って、Illumina MiSeqで配列決定した。各反応混合液には、各プライマーを15 pmol、0.2 mMのデオキシリボヌクレオシド三リン酸、5 µlの10× Ex Taq HSバッファー、1.25 UのEx Taq HSポリメラーゼ（タカラバイオ）、50 ngの抽出DNA、および滅菌水を最終容量50 µlとなるように加えた。PCR条件は以下の通りであった：95℃で2分間、95℃で20秒間、55℃で15秒間、72℃で5分間のサイクルを25回、その後72℃で10分間。PCR産物はAMPure XP（Beckman Coulter、Brea、CA、米国）で精製した。定量化のためのリアルタイム PCR は、製造元のプロトコルに従って、KAPA Library Quantification Kit for Illumina を使用してプールされたライブラリーに対して実施した。 20% の変性 PhiX を添加したサンプルライブラリーを、500 サイクルキットを使用して MiSeq によりシーケンスした。 分類群の割り当てとシーケンスデータからの相対的豊富度の推定は、QIIME2 バージョン 2023.551 の分析パイプラインを使用して実施した。アンプリコンシーケンスバリアント（ASV）は、QIIME2に実装されたDADA252を使用して、ノイズ除去後のリードから推定した。ASVの分類は、SILVAバージョン13853との比較に基づいて割り当てた。β-多様性は、Bray-Curtis 距離を用いて計算しました。これは、サンプル間の OTU 分布に基づいて微生物コミュニティ組成の相違を評価するものです。 微生物コミュニティの類似性に基づいてサンプルをグループ化するために階層的クラスタリングを行いました。 得られた Bray-Curtis 距離は、主座標分析（PCoA）を用いて視覚化しました。
統計分析
P値は、2つのグループ間の比較にはStudentのt検定（両側）またはカイ二乗検定を、複数のグループの分析には一元配置分散分析（ANOVA）に続いてTukey-Kramer検定を用いて算出した。データ分析にはGraphPad（バージョン9.4.1、GraphPad Software、サンディエゴ、CA）を使用した。エラーバーは平均標準誤差（SEM）を表し、実験数（n）は表中に示した。
データの利用可能性
配列データは、アクセッションコードDRA013870（マウス）およびDRA13871（SSc患者）で、日本DNAデータバンク（DDBJ）で入手可能である。本研究に関する追加データおよび資料は、問い合わせにより、責任著者の連絡先から入手可能である。
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謝辞
本研究は、日本学術振興会科学研究費補助金（20K17308（AS）および23K07758（YY））の支援を受けた。
著者情報
著者および所属
群馬大学大学院医学系研究科皮膚科学教室、〒371-8511 群馬県前橋市昭和町3-39-22
関口明子、内山明彦、横山陽子、荻野幸子、鳥居涼子、茂木精一郎
寄生虫学部門、国立感染症研究所、東京都新宿区戸山1-23-1
下川ちか子、久枝 肇
腸内生態系研究チーム、理化学研究所統合生命医科学研究センター、神奈川県横浜市鶴見区末広町1-7-22
加藤 保、大野 弘
貢献
A.S.は、実験の計画と実施、データの解釈、論文の執筆のすべてのプロセスに関与した。C.S.とT.K.は、実験の計画と実施、データの解釈のプロセスに関与した。A.U.、Y.Y.、S.O.、R.T.は、実験の実施プロセスに関与した。H.H.とH.O.は、実験の計画、データの解釈のプロセスに関与した。S.M.は、実験計画、データ解釈、論文執筆に関与した。すべての著者が論文を査読した。
責任著者
連絡先はSei-ichiro Motegiまで。
倫理宣言
競合する利害関係
著者は競合する利害関係がないことを宣言する。
追加情報
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この記事の引用
関口、下川、加藤、他。全身性硬化症におけるTh17/Tregの不均衡の制御による皮膚線維症の抑制。Sci Rep 15, 1423 (2025)。https://doi.org/10.1038/s41598-025-85895-2
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受理
2024年10月27日
受理
2025年1月7日
公開
2025年1月9日
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