腸内細菌科細菌を生態系制御によって脱コロニー化するコンセンサルの存在
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公開：2024年9月18日
腸内細菌科細菌を生態系制御によって脱コロニー化するコンセンサルの存在
概要
長期にわたる抗生物質の使用や炎症状態により、腸内に病原性のある細菌が持続的に定着・増殖し、免疫異常や組織障害を持続させる可能性がある1,2。グラム陰性腸内細菌科病原菌は、特に従来の抗生物質治療には不応性である3,4が、常在細菌叢を操作することが実用的な代替治療戦略であることを示唆するエビデンスも出てきている5,6,7。我々は、健康なヒトの便サンプルから、腸内細菌を強く特異的に抑制する常在細菌コンソーシアムを単離し、ダウンセレクションした。18株の常在細菌からなる精緻なコンソーシアムの1つは、グルコン酸の利用可能性を制御することで生態学的ニッチを効果的に制御し、それによってコロニー形成抵抗性を再確立し、Klebsiella属およびEscherichia属に起因するマウスの腸炎を緩和した。これらの活性を生菌療法の形で利用することは、炎症性抗菌薬耐性腸内細菌科感染症の増大する脅威と闘うための有望な解決策となる可能性がある。
主要課題
強力な抗菌薬の発見と臨床応用は諸刃の剣であり、世界中で数え切れないほどの命を救うと同時に、世界の健康にとって重要な脅威となっている多剤耐性菌の進化と拡大に拍車をかけてきた。特に、エシェリヒア属やクレブシエラ属などのグラム陰性腸内細菌科細菌は、治療法の選択肢が限られている重要な多剤耐性院内感染病原体として台頭してきた3,4。多剤耐性腸内細菌科細菌の治療には、広域抗生物質がしばしば使用されるが、この抗生物質がさらに腸内細菌異常を悪化させ、耐コロニー性を損なう可能性がある。抗生物質による治療に加えて、炎症状態もまた腸内細菌が増殖する素因となる1,2,8,9,10,11,12。実際、炎症性腸疾患（IBD）はしばしば腸内細菌叢の形成異常や濃縮と関連しており13,14,15、腸内細菌叢の持続は腸の炎症や他の微生物による院内感染を永続化させる16,17,18,19。さらに、腸内における腸内細菌科細菌の増殖は、全身感染の主要な危険因子であり、死亡率の上昇につながる20,21。いくつかの臨床試験や前臨床試験で、糞便微生物叢移植（FMT）が腸内の腸内細菌レベルを低下させるのに有効であることがわかっている5,6,7。したがって、腸内細菌叢を操作することは、IBDや多剤耐性菌感染症を治療する有望なアプローチである。しかし、FMT療法は、結果がまちまちで、安全性に懸念があり、固有のバッチ間変動に起因する製造上の非現実性を示している5。これらの制限を克服するには、腸内細菌科細菌を脱コロナイズできる特定の細菌またはコンソーシアムを同定し、その作用機序を解明する必要がある。
18株のコンソーシアムがクレブシエラを除菌できる
クレブシエラ属菌は院内感染の主要な原因菌である3,4。私たちは以前、IBD患者から多剤耐性Klebsiella pneumoniaeKp-2H7株を分離した。このKp-2H7株は、抗生物質による腸内環境の異常によって増殖・持続し、Tヘルパー1（TH1）細胞を介した炎症を促進する17。我々は、Extended Data Fig.1aで概説した戦略を用いて、Kp-2H7の脱コロニー化を促進するヒト腸内常在菌の同定に着手した。無菌（GF）C57BL/6（B6）マウスをKp-2H7で単コロニー化した後、5人の健康な日本人ヒトドナー（A、F、I、J、K）のうちの1人の便サンプルを経口接種した。糞便中のKp-2H7コロニー形成単位（CFU）を経時的に定量することにより、各ドナーからのFMTによるKp-2H7除菌の有効性を検討した。すべてのドナーのFMTにより、Kp-2H7存在量は3～4 log減少した（図1a）。ドナーF、I、Kの便検体を6種類の培地で培養し、16SリボソームRNA（rRNA）遺伝子の塩基配列決定と全ゲノム塩基配列解析から、ドナーFから37株（重複排除すると31株のユニーク株）、ドナーIから41株、ドナーKから46株を分離した（Extended Data図1bおよび補足表1）。各ドナーから分離された菌株の混合物をKp-2H7-モノクローナル化マウスに接種し、Klebsiella-decolonization能力を試験した。ドナーF由来の31株の混合株（F31-mixと命名）が最も効果的であり、Kp-2H7減少の大きさと動態は、ドナーFの糞便微生物叢によって誘導されたものと同様であった（図1b,c）。
図1：Klebsiellaを除菌できる18株コンソーティウムの精緻化。
a-c,e,f、GF B6マウスをKp-2H7で単コロニー化した後、5人の健康なヒトドナー（A,F,I,J,K）のうちの1人（a）、または指定した細菌分離株の混合物（b,c,e,f）の便サンプルを経口投与した。d, GFマウス（n= 5）をKp-2H7で単コロニー化し（7日目）、F31-mixで処理し（0日目）、その後飲料水を介してアンピシリン（200 mgl-1）を投与した（32～63日目）。各 31 株の存在量は、2 つのテクニカルレプリケートで定量的 PCR（qPCR）により測定し、平均データを示した。RuminoはRuminococcus、CoproはCoprococcus。Extended Data Fig. a -c,e,fのデータは、同様の結果を得た2つの独立した実験から得られた代表的なデータの中央値±四分位範囲（IQR）である。28日目のデータは、多重比較のためのBenjamini-Hochberg補正を用いたKruskal-Wallis検定によって比較されている。
F31-mixから最小限のエフェクターコンソーシアムを同定するために、Kp-2H7でモノコロナイズマウスをF31-mixで処理した後、微生物叢のホメオスタシスを擾乱するために飲料水を介してアンピシリンを与えた（図1dおよび拡張データ図2a）。アンピシリン処理により、Kp-2H7（β-ラクタマーゼ17を保有）の存在量が一過性に急増したが、31株はさまざまな経過をたどった。Bacillota属の大半の菌株はKp-2H7と逆の存在量パターンを示したが、Bacteroidota属の菌株はほとんど変化しなかった（図1dおよび拡張データ図2a）。そこで、F31-mixをBacteroidota属6株（F6-mix）とその他の25株（F25-mix）の2つのグループに分けた。F25-mixはF31-mixと同程度にKp-2H7量を減少させたが、F6-mixは影響を及ぼさなかった（図1cおよびExtended Data図3a）。F25-mixからは、アンピシリン処理中にクリアされた5株と、Kp-2H7と同様の軌跡を示した2株（ルミノコッカス1株とコプロコッカス1株）を除外した（図1dおよび拡張データ図2a）。スピアマンの順位相関検定によると、残りの18株のほとんどがKp-2H7の存在量と有意に逆相関していた（Extended Data Fig.） そこで、これらの18菌株（F18-mix）の活性を試験したところ、糞便中のKp-2H7 CFUが、親株であるF31-mixで処理したマウスと同程度の大きさと速度で、しっかりと減少することが観察された（図1c,e）。経時的に採取した糞便サンプルの全長16S rRNA遺伝子配列決定により、18株すべてがコンタミネーションなしにコロニー形成に成功し、Kp-2H7が持続的に抑制されていることが確認された（Extended Data Fig.） F31-mixから除外された13株（F13-mix）の投与は、F18-mixよりもKp-2H7の除菌効果がはるかに低かった（図1c,eおよびExtended Data図3b）。F18-mixはKp-2H7に対して強力なコロニー形成抵抗性を示し、Klebsiellaを脱コロニー化する能力に加えて、F13-mixよりも有意に優れていた（Extended Data Fig.3c）。
また、F18-mixから様々な菌種の組み合わせを減算して7つの派生コンソシアを作製し、12～17株の大きさのコンソシアを得た。これらのコンソシアムは、in vivoでKp-2H7を脱コロニーする能力はさまざまであったが、F18-mixの完全体と同程度の効果を示したものはなかった（図1c,f）。特に、A群（Blautia属4株）、B群（Lachnospiraceae属6株）、C群（Bacillota属5株）、D群（その他の門の3株）のいずれかを欠く誘導体サブセットは、F18-mixのフルセットと比較して、いずれも脱コロニー能力が低下していた（図1c,f）。これらの結果は、F18メンバーが協調的に作用し、Kp-2H7を最大限に抑制するためにはすべての系統構成要素が必要であることを示唆している（補足考察1）。
F18-mixは腸内細菌科細菌を優先的に抑制する
次に、F18-mixが広域スペクトルβ-ラクタマーゼ（ESBL）＋ 大腸菌およびカルバペネマーゼ（CPM）＋ 肺炎桿菌を除菌する能力を調べた。比較のため、F31-mix、F13-mix、I41-mix、K46-mix、およびドナーFの完全な糞便微生物叢を追加分析した。F18-mixは、ドナーFの糞便微生物叢と同程度の大きさと速度論で、腸内のESBL+大腸菌およびCPM+肺炎桿菌を抑制するのに非常に有効であり、糞便CFUで3～4 logの減少を達成した（図2a）。F18-mixはKlebsiella aerogenes（Ka-11E12株）および付着性大腸菌（AIEC、LF82株）の脱コロニーにも高い効果を示した。K46-mixはF18-mixと同程度にKlebsiellaと 大腸菌を除菌したが、F13-mixとI41-mixは除菌効果が低かった（図2a）。注目すべきは、カンピロバクター・ウプサリエンシス（Campylobacter upsaliensis）や緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）など、腸内細菌科以外のシュードモナドータ（Pseudomonadota）のメンバーは、F18-mixを含むすべての試験済みコンソーシアムによる除染にほとんど抵抗性であったことである（Extended Data Fig.3d）。
図2：F18-mixは腸内病原体と大腸炎を制御する。
a, GF B6マウス（1群あたりn= 3-10）を指定の病原性株または抗生物質耐性株で単コロニー化した後、指定の混合細菌で処理した。b,c,クローン病患者(CD15)の糞便微生物叢でGF B6マウスをコロニー形成し、K. pneumoniae(b)または潰瘍性大腸炎患者(UC5)の糞便微生物叢でコロニー形成し、ESBL+大腸菌(c)でコロニー形成した。その後、すべてのマウスにバンコマイシン（VCM）を投与し、半数のマウスにF18-mixを2日間に4回経口投与した。糞便サンプルの全長16S rRNA遺伝子配列決定を行い、検出された菌株の相対的存在量を決定した。d-f, GFIl10-/-マウス（各群n= 6）にUC5微生物叢をコロニー形成させた後、F18-mix、F13-mixまたはビヒクルコントロールを投与した。実験期間中の大腸菌の糞便中CFU（d）、28日目の大腸の代表的なヘマトキシリン・エオジン染色（e；スケールバー200μm）、28日目の組織学的大腸炎スコア（f）を示す。a,d,fのデータは中央値±IQRで、多重比較のためのBenjamini-Hochberg補正を用いたKruskal-Wallis検定により比較した。
さらに、ドナーF、KおよびI由来のコンソーシアムのグラム陽性病原体に対する効果を調べた。これらの病原体には、バンコマイシン耐性腸球菌（VRE）およびクロストリジオイデス・ディフィシル（Clostridioides difficile）も含まれ、これらは優先順位の高い多剤耐性の脅威とも考えられている4。K46-mixはVRE（ATCC 700221）とC. difficile（BAA1382）の両方に有効であったが、I41-mixは有効ではなかった（図2a）。注目すべきことに、F31-mixはK46-mixと同様にVREの除菌に有効であったが、C. difficileに対してはこの効果は鈍かった。対照的に、F18-mixはこれらのグラム陽性病原体に対する効果は低かった（図2a）。これらの結果を総合すると、F31-mixからF18-mixに絞り込む過程で、腸内細菌科細菌を優先的に除菌できる常在菌が選択されたことを示している。
常在菌と大腸炎に対するF18-mixの影響
次に、F18-mixのコロニー形成が他の常在菌の存在量に影響を及ぼすかどうかを検討した。我々の培養コレクションから7つの常在菌株を選択し、これらの株とKp-2H7を同時にGFマウスに接種した。その後、F18-mixを経口投与し、各菌株の糞便量を経時的に観察した。F18-mix由来の菌株はすべてコロニー形成に成功し、Kp-2H7は顕著に減少した。常在菌であるBacillotaとBacteroidotaのレベルはほぼ安定していたが、7株のうち低存在株（Bifidobacteriumと Collinsella）のレベルは減少していた（Extended Data Fig.3e,f）。より複雑な微生物叢の設定におけるF18-mixの常在菌への影響を検討するため、GFマウスにI41-mix、K46-mix、またはこれらのコンソーシアムの両方とClostridium scindens株（合計88株）をコロニー形成させた後、F18-mixを経口投与した。ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）、コリンセラ（Collinsella）、メガファエラ（Megasphaera）のような低存在量のメンバーも減少を示したが、ドナーIまたはKに由来する株はほぼ安定していた（Extended Data Fig. これらのデータを総合すると、F18-mixは腸内常在菌群集に大きな影響を与えることなく、腸内のKlebsiellaレベルを低下させることができることが示唆される。
臨床への応用可能性をさらに検討するために、IBDに関連する複雑な微生物叢の中で、腸内細菌科細菌を除菌するF18-mixの能力を試験した。クローン病（CD15）または潰瘍性大腸炎（UC5）患者の糞便微生物叢をGFマウスに接種し、それぞれK. pneumoniaeまたはESBL+大腸菌を濃縮した（図2b,c）。その後、マウスにバンコマイシンを投与し、F18-mixの生着に適した生態学的ニッチを形成させた後、F18-mixを経口投与し、生きたバイオ治療製品24を用いた潜在的な臨床治療レジメンを模倣した。腸内細菌叢の構成は全長16S rRNA遺伝子配列決定によって調べられ（図2b、c）、肺炎桿菌または大腸菌の負荷は糞便CFUの計数によって決定された（Extended Data図4a、b）。すべてのF18株はIBD関連微生物群集にうまく生着し、その結果、微生物の多様性が増加し、肺炎桿菌と 大腸菌が抑制された（図2b,cおよびExtended Data図4a,b）。予想通り、バンコマイシン単独投与ではこれらの病原体は抑制されなかった。このように、F18-mixは臨床的に関連性のあるいくつかの複雑な微生物叢の中で抗腸内細菌科活性を発揮することができる。
Kp-2H7は腸内TH1細胞の強力な誘導因子であり、インターロイキン-10欠損（Il10-/-）マウスのような遺伝的に影響を受けやすい宿主では、大腸病原体として作用する17。Kp-2H7による大腸炎に対するF18-mixの効果を調べるため、GFIl 10-/-マウスにKp-2H7を単コロニー化し、F18-mixまたはF13-mixを経口接種した。野生型マウスと同様に、F13-mixではなくF18-mixで処置したIl10 -/-マウスは、Kp-2H7存在量が3～4 log減少した（Extended Data Fig.） F13-mixとは対照的に、F18-mixは大腸炎の組織学的スコア、リポカリン-2およびカルプロテクチン（いずれも腸炎症の高感度バイオマーカー）の糞便中濃度、およびTH1細胞の頻度を有意に減少させた（Extended Data Fig.） 同様の結果は、IL10-/-GFマウスにESBL+大腸菌（UC5）を含む潰瘍性大腸炎関連微生物叢をコロニー形成させた場合にも観察された。F18-mixの投与は、ESBL+大腸菌の脱コロニー化に成功し、腸の炎症から保護した（図2d-f）。以上より、F18-mixは腸内常在菌群を崩壊させることなく、腸内腸内細菌負荷を軽減し、IBD様炎症を緩和することが可能であり、高いトランスレーショナルポテンシャルが示唆された。
クレブシエラの脱コロニー化のメカニズムの解明
次に、F18-mixが介在するKlebsiella菌抑制のメカニズムを明らかにしようとした。F18-mixは、IFNγ応答欠損マウス（Ifngr-/-）、Toll様受容体シグナル欠損マウス（Myd88-/-Ticam1-/-（Ticam1はTrifとしても知られている））、あるいは自然および適応リンパ球欠損マウス（Rag2-/-IL2rg-/-）において、腸管Kp-2H7負荷を効率的に減少させることができた（Extended Data Fig. また、有効な微生物コンソーシアム（F31-mixまたはF18-mix）をコロニー形成したGFマウスと、そうでない微生物コンソーシアム（F13-mix）をコロニー形成したGFマウスで、腸管上皮細胞のトランスクリプトーム応答を評価した。しかし、抗菌ペプチドやPPARγ制御分子25,26など、以前に報告された抗クレブシエラ遺伝子産物をコードする遺伝子を含め、有効なコンソーシアムによって特異的に調節された遺伝子や経路の一貫したシフトは確認できなかった（Extended Data Fig.） したがって、F18-mixを介したKp-2H7の脱コロニー化には宿主因子が関与している可能性があるが、我々は細菌間相互作用に焦点を絞って研究を行った。
F13-mixではなく、F31-mixまたはF18-mixでコロニー形成されたマウスの糞便懸濁液は、in vitro嫌気性共培養でKp-2H7の増殖を強く抑制した（Extended Data Fig.） この抑制効果は、好気性条件下で共培養を行ったり、糞便懸濁液を濾過したり熱不活性化したりすると消失したことから、生きたF18-mix活性が必要であることが示唆された。液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）により、効果的なコンソーシアム（F31-mixまたはF18-mix）でコロニー形成されたマウスは、効果の低いコンソーシアム（F13-mixまたはF18-mixから系統群A、B、CまたはDを除いたもの）またはKp-2H7単独でコロニー形成されたマウスよりも、4-ヒドロキシ安息香酸（4-HBA）、コール酸、酢酸および酪酸の糞便中濃度が高いことが明らかになった（Extended Data Fig.） これらの分子は以前から、腸内細菌科細菌に対するコロニー形成抵抗性メカニズムに関与している27,28,29。しかし、コール酸は試験したすべての濃度でまったく効果がなく、4-HBA、酢酸および酪酸は弱い抑制効果しか示さず、in vitroでKp-2H7の増殖を抑制するには高濃度（酢酸および酪酸の場合は低pH）が必要であった（Extended Data Fig.） さらに、トリブチリン給餌による高濃度の酪酸塩曝露は、in vivoでのF18-mixまたはF13-mixが介在するKp-2H7抑制の速度や大きさに影響を与えなかった（Extended Data Fig.）
次に、F18-mixが、腸内細菌科細菌の腸内適性に関連する既報のプロセスを調節することによって作用するかどうかを調べた。しかし、クオラムセンシング（lsrA、lsrC、lsrB、lsrD、lsrR）30、バイオフィルム形成（csgD）31、ストレス応答（rpoS）31、硝酸塩呼吸（narG、narZ）1,8に関連するKp-2H7遺伝子の欠失は、F18-mixを介した脱コロナイズに対する感受性に有意な影響を与えなかった（Extended Data Fig.） これらの結果は、F18-mixが別のメカニズムで抗クレブシエラ活性を発揮することを示唆している。
グルコン酸競合によるクレブシエラの抑制
次に、Kp-2H7とF18-mixでコロニー形成したマウスとKp-2H7単独でコロニー形成したマウスのKlebsiellaのトランスクリプトームを比較した。F18-mixとの共コロニー化によって、Kp-2H7の転写様式は著しく変化し、炭素およびアミノ酸代謝に関連する経路やリン酸化酵素系に影響を与えた（Extended Data Fig.） 注目すべきことに、モノクローナル化Kp-2H7は、グルコン酸、グルコース、キシロース、グルクロン酸、アラビノース、ガラクツロン酸、リボースを含む様々な炭水化物の代謝に関与する遺伝子の強固な発現を示した（Extended Data Fig.） 対照的に、F18-mixの存在はこれらの遺伝子の発現を減弱させた（Extended Data Fig. この仮説は、グルコース32、グルカル酸33、ガラクチトール34,35,36、β-グルコシド糖37など、腸内細菌科細菌のニッチを規定する様々な炭水化物の役割を強調した先行研究38,39と一致する。
F18-mixとの共コロニー化によってKp-2H7の腸内適性に影響を与える遺伝子を同定するために、Kp-2H7に約8×105個の異なる変異を持つ、高度に飽和したトランスポゾン挿入変異体ライブラリーを作製した（1遺伝子あたり100個以上の挿入変異体を含むと推定される）（図3a）。GFマウスにすべてのトランスポゾン挿入変異体を含むKp-2H7プール（Kp-TPS）を接種し、その後F18-mixまたはF13-mixを経口投与した。糞便サンプルを経時的に採取し、トランスポゾン挿入シークエンシング40,41（Tn-seq）で解析した。F18-mix処理後、194のKp-2H7変異体は著しく体力を低下させ、その多くは炭水化物およびアミノ酸代謝に欠損を示した（図3bおよび補足表3）。特に、グルコン酸、グルコース、フルクトースなどの炭水化物の代謝に関与する遺伝子の変異は、F18-mix処理マウスにおけるKlebsiellaの抑制を、無処理マウスやF13-mix処理マウスに比べて加速した（補足表3）。これは、F18-mixがこれらの炭素源に対してKp-2H7と競合することを裏付けている。
図3：F18-mixはKp-2H7とグルコン酸を競合する。
a, Tn5ベースのトランスポゾンを用いたランダム挿入変異導入により、8×105個のカナマイシン耐性（KmR）Kp-2H7変異体（Kp-TP）が得られた。Kp-TPをプールし、GF B6マウスに投与した後、F18-mixまたはF13-mixを経口投与した。b,ヒートマップはF18-mix投与により有意に発現が低下した194のKp-2H7遺伝子を示す。c,各マウス（各群4匹）におけるKp-TP変異体の相対的存在量。d,K.pneumoniaeのグルコン酸代謝経路。GntRはグルコン酸トランスポーター（gntU）、グルコン酸キナーゼ（gntK）およびED経路酵素（eddおよびeda）をコードする遺伝子の発現を抑制する。e, GFマウスに野生型（WT）とΔgntKKp-2H7の1：1混合物をコロニー形成させ、その後F18-mixまたはF13-mixを経口投与した。糞便中のKp-2H7 CFUは、2回の独立した実験の代表値を示す。f, 栄養豊富な餌（CL-2）を与えたGFマウス（n= 4）の糞便中の指示した炭素源のLC-MS/MS分析。g, Kp-2H7、F18-mixまたはF13-mixでコロニー形成したGFマウスまたはGFマウスの糞便中のグルコン酸レベル。21日目に、飼料をCL-2から0％、2.5％または10％のグルコン酸を添加したグルコン酸欠乏（AIN93G）飼料に切り替えた。糞便中のKp-2H7 CFUを示し、2つの独立した実験の代表である。i, 病原株を300μMのグルコン酸で48時間培養した（n= 3生物学的複製）。培養上清中のグルコン酸濃度をLC-MS/MSで測定した。a,e-iのデータは中央値±IQRで、多重比較のためのBenjamini-Hochberg補正を用いたKruskal-Wallis検定（g,h）または両側Mann-Whitney U検定（e）で比較した。
各マウスにおけるKp-TPの相対量を比較すると、HTH型転写制御因子遺伝子（gntR）欠損マウスは、F18-mix処理マウスでは10日目までに消失したが、無処理マウスおよびF13-mix処理マウスでは高レベルで残存していた（図3c）。GntRはグルコン酸オペロン抑制因子として機能することが報告されている42,43。クレブシエラをはじめとする腸内細菌科の菌株では、グルコン酸はまずグルコン酸キナーゼ（GntK/IdnK）によってリン酸化され、6-ホスホグルコン酸（グルコン酸-6P）となる、 このグルコネートは、グルコネート-6Pデヒドラターゼ（Edd）によって2-ケト-3-デオキシ-6-ホスホグルコネート（KD6PG）に還元され、最終的にKD6PGアルドラーゼ（Eda）によってピルビン酸とグリセルアルデヒド3リン酸（GA3P）に変換される（Entner-Doudoroff経路44）； Fig. 3d). GntRは、環境中のグルコン酸が制限されると、Klebsiellaのグルコン酸トランスポーター（gntU）、グルコン酸キナーゼ（gntK/idnK）、およびエントナー・ドゥドロフ経路酵素（eddと eda）をコードする遺伝子を抑制する42,43（図3d）。したがって、Kp-2H7gntR変異体がF18-とF13-mixを共培養した場合のクリアランスに顕著な差があることから、グルコン酸代謝が、観察されたF18-mixによるKlebsiella抑制の重要な機構的基盤である可能性が示唆された。同様に、糞便サンプル中のKp-2H7遺伝子のトランスクリプトーム解析から、F18-mixでの処理後、グルコン酸オペロン遺伝子（gntK、gntU、edd）は著しく抑制されたが、F13-mixでは抑制されなかった（Extended Data Fig.） gntK欠損の同系Kp-2H7変異体を作製し、in vitroおよびin vivoでの適合性を調べた（図3eおよび拡張データ図8a）。予想通り、Kp-2H7 ΔgntKは、グルコン酸を唯一の炭素源として培養すると成長が阻害されたが、グルコース添加の最小培地では影響を受けなかった（Extended Data Fig.） 野生型とΔgntKKp-2H7の1：1混合物をGFマウスに接種し、F18-mixまたはF13-mixで処理した。野生型Kp-2H7と比較すると、ΔgntKKp-2H7は、F13-mix（3-4 log減少）だけでなく、F18-mix（5-6 log減少）でも脱コロニーに対する感受性が高かった（図3e）ことから、GntK依存的なグルコン酸代謝の制御が、腸におけるクレブシエラの抑制に関与していることが示唆された。
また、∆gntRKp-2H7株を作製し、上記と同様に検討した。gntR株はF13-mix処理には抵抗性であったが、F18-mix処理には野生型Kp-2H7と比較して感受性が高く、トランスポゾン変異体実験から得られた知見と一致した（Extended Data Fig.） gntRKp-2H7株のトランスクリプトーム・プロファイリングとin vitro培養研究から、GntRはグルコン酸代謝に関与する遺伝子の発現を抑制する一方で、グルコサミン代謝に関与する遺伝子の発現を亢進するという、二重の役割を担っている可能性が示唆された（Extended Data Fig.） この二重機能性は、∆gntRKp-2H7の状況に依存した体力差を説明できるかもしれない：gntR欠失はグルコン酸駆動の成長を促進する一方で、グルコン酸欠乏条件下では、グルコン酸オペロン遺伝子の無駄な発現とグルコサミン代謝遺伝子の発現障害により、成長を損なう可能性がある（補足考察3）。
通常のCL-2飼料を与えたGFマウスの糞便サンプルを定量的LC-MSで分析したところ、グルコン酸が最も豊富な炭水化物の1つであることが同定されたが、グルコサミンレベルは約20倍低かった（図3f）。グルコン酸欠乏のAIN93G飼料を与えたマウスでも、相当量の糞便中グルコン酸が観察された（Extended Data Fig. 糞便中のグルコン酸濃度は、Kp-2H7-monocolonizedマウスでは1 log、F18-mix-colonizedマウスでは2 log減少したが、F13-mix-colonizedマウスではわずかな影響しかなかった（図3g）。また、Kp-2H7、F18-mix、F13-mix、K46-mixまたはI41-mixでコロニー形成したマウスの糞便中のグルコン酸および他の主要炭素源を調べた。グルコン酸レベルは、効果的なコンソーシアム（F18-mixとK46-mix）にコロニー形成されたマウスでは大きく減少し、効果の低いコンソーシアム（I41-mixとF13-mix）にコロニー形成されたマウスではわずかに減少しただけであった。このパターンはグルコン酸に特有のもので、他の糖質ではクレブシエラ菌の脱コロニー能力との間にこのような明確な関連性は見られなかった（Extended Data Fig.9b）。さらに、グルコン酸の欠乏はモノコロナイズマウスのKp-2H7負荷を減少させ（Extended Data Fig. 逆に、過剰のグルコン酸を食事から補給すると、F18-mixのKlebsiella抑制効果は著しく低下した（図3h）。Kp-2H7でモノクローナル化したマウスに、95日間にわたり5日間隔で各F18株を順次接種したところ、Kp-2H7負荷の減少に並行して、糞便中のグルコン酸レベルの累積的な減少が見られた（Extended Data Fig.9d,e）。これらの結果から、F18株は競合的にグルコン酸の利用可能性を低下させることで、Klebsiellaを抑制するために協調的に機能していることが示唆される。
F18株のうち、8株が試験管内でグルコン酸を効果的に消費した（図4a）。これら8株のグルコン酸利用株の混合株（F8-mix）は、完全なF18-mix株よりも若干程度は低いものの、gnotobiotic環境においてKp-2H7負荷を大幅に減少させた（図4b）。注目すべきことに、グルコン酸の優先的利用はクレブシエラや エシェリヒアなどの腸内細菌科に比較的特異的な特徴であり、シュードモナス、カンピロバクター、ストレプトコッカス、E. faecium、C. difficileなどの他のグループの菌株はグルコン酸を効率的に消費しなかった（図3i）。このことは、F18-mix処理が他の病原菌よりも腸内細菌科細菌に対して選択的に有効であった理由を説明するかもしれない（図2a）。
図4：グルコン酸経路遺伝子を持つ株とIBDとの関連。
a, 左：各F18株のin vitroグルコン酸消費能（n= 3生物学的複製；中央値±IQR）。右、F18株で同定された推定グルコン酸代謝遺伝子のゲノム近傍。b, GF B6マウスをKp-2H7で単コロニー化し、F8-mixまたはF18-mixで処理した。糞便中のKp-2H7 CFUは中央値±IQRで示した。c,Klebsiella属およびBlautia属に典型的に見られる古典的および代替的なグルコン酸代謝経路。d, 中等症または重症（n= 57）または軽症（n= 64）と非活動性（n= 119）の小児潰瘍性大腸炎（UC）サンプル間の反復比較種数分析。点と線分は、ブートストラップによって得られたrの効果量と信頼区間を表す。種はMSPビン内のグルコン酸関連遺伝子の組み合わせに基づいてグループ分けした。e, コホート全体のMSP有病率（n= 240）。f,g,混合効果モデルにより、PROTECTにおけるカルプロテクチンおよび対象（n= 84）をコントロールした上で、種の存在量とグルコン酸の関係を定量化した。f,累積t値（係数は標準誤差で調整）は、グルコン酸の存在量と腸内細菌科細菌との間に主に正の相関があることを示す。プラス記号は、Benjamini-Hochbergで調整したP値が0.05未満の種とグルコン酸との関連を示す。効果量rはブートストラップによる信頼区間を用いて計算した。箱ひげ図では、中心線は中央値、箱はIQR、ひげは1.5×IQRまで。
注目すべきことに、LC-MS分析から、F18-mixはグルコン酸に加えてKp-2H7が好むさまざまな炭水化物を効果的に利用することが明らかになった（Extended Data Fig. さらに、Kp-2H7の分布は結腸のグルコン酸濃度と相関していたが、F18-mixによるKp-2H7の抑制にもかかわらず、グルコン酸濃度は下部小腸で高いままであった（Extended Data Fig.） これらの結果は、グルコン酸の利用可能性がクレブシエラのコロニー形成を決定する唯一の要因ではないことを示唆している。実際、これまでの研究では、ガラクチトール、セロビオース（β-グルコシド糖）、グルカリン酸など、いくつかの他の糖質が腸内腸内細菌の増殖制御に関与していることが示唆されている33,34,35,36,37。F18-mixが介在するKlebsiella抑制におけるこれらの糖の役割を明らかにするために、Kp-2H7とF18-mixをコロニー形成させたマウスに、個々の糖質を添加したAIN93G配合飼料を与えた。マンノース、キシロース、セロビオース、グルカレート、ガラクツロン酸の添加は、F18-mixに対するKp-2H7の感受性に影響を与えなかった。対照的に、グルコサミン、ガラクチトールまたはソルビトールの補給はKp-2H7レベルを有意に上昇させた（Extended Data Fig. しかし、グルコサミンとガラクチトールの糞便中濃度は非常に低いか検出限界以下であった（拡大データ図9a,bおよび10b）ことから、これらの糖質の競合がF18ミックスを介したKlebsiella抑制に大きな役割を果たしているとは考えにくい。F18-mixはソルビトール代謝の効率が低いにもかかわらずKp-2H7を脱コロンした（Extended Data Fig.） さらに、ソルビトールはKp-2H7を抑制しなかったI41-mixによって効果的に消費された（Extended Data Fig. まとめると、他の炭水化物との競合がKlebsiellaの増殖抑制に寄与している可能性はあるが、Kp-2H7は主にグルコン酸に依存しており、この重要な資源に対するF18-mixが介在する競合が腸内での増殖を阻害している可能性が最も高い。腸内グルコン酸の重要性は、単に栄養素としての役割を果たすだけにとどまらず、その存在と代謝が微生物の相互作用パターンに連鎖的な影響を及ぼす可能性がある（補足考察4）。とはいえ、これらの結果は、F18-mixの脱コロニー能力が文脈依存的であり、食事成分によって大きく影響される可能性があることを示している。
IBD患者におけるグルコン酸経路遺伝子
次に、F18株のゲノムの塩基配列を決定したが（補足表1）、顕著な病原因子や毒素は同定されなかった（補足表4）。テトラサイクリン耐性遺伝子はほとんどのゲノムに存在したが、多剤耐性を示す株はなかった（補足表5）。注目すべきは、Blautia属の3株、Enterocloster属の2株、および大腸菌の1株が、グルコン酸代謝に関与するとされる酵素やトランスポーターをコードする遺伝子クラスターを保有していたことである（図4aおよび拡張データ図11）。腸内細菌科細菌に見られる「古典的な」グルコン酸キナーゼ依存性代謝経路遺伝子とは対照的に、Blautia株とEnterocloster株で同定された遺伝子クラスターは、グルコン酸デヒドラターゼ（GAD）を利用する代替経路をコードしている。この経路では、グルコン酸はまずGADによって2-ケト-3-デオキシグルコン酸（KDG）に脱水され、次にKDGキナーゼ（KDGK）によってKD6PGにリン酸化され、最終的にEda46によってピルビン酸とGA3Pに切断される（図4c）。そこで、ドナーF、KおよびI由来の培養コレクション（101単離株から成る）のゲノム中の代替グルコン酸経路遺伝子の存在を調べた（補足表1）。いくつかの腸内細菌科細菌、ビフィドバクテリウム属細菌およびMegasphaera属細菌では古典的なグルコン酸オペロン遺伝子が同定されたが、Blautia属細菌、Ruminococcus属細菌、Enterocloster属細菌およびFaecalibacterium属細菌では、グルコン酸トランスポーターとGAD相同遺伝子の両方をコードする代替遺伝子クラスターが同定された（拡張データ図11および補足表6）。グルコン酸経路遺伝子クラスターの保有は、トランスポーターや脱水酵素／キナーゼ単独ではなく、in vitroでの効果的なグルコン酸消費と関連していた（Extended Data Fig.11）。
最後に、Predicting Response to Standardized Colitis Therapy (PROTECT)cohort47,48の潰瘍性大腸炎小児患者において、糞便中グルコン酸濃度とグルコン酸オペロン保有種の存在量および有病率との関連を調べた（Extended Data Fig.） 化学的基準を用いてLC-MSで測定し、注釈を付けた糞便グルコン酸の強度は、PROTECTにおける糞便カルプロテクチンのレベルと正の相関があった（Extended Data 図12b）。グルコン酸関連遺伝子を含むメタゲノム種パンゲノム（MSP）のうち、グルコン酸キナーゼおよびトランスポーター遺伝子を持つCitrobacter freundii、Klebsiella oxytoca、K. pneumoniae、E. coli、Megasphaera massiliensis、Megamonas funiformisとアノテーションされたものは、潰瘍性大腸炎患者の活動性と非活動性の疾患状態において有意に多く存在した。対照的に、GADオペロンをコードするBlautia、ClostridiumおよびFaecalibacteriumは、活動性のない病状の患者においてより豊富であった（図4d,e）。IBDにおける腸内細菌科細菌の増加は、炎症およびグルコン酸代謝以外の生化学的過程（硝酸塩呼吸など1,8）と関連していることから、混合効果モデルを用いて、糞便カルプロテクチンを固定効果として導入し、MSPとグルコン酸の存在量との関係を検討した。この解析の結果、特に腸内細菌科において、グルコン酸キナーゼをコードするMSPとグルコン酸存在量との間に正の相関があることが明らかになった（図4f,g、補足表7、補足考察3）。一般に、グルコン酸キナーゼとトランスポーターの両方をコードするMSPは、他の遺伝子の組み合わせを持つ種と比較して、グルコン酸量との関連が強かった（t値が高く、誤差が小さかった）。対照的に、GADオペロンをコードするMSPは一般的にグルコン酸量との関連が弱かったが、IBD49と関連することが多く、他の脱水酵素をコードするMSPよりもt値が高かったRuminococcus gnavusは例外であった（図4g）。
また、Integrative Human MicrobiomeProject14（HMP2）の成人IBDコホートも調べた（Extended Data Fig.） ここでもまた、IBDはグルコン酸キナーゼ遺伝子を保有する腸内細菌科菌種の増加と関連していた（Extended Data図12c）。特に、大腸菌、C. freundiiおよびK. pneumoniaeは、HMP2コホート内の疾患のある個体で一貫して有意に多いことが明らかになり（Extended Data図12c）、PROTECTでみられた傾向を反映していた。さらに、糞便カルプロテクチン濃度を混合効果モデルでコントロールした場合でも、グルコン酸濃度は、腸内細菌科を含むグルコン酸キナーゼオペロン遺伝子を持つMSPの多さと有意に関連していた（拡張データ図12e,fおよび補足表7）。逆に、常在菌におけるGADオペロンの濃縮は、IBDのない個体と関連していた（Extended Data Fig.
考察
ここでは、トップダウン的なgnotobioticアプローチ50を応用して、腸内細菌科菌株を効果的かつ選択的に脱コロニーすることができる、健常人由来の18のエフェクター細菌株からなる定義された微生物コンソーシアムを精緻化した。このF18-mixは、おそらく複数のメカニズムを通じて強力な抗腸内細菌作用を発揮するが、その主なメカニズムは、栄養の利用可能性を制限し、腸内の生態学的ニッチを再構築することである。微生物叢の各メンバーは独自の栄養プログラムを持っており、それが局所的な栄養の利用可能性を決定し、その結果ニッチが定義される。我々の結果は、先行研究32,33,34,35,36,37,38,39,51,52と合わせて、腸内細菌科が炭素嗜好性の階層を持ち、グルコン酸が腸内での増殖に最も好ましい炭素源の一つであることを示唆している。F18-mixによるグルコン酸の制限に直面すると、クレブシエラは代謝的に他の好ましくない炭素源を利用するように切り替えて代償する。しかしながら、F18-mixはこれらの代替炭素源のいくつかを効果的に消費することもでき、それによってクレブシエラが利用できる栄養素をさらに制限している可能性が高い。他の栄養依存性、種間相互作用の役割、腸内各部の常在細菌による炭水化物代謝の制御、食餌成分の影響など、効果的な競争を支配するルールを完全に解明するためにはさらなる研究が必要であるが、今回の研究結果は、生態学的制御によって腸内細菌科病原菌の抑制を目的とした微生物指向型治療法を開発するための確かな基盤となるものである。全体として、F18株は、蔓延する感染症や炎症性疾患を治療するための生きたバイオ治療製品として、臨床開発の有望な候補となる。
方法
マウス
三共ラボラトリーズジャパン、SLCジャパンまたはCLEAジャパンより、GF条件下で飼育されたC57BL/6マウスを購入した。GFマウスおよびgnotobioticマウスは、慶應義塾大学医学部またはJSR-慶應義塾大学医化学イノベーションセンターのgnotobiotic施設内で飼育・管理された。Il10-/-およびIfngr 1-/-マウスはJackson Laboratoriesから購入した。Myd88-/-Ticam1-/-マウスおよびRag2-/-IL2rg -/-マウスはオリエンタルバイオサービスより購入した。すべてのマウスは12時間の明暗サイクルで飼育された。温度20-24℃、湿度40-60％の環境下で飼育した。すべての動物実験は慶應義塾大学動物実験委員会の承認を得た。
ヒト糞便サンプルおよび細菌株の分離
ヒト糞便サンプルは、慶應義塾大学医学部施設審査委員会の承認（承認番号20150075、20140211、20150075）に従って、健康なヒトドナー、潰瘍性大腸炎患者、クローン病患者から採取した。各個人からインフォームドコンセントを得た。糞便サンプルはPBS（20％グリセロール含有）と混合し、-80℃で保存した。各サンプルのアリコートを嫌気チャンバー（80％N2、10％H2、10％CO2；Coy Laboratory Products）内でPBSで希釈し、異なる寒天プレート（EG、mGAM、BHK、CM0151、MRSまたはBL培地）にプレーティングした。2～7日間培養後、外観の異なるコロニーを液体培地（EG、mGAM、HKまたはCM0149）に移し、24～48時間培養した後、グリセロール（最終濃度20％（v/v））と混合し、-80℃で保存した。単離した菌株から、糞便サンプルからのDNA単離と同じプロトコルで細菌ゲノムDNAを抽出した。16S rRNA遺伝子座は、KOD plus Neoキット（東洋紡）を用いて、メーカーのプロトコールに従ってPCR法により増幅した。DNA配列決定はEurofins社により行われた。配列はNCBIのBLASTプログラムとRibosomal Database Project (RDP)データベースを用いてアライメントした。DNA配列決定に使用したプライマーは以下の通りである： F27プライマー：5′-AGRGTTTGATYMTGGCTCAG-3′；R1492プライマー：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′。培養コレクション中の個々の単離株は、それらの16S rRNA遺伝子配列が98.0％以上の相同性を共有する場合、「株」としてグループ化した。
接種用の細菌混合物を調製するために、単離した菌株をそれぞれ適切なブロス中で37℃、1～2日間培養した（F18株の培養にはmGAMブロスを使用）。600nmの吸光度から菌密度を調整し、等量の培養株を混合して3,000g、10分間、4℃で遠心分離し、5倍に濃縮した。その後、GFマウスに1匹あたり200μlの混合菌体（総菌数約1～2×109CFU）を経口投与した。混合細菌を経口ガベージによりGFマウスに投与した（マウス1匹あたり200μl、総菌数約1〜2×109CFU）。Extended Data Fig.3eでは、f37_E. coli株をE. coliNissle1917株（Mutaflor、DSM 6601）に置き換えている。
病原性細菌株および常在細菌株に対する定義されたコンソーシアムの効果
病原性細菌に対する定義コンソシアの効果を調べるため、C57BL/6 GFマウス（8～14週齢、別々のGFアイソレーターに収容）にK. pneumoniae2H7（Kp-2H7）, カルバペネム耐性K. pneumoniae（CPM+Kp, ATCC BAA1705）,K. aerogenes（Ka-11E1217 株）, extended-spectrum-β-lactamase producingE. coli（ESBL+E.coli）、ESBL-β-ラクタマーゼ産生E. coli（ESBL+大腸菌、ATCC BAA2777）、付着性侵入性大腸菌（AIEC、LF82株、N.Barnich23より提供）、緑膿菌（ATCC 10145）、バンコマイシン耐性E. faecium（VREEf、ATCC 700221）、C. upsaliensis（ATCCBAA1059）、またはC. difficile（Strain630、ATCC BAA1382）を経口投与した（マウス1匹あたり2×108CFU）。病原性微生物によるコロニー形成の7日後、マウスに200μlの分離菌株ミックス（合計109CFU）または200μlのヒト糞便懸濁液を経口経口投与した。糞便サンプルを3～4日ごとにマウスから採取し、PBS（20％グリセロール含有）に懸濁し、選択培地（Kp-2H7、CPM+ Kp、Ka-11E12および緑膿菌には30 mg l-1アンピシリンおよび30 mg l-1スペクチノマイシンを添加したDHL寒天培地、1 mg l-1セフォタキシムを添加したMacConkey寒天培地、VREにはVRE選択寒天培地プレート（BD 251832））で培養した。24～48 時間の培養後、CFU をカウントした。CFU の計数による評価が不可能な場合は、糞便から抽出した細菌 DNA を定量的リアルタイム PCR（qPCR）により評価した。Kp-2H7に対するコロニー形成抵抗性活性を評価するため、C57BL/6 GFマウスにまずF18-mixまたはF13-mixをコロニー形成させ、7日目にKp-2H7を接種した。3～4日ごとに糞便サンプルを採取し、Kp-2H7 CFUをカウントした。Kp-2H7に対する18株の累積効果を調べるため、C57BL/6 GFマウスにKp-2H7（マウス1匹あたり2×108CFU）を経口経口投与した後、F18-mixの各株を5日ごとに1株ずつ95日間経口投与した。5日ごとに糞便サンプルを採取し、Kp-2H7のCFUをカウントするとともに、グルコン酸レベルを定量化した。
常在菌に対するF18-mixの影響を調べるために、我々の培養コレクションから7株（Dorea longicatena、Eubacterium rectale、C. scindens、Bacteroides thetaiotaomicron、Bacteroides uniformis、Bifidobacterium adlescentis、Collinsella aerofaciens）を選択した。C57BL/6 GFマウスに7種の常在菌とKp-2H7（各2×108CFU）をコロニー形成させた。14日後、マウスにF18-mix（200 μl中109CFU）を経口投与した。糞便サンプルを週2回採取し、CFU計算とqPCRによる定量を行った。より複雑な微生物叢の中での F18-mix の効果を調べるため、C57BL/6 GF マウスに、ドナー I 由来の 41 株、ドナー K 由来の 46 株、または両群を組み合わせたC. scindensVE202-26 （合計 88 株）をコロニー形成させた。その後、事前に抗生物質を投与することなく、これらのマウスにF18-mixを経口接種した。糞便は全長16S rRNA遺伝子配列解析のために採取した。
細菌叢異常におけるF18-mixの影響を調べるために、GF B6またはIl 10-/-（B6バックグラウンド）マウスに、高レベルのESBL+大腸菌またはK. pneumoniaeを含む潰瘍性大腸炎またはクローン病患者の糞便懸濁液200μlを投与した。IBD微生物叢接種の10日後、マウスに1 gl-1バンコマイシン500 μlを経口経口投与した。マウスをF18-mixで4回処理した（バンコマイシン処理後4、8、24、48時間）。糞便を回収し、16S rRNA遺伝子の塩基配列決定または大腸菌または肺炎桿菌のCFU計数を行った。
炭水化物による食餌補充
特に指示がない限り、マウスにはグルコン酸を多く含む栄養価の高い飼料（CL-2；CLEA Japan）を与えた。糖質補給の影響を評価するため、グルコースを多く含むが、グルコン酸、ソルビトール、マンノース、キシロース、グルカレート、ガラクツロン酸、キシロースを欠く配合飼料（AIN93G；オリエンタル酵母工業）を用いた。この飼料に、グルコン酸塩（総カロリーの0％、2.5％、10％）、またはグルカリン酸塩、ガラクチトール、ソルビトール、セロビオース、グルコサミン、キシロース、マンノース、ガラクツロン酸塩などの他の炭水化物を10％ずつ添加した（補足表8）。飼料はγ線照射（50 Gy）により滅菌した。
細菌DNA抽出および定量的リアルタイムPCR
凍結した糞便サンプルを解凍し、各サンプル50μlを、RNase A（最終濃度100μgml-1、Invitrogen）およびリゾチーム（最終濃度3.0 mgml-1、Sigma）を含む350μlのTE10（10 mM Tris-HCl、10 mM EDTA）緩衝液と混合した。懸濁液を37℃で1時間、穏やかに攪拌しながらインキュベートした。精製アクロモペプチダーゼ（和光）を最終濃度2,000ユニットml-1になるように加え、さらに37℃で30分間インキュベートした。その後、ドデシル硫酸ナトリウム（最終濃度1%）とプロテイナーゼK（最終濃度1 mg ml-1、ナカライ）を懸濁液に加え、55℃で1時間インキュベートした。その後、Maxwell RSC培養細胞DNAキットを用いて、メーカーのプロトコールに従ってサンプルから精製DNAを得た。細菌のDNA量を定量するために、Thunderbird SYBR qPCR Mix（東洋紡）とLightCycler 480（Roche）を用いてリアルタイムqPCRを行った。本研究で使用したプライマー対を補足表9に示す。
全長16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンス
全長16S rRNAアンプリコンシークエンシングは、PacBio社が用意したプロトコルに若干の修正を加えて実施した。簡単に言うと 全長16S rRNA遺伝子（超可変領域V1〜V9を含む）を、バーコード付き27Fmod（5′-Phos-GCATCNNNNNNN）を用いて増幅した。 GCATCNNNNNNAGRGTTYGATYMTGGCTCAG-3′）およびバーコード化1492R（5′-Phos-GCATCNNNNRGYTACCTTGTTACGACTT-3′）プライマーを用いて増幅した； Phos」は5′-リン酸修飾を示し、「N」は各サンプルに固有のPacBioバーコード配列を示す。PCR条件は以下の通り：95 °Cで3分間の初期変性、95 °Cで30秒間の変性、57 °Cで30秒間のアニーリング、72 °Cで60秒間の伸長を20サイクル繰り返した。PCR産物はAMPure磁気ビーズを用いて精製し、等モル濃度でプールした。プールしたアンプリコンをAMPureビーズでさらに精製し、1μgをライブラリー調製に用いた。ライブラリーはPacBio SMRTbell Prep Kit 3.0のプロトコールに従って調製し、PacBio Revioシステムでシーケンスした。HiFiリードはSMRT Linkソフトウェア（バージョン13.0）を用いてデフォルト設定で自動生成し、SMRT Toolsのlimaアプリケーションを用いてHIFI-ASYMMETRICプリセットでデマルチプレックスした。
アンプリコン配列のバリアント解析
全長16S rRNA遺伝子アンプリコン配列バリアント（FL16s-ASVs）は、R（バージョン4.3.3）のDADA2パッケージ（バージョン1.30.0）を用いて、以前に記載されたDADA2 for PacBioワークフロー53に若干の修正を加えて、デマルチプレックスしたHiFiリードから推論した。minQ=3、minLen=1300、maxLen=1600、maxN=0、rm.phix=FALSE、maxEE=2。Revioシステムで採用されているビン化品質値のため、'dada2:::PacBioErrfun'オプションなしでlearnErrors関数を使用して、最大QV40でエラー率を学習する。次に、FL16s-ASVを、公開ゲノム（2023年9月12日にGenBankからダウンロード）から抽出した16S rRNA遺伝子配列との相同性検索に、BLASTNを使用し、最大e値カットオフ1×10-10でかけた。トップヒットは、最も高いビットスコアによって決定された。
細菌全ゲノムシーケンス
細菌全ゲノムシーケンスにはIllumina MiSeqおよびPacBio Sequelプラットフォームを使用した。イルミナシーケンスでは、TruSeq DNA PCRフリーライブラリープレップキット（イルミナ）を用いて、ターゲットインサートサイズ550 bpでライブラリーを調製した。イルミナのリードはすべてFASTX-toolkit（バージョン0.0.13）を用いてトリミングおよびフィルターした。PacBioシーケンスでは、SMRTbell template prep kit 1.0を用いてライブラリーを調製した。両タイプのシーケンスデータは、ハイブリッドアセンブラーUnicyclerを用いてアセンブルした。GTDB-tk54バージョン2.3.0のclassify_wfとGTDB55データベースR214を用いてゲノムの分類を行った。NCBI-genome-downloadバージョン0.3.3（ncbi-genome-download;https://doi.org/10.5281/zenodo.8192432）とNCBI分類学データベース56（2023年9月14日ダウンロード）のunknownlineage.dmpを用いて、各株のゲノムに関連するFastANI参照ゲノムのNCBI分類学を検索した。遺伝子はProkka version 1.14.0に"--kingdom Bacteria --rnammer "オプションをつけ、rnammer version 1.2を用いて予測した。予測遺伝子の相同性検索は、diamond57 version 2.0.15 を用い、"blastp --evalue 0.00001 --id 30 --query-cover 60 --ultra-sensitive "オプションで、KEGG (downloaded on 19 April 2022)58, COG (downloaded on 19 May 2021)59, VFDB (downloaded on 10 September 2022)60, UniRef90 (downloaded on 24 May 2022;https://www.uniprot.org/help/uniref)データベースを用いて行った。KEGG DBとの相同性検索には、KEGG nonredundant datasetsから種レベルで抽出したKEGG Ontology（K番号）を持つタンパク質配列から手作業でデータベースを構築した。また、分離株のグルコン酸代謝遺伝子の相同性検索を "blastp --evalue 0.00001 --id 20 --query-cover 60 --ultra-sensitive "オプションで追加した。f37_E.coli株のグルコン酸キナーゼ（gntK, MKMCEHOJ_02531）およびグルコン酸トランスポーター（MKMCEHOJ_02530およびMKMCEHOJ_02505）の塩基配列を示した。coli株、グルコン酸デヒドラターゼ（gad、EAOGLLOI_00767）、グルコン酸トランスポーター（EAOGLLOI_00766およびEAOGLLOI_00912）、2-デヒドロ-3-デオキシグルコノキナーゼ（kdgK、 EAOGLLOI_00768）、f17_Blautiacaecimuris株の2-dehydro-3-deoxyphosphogluconatealdolase（eda, EAOGLLOI_00769）を参照配列として用いた。
生体外糞便懸濁培養
GFマウス、F31-mixマウス、F18-mixマウス、F13-mixマウスの糞便内容物を100 mg ml-1の濃度で嫌気的に水に懸濁した。糞便内容物は、10,000gで5分間遠心後、0.22μmのフィルター（Millex Millipore）で濾過するか、105℃で30分間加熱死させるか、あるいはそのまま放置した。その後、Kp-2H7の希釈一晩培養液（10μl中103CFU）を各糞便懸濁液200μlに添加した。好気性または嫌気性条件下で37℃で48時間培養した後、サンプルを連続希釈し、Kp-2H7 CFUを計数するために選択寒天平板（30 mg l-1アンピシリンおよび30 mgl-1スペクチノマイシンを含むDHL）にプレーティングした。
細菌増殖モニタリング
野生型、ΔgntKまたはΔgntRKp-2H7株をM9最小培地で37℃、24時間培養した。その後、培養液を滅菌水で100倍に希釈した。希釈した培養液の10μlアリコートを、唯一の炭素源として各炭水化物（最終濃度2mM）を添加した200μlのM9培地、またはモックコントロールに接種した。Kp-2H7の増殖に対する代謝産物の影響を調べるため、野生型Kp-2H7培養希釈液10μlを、濃度を変えた4-HBA（100、10、1または0.1 mM）、コール酸（500、100、20または4 μM）、および酢酸または酪酸（100、25、6.25、1.56または0.39 mM）を含む200 μlのM9培地に接種した。酢酸塩と酪酸塩のpHは5.0または7.0に調整した。細菌増殖は、マイクロプレートリーダー（嫌気的条件ではSunrise Thermo（Tecan社製）、好気的条件ではInfinite 200 PRO（Tecan社製））を用い、37℃で各時点の前に100秒間振盪しながら、30分ごとに600 nmの吸光度を測定することによりモニターした。
上皮細胞のトランスクリプトーム解析
NucleoSpin RNA（Macherey-Nagel社製）を用いて、大腸上皮細胞から全RNAを単離した。RNAシーケンス用のライブラリーは、TruSeq Stranded mRNA Library Prep（Illumina）を用いて、メーカーの指示に従って調製した。ライブラリーはNovaSeq 6000（Illumina）を用い、150bpペアエンドモードでシーケンスした。配列決定されたペアエンドリードは、Trimomatic61バージョン0.39（"2:30:10 LEADING:3 TRAILING:20 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:5 "オプション）およびFASTX-Toolkitバージョン0.0.13（https://github.com/agordon/fastx_toolkit）（"-q 20 -p 80 "オプション）を用いて品質管理した。ペアリングされていないリードおよびminimap262 version 2.17-r941を用いてPhiX参照ゲノムにマップされたリードは、以降の解析から除外した。残りの品質管理されたリードは、STAR63 version 2.7.2bを用いてマウスリファレンスゲノム(mm10)にマップした。マップされたリードは、featureCounts64 version 1.5.2 を用いて、"-t exon -p -B -Q 1 "オプションで各遺伝子をカウントした。微分発現解析はDESeq265 version 1.28.1を用い、P値はBenjamini-Hochberg法で補正し、偽発見率（FDR）を5％以下に維持した。
Kp-2H7のトランスクリプトーム解析
インビボでのKp-2H7のトランスクリプトーム・ランドスケープを調べるため、GFマウスにKp-2H7を単クローン化し、その後F18-mixまたはビヒクルコントロールを経口投与した。F18-mix投与2日後に糞便サンプルを採取し、全RNAを抽出した。Kp-2H7株のトランスクリプトームをin vitroで調べるために、野生型、ΔgntKおよびΔgntRKp-2H7を、グルコースまたはグルコン酸のいずれかを添加したM9最小培地で37℃で培養した。対数期初期（600 nmでの吸光度＝0.35）に細菌を回収し、全RNAを抽出した。in vivo糞便サンプルまたはin vitro培養サンプルからの全RNAの単離は、NucleoSpin RNAキット（Macherey-Nagel）を用い、メーカーの説明書に従って行った。RNA配列決定用のライブラリーは、TruSeq Stranded mRNA Library Prep（イルミナ社製）を用いて調製し、HiSeq X（イルミナ社製）を用いて150-bpペアエンドモードで配列決定した。F18-mixの存在下または非存在下におけるKp-2H7のin vivoトランスクリプトームプロファイルを解析するために、Kp-2H7のゲノム配列とF18-mixのゲノム配列を連結して参照ゲノムを作成した。配列決定されたペアエンドリードは、Trimmomatic61バージョン0.39、"2:30:10 LEADING:3 TRAILING:20 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:5 "オプション、FASTX-Toolkitバージョン0.0.13を用いて品質管理された。対になっていないリード、およびminimap262バージョン2.17-r941（in vivo）または2.24-r1122（in vitro）を用いてマウス（mm10）またはPhiX参照ゲノムにマップされたリードは、以降の解析から除外した。品質管理されたリードは、bowtie266バージョン2.3.4.1を用いて連結ゲノムまたはKp-2H7参照ゲノムにマップされた。(in vivo）または2.4.4（in vitro）を用いた。in vivoのマウス糞便サンプルの場合、各Kp-2H7遺伝子のリードカウントは、一意にマップされたリードをカウントし、一意にマップされたリードの数に基づいてマルチヒットリードカウントを分配し合計することで得られた。in vitro 培養サンプルについては、featureCounts64 version 2.0.1 を用いて、"-t CDS -p -B -Q 10" オプションで各 Kp-2H7 遺伝子のリードカウントを求めた。差分発現解析は、DESeq265 version 1.28.1 (in vivo)または1.30.1 (in vitro)を用い、"fitType = local "オプションと、FDRを5%以下に維持するためのBenjamini-Hochberg補正法を用いて行った。ヒートマップはDESeq2の出力から得られた分散安定化変換値から得られた。
リアルタイムqPCR解析では、ReverTra Ace qPCR RT Master Mix（東洋紡）を用いてcDNAを合成し、Thunderbird SYBR qPCR Mix（東洋紡）を用いてLightCycler 480（Roche）でqPCRを行った。
トランスポゾン変異ライブラリーの構築
EZ-Tn5TM <KAN-2> Tnp Transposome kit (Lucigen) を用いてKp-2H7のトランスポゾン挿入ライブラリーを構築した。簡単に説明すると、80μl（109CFU）のKp-2H7懸濁液を0.5μlのEZ-Tn5TM <KAN-2>と混合し、1mmのギャップ幅のエレクトロポレーションキュベットに移し、ELEPO21（ネパジーン社）を用いてエレクトロポレーションを行った：ポーリングパルス；電圧：1,800V、パルス長：5.0ms、パルス間隔：50ms、パルス数：50： パルス長：5.0ms、パルス間隔：50ms、パルス数：1、極性：+： +トランスファーパルス；電圧：150V、パルス長：50ms、パルス間隔：50ms、パルス数：1、極性：＋： 電圧：150V、パルス長：50ms、パルス間隔：50ms、パルス数：5、極性：±。形質転換されたKp-2H7細胞は、1mlのLBブロス中で37℃で3時間インキュベートした後、カナマイシン（90mgl-1）を含むLB寒天プレート上で37℃で選択した。その後、約8×105個のトランスポゾン変異体コロニーを集め、20％グリセロールを含むLB中で-80℃に保存した。
トランスポゾン配列決定
GFマウスに8×105個のKp-2H7トランスポゾン変異体プールをコロニー形成させた。糞便サンプルをコロニー形成後0、4、10、28日目に採取し、20％グリセロールを含むPBS（50 mgml-1）に懸濁し、カナマイシン（90 mgl-1）を含むLB寒天プレート上で37℃で一晩培養した。Kp-2H7変異体コロニーを掻き集め、上記の方法でDNAを抽出した。トランスポゾンシークエンシングはKaziら67. 簡単に言うと、超音波処理でゲノムDNAを断片化した。次に、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによってDNA断片の3′末端にポリCテールを付加した。ビオチン化プライマーを用いてトランスポゾンジャンクションを増幅し、ストレプトアビジンビーズを用いて濃縮した。2回目のネステッドPCRを行うことで、各サンプルに1つのバーコードを付加した。ライブラリーはHiSeq 2500（Illumina）を用いて50-bpシングルエンドモードでシーケンスした。各シーケンスリードの最初の24塩基は、プライマーおよびモザイク末端配列を除外するためにトリミングした。トリミングしたリードは、Trimmomatic61バージョン0.39およびFASTX-Toolkitバージョン0.0.13を用いて品質管理した。残りのリードは、minimap2 version 2.17-r941を用いてPhiX参照ゲノム（mm10）にマッピングし、PhiXゲノムとアライメントするものを除外した。次に、解析可能なリードをbowtie2 version 2.4.266を用いてKp-2H7ゲノムにマップした。マップされたリードは、featureCounts64 version 1.5.2 を用いて、"-t CDS -p -B -Q 1 "オプションで遺伝子ごとにカウントし、各トランスポゾン変異体が単一挿入であると仮定して、サンプル中の遺伝子変異体の相対存在量として各遺伝子のTPMを計算した。FDRが5%未満になるようにBenjamini-Hochberg補正法を用いた対数スケールTPMのWelchのt検定により、存在量の差のある変異体を検出した。
Kp-2H7変異体の作製
Kp-2H7欠失変異体は、Quick and EasyE. coliGene Deletion Kit (Gene Bridges)を用い、製造元のプロトコールに従って、補足図3に示すように作製した。簡単に説明すると、Kp-2H7細胞をテトラサイクリン耐性遺伝子を持つpRED/ETプラスミドでエレクトロポレーションにより形質転換した。pRED/ETを持つ細菌を、30℃でテトラサイクリン（30 mgl-1）を含むLBプレート上で選択した。その後、これらの細胞を適切な抗生物質を含むLBブロス中で、600 nmの吸光度が0.2になるまで30℃で培養し、さらに0.3% l-アラビノースとともに37℃で1時間培養して、組換えタンパク質の発現を誘導した。これらの細胞を用いてエレクトロコンピテント細胞を調製し、直鎖DNA断片（FRT-PGK-gb2-neo-FRTカセット）-フランキングホモロジーアームで形質転換した。機能性カセットは、製造業者のプロトコールに従ってPCRにより作製した。ホモロジーアームを持つプライマーを補足表9に示す。エレクトロポレーションした細胞を1mlのLBブロス中で37℃で3時間インキュベートした。遺伝子欠失株は、37 ℃で一晩増殖させた後、カナマイシ ン（90 mgl-1）を添加したLB寒天培地プレート上で選択した。FLP発現プラスミド（707-FLPe）のエレクトロポレーションによりカナマイシン選択マーカーを除去し、上記のプロトコルを繰り返すことにより、二重ノックアウト株を作製した。欠失はDNA配列決定により確認した。
リンパ球の単離とフローサイトメトリー
大腸からリンパ球を採取し、既出のプロトコールに従って分析した17,68。簡単に説明すると、腸を縦に解剖し、PBSで洗浄して管腔内の内容物をすべて除去した。すべてのサンプルを、5mM EDTAを含む15mlのHanks' balanced salt solution (HBSS)中で37℃、20分間、振とう水浴中でインキュベートし、上皮細胞を除去した。その後、鉗子を用いて残存する上皮細胞、筋層および脂肪組織を除去した後、サンプルを小片に切断し、4％ウシ胎児血清（FBS）、0.5 mgml-1コラゲナーゼD（Roche Diagnostics社製）、0.5 mgml-1ディスパーゼII（Roche Diagnostics社製）、および40μgml-1DNase I（Roche Diagnostics社製）を含む10 ml RPMI1640中、37℃で50分間、振とう水浴中でインキュベートした。その後、得られた消化組織を5mM EDTAを含む10mlのHBSSで洗浄し、5mlの40％パーコール（GE Healthcare）に再懸濁し、15mlのファルコンチューブに2.5mlの80％パーコールを入れた。パーコール勾配分離は、850g、25℃、25分間の遠心分離で行った。リンパ球をパーコール勾配の界面から回収し、10％FBSを含むRPMI1640で洗浄した後、ゴルジストップ（BD Biosciences）存在下、50 ngml-1PMAと750 ngml-1ionomycin（ともにSigma製）で37℃、4時間刺激した。Ghost Dye Red 780 Viability Dye（Cell Signaling Technology社製）で死細胞を標識した後、細胞を透過処理し、抗CD3e（BUV395; BD Biosciences社製）、抗CD4（BUV737; BD Biosciences社製）、抗TCRβ（BV421; Biolegend社製）、抗IFNγ（FITC; Biolegend社製）で1： Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Kit (Tonbo Biosciences)を用い、1,000倍希釈で、製造元の指示に従って行った。すべてのデータは BD LSRFortessa（BD Biosciences）で収集し、Flowjo ソフトウェア（TreeStar）を用いて解析した。CD4＋T細胞は、生リンパ球ゲート内のCD4＋TCRβ＋CD3e＋サブセットと定義した。
リポカリン-2とカルプロテクチンの測定
Il10-/-マウスの糞便ペレットをボルテックスし、Complete Protease Inhibitor Cocktail（1錠を50mlのPBSに溶解；Roche）を加えたPBS（5％w/v）に懸濁し、遠心分離して上清を回収した。糞便上清中のリポカリン-2およびカルプロテクチン濃度は、ELISA法（Mouse Lipocalin-2 Matched Antibody Pair Kit; Abcam, Mouse S100A8/S100A9 Heterodimer DuoSet; R&D ）により、メーカーのプロトコールに従って測定した。
組織学的解析
大腸組織サンプルは縦に解剖し、スワスロールし、4％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋し、5μmの切片にスライスし、ヘマトキシリン・エオジンで染色した。大腸炎の程度は、マウス大腸炎組織学的指標69 によって評価した。組織学的スライドは 2 名の研究者が盲検で評価した。
ノンターゲットメタボローム解析
C57BL/6 GFマウスにKp-2H7をモノクローナル投与した後、バクテリアミックスを経口投与した。分離した細菌ミックス投与後28日目に糞便内容物を採取し、使用するまで-80℃で保存した。凍結した糞便内容物は、前述のようにマルチビーズショッカーを用い、メタルコーンで振盪してホモジナイズした70。次に、サンプルを100mgの糞便内容物あたり400μlのメタノールに懸濁し、40μlのアリコートを単層抽出および非標的LC-QTOF/MS分析に供した70。ペンタフルオロベンジルブロマイドアルキル化試薬（Thermo Fischer Scientific）を用いて、懸濁液20μlからSCFAを同時に抽出・誘導体化し、既述のとおりガスクロマトグラフィー質量分析（GC-MS）で分析した71。水溶性代謝物の抽出は、まず懸濁液4μl、メタノール196μl、クロロホルム200μl、水70μl、内部標準混合物10μl（100μMシクロロイシン、500μMクエン酸-d4、1.0mMオルニチン-d7（Cambridge Isotope Laboratories））を混合して行った。1分間ボルテックスし、4℃で5分間15,000gで遠心した後、100μlの上清を蒸発乾固した。乾燥した試料をメトキシアミノ化、トリメチルシリル化、tert-ブチルジメチルシリル化で誘導体化し、Smart Metabolite Database（島津製作所）またはGC-MSの選択イオンモニタリングモードを用いてGC-MS/MSで分析した。重水素標識内部標準混合物（1.0 μM コール酸-d4、1.0 μM リトコール酸-d4、1.0 μM デオキシコール酸-d4、1.0 μM タウロコール酸-d4、1.0 μM グリココール酸-d4（Cayman Chemical））と混合した懸濁液4 μlから、Monospin C18 カラム（GL science）を用いて胆汁酸を抽出した。カラムは300μlの水（×2）と300μlのヘキサン（×1）で洗浄した。胆汁酸を100μlのメタノールで溶出し、Acquity UPLC BEH C18カラム（50mm、2.1mm、1.7μm；Waters）を装着したリニアイオントラップ四重極型質量分析計（QTRAP 6500；AB SCIEX）を備えたUPLC Iクラス（Waters）を用いてLC-MS/MS分析に供した。サンプルは、水：メタノール：アセトニトリル（14:3:3（vol:vol:vol））とアセトニトリル（いずれも5mM酢酸アンモニウムを含む）からなる移動相で4分間分析し、12分後に40:60に、2分後に5:95に変更し、2分間保持した；流速は300μlmin-1。胆汁酸はネガティブモードの多重反応モニタリングで検出した。前駆体イオンから生成した[M-H]、タウリン(m/z= 124)、グリシン(m/z= 74)のイオンを、それぞれ非共役、タウリン共役、グリシン共役胆汁酸のプロダクトイオンとしてモニターした。イオン源、ターボスプレー、カーテンガス、30 psi、コリジョンガス、9 psi、イオンスプレー電圧、-4,500 V、イオン源温度、600 °C、イオン源ガス1、50 psi、イオン源ガス2、60 psi。
炭水化物レベルの測定
細菌のグルコン酸利用をin vitroで評価するため、分離株を300μMのグルコン酸を含むmGAMブロスまたはRCMで、嫌気条件下、37℃で48時間培養した。各培養ブロスの上清を回収し、ExionLC ADおよびSCIEX Triple Quad 6500+ LC-MS/MSシステムでグルコン酸濃度を測定した。糞便または腸内容物中の糖質濃度を評価するため、各サンプルを水（50 mg ml-1）に懸濁し、上清中の糖質濃度をLC-MS/MSで測定した。グルコン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸の測定条件は以下の通り：クロマトグラフィ分離はIntrada Organic Acidカラム150×2 mm（Imtakt社製）を用いて行い、カラム温度は40℃、各注入量は5 μlとした。A（アセトニトリル/水/ギ酸、10/90/0.1）とB（アセトニトリル/100mMギ酸アンモニウム、10/90）からなる移動相をグラジエント条件で使用した： 0-1.5 min, A 100%, B 0%; 1.6-7 min, A 70%, B 30%; 10-13 min, A 0%, B 100%; and 13.1-18 min, A 100%, B 0%); 流速は0.2 ml min-1。詳細なMS条件は以下の通り：カーテンガス、30psi；コリジョンガス、6；イオンスプレー電圧、-4,500V；温度、550℃；イオン源ガス1、50psi；イオン源ガス2、60psi。保持時間と多重反応モニタリングのトランジションを補足表10に示す。その他の炭水化物の測定条件は以下の通り：クロマトグラフィー分離はUK-Aminoカラム（UKA26）、250×2 mm、（Imtakt）を用いて行った；カラム温度は65℃、各注入量は2 μl。A（5mM酢酸アンモニウム、0.05％ギ酸）とB（アセトニトリル）からなる移動相をグラジエント条件で使用した： 0-10分、A 5%, B 95%; 35分、A 15%, B 85%; 50分、A 40%, B 60%; 50.1-55分、A 80%, B 20%; 55.1-60分、A 5%, B 95%）のグラジエント条件で使用し、流速は0.25 ml min-1であった。詳細なMS条件は以下の通り：カーテンガス、25psi；コリジョンガス、9；イオンスプレー電圧、ネガティブモードで-4,500V、ポジティブモードで5,500V；温度、250℃；イオン源ガス1、50psi；イオン源ガス2、70psi。多重反応モニタリングパラメータを補足表10に示す。データはAnalystソフトウェアバージョン1.7.1を用いて取得し、SCIEX OS-MQソフトウェアバージョン2.1.0.55343を用いて解析した。
IBDコホートのメタゲノム解析
グルコン酸オペロン遺伝子を有する確立された微生物分類群および新規微生物分類群を探索するために、IBDを病因とする2つのコホート（小児PROTECTコホートおよび成人HMP2コホート）から遺伝子カタログを取得した。MSPは、Schirmerら3(PROTECT)とKennyら75(HMP2)に記載されているように、co-abundant gene binning (MSPminer73)と品質評価(CheckM74)によって構築された。これらのビンをDIAMOND BLASTP version 0.9.1476でスクリーニングし、e-value <0.01で配列同一性が60%以上のヒットを残し、推定グルコン酸輸送および代謝遺伝子を同定した。MSPは、検出されたグルコン酸関連遺伝子の組み合わせに基づいて分類された。TPM正規化および中心対数比変換したMSP数について、配列決定深さ、遺伝子長、および組成の偏りをコントロールするために、存在量の差分析を行った。統計的有意性は、ノンパラメトリックの両側Mann-Whitney U検定とBenjamini-Hochberg補正によって確認した。効果量（r）は、検定統計量をサンプルサイズの平方根で割った値として算出し、ブートストラップ信頼区間とともに、アンバランスなグループサイズを考慮して計算し、観察された効果の頑健性と方向性に関する洞察を提供した。
PROTECTでは、軽症（n= 64）、中等症/重症（n= 57）、非IBDサンプル（n= 119）の縦断的データプールから無作為にサンプルを選択する際のシード値を変えて、比較解析を繰り返し行った。HMP2では、カルプロテクチンデータを伴う横断的サンプルに限定した。研究コホート77で観察された疾患シグナルの減弱に対応して、炎症に特異的な標的選択アプローチが利用された。IBD症例については、患者あたりのカルプロテクチン値が最大であったサンプルを対象とした（クローン病、n=41；潰瘍性大腸炎、n=26）。逆に、非IBD対照群については、患者1人当たりのカルプロテクチン値が最小のサンプルを選択した（n= 24）。統計解析はRソフトウェアバージョン4.2.1（Ubuntu 20.04.5 LTS）を用いて行った。
非標的便メタボロミクスとグルコン酸強度推定
PROTECTコホートの糞便サンプルの非標的便メタボロミクスは、ネガティブモードのLC-MSを用いて実施し、カルプロテクチンはELISAで測定した。簡単に説明すると、水溶性代謝物の親水性相互作用液体クロマトグラフィー（HILIC）分析は、Q Exactive Plus質量分析計（Thermo Fisher Scientific）に結合したShimadzu Nexera X2 U-HPLC（島津製作所）を用いて負イオン化モードで実施した。代謝物は、イノシン-15N4、チミン-d4、およびグリココール酸-d4内部標準物質（Cambridge Isotope Laboratories）を含む120 μlの80％メタノールを用いて、血漿または便（30 μl）から抽出した。サンプルを遠心分離し（10分、9,000g、4℃）、上清を150×2.0mmのLuna NH2カラム（Phenomenex）に直接注入した。HILICネガティブモードで検出されたすべての質量は、2022年10月10日にHuman Metabolome Database (HMDB)からダウンロードされた化合物とアダクトサブトラクションおよび分子式マッチングによってマッチングされた。測定されたm /z値は[M-H]-付加体について調整され、5ppm以内に一致する分子式が識別候補として選択された。複数の分子式が付加体調整後の質量と一致する場合（複数の付加体の可能性があるため）、ppmの差が最小のものが選択された。検出された4,461のフィーチャー（m/z、リテンションタイムのペア）のうち、4.34分で195.0512m /zの単一フィーチャーが式C6H12O7（delta ppm = 0.89）に分解され、l-グルコン酸（HMDB0000625）を含む標準構造O=C(O)C(O)C(O)C(O)COを持つ5つの化合物群に関連した。その後、iHMPプール便サンプルのリテンションタイムとMS/MSマッチングにより、参照標準物質（Sigma Aldrich, S2054）を用いて代謝機能を検証し、Eclipse78を用いたPROTECT便サンプルのグローバルm/zとリテンションタイムのマッチングによりアライメントを行った。これにより、PROTECTからはHNs_QI1923（HILIC-neg 195.0512m/zat 4.34分）、HMP2からはQI11027（HILIC-neg 195.0512m/zat 4.48分）がアノテーションされました。
統計解析
統計解析はGraphPad Prismソフトウェアを用いて行った。CFU比較の多重比較には、Kruskal-Wallis検定とBenjamini and HochbergのFDR法を用いた。2群間の比較には、Welchの補正を加えたMann-Whitney U検定を用いた。Kp-2H7 と分離株の相対存在量の相関を調べるためにスピアマンの順位相関を用いた。
報告概要
研究デザインに関する詳細は、本論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。
データの利用可能性
宿主、Kp-2H7 in vivoおよびKp-2H7 in vitroのTn-SeqデータおよびRNA配列データは、バイオプロジェクトPRJDB17114として日本DNAデータバンクに寄託されている。ドナーF、I、Kからそれぞれ分離された31株、41株、46株のゲノム配列は、バイオプロジェクトPRJDB17661として日本DNAデータバンクに寄託されている。ソースデータは本論文に添付されている。
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謝辞
K.H.は、日本医療研究開発機構(AMED)ムーンショット研究開発プログラム(JP22zf0127007)、AMED NEDDTrimプログラム(JP21ae0121041)、AMED LEAPプログラム(JP20gm0010003)、日本学術振興会特別研究奨励費(20H05627)、Stand Up to Cancer助成金(SU2C Convergence 3.1416 Research Team)を受けている。R.J.X.は、MITのCenter for Microbiome Informatics and TherapeuticsおよびNIHの助成金（DK043351、AI172147、DK127171、HL157717）の支援を受けている。菌の分離にはS. Narushima、臨床サンプルの収集にはK. Takeshita、動物の飼育にはM. Kumamotoに感謝する。図1a,b,e,f,2b-d,3a,e,h,4b、拡張データ図1a,3a-c,e-g,4a-c,5a,b,6a,d,7a,8b,9c,d,10a,12aおよび補足図1はBioRender.comで作成した。
著者情報
著者ノート
これらの著者は同等に貢献した： 古市宗弘、川口高明、Marie-Madlen Pust、安間・三戸部恵子
著者および所属
慶應義塾大学医学部微生物・免疫学教室、日本、東京
古市宗弘、川口高明、安間美登恵子、長谷川直美、大矢隆、笹島聡、Timur Tuganbaev、八木沼瑞樹、杉田佳代子、Ashwin N. Skelly、田之上武志、アタラシ浩二、本田賢也理化学研究所 統合生命医科学研究センター（日本、横浜
古市宗弘、川口高明、大谷隆司、上田昌広、岡橋信行、服部正平、田之上武志、須田渉、有田誠、アタラシコウジ、本田賢也マサチューセッツ工科大学・ハーバード大学ブロード研究所感染症・マイクロバイオームプログラム（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ
マリー・マドレン・プスト、ダミアン・R・プリクタ、マーティン・ストラジャール、ジュリアン・アビラ＝パチェコ、ケリー・ピアース、クラリー・B・クリッシュ、ラムニック・J・ザビエルマサチューセッツ総合病院・ハーバード大学医学部計算統合生物学センター（米国マサチューセッツ州ボストン
マリー・マドレン・プスト＆ラムニック・J・ザビエル米国マサチューセッツ州ウースター、UMass Chan医科大学、微生物学・生理システム学科、マイクロバイオーム・ダイナミクス・プログラム
シャクティ・K・バッタライ & ヴァンニ・ブッチJSR-慶應義塾大学医化学イノベーションセンター、慶應義塾大学医学部、日本、東京
青戸義正、上田昌弘、天藤公子、切通裕子慶應義塾大学ヒト生物学マイクロバイオーム量子研究センター(Bio2Q)
ティムール・トゥガンバエフ、有田誠、アタラシ浩二、本田賢也大阪大学大学院情報科学研究科バイオインフォマティクス工学専攻（日本、大阪
岡橋 信行慶應義塾大学大学院薬学研究科 生理代謝学分野
岡橋信行・有田誠早稲田大学大学院先進理工学研究科先進健康科学共同専攻
服部正平・須田渉慶應義塾大学医学部 内科学教室 消化器・肝臓内科
中本信博ヴェダンタ・バイオサイエンシズ（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ
シルビア・カバジェロ、ジェイソン・M・ノーマン、ベルナット・オレ米国マサチューセッツ州ボストン、マサチューセッツ総合病院分子生物学部
ラムニック・J・ザビエル
貢献
K.H.とM.F.は、T.K.、M.-M.P.、K.Y.-M.、D.R.P.、S.S.、Y.A.、N.O.、Y.K.、M.A.、A.N.S.、D.R.P.、R.J.X.とともに実験を計画し、データを分析し、論文を執筆した。K.Y.-M.は、in vivo Kp-2H7脱コロナイズ実験を計画した。M.F.、T.K.およびK.Y.-M.は、N.H.、T.O.、M.Y.、T.Tuganbaev、K.Amafuji、K.S.、N.N.、J.A.-P.、K.P.、C.B.C.、S.C.、J.M.N.、B.O.、T.TanoueおよびK.Atarashiの支援を受けて細菌および動物実験を行った。S.S.、M.U.、N.O.、M.A.がメタボローム解析を行った。M.-M.P.、D.R.P.、Y.A.、Y.K.、W.S.、M.H.、M.S.、V.B.、R.J.X.がマイクロバイオーム解析およびバイオインフォマティクス解析を行った。
著者
Ramnik J. XavierまたはKenya Hondaまで。
倫理申告
競合利益
K.H.はVedanta Biosciencesおよび4BIO CAPITALの科学顧問委員。R.J.X.は、Jnana Therapeutics社およびCelsius Therapeutics社の共同設立者であり、Nestlé社の科学顧問委員、MoonLake Immunotherapeutics社の取締役。Y.A.、M.U.、K.アマフジ、Y.K.はJSR株式会社の社員。J.M.N.とB.O.はヴェダンタ・バイオサイエンスの社員。S.C.は寄稿当時、ヴェダンタ・バイオサイエンスの社員であった。D.R.P.は現在ノボネシスの社員。K.H.、M.F.、N.H.、S.S.、K.Atarashi、T.O.およびY.A.は国際特許出願PCT/JP2024/008014を行った。他の著者は、競合する利益はないと宣言している。
査読情報
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追加情報
出版社からの注記Springer Natureは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。
図表
Extended Data 図1 健康なヒト腸内細菌叢から 肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）を除菌できる細菌株を分離した 。
a,健康なヒト腸内細菌叢からKlebsiellaを脱コロン化する常在菌を分離する戦略の概略図。ドナーF、I、およびKの糞便を、EG、mGAM、BHK、CM0151、MRS、およびBLを含む異なる増殖培地を用いた様々なタイプの寒天培地上で嫌気培養した。ドナーF、I、Kの微生物叢から、それぞれ合計192、288、480の細菌コロニーが採取され、塩基配列が決定された。この中から、F、I、K株からそれぞれ31株、41株、46株が同定され、gnotobioticスクリーニングに供された。ドナーF由来の31株は、F18-mixと呼ばれる18株からなる最小限のエフェクターコンソーシアムが同定されるまでさらに評価された。b, 健康なヒトドナーの糞便のマイクロバイオーム組成は、PacBioベースの全長16S rRNA遺伝子配列決定によって決定された。濃い黄色から薄い黄色は、ドナーFの31株、ドナーIの41株、ドナーKの46株に対応するアンプリコン配列バリアント（ASV）のセットを示し、それぞれ全配列の91％、48％、29％を占める。
Extended Data 図2 アンピシリン処理に対する反応性の違いに基づくF18メンバーの選択。
a, Kp-2H7でモノクローナル化したGF B6マウス（n = 5）にF31-mixを経口投与した。32日目から63日目までアンピシリン（200 mg/L）を飲料水に添加した。糞便を縦断的に採取し、Kp-2H7とF31コンソーシアムの各メンバーの相対量を、株特異的プライマーセットを用いたqPCRで測定した（ただし、f17とf19のBlautia caecimuris株は区別できなかった）。2回の独立した実験の平均データを示す。Kp-2H7と逆の軌道を示したF31メンバーはKp-2H7の脱コロニーに必要であると考えられ、Kp-2H7と同様の、あるいはKp-2H7とは独立した挙動を示したF31メンバーは不要であると考えられた。b, アンピシリン処理中のKp-2H7相対量とF31コンソーシアムの各メンバーとの関連を定量化したスピアマンの順位相関係数（両側）。Kp-2H7の存在量とほとんどのF18株との間に有意な負の相関が見られた（赤）。
Extended Data 図3 病原性および常在菌に対するF18-mixの影響。
a, b, GF B6マウスをKp-2H7で単コロニー化した後、F6バクテロイーダミックスおよびF25非バクテロイーダミックスを含む指示された細菌ミックスで処理した（各群n = 4）。Kp-2H7糞便CFUを経時的にカウントし（a）、各マウスから経時的に採取した糞便サンプルについて全長16S rRNA遺伝子配列を決定した（b）。c, F18-mixのコロニー形成抵抗性効果を調べるため、GF B6マウスをまずF18-mixまたはF13-mixでコロニー形成し、7日目にKp-2H7を接種した。d, GF B6マウス（各群n = 4）を緑膿菌またはカンピロバクター・ウプサリエンシスで単コロニー化した後、指定した細菌ミックスを経口投与した。e, f, GF B6マウスにKp-2H7と我々の培養コレクションから選んだ7種類の常在菌をコロニー形成させた後、F18-mixを投与した。各菌株の糞便中存在量は、菌株特異的プライマーセットを用いたqPCRで定量した。各菌株の相対存在量（e）およびDNA濃度（f）を示す。g, GF B6マウス（各群n = 4）に、I41-mix、K46-mix、またはこれらのコンソーシアムの両方とC. scindens株（合計88株）をコロニー形成させた後、抗生物質を事前に処理することなくF18-mixを経口接種した。糞便サンプルについて16S rRNA遺伝子の全長配列決定を行った。F18-mix処理後に大幅に減少した菌株は紫色で表示されており、ビフィズス菌、コリンセラ菌、メガファエラ菌が含まれている。データは中央値±IQRで表され、2つの独立した実験の代表値であり、F31-mix（a）またはF18-mix（c）と比較した28日目の多重比較についてBenjamini-Hochberg補正を用いたKruskal-Wallis検定で比較した。
Extended Data 図4 IBDモデルにおけるF18-mixの効果。
a, b, GF B6マウスに、肺炎桿菌を多く含むクローン病患者（CD#15）由来の糞便微生物叢（a）、またはESBL+大腸菌を含む潰瘍性大腸炎患者（UC#5）由来の糞便微生物叢（b）をコロニー形成させた。その後、すべてのマウスにバンコマイシンを投与し、半数にはF18-mixを2日間に4回経口投与した。K. pneumoniaeと 大腸菌のCFU（上段）と糞便微生物叢のShannon index（下段）を縦断的に調べ、28日目にMann-Whitney U検定で比較した（両側）。c-g, GFIl10-/-マウスをKp-2H7で単クローン化し、7日後に標記細菌ミックスを経口投与した。大腸の代表的なヘマトキシリン・エオジン染色（スケールバー＝100μm）（d）、組織学的大腸炎スコア（e）、糞便中リポカリン-2およびカルプロテクチンレベル（f）、および大腸固有層CD4+TCRβ+T細胞中のIFNγ+細胞の頻度（g）を示す。パネルa-cおよびe -gでは、中央値±IQRを示し、2つの独立した実験の代表である。統計解析は、多重比較のためのBenjamini-Hochberg補正を用いたKruskal-Wallis検定を用いて行った。
Extended Data 図5 F18-mixは宿主の主要な免疫系とは独立したメカニズムでKp-2H7を脱コロニーする。
a,b, GFIfngr1-/-(a),Myd88-/-Ticam1-/-,Rag2-/-Il2rg-/-(b), または野生型 (WT) B6マウスをKp-2H7で単コロニー化した後、F18-mixを経口投与した。糞便中のKp-2H7 CFUはF18-mix投与後28日目までカウントした。データは中央値±IQRで表し、28日目のサンプルについて、Mann-Whitney U検定（両側）（a）または多重比較のためのBenjamini-Hochberg補正を用いたKruskal-Wallis（b）により比較した。c, ヒートマップは、示した細菌ミックスでコロニー形成したマウスの大腸上皮細胞における防御応答に関連する遺伝子およびペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（PPARγ）誘導性遺伝子の発現を描いたものである。防御応答遺伝子およびPPARγ誘導性遺伝子はgene ontology termに基づいて選択した。
Extended Data 図6 クレブシエラの 減少に関与するメカニズムの探索 。
a,Kp-2H7を、未コロニー化GFマウスまたはF31-、F18-、F13-ミックスでコロニー形成したGFマウスの糞便懸濁液と、事前の熱不活性化またはろ過（0.22μm）の有無にかかわらず、好気的または嫌気的条件下でin vitro培養した。Kp-2H7 CFUは、n = 3生物学的複製で37℃、48時間培養後にカウントした。データは中央値±IQRで表した。b, GFマウス（1群あたりn = 3-5）をKp-2H7でコロニー形成させ、その後、指示した細菌混合物で処理した。A、B、C、Dを除くF18-mixと指定された菌株の詳細は図1cに示す。28日目に糞便内容物を回収し、標的および非標的LC-MS/MS、GC-MS、またはLC-QTOF/MS分析に供した。ヒートマップは、糞便中のKp-2H7 CFU（ピアソン係数-0.6 > r > 0.6）と相関を示した各代謝物のzスコアを示している。4-HBA、4-ヒドロキシ安息香酸。c, Kp-2H7をM9培地中で、37℃の好気的および嫌気的条件下で、濃度の異なる様々な化学化合物とインキュベートした。酢酸または酪酸を添加した培地は、NaOHを用いて最終pHを5.0または7.0に調整した。菌の増殖は、マイクロプレートリーダーを用いて0.5時間ごとに600 nmの吸光度を測定することによりモニターした。d, GF B6マウスはKp-2H7でコロニー形成され、その後0日目にF18-mixまたはF13-mixで処理された。14日目から、トリブチリン（5g/kg体重）またはビヒクルコントロールを1日1回、2週間経口投与した。Kp-2H7の糞便CFUは28日目までカウントし、中央値±IQRで示した。28 日目のデータは、Mann-Whitney U 検定（両側）を用いて比較した。
Extended Data Fig. 7 F18-mixは、 クオラムセンシング、バイオフィルム形成、ストレス応答、硝酸塩呼吸に影響を与えるのではなく、栄養競合によってKlebsiellaを抑制する 。
a, GF B6マウスにKp-2H7（野生型または指定の変異株）をコロニー形成させ、その後F18-mixを経口投与した。糞便中のKp-2H7 CFUをカウントした。データは中央値±IQRで示した。b, c, GFマウスにKp-2H7単独（n = 3）またはKp-2H7+F18-mix（n = 4）を接種した。F18-mix投与2日後に糞便サンプルを採取し、細菌RNA抽出と塩基配列決定を行った。Kp-2H7遺伝子のうち、群間で発現が有意に異なる（q<0.001）遺伝子についてKEGGパスウェイ濃縮解析を行った。Kp-2H7+F18-mix群でKp-2H7のみ群と比較して発現量が増加または減少した各パスウェイ（10遺伝子以上で構成）内の遺伝子数を（b）に示す。d,Kp-2H7のみ、Kp-2H7+F13-mix、またはKp-2H7+F18-mixでコロニー形成したマウスの糞便中のKp-2H7のグルコン酸代謝遺伝子の発現を、2テクニカルレプリケートでqPCRにより調べた。各ドットは個々のマウスのデータを示す。データは中央値±IQRで示され（c, d）、多重比較のためのBenjamini-Hochberg補正を用いたKruskal-Wallis検定を用いて解析された（d）。
Extended Data 図8 クレブシエラの 増殖におけるグルコン酸代謝遺伝子の役割 。
a, 野生型（WT）、ΔgntK、またはΔgntRKp-2H7株を、指定の糖質（最終濃度：2mM）を添加したM9最小培地中で、37℃で48時間培養した。菌の増殖は600nmでの吸光度を測定することで評価した。b, GFマウスにWT株とΔgntRKp-2H7株の1：1混合株を接種し、F18-mixまたはF13-mixで処理した。Kp-2H7の糞便CFUを経時的にカウントした。c, WT,ΔgntK,ΔgntRKp-2H7を、グルコースまたはグルコン酸を添加したM9最小培地中で、37℃で培養した（n = 3生物学的複製）。対数期初期（600 nmでの吸光度＝0.35）に細菌を回収し、RNA抽出と塩基配列決定に供した。炭水化物代謝に関与する遺伝子の発現レベルは、TPM（Transcripts per million）で表し、中央値±IQRで示した。
Extended Data 図9 Kp-2H7とF18-mixによるグルコン酸の利用。
a, 標準食（CL-2）または定義食（AIN93G、グルコン酸およびグルコサミンを含まない）を与えたGF B6マウス（各群n = 4）の糞便中のグルコン酸およびグルコサミンレベルをLC-MS/MSで測定した。CL-2飼料を与えたGFマウスの糞便からは高レベルのグルコン酸が検出された。グルコン酸欠乏AIN93G飼料を与えたマウスでも糞便中に相当量のグルコン酸が検出されたことから、腸管内腔グルコン酸の供給源には、食事からの摂取と宿主による生産の両方が含まれることが示唆された。対照的に、糞便中のグルコサミン濃度はCL-2飼料を与えたマウスでは非常に低く、AIN93G飼料を与えたマウスではほとんど検出されなくなったことから、グルコサミンは主に食餌由来であることが示唆された。データは中央値±IQRで示し、2つの独立した実験を代表し、両側Mann-Whitney U検定を用いて分析した。b, CL-2食を与えたKp-2H7または指示した細菌ミックス（F18-mix、F13-mix、K46-mix、I41-mix）でコロニー形成したGFマウスの糞便糖質レベルをLC-MS/MSを用いて測定し（各群n = 4）、結果は中央値±IQRで示した。c, CL-2食を与えたGFマウスをKp-2H7でモノクローナル化し、21日目にグルコン酸を含まないAIN93G食に切り替えた。d, e, GFマウスをKp-2H7で単コロニー化し、その後F18-mixの個々のメンバーを5日間隔で合計95日間接種した。Kp-2H7の糞便中CFU数（d）とグルコン酸濃度（e）を試験期間中測定した。データは中央値±IQRで表した。f, Kp-2H7またはKp-2H7+F18-mixでコロニー形成したGFマウスの上部および下部腸管内腔におけるクレブシエラCFUおよびグルコン酸濃度（各群n = 4）。SIは小腸。データは中央値±IQRで示す。
Extended Data 図10 F18-mixを介したKp-2H7抑制効果に対する炭水化物補給の影響。
a, GF B6マウス（各群n = 4）にKp-2H7を単コロナイズし、7日後にF18-mixを経口投与した。21日目に、標準的なCL-2食餌から、総カロリーの10％の炭水化物を添加した定義されたグルコン酸欠乏（しかしグルコース豊富）AIN93G食餌に切り替えた。糞便中のKp-2H7 CFUは中央値±IQRで表示され、2回の独立した実験の代表値であり、多重比較のためのBenjamini-Hochberg補正を用いたKruskal-Wallis検定を用いて分析した。b, LC-MS/MSにより糞便中のガラクチトールレベルを測定した（各群n = 4）。CL-2またはAIN93G食を与えたマウスでは、糞便ガラクチトールレベルは検出限界以下であった。しかし、10％のガラクチトールを添加したAIN93G飼料を与えたマウスでは、糞便中のガラクチトールが検出され、ガラクチトール検出アッセイの有効性が確認された。データは中央値±IQRで示した。
Extended Data 図11 常在菌による古典的および代替的グルコン酸代謝遺伝子のキャリッジ。
ドナーF、K、Iから分離した細菌株を、300μMのグルコン酸を含むmGAMブロス中で37℃、48時間培養した（n = 3生物学的複製）。培養上清中のグルコン酸濃度をLC-MS/MSで測定し、中央の棒グラフに示した。データは中央値±IQRで示した。培養株のゲノム配列を決定し、グルコン酸代謝に関与すると推定される遺伝子のキャリッジを調べた。古典的経路遺伝子については、f37_大腸菌株由来のグルコン酸キナーゼ（gntK、MKMCEHOJ_02531）およびグルコン酸トランスポーター配列（MKMCEHOJ_02530、MKMCEHOJ_02505）をリファレンスとして用いた。代替経路遺伝子については、グルコン酸デヒドラターゼ（gad、EAOGLLOI_00767）、グルコン酸トランスポーター配列（EAOGLLOI_00766、EAOGLLOI_00912）、2-デヒドロ-3-デオキシグルコノキナーゼ（kdgK、 EAOGLLOI_00768）、f17_Blautiacaecimuris株由来の2-デヒドロ-3-デオキシホスホグルコネートアルドラーゼ（eda、EAOGLLOI_00769）をリファレンスとして用いた。アスタリスクはf19_Blautiacaecimuris株のグルコン酸脱水酵素がフレームシフト変異により機能しないことを示す。GntK、グルコン酸キナーゼ。GAD、グルコン酸脱水酵素。
Extended Data 図12 IBD患者における疾患状態とグルコン酸キナーゼオペロン遺伝子を持つ菌種との関連。
a,コホートの詳細。PROTECT（N=94）では、軽症（n=64）、中等症/重症（n=57）、非IBD（n=119）の縦断的サンプルプールから様々な横断的サンプルを選択し、繰り返し解析を行った。HMP2については、特定の患者からの最も極端なカルプロテクチン値に基づいてサンプルを選択した： CD（N=41）、UC（N=26）、非IBD（N=24）。N：被験者数、n：サンプル数： b, UCの重症度が異なる84のPROTECTサンプルのサブセット（不活性（n = 33、緑）、軽度（n = 24、黄）、中等度/重度（n = 27、赤）における、糞便カルプロテクチン（μg/g）対グルコン酸質量強度のスピアマン相関分析。c,CD（黒、N=41）またはUC（灰色、N=26）と非IBD（N=24）とのHMP2サンプルにおけるグルコン酸遺伝子を持つMSPの存在量の比較解析。点と延長線分は、ブートストラップにより得られたrの効果量とCIを表す。d,HMP2コホート（N = 91）におけるMSP有病率（％）。種のアノテーションと参照ゲノムがない分類群は「MSP-」ラベルのままであるため、遺伝子の組み合わせは完全なアセンブリーでは検証できなかった。e,f, 混合効果モデルは、カルプロテクチンおよび被験者IDをコントロールしながら、便サンプル（n = 223）における種の存在率とグルコン酸の関係を定量化した。累積t値（標準誤差で補正したモデル係数）は、HMP2における腸内細菌科クレードとグルコン酸との正の相関を強調している（e）。(f)の丸印はグルコン酸代謝遺伝子を持つMSPを示し、プラス印は種とグルコン酸の関連を示し、BH調整p値は0.05未満であった。グルコン酸キナーゼ＋トランスポーター遺伝子を持つMSPは、トランスポーター（両側Mann-Whitney U、p〜0.04）またはグルコン酸脱水酵素（p〜0.02）のみを持つMSPよりもグルコン酸との関連が強かった。効果量rはブートストラップによるCIで計算した。箱ひげ図は中央値（中央線）とIQR（箱）を示し、ひげは1.5×IQRまで伸びている。GntKはグルコン酸キナーゼ。GAD、グルコン酸脱水酵素。
補足情報
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このファイルにはSupplementary DiscussionとSupplementary Fig.
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補足表
補足表1-10 補足表1： 分離菌株のリスト。補表2 常在菌に対するF18-mixの影響（全長16S rRNA遺伝子配列決定）。補足表3：Tn-seqの結果。補足表4：18株の病原性因子。補足表5：18株の抗菌薬耐性遺伝子。補足表6：分離株におけるグルコン酸代謝遺伝子ホモログ。補足表7：IBDコホートにおけるグルコン酸レベルとMSPをコードするグルコン酸経路。補足表8 食餌組成。補足表9：プライマーリスト。補足表10：LC-MS/MSのMRパラメータ。
出典データ
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ソースデータ 拡張データ 図1
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権利と許可
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古市正樹、川口哲也、Pust, MM.ほか.Commensal consortia decolonize Enterobacteriaceae via ecological control. Nature(2024). https://doi.org/10.1038/s41586-024-07960-6
2023年10月18日受領
受理2024年8月19日
2024年9月18日発行
DOIhttps://doi.org/10.1038/s41586-024-07960-6
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ネイチャー (Nature)ISSN 1476-4687 (online) ISSN 0028-0836 (print)
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