AhRシグナル活性化による肺動脈性肺高血圧症 大腸炎から身を守る

哉百名


第203巻 第3号
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AhRシグナル活性化による肺動脈性肺高血圧症 大腸炎から身を守る
平出貴裕1*、寺谷俊明1*、上村静香2、吉松祐介1、長沼誠3、新谷良樹1、桃井瑞希1、小林英治1、袴田洋二2、福田圭一1、金井隆則1、Show All...
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ピーディーエフ

編集部へ：AhR（アリール炭化水素受容体）リガンドが宿主の健康や病気の重要なメディエーターであることを示す証拠が蓄積されています。漢方薬の青黛はAhRリガンドを多く含み、潰瘍性大腸炎（UC）の寛解を誘導することが示されている（1）。最近の全国規模の無作為化プラセボ対照試験では、8週間の青黛（0.5〜2.0g/日）摂取がUCの治療として有効であることが示されました（2）。しかし、清肺湯は肺動脈性肺高血圧症（PAH）という重篤な副作用を伴う可能性があることが知られています（3）。日本の全国調査では、49,320人のUC患者のうち877人（1.8%）に青竹が使用され、青竹を常用していたPAH患者11人が報告されました（4）。UC領域における青島の臨床的重要性にもかかわらず、青島によるAhRシグナル活性化とPAH発症の因果関係は十分に解明されていない。そこで、我々は、青醍がPAHを誘発するかどうかを実験的に調べるために、逆トランスレーショナル研究（ベッドサイドからベンチに戻る）を実施した。重要なことは、もし青島がPAHの病態に決定的に関与しているのであれば、PAHのAhRリガンド誘導モデルとして一般的に使用されるかもしれない、新しいPAHの動物モデルを確立できる可能性があることである。
 すべての動物実験は、NIHのGuide for the Care and Use of Laboratory Animalsの勧告に厳格に従って実施された。実験には、体重90-110gのFischer 344雄ラット（CLEA Japan）を使用した。ラットは、CE-2飼料または4％清代（福建省）を含む飼料（600mg／kg体重、UC患者の治療用量の10倍量に相当）、20mg／kgのシュゲン5416（SU5416）（アブカム）の単回皮下注射、および8mg／kg／日のAhR拮抗薬CH223191（Selleck）のガベージに従って8グループに配分された。ラットは8週間、正常酸素環境下で飼育した。最後の2週間は毎日CH223191のガベージを行った。AhRシグナルによって活性化されるチトクロームP450 1A1 (CYP1A1)の相対発現を評価するために、リアルタイム定量PCRを実施した(5)。プライマーおよびPCRプロトコルは、以前に記載したものである（6）。CYP1A1およびCD31の発現は、肺免疫組織化学により評価した。一次抗体として、ウサギ抗ラットCYP1A1ポリクローナル抗体（1：200；Abcam）およびマウス抗ラットCD31モノクローナル抗体（1：20；Elabscience）が用いられた。2群間の比較はMann-Whitney U test、複数群間の比較はKruskal-Wallis testにHolmの方法（ポストホックアナリシス）を加えて実施した。P＜0.05の値を統計的に有意とみなした。
右室収縮期圧は、SU5416を添加した清代食ラットが普通食群と比較して有意に高く、これはCH223191の経口投与により改善された（図1A）。さらに、右室肥大のパラメータである右室重量と左室＋中隔重量の比は、SU5416添加清代食群で最も高く、CH223191の投与により有意に改善された（図1B）。また、内側壁厚は、清代食、SU5416、およびSU5416添加清代食群で増加し、CH223191の投与により改善した（図1Cおよび1D）。定量的PCR分析により、CYP1A1 mRNAの相対的な肺レベルは、青島ダイエット、SU5416、およびSU5416添加青島ダイエット群で有意に上昇し、これらの上昇レベルは、CH223191の添加により有意に減少した（図1E）。肺標本の免疫染色により、清代食を与えたラットのCD31陽性肺動脈内皮細胞でCYP1A1が発現していることが示された。特に、Qing-Dai食およびSU5416注射群のラットは、他の群と比較してCYP1A1の高い発現を示した（図1F）。
図1.QD食8週間とアリール炭化水素受容体（AhR）シグナル活性化の影響。ラットにNDまたはQDを含む飼料を8週間与え、最後の2週間はSU5416の単回皮下注射とAhRアンタゴニストCH223191のガベージを行った（n = 6-10 rats per group）。(A) RVSP。(B) RV/(LV + S)。(C）各実験群のラットの肺の代表的なElastica van Gieson染色。スケールバー、20μm。(D）小肺動脈（直径20〜80μm）における％MWT（各群4匹のラットからのn＝16本の動脈）。(E）ラット肺におけるGAPDHと比較したチトクロームP450 1A1（CYP1A1）の相対的発現を定量的PCRで解析した。(F) ラット肺の肺動脈におけるCYP1A1（赤）、CD31（緑）およびDAPI（青）の免疫染色。スケールバー、20μm。NDを与え、SU5416を注射していないラットと比較して、*P < 0.05。QD食を与えたがSU5416を注射していないラットと比較して、†P < 0.05。SU5416注射をし、NDを与えたラットと比較した‡P < 0.05。これらの記号は、CH223191を経口投与していないラットで注釈されている。CH223191を投与した各群のものに対応するCH223191を投与していないラットと比較した§P < 0.05。MWT＝内側壁厚パーセント；ND＝普通食；QD＝青島；RV／（LV＋S）＝右室重量と左室＋隔壁重量の比；RVSP＝右室収縮期圧；SU5416＝シュゲン5416。
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本研究の結果、SU5416の皮下注射と青汁摂取の組み合わせは、ラットのPAH発症に対して相乗的または相加的な効果を示し、これらの効果はAhRシグナル阻害によって抑制されることが示された。また、ラット肺におけるCYP1A1の発現から、これらの作用が肺動脈内皮細胞におけるAhRシグナルの活性化を介するものであることが示された。SU5416投与および低酸素誘発PAHラットの肺では、CYP1A1が高度に誘導されていたことが報告されている（7）。これらのことから、青島の摂取は一貫してAhRシグナルの活性化を介してPAHの誘発に関連する可能性があることが示唆されました。また、青汁誘発性PAHの臨床疫学を調査し、UC患者における青汁の最適な投与方法を探るために、さらなる研究が必要である。
これまでの報告では、AhRシグナルの過活性化が腫瘍形成につながることが示されており（8）、一方、AhRリガンドとしての天然インドール化合物の不足は、活動性大腸炎やアトピー性皮膚炎の発症に関連し、UC患者の天然AhRリガンドの糞便中の含有量は、健康対照群と比較して著しく低い（9）。今回の研究結果と合わせると、生理学的にバランスのとれたレベルのAhRリガンドとAhRシグナル活性が、適切な免疫恒常性の維持と細胞増殖に不可欠であることが示唆されます（図2）。
図2.アリール炭化水素受容体（AhR）シグナル伝達経路の概要。AhRシグナルは、炎症促進、抗炎症、細胞増殖と関連している。マクロファージやTh17はIL-6、NF-κB、IL-17などの炎症性サイトカインを産生するが、ILC3やTregはAhRシグナルの活性化によりIL-22やIL-10などの抗炎症性サイトカインを分泌する。このバランスは、免疫の恒常性の維持に不可欠である。また、AhRシグナルは、内皮細胞や腫瘍細胞の増殖を活性化し、血管新生を促進する。人体には、藍やインジルビンなど、天然のAhRリガンドがいくつか存在する。トリプトファンは細菌による分解でインドールに代謝され、FICZは紫外線で生成される。Qing-DaiとSU5416はAhRの外因性リガンドである。I3Cはアブラナ科の野菜に含まれるグルコブラシシンの分解によって生成され、胃酸によって生成されるI3C代謝物はAhRリガンドとして作用する。今回の研究結果は、AhRの高活性化がPAHや腫瘍の進行リスクの増加と関連し、低活性化がUCやアトピー性皮膚炎と関連するという考えを支持するものであった。FICZ = 5,11-ジヒドロインドロ［3,2-b］カルバゾール-6-カルボキシアルデヒド、I3C = インドール-3-カルビノール、ILC3s = 3群自然リンパ球、NF-κB = 核因子κB、PAH = 肺動脈性高血圧、SU5416 = Sugen 5416、Th17 = T-helper cell type 17、Treg = regulatory T cells、UC = ulcerative colitis.
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さらに、本研究は、PAHの実験分野に新たな知見を提供するものである。PAH実験モデルの作製には、SU5416を皮下注射した後、3週間低酸素に曝露し、10-11週間正常酸素に再曝露する方法が従来から用いられている（10-12）が、これらのプロセスには低酸素室が必要で、長時間を要する。一方、SU5416は、AhRリガンドとして機能するとともに、血管内皮増殖因子受容体の阻害剤としても機能する。したがって、本研究により、SU5416といずれかのAhRリガンドを組み合わせた独自の方法が、低酸素室を必要とせず、従来のPAHモデルよりも短期間で実験的PAHモデルを作成するための代替有望なアプローチとなり得ることが明らかになった。
以上のように、我々は、臨床現場における清涼飲料水の副作用に基づく逆輸入研究を行い、AhR経路を介した清涼飲料水とPAHの因果関係を確認し、AhRシグナル活性化によるヒトPAHを模した実験モデルを用いた病態研究の未来を切り開くことができました。
謝辞
本原稿の原稿を編集してくれたエダンズグループ（https://en-author-services.edanzgroup.com/ac）のSusan Furness, Ph.D.に感謝します。
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*These authors contributed equally to this work.
‡Corresponding author (e-mail: m.kataoka09@keio.jp)。
厚生労働省研究費（201706009A）および医療イノベーション推進プログラム（18lk1403023h0001、医療イノベーション推進プログラム-進化科学技術基盤研究；16gm1010003h0001）の助成を受けた。
著者貢献： T.H.とT.T.は、実験、データ収集、解析を行った。Y.Y.、M.N.、K.F.は解析の監修を行った。S.U.、Y.S.、M.M.は、動物実験をサポートし、データを収集した。E.K.とY.H.は、動物実験を監修した。T.K.は、本研究を考案し、解析を監修した。M.K.は、実験を計画し、研究を監修した。T.H.、T.T.、T.K.、M.K.は、すべての共著者の貢献により論文を執筆した。
原文：DOI: 10.1164/rccm.202009-3385LE として2020年10月14日にプレスリリースされました。
著者の情報開示は、この手紙の本文とともに、www.atsjournals.org。
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