神経血管ユニットオンチップによる細菌性新生児髄膜炎の解明

2023年6月7日 09:46

研究論文
月YYYY巻XX号e01233-23
神経血管ユニットオンチップによる細菌性新生児髄膜炎の解明

https://journals.asm.org/doi/epub/10.1128/spectrum.01233-23?utm_source=twitter&utm_medium=social&utm_content=ASM&utm_id=falcon&utm_campaign=MicrobiologyMonday

Rossana Rautihttps://orcid.org/0000-0001-8569-0810a,b、Sharon Navokc、Dvora Biranc、Keshet Tadmord、Yael Leichtmann-Bardoogoa、Eliora Z. Ronhttps://orcid.org/0000-0003-2615-8685c, Ben M. Maozhttps://orcid.org/0000-0002-3823-7682a,d,e
aDepartment of Biomedical Engineering, Tel Aviv University, Tel Aviv, Israel(イスラエル)
bDepartment of Biomolecular Sciences, University of Urbino Carlo Bo, Urbino, Italy
cテルアビブ大学シュムニス生物医学・がん研究学部（テルアビブ、イスラエル
dテルアビブ大学サゴル・スクール・オブ・ニューロサイエンス（イスラエル、テルアビブ
テルアビブ大学ナノ科学・ナノテクノロジーセンター（イスラエル・テルアビブ
ABSTRACT
細菌感染症に対抗するためには、その病態を理解することが重要である。一部の感染症では、動物モデルが不十分で、機能的なゲノム研究ができない。その一例が、死亡率や罹患率が高く、生命を脅かす感染症である細菌性髄膜炎である。ここでは、新たに開発された生理学的に適切な、内皮と神経細胞を統合したorgan-on-a-chipプラットフォームを用い、in vivoの状況に近い形で研究しました。高倍率顕微鏡、透過性測定、電気生理学的記録、免疫蛍光染色を用い、病原体が血液脳関門を通過して神経細胞にダメージを与えるまでの過程を研究した。今回の研究成果は、髄膜炎に関与する病原性遺伝子を同定し、感染プロセスにおける様々なカプセルタイプを含むこれらの遺伝子の役割を明らかにするために、細菌変異体ライブラリーを用いた大規模スクリーニングを実施する可能性を開くものです。これらのデータは、細菌性髄膜炎の理解や治療に不可欠なものです。さらに、このシステムは、細菌、真菌、ウイルスなど、他の感染症の研究にも応用できる可能性がある。
重要性新生児髄膜炎（NBM）と神経血管系との相互作用は非常に複雑であり、研究が困難であった。本研究では、多細胞の相互作用をモニタリングできるシステムでNBMを研究し、これまで観察されなかったプロセスを特定するための新しいプラットフォームを提示する。
キーワード細菌性髄膜炎、オルガンオンチップ、大腸菌、神経細胞ネットワーク、血管細胞、神経血管ユニット、電気生理学、MEA、BBB透過性、in vitroモデル、新生児髄膜炎
2023年3月22日受領 2023年5月9日受理 2023年5月24日発行
Rossana RautiとSharon Navokは同等に貢献した。順番は年功序列で決定した。
著者は利益相反がないことを宣言している。
編集者イラナ・コロドキン＝ガル（ワイツマン科学研究所
Copyright © 2023 Rauti et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution 4.0 International license.
抗生物質耐性の急速な発達により、細菌感染症に対抗するための新たな手段を見つけることが急務となっている。そのためには、薬剤やワクチン開発のための新たな標的を特定することが必要である。そのためには、細菌感染症の病態生理と細菌および宿主の関与する因子を理解することが不可欠である。このような理解のためには、病原体と宿主の機能ゲノミクスを生理的に関連した系で解析できる適切なモデル系を利用できることが重要なステップとなる。
重症の細菌感染症のひとつに細菌性髄膜炎があり、高い罹患率と死亡率を伴う中枢神経系（CNS）の生命を脅かす感染症である。現在、世界の感染症関連死のトップ10に入る死因として認識されており、抗菌薬治療の分野で進歩が見られるにもかかわらず、生存者のほぼ半数が多様な神経学的後遺症（精神遅滞、聴覚障害、失明など）に苦しんでいます（1-4）。髄膜炎に関与する最も一般的な細菌はNeisseria meningitidis株でしたが、これらの感染は、近年の髄膜炎菌ワクチンやアジュバント療法の開発により激減しています（5、6）。しかし、N. meningitidis以外の細菌、特に腸管外病原性大腸菌（ExPEC）などのグラム陰性菌による髄膜炎の種類も増えてきている（7, 8）。これらの細菌は通常、新生児髄膜炎（NBM）に関与し、しばしば抗生物質耐性である（9）。NBMは全新生児の0.1%に発症し、生存率は発展途上国で約50%、先進国では8～12.5%であり、回復した人は神経変性疾患を発症しやすいと言われています(10)。
細菌性髄膜炎の研究は、優れたモデル系を見つけることが困難であることが障害となっている。既存の動物モデルは、新生児マウス、ラット、ブタである（11-13）。例えば、中枢神経系合併症や神経細胞傷害の原因となる病原メカニズムに関する現在の知見は、脳脊髄液（CSF）への細菌の直接注入や血液脳関門（BBB）の迂回に基づく実験モデルから得たものが多い（2、14-19）。これらのシステムでは、細菌と宿主の相互作用の連続的なステップに関与する分子および細胞メカニズムや、細菌性髄膜炎によって誘発される細胞死につながる下流イベントを研究することはできません。
また、細菌性髄膜炎を理解する上で重要なのが、感染菌の病原性因子の同定である。どの細菌遺伝子が髄膜炎を引き起こす役割を果たし、それらがどのように制御されているかを理解するためには、機能ゲノミクスと遺伝子ノックアウトを用いたゲノムワイドな研究が必要である。このような実験は、新生齧歯類に基づくモデル系では最も困難である。
過去数十年の間に、BBBを介した中枢神経系感染病原体の侵入メカニズムを研究するために、in vitroで培養した脳微小血管内皮細胞（BMEC）が開発されている(20)。大腸菌では、BMECへの細菌侵入に関連するいくつかの病原性因子が特徴づけられている（20-24）。しかし、BBBは単なる内皮細胞の単層培養よりも複雑であり、例えば、BBBに大きな影響を与える流れの欠如、神経細胞や他の細胞との相互作用の欠如など、標準的なin vitroモデルには欠けている複数の機械的、生化学的条件が存在する。最も広く使われているin vitro BBBモデルは、上室と下室の間に多孔質膜上の内皮細胞バリアを持つ2次元（2D）トランスウェルシステムである（25-27）。このシステムは、一部の研究には有用であるが、ヒトBBBの複雑な生体内構造や生理機能を完全に表現するものではなく、神経細胞成分を有していない（28、29）。
2D-BBBモデルの限界を克服するために、臓器オンチップデバイスを使用して、in situの読み出しが可能な生体内類似のBBBモデルが作成されている（30、31）。マイクロ流体チップは、生理的な流体の流れを現実的な大きさで表現するため、BBBモデルの改良に技術的な利点をもたらすことができる（32-35）。我々は、新たに開発されたマイクロ流体チップを用いた先進的なオルガン・オン・ア・チップ装置（27, 36-38）を活用し、脳感染性病原体に対するBBB反応に焦点を当て、ヒトに関連したCNSプラットフォームで細菌性髄膜炎に関する洞察を得ることを目的とした（図1）。

図1 （A）髄膜炎大腸菌が生体内でBBBを障害する能力を表すスケッチで、血管系に第一の影響を及ぼし、次に神経細胞に影響を及ぼす。(B)本研究で使用したBBBを模倣するインサートチップのイメージ図。
ここでは、NBMから分離された2つの大腸菌（ExPEC）株の病態生理を理解することを目的としました。まず、髄膜炎大腸菌が内皮細胞、神経細胞、グリア細胞の形態と機能に与える影響を探った。次に、神経血管ユニット（NVU）-オン-ア-チップ技術を用いて、病原体がNVUの個々の構成要素（内皮とアストロサイト＋ニューロン）および複合システムに与える影響を調査しました。その結果、髄膜炎菌との相互作用により、神経細胞および内皮の生理的パラメータに大きな変化が見られた。
この実験により、細菌と宿主の相互作用を生理学的に適切なモデルで研究するための、さまざまな興味深い可能性が開かれました。この方法は、動物実験では不可能な、細菌ライブラリー、プラスミド、抗菌薬、抗体など、大量のサンプルを必要とする研究に特に有効である。また、このin vitro organ-on-a-chip技術は、ゲノム研究やファンクショナルゲノム研究にも有効である。
研究成果
NBMから分離された大腸菌の特性評価
病原性髄膜炎菌に対する血管と神経細胞の反応に光を当てるため、新生児髄膜炎（NBM）患者から分離した2つの大腸菌株を使用しました。この2つの株、E. coli O78-285とO78-287は、O78として血清型別された（39、40）。これらの菌株の選択は、動物モデルでNBMを研究するために以前に使用された菌株に対して、実際にNBMから分離されたことと、以前に使用された菌株のK1カプセルとは異なるカプセルを生成するという2つの利点をもたらす。K1カプセルを持つ菌株は、N.meningitisが発現するシアル酸カプセルの一種であるため、これまで使用されてきました。K1カプセルを発現せず、別のカプセルを発現する細菌を使用することで、NBMに必要なカプセルはK1カプセルだけなのかどうかを明らかにすることができる。これらの菌株の塩基配列、遺伝子、生理学的解析の結果、毒素やヘモリシンを産生しないことがわかった(41)。両株とも、補足資料のFig.S1Aに示すように、ColVプラスミドと同定された大きなプラスミドを保有している（40）。このプラスミドは、シデロフォアであるエアロバクチンの産生をコードするaer遺伝子（41）を持ち、血清生存に必須である（42、43）。さらに、O78-285とO78-287の両方が、鉄欠乏の克服とヒト血液中での生存に必要なiroBとiroC遺伝子（図S1B）を発現していることも明らかにした。実際、これら2つのNBM分離株は、図S1Cに示すように、40%の血清によって阻害されなかったが、対照の大腸菌K-12株は、血清によって完全に阻害されたのと対照的であった。細菌が髄膜や脳に到達するためには、血流を通過しなければならないため、血清に耐える能力は非常に重要である。
細菌が血管細胞に付着して侵入する能力は、最初の実験セットで走査型電子顕微鏡（SEM）により評価した（図2A）。その結果、髄膜炎菌が血管細胞の表面に付着し、その膜を貫通していることが分かりました。さらに高倍率の画像では、病原性大腸菌が血管細胞表面に孔を形成し、細胞間結合を破壊している（矢印で示す）ことから、細胞に大きなダメージを与えていることが明らかになりました。細菌が内皮細胞にどのように付着するかを知るために、いくつかの時点で共焦点画像を撮影し（図2B）、付着の割合を算出した（図2C）。病原性細菌O78-285およびO78-287を曝露したヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）では、K-12（1時間後4.7%±0.3%から4時間後4%±1.4%）に比べ、より強い付着の増加（O78-285：1時間後18%±4.2から4時間後29.5%±3.5%、 O78-287 ：1時間後 26% ± 8.5% から 4時間後 32%±5.6%）が確認されました。また、細菌の侵入はゲンタマイシン保護アッセイで測定した。O78-285およびO78-287では、4時間後の細胞内細菌数はそれぞれ4.4 - 103 ± 1.6 - 103 (0.073%) および 3.2 - 103 ± 141 (0.057%) となった（図2）。
図2 大腸菌NBM株の付着・浸潤。(A）病原性大腸菌の血管内皮細胞への付着・浸潤を示す倍率の異なる代表的なSEM画像。(B）核（DAPI、青色）を染色し、細菌（緑色）に感染したHUVECの代表的な共焦点画像。スケールバー＝10μm。(C) 細菌の付着の分析。(D）材料と方法に記載されているように、ゲンタマイシン保護アッセイによって決定された浸潤レベルの分析。
内皮機能に対する細菌の影響
髄膜炎菌に対する血管反応をよりよく理解するために、トランスウェルプラットフォームやインサートチップなど、いくつかのin vitroプラットフォームを使用した（Fig. 1B）。これらのプラットフォームにより、バリアとしての内皮の重要な機能であるタイトジャンクションの変化や膜透過性などの重要なパラメータを調べることができました。理想的には、脳内皮細胞を使用することである。しかし、初代内皮細胞を通常のチップ設計に組み込むことは基本的に不可能である。そこで、私たちはヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を使用しました。HUVECは、重要なタイトジャンクションタンパク質をすべて持っており（図S2A）、内皮細胞の代表として使用できることがわかった（44）。これらのプラットフォーム上でHUVECを培養し、異なる株の大腸菌に感染させ、内皮機能への影響を検討した。まず、免疫組織化学（IHC）を用いて、1時間、4時間、24時間の複数の時点で様々な大腸菌とインキュベートしたHUVECのVE-カドヘリンの発現を調べた（図3Aおよび図S2B）。図3AからCに示すように、病原性株であるO78-285およびO78-287に曝露した細胞は、VE-カドヘリンの強度が著しく低下しており、細菌がタイトジャンクションの特性および内皮透過性に影響を及ぼす可能性があることがわかった。O78-285およびO78-287に曝露したHUVECでは、4時間後および24時間後にVE-カドヘリンが有意に減少した（O78-285：1時間後の14.6 ± 1.4 arbitrary units [AU] から4時間後の8.5 ± 2.2 AUおよび24時間後の4.2 ± 0. 3 AU after 24 h; O78-287, from 15.9 ± 0.3 AU after 1 h to 4.3 ± 1.8 AU after 24 h; *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001; twoaway analysis of variance (ANOVA); two different culture series). なお、コントロールおよび非病原性（K-12）サンプルのいずれにおいても、有意な効果は観察されなかったことを記しておく。タイトジャンクションはバリア機能と強く結びついているため、細胞単層の完全性と透過性を示すインピーダンス値の変化を識別する標準的な方法である経上皮/経内皮抵抗（TEER）を用いた（44、45）。TEER測定により、VE-カドヘリン発現に関連する以前のデータが確認され、O78-285およびO78-287大腸菌株に曝露した細胞では透過性が著しく低下した（Fig. 3D）。さらに強く、O78-285およびO78-287を介在させたHUVECでは、4時間後および24時間後にTEER値が有意に減少した（O78-285では、感染前の205.2±41.2MΩ/cm2から4時間後に173.2±24.9MΩ/cm2、24時間後に165.7±14. 8 MΩ/cm2 after 24 h; O78-287, 189.7 ± 28.9 MΩ/cm2 before the infection to 160.0 ± 20.5 MΩ/cm2 after 4 h and 130.6 ± 24.4 MΩ/cm2 after 24 h; *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001; twoaway ANOVA; 3 different culture series). 病原性細菌がバリア透過性に影響を与える能力は、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）-デキストランアッセイによっても確認された。FITC-デキストランの蛍光強度は、HUVEC対照培養と比較して、O78-285およびO78-287サンプルで強く増加し（図S2C）、内皮バリアに障害を与える能力を確認した。したがって、これらのデータは、病原性大腸菌の内皮機能に対する強い影響を示しており、内皮の完全性の低下を説明することができる。
図3 血管機能に対する髄膜炎大腸菌の影響細胞培養物は、MOI10で細菌を感染させた（105個の内皮細胞に106個の細菌を感染させた）。(A) 指定した4つの条件と時間帯におけるVE-カドヘリン（赤）およびHoechst（青）の共焦点再構成図。スケールバー＝20μm。緑色で表示された細菌に注目。(B) 指定された条件と時間帯の直交するビューによる高倍率共焦点再構成。スケールバー＝5μm。(C）パネルAに示した画像からのVE-カドヘリン発現レベルの解析。 D）髄膜炎菌の結果としてのバリア機能の変化は、経上皮／経内皮電気抵抗（TEER）測定により評価した。二元配置分散分析(ANOVA)テストによるF統計、および多重比較のためのホルム-シダックテストにより評価した統計的差異に注目。(E）細菌がない場合とある場合の内皮の図解。
NBMでは、細菌がBBBを透過して脳実質に到達することが知られているが、どのようなメカニズムでそれが起こるかはまだ不明である。この課題を解決するため、髄膜炎大腸菌がどのようにして細胞に侵入するのかを明らかにするため、高倍率共焦点イメージングを実施した。図3Bに示すように、2つの髄膜炎株はタイトジャンクションを破壊するだけでなく、細胞体内にも侵入することができます。この発見は、タイトジャンクションが無傷で、細菌のほとんどが膜上にあり、細胞内にいなかったK-12の結果と対照的である（図3E）。
細菌が炎症反応を高める
近年、一部の髄膜炎大腸菌が炎症反応の亢進や炎症性サイトカインの誘導に寄与することが明らかになった（1, 15）。炎症誘発と凝固促進における病原性細菌の影響をさらに検討するため、Von Willebrand因子（VWF、図4AおよびB）の染色と発現レベルの解析を行いました。実際、VWFは血管炎症の新たなメディエーターであり、白血球の動員を促進し、補体カスケードを活性化し、血管透過性障害に関与する（46、47）。
図4 炎症反応に対する髄膜炎大腸菌の影響。A）コントロール（未処理）、K-12、O78-ΔetPetK、O78-285、O78-287の5つの条件で、Von Willebrand因子（VWF）（緑）およびHoechst（青）で染色したHUVECの共焦点再構成図である。スケールバー＝20μm。(B）VWF発現量の解析。(C）インターロイキン-6（IL-6）のFold変化。(D）異なる細菌に反応したTNF-αのフォールド変化。
血管透過性に対する細菌の最も強い効果が24時間後に確認されたので、この特定の時点におけるVWF発現を特徴付けることにした。図4Bに示すように、対照試料（コントロール、K-12）はVWFの顕著な発現を示さなかったが、O78-285およびO78-287と相互作用した細胞は有意な変化を示した。さらに、VWFは炎症の増加とも関連しているため（48）、感染後のサイトカイン発現の変化をモニターした（図4C）。予想通り、O78-285およびO78-287に曝露した細胞では、コントロール培養と比較して、インターロイキン6（IL-6）および腫瘍壊死因子α（TNF-α）の分泌が有意に増加した（図4CおよびD）ことから、病原株による血管炎症誘発能が確認された。
細菌の莢膜は、多くの感染症において重要な病原性因子である(49)。以前、大腸菌髄膜炎にはK1カプセルが必須であることが示された（50、51）。大腸菌血清型O78は4群（O抗原）カプセルを持ち（50）、血清耐性に必須であることが示された（52）。今回の髄膜炎株はK1以外のカプセルを持つことから、カプセルの必要性が一般的なものか、シアル酸（K1カプセル）にのみ特異的なものかを判断することができた。実際、我々は、O-抗原、グループ4のカプセルも炎症反応の誘導に必須であることを示した。図4に示すように、4族カプセルの合成をコードするetKetP遺伝子を欠損させた細菌（ΔetPetK）は、炎症反応に関してコントロールやK-12細菌と同様の挙動を示した（図4）。
細菌と神経細胞培養液との相互作用
髄膜炎大腸菌が血管細胞の形態と機能に与える影響を特徴付けると、NBMの影響を受ける次の生理系、すなわち脳実質に話を移した。そのために、分離して14日から20日間in vitro（DIV）で培養した皮質神経細胞を使用しました。初代神経細胞培養液を異なる大腸菌株と1時間、4時間、24時間インキュベートし、その形態と機能を共焦点顕微鏡と電気生理学的測定により調査した。まず、アストロサイト（GFAP）とニューロン（β-チューブリンIII）の免疫蛍光マーカーを用いて、コントロールと大腸菌処理した大脳皮質培養物の細胞組成を決定しました。その結果、3つの異なる時点のすべての条件下で、β-チューブリンIII（神経細胞）とGFAP（グリア線維性酸性タンパク質の染色体）の両方を確認しました（図5A）。病原性細菌を添加すると、β-チューブリンIII量は、O78-285およびO78-287サンプルでは24時間後、O78-287株では4時間後でも有意に減少した（図5A～C）。グリア細胞の面積については、差は検出されなかった（図5D）。このように、病原性株は、神経細胞の形態と生存率を特異的に変化させた。なお、髄膜炎菌は、内皮細胞とは対照的に、神経細胞-グリア培養の高倍率イメージング（図5B）で示されたように、神経細胞やアストロサイトに侵入せず、主に神経細胞膜に結合していた（図5E）。
図5 神経グリア形態に対する髄膜炎大腸菌の影響実験は、図3について説明したように実施した。合計104個の細胞に105個の細菌を感染させた。(A）4つの指定された条件および時点のβ-チューブリン（赤）およびGFAP（シアン）についての共焦点再構成である。スケールバー＝20μm。緑色で表示された細菌に注目。(B) 指定された条件と時間帯の直交するビューによる高倍率共焦点再構成。スケールバー＝10μm。(C）髄膜炎菌によるβ-チューブリン体積の変化。(D）髄膜炎菌によるGFAP体積の変化。(E）細菌がない場合とある場合の神経細胞とアストロサイトの図解。
神経細胞の形態と生存率が特徴付けられたら、細菌感染によって神経細胞の機能がどのように変化するかを明らかにしようとした（図6）。この目的のために、大脳皮質神経細胞の一次培養において、細胞外の自発的スパイクを記録するために、多電極アレイ（MEA）記録システム（図6A）を使用した。このシステムでは、治療前と治療後の同じ培養物から記録と解析ができるため、培養物間のばらつきが大幅に減少する。図6Bは、3つの時点で異なる株について記録された電気活動の代表的な電流トレースである。スパイクの出現は、ネットワークの有効性を示す指標として広く受け入れられている機能的なシナプス形成の明確な証拠となりました。さらに、O78-285およびO78-287病原性株は、神経細胞の電気活動を著しく低下させていることが明確に確認できる（図S3）。1サンプルあたり12電極のうち9電極以上を定量化したところ、これらの菌株は、自発的スパイクのパターンやバースト活動・特性など、いくつかのパラメータにおいて神経細胞活動を有意に低下させることがわかった（図6C）。バースト活動とは、短時間に発生した一連の自発的なスパイクと判断した。最小3個、最大スパイク間隔0.3秒の自発的スパイクをバーストと定義し、病原性細菌がバースト活動に大きな影響を与えることを示しました（図6C）。シナプス電気活動の強い減少は、先に述べたβ-チューブリンIIIの著しい減少を強く裏付け、大腸菌O78-285およびO78-287がシナプス形成と機能を著しく変化させ、細胞の生存と適切な機能性ネットワークサイズに影響を及ぼす能力を強調している。
図6 神経細胞機能に対する髄膜炎大腸菌の影響 (A）MEAプラットフォーム上で成長させた皮質ニューロンの明視野画像。スケールバー＝100μm。(B) 3つの異なる時点（14 DIV、4時間、24時間）における異なる条件の代表的な電気生理学的記録。 (C) 病原菌に直接感染した神経細胞の4つの異なる時点における異なる条件の電気生理学的パラメータを示すプロット（P値は表S1に示す）。
神経血管ユニット・オン・ア・チップの構築
髄膜炎菌の脳への影響をより深く理解するために、神経血管ユニット（NVU）を模擬したorgan-on-a-chipを構築しました。このシステムは、独立した構成要素（内皮と神経細胞を別々に）の反応とは異なる、システム全体の反応を模倣するものである。そのために、血管系細胞と神経系細胞をインサートチップ上で共培養しました（30）。このインサートチップは、透明な歯科用樹脂から3Dプリントされたもので、その底面近くには、細胞を培養して配置できる単一の多孔質膜がある（図7A）。重要なのは、このインサートチップが市販のMEAプラットフォームに組み込まれ（図7B）、バリア組織の透過性が市販のTEERシステムで測定され、電気活動がMEAプラットフォームで測定されたことである（図7C）。NVUの模倣は次のように行った。インサートチップ上でHUVECを培養し、細胞がコンフルエントな単層を形成したところで、チップをMEAの上に置き、皮質ニューロンを14DIV培養した後、血管区画に細菌を追加し、in vivoシナリオと同様にしました（図7A）。このようにして、NVUの構造をよりよく再現し、内皮側に大腸菌を添加した後のニューロンへの細菌の影響を調べることができた。バリア透過性をTEERで測定し（図7CおよびD）、神経細胞の電気的活動（図7CおよびE）と共に測定した。血管細胞について先に示したように、髄膜炎菌は4時間後に内皮の透過性を著しく低下させた（図7D）。しかし、前回の神経細胞独立培養での実験では、主に4時間後に神経細胞活動の有意な低下が観察されたのに対し、ここでは、内皮層が電気活動の低下を20時間程度先送りしていることがわかる（図7Eおよび図S4）。これらの結果から、髄膜炎菌が血管側に添加されると、内皮を透過して神経細胞に到達し、スパイクやバースト活動を有意に低下させたと考えられる。ここで重要なことは、共培養において神経細胞の電気活動が細菌の影響を受けるダイナミズムが、独立した神経細胞培養における減衰と大きく異なることである。共培養では、減衰が非常に早い独立した神経細胞培養と比較して、減衰は非常に緩やかであり、いくつかのパラメータ（例えば、バースト持続時間）に効果が見られるまでに48時間かかることがある。
図7 血管-神経細胞共培養機能に対する髄膜炎大腸菌の影響。(A）本研究で使用したインサートチップを表すスケッチで、膜の上部に血管細胞、MEAの上部に神経細胞を共培養している。共焦点再構成により、血管細胞（VE-Cadherin［赤］、Hoechst［青］染色）と神経膠細胞（β-チューブリン［赤］、GFAP［シアン］、Hoechst［青］染色）という2種類の細胞を示す。スケールバー＝10μm。(B) MEAプラットフォームに挿入されたインサートチップを示す写真。(C）TEERと電気生理学的測定を同時に行うことができるMEA内のインサートチップを示す写真。(D）神経細胞と共培養し、異なる細菌に感染させたHUVECのバリア機能の変化。(E）細菌に感染させたHUVECのみで、4つの時点における異なる条件の電気生理学的パラメータを示すプロット（P値は表S1に示す）。
考察
ここでは、内皮細胞、神経細胞、および血管系と神経細胞をインサートチップ上で共培養したNVU-on-a-chip（neurovascular-unit on a-chip）のin vitroモデルを用いた大腸菌NBMの研究に関して述べた（30）。これらのシステムでは、膜の安定性、タイトジャンクションの運命、細胞上または細胞内の細菌の局在など、基本的な細胞生理学的パラメータに対する細菌の効果を決定することが可能である。これらのパラメータは、NBMのモデルとして乳児のげっ歯類や豚を使用する動物実験では決定できない。さらに、NVU-on-a-chipを用いることで、複数の脳組織を含むモデル系での感染や、組織間の相互作用の研究が可能になります。例えば、独立した神経細胞培養では、4時間後に神経細胞活性の有意な低下が観察されたが、内皮層の存在により、神経細胞活性の低下が何時間も遅延することがわかった。また、内皮層の存在は、神経電気活動の動態にも影響を及ぼし、48時間後まで、独立した神経細胞培養よりもはるかに緩やかに減少する。
特に、大腸菌による髄膜炎の発症メカニズムや、細菌がBBBをどのように通過するかについての知識が不十分であることが、この病気に関連する重大な死亡率の原因となっていることを考えると、細菌性髄膜炎の理解に優れたモデル系を持つことは不可欠である。
髄膜炎を引き起こすためには、どのような遺伝的・生理的特徴が不可欠なのか。今回の実験では、NBMから分離された大腸菌O78の2株、O78-287とO78-285を使用した（39、40）。これらはColVプラスミドと鉄の取り込みをコードするいくつかの遺伝子（図S1）を持ち、血流中で生存するために必須であり、細菌が髄膜や脳に到達することを可能にします。莢膜は病原体として重要であり、さらに、NBMにとってK-1莢膜の重要性がいくつかの研究で示されていることから、莢膜の生合成に関わる遺伝子が重要であるはずと考えた。実際、我々が構築した大腸菌O78のカプセル形成をコードするetPetK遺伝子を欠失した変異体は、我々のin vitro系では全く被害を出さなかった。私たちのin vitroシステムで、感染を引き起こさない変異体を検出できるという発見は、NBMに必須な遺伝子を特定することを目的としたゲノム実験を行う可能性を開くものである。このように、本システムでは、サンプル数が限られる新生児マウスとは対照的に、大量の変異体ライブラリーをスクリーニングすることが可能である。さらに、本システムでは、細菌と組織培養細胞の転写・翻訳パターンをスクリーニングする機能的ゲノム実験が可能である。
細菌性髄膜炎の発症において最も重要なステップは、細胞外病原体が、通常は病原体や毒素を排除する手ごわい防御システムであるBBBを越えて侵入することである。この研究に最適なモデル系は、脳内皮細胞であろう。しかし、私たちのチップ設計では、これを実現することができませんでした。代わりに、重要なタイトジャンクションタンパク質をすべて持ち、内皮細胞を表現できることから、代用品として許容できるヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を使用した（図S2）（44）。実際、HUVECモデルは、様々な研究においてBBBを生理学的に代表するものとして説明されており（35, 53, 54）、BBBに対する新規薬剤の影響だけでなく、生理的および病理的状態の研究が可能です。本研究は、病原性大腸菌が血管細胞に侵入することを示すこれまでの結果を裏付けるものであり、この性質は脳への侵入の前提条件である（22、55）。さらに、共焦点測定により、病原性大腸菌は、内皮細胞そのものを通過するトランスセルラー方式と、タイトジャンクションを破壊するパラセルラー方式の両方でBBBを通過する能力があることが示された。一旦バリアーを通過した病原性株は、生体内でアストロサイトや神経細胞と直接接触している血管細胞の反対側を通って出ていきます。
大腸菌による髄膜炎で明らかになったように、サイトカインやケモカインがBBBの損傷に寄与する可能性がある(1, 56)。我々はこれらの結果を確認し、TNF-αやIL-6などの炎症性サイトカインのバーストが、内皮バリアの機能障害や脳の血管透過性の上昇を直接もたらし、最終的に重度の中枢神経系障害を引き起こす可能性を強調した（57、58）。未解決の問題は、髄膜炎菌がどのようにして脳に侵入し、神経細胞に影響を与えるかということである(59)。このような病原体と神経細胞との相互作用の背後にある特定の分子メカニズムはまだ研究中であるが、細菌と神経細胞との相互作用と脳内の神経炎症反応が神経細胞死を引き起こすことは明らかである。最近の研究では、細菌がタイトジャンクションを損傷することで、細菌が脳実質に侵入することが示唆されている。ここでは、VE-CadherinとTEERの値がともに有意に低下することが確認され、これらの知見を支持しています。しかし、今回の結果は、このメカニズムに加えて、細菌が内皮に入り込み、細胞を通り抜けることができることを示唆しています。なお、タイトジャンクションの破壊と神経細胞への侵入は、髄膜炎株でのみ起こり、無病原性K-12株では起こらないことが重要である。したがって、K-12のような常在菌はダメージを与えず、それで処理した細胞は、未処理のコントロール細胞と同じように振る舞った。この発見は、前述のように、NBMの原因となる遺伝子をゲノムワイドに同定する必要性を強調するものである。
髄膜炎菌と神経細胞培養液との相互作用から、興味深い点がいくつも明らかになった。(i) 神経細胞は、グリア細胞（アストロサイト）よりも髄膜炎菌にはるかに感受性が高い。(ii)その効果は髄膜炎菌にのみ起こり、前駆菌であるK-12株には起こらない。(iii) 細菌と内皮および神経細胞との相互作用に大きな違いがある。細菌は内皮を貫通することができるが、神経細胞内ではそのような過程を観察することはできなかった。
NBMが新生児の脳に大きな影響を与え、大きな障害や死に至ることもあることが知られているが（59）、髄膜炎菌が神経細胞とどのように相互作用し、影響を与えるかは分かっていない。一つの仮説として、細菌性髄膜炎は神経炎を引き起こし（2）、神経細胞の損傷を促進し、神経細胞の後成熟状態により、神経回路に修復不可能な影響を与える可能性がある（59, 60）。実際、神経炎症は、活性酸化種や一酸化窒素などのいくつかの細胞毒性化合物の放出を引き起こし、これがプロアポトーシス化合物の放出を刺激し、最終的にニューロンやその他の脳内常在細胞のアポトーシスにつながる(61)。神経細胞は後天性であるため、将来的に細胞が入れ替わることなく神経細胞の劣化を助長するため、潜在的に有害な影響を及ぼす可能性がある（60）。私たちの研究は、非常に短い時間（24時間以内）でニューロンが著しく損傷し、その活性を失うことを実証しています。
内皮とニューロンを統合してNVU-on-a-chipシステムを作ると、この統合システムと細菌の相互作用は、個々の区画（内皮のみまたはニューロンのみ）で観察されたものと同様であることを示すことができました。この結果は、内皮層は細菌を阻止することで神経細胞を保護するが、細菌が脳実質に侵入して神経細胞の機能を奪うことを阻止することはできないことを示しています。
もう一つの興味深い観察は、神経細胞の電気活動の変化のダイナミズムが、独立した培養と共培養とで異なるということである。これは、神経細胞の独立培養では髄膜炎菌が一度に添加されるのに対し、内皮から徐々に髄膜炎菌が侵入することが主な理由である。この結果は、細菌がBBBに入り込み、細胞毒性化合物の放出を増加させ、このようにして神経細胞の損傷につながるというこれまでの仮定を確認することができる（59）。
以上のように、生体内の神経細胞・内皮細胞間の相互作用を模倣したモデル系を利用することで、脳組織への生理的影響という観点からNBMを研究し、感染菌のゲノムレベルでの研究を行うことができる。このような研究により、この感染症や関与する細菌についての理解を深めることができるはずです。さらに、このシステムは、中枢神経系を含む新たな感染症の病態生理を研究するために適応することができる。
材料と方法
菌株、増殖条件、培地
本研究で使用した大腸菌の全菌種を表 1 に示す。菌はLuria-Bertani（LB）ブロス（Difco）中、37℃で通気しながら培養した。クロラムフェニコール（Sigma-Aldrich）は、必要に応じて、最終濃度33μg/mLで添加した。pTac-YFP（表1参照）の形質転換は、標準的なプロトコル（62、63）を用いてエレクトロポレーションにより実施した。一晩培養したものをLB培地で1：100に希釈し、BioTek Eonプレートリーダーで20分ごとに600nmの光学密度（OD600）での濁度を測定した。血清の影響を調べる場合は、滅菌・ろ過したヒト男性AB血漿（Sigma-Aldrich）を使用した。感染については、新鮮な一晩培養したものを希釈し、中ログ相（OD600 nm = 0.6）まで増殖させた。その後、感染倍率（MOI）が10となるように希釈した。このMOIは、すべての細胞が感染することを保証しつつ、培養物に細菌を過剰に投入しないために選択された。侵入した細菌は、以前に記述したように、標準的な抗生物質保護アッセイによって定量化した（64、65）。
表1 本研究で使用した株とプラスミド（表見出し）
DNAの技術。
DNAの単離およびアガロースゲル電気泳動は、以前に記載したように行った(66)。大型プラスミドの調製と可視化は、既述の通り行った（67）。iroBおよびiroC遺伝子は、表S2に記載のプライマーを用いたPCRにより検出した。
内皮細胞培養。
ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）（PromoCell GmbH, Heidelberg, Germany）を、血管特性に対する細菌の影響を試験するために使用した。解凍後、凍結したHUVECを低漿液性内皮細胞増殖培地（PromoCell）で37℃、5％CO2、加湿インキュベーター内で増殖し、継代p3からp6で用いた（30、44）。細胞は80～90％コンフルエンスまで成長させてから、透明ポリエチレンテレフタレート（PET）トランスウェル支持体（孔径0.4μm、Greiner Bio-One、オーストリア）、プラスチックウェルプレート（コーニング）、ガラス底ウェルプレート（セルビス、マウンテンビュー、カリフォルニア）、および挿入チップ（30）に移した。播種前に、コーティングされていない基板を、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で希釈したエンタクチン-コラーゲンIV-ラミニン（ECL）細胞付着マトリックス（Merck）（10 μg/cm2）でインキュベーター内で1時間処理した。その後、トリプシン／EDTA溶液（Biological Industries社製）で採取したHUVECを培養台内に25万個／cm2の密度で播種して48時間培養した後、細菌を添加し、1時間後、4時間後、24時間後に細胞の挙動に対する影響を試験した。
神経細胞培養。
生後間もないラット（p2〜p3）から、既述のように初代解離培養物を得た（68、69）。すべての実験は、地元当局の承認を得て、イスラエルの法律に従って行われた。動物の苦痛を最小限に抑え、使用する動物の数を減らすためにあらゆる努力が払われた。神経性海馬細胞は、ガラス底ウェルプレート（Cellvis）およびネットワーク調査用の多電極アレイ（MEAs; Multi-Channel Systems, Reutlingen, Germany）プラットフォーム上にプレーティングした。細胞播種の前に、ガラス底プレートはポリ-d-リジンで処理し、MEA基板はポリエチレンイミン（PEI、Sigma-Aldrich）でボレートバッファー（Sigma-Aldrich）中で4℃にて一晩処理した。その後、両基板を蒸留水で4回洗浄し、紫外線で1時間滅菌した後、牛胎児血清（FBS、5％、Biological Industries）、B27（2％、Gibco）、Glutamax（1％、Gibco）およびPSA（1％、Biological Industries）を添加したニューロベース培地（Gibco）中で希釈したラミニン（20μg／mL、Sigma-Aldrich）で37℃で4時間処理しました。
その後、神経性海馬細胞をプレーティングメディウムでコーティングした基板上にプレーティングし、5％CO2で濃縮した加湿雰囲気下で37℃にてインキュベートした。播種から24時間経過した後、培地をB27（2％）、Glutamax（1％）、PSA（1％）、ゲンタマイシン（1％、Gibco）（70、71）を補充した無血清神経基底培地に置換（80％）した。培養液は、播種から3日ごとに更新（50％）した。プレーティングは、100,000細胞/cm2の公称密度で実施された。そして、培養物は、インビトロで12〜20日後（DIV）に実験に使用した。
走査型電子顕微鏡で観察した。
細菌の形態および内皮細胞との相互作用は、走査型電子顕微鏡（SEM）を通じて定性的に評価した。画像は、Quanta 200FEG環境SEM（ESEM）で高真空モードで二次電子を収集することにより取得した。異なるサンプルは、12.5kVの電子ビームで画像化した。細胞サンプルは、カコジル酸ナトリウムバッファー中の2.5％グルタルアルデヒド（シグマアルドリッチ）および4％パラホルムアルデヒド（シグマアルドリッチ）で、室温で60分間固定した。カコジル酸緩衝液で3回洗浄した後、サンプルを蒸留水中のOsO4で60分間ポストフィックスし、その後、アルコール濃度が徐々に高くなる水/エタノール溶液（25%、50%、75%、95%、100%エタノール、各5分間）にサンプルを浸漬する脱水工程を行いました。サンプルは室温で乾燥させた。SEMイメージングに先立ち、サンプルはAu/Pdスパッタコーターを用いてスパッタリングされた。
共焦点ライブイメージング。
HUVECをガラス底ウェルプレート（Cellvis）上で培養し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中のDAPI（4′，6-diamidino-2-phenylindole）を用いて室温（RT）で10分間インキュベートして核を染色させた。その後、細菌を加え、適切なフィルターキューブを用い、20×（0.8数値開口[NA]）レンズ対物レンズを備えた倒立共焦点顕微鏡（Olympus FV3000-IX83）を用いて、異なる時点（1時間、4時間、24時間）で共焦点画像を撮影した。画像の再構成と解析は、オープンソースのImageJソフトウェア(72)を用いて行った。
免疫蛍光および共焦点イメージング。
HUVECと神経細胞の両方をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、4％パラホルムアルデヒド（Sigma-Aldrich、Rehovot、イスラエル）で、細菌添加から1時間、4時間、24時間後に室温（RT）で20分間固定した。免疫細胞化学は、PBS中の0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) で10分間RTで透過処理し、PBS中の5% FBSと5%ウシ血清アルブミン (BSA) で30分間ブロッキングした後に実施されました。以下の一次抗体をPBS中、4℃で一晩適用した：血小板内皮細胞接着分子1（PECAM1）に対するウサギ抗VWF（Abcam、Cambridge、UK）、ウサギ抗VE-カドヘリン（Cell Signaling Technology、Danvers、MA）、ウサギ抗CD31（Abcam）、ウサギ抗β-カテニン（Cell Signaling Technology）、ウサギ抗ZO-1（Cell Signaling Technology）、ウサギ抗オクルディン（Cell Signaling Technology）、ウサギ抗β-チューブリンIII（Sigma-Aldrich）、およびマウス抗GFAP（Sigma-Aldrich）である。次に、細胞をPBSで3回洗浄し、二次抗体である抗ウサギAlexa Fluor 488（Invitrogen、Carlsbad、CA）、抗ウサギAlexa Fluor 594（Invitrogen）、および抗マウスAlexa Fluor 647（Invitrogen）で1時間、RTで染色をした。PBSで4回洗浄した後、細胞をPBS中のHoechstと10分間インキュベートし、核を染色した（RT）。PBSで2回洗浄した後、適切なフィルターキューブを用い、20×（0.8NA）、40×（0.95NA）、60×（1.42NA）のレンズ対物を備えた倒立共焦点顕微鏡（Olympus FV3000-IX83）を用いてイメージングが行われた。画像再構成と解析は、オープンソースのImageJソフトウェア(72)を用いて行った。
経上皮/経内皮電気抵抗（TEER）測定。
細菌感染から1時間後、4時間後、24時間後にTEER測定を行い、内皮単層のバリア特性を評価した。TEERは、Millicell ERS-2 voltohmmeter（Merck Millipore社製）を用いて測定した。TEER値（Ωcm2）は、異なる細菌株に曝露された細胞間の異なる時点において、3つの異なる個々の実験において、ブランクとみなされる細胞を含まないトランスウェルインサートまたはインサートチップから得られた値を差し引いて計算した。
透過性アッセイ。
HUVECは、上記のように12ウェルのTranswellインサート上で培養した。細菌感染から4時間および24時間後に、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）-デキストラン（Sigma-Aldrich）をインサートの上部区画に投与した。そして、デキストランを投与してから1時間後に、蛍光プレートリーダーを用いて、励起492nm、発光518nmで下部コンパートメントの培地の蛍光強度を測定した。異なる条件から得られたFITC結合デキストラン濃度は、細胞を含まないトランスウェル（TW）から得られた濃度に対して正規化し、ブランクとした。
MEA記録。
神経細胞ネットワーク細胞外記録は、24マルチウェルMEAプレートシステム（Multi Channel Systems）を用いて実施された。初代皮質培養物を、12個の電極（電極直径30μm、電極間隔300μm）を有する金コート電極MEA上にプレーティングした。生データは、市販のソフトウェアMultiwell-Screen（Multi Channel Systems）を用いて、細胞培養液の存在下、37℃でモニター・記録した。記録されたイベントは、Matlabソフトウェアでオフラインで解析した。
サイトカインアッセイ。
IL-6およびTNF-αの定量的酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を、感染前および細菌感染後1時間、4時間、24時間の感染HUVECのコンディション培地で、製造者の推奨（PeproTech Rehovot、イスラエル）に従って実施した。
統計解析を行った。
結果は、平均値±標準偏差（SD）で示した。複数のグループ間の統計的に有意な差は、二元配置分散分析、次いで多重比較のためのホルム-シダックテスト（GraphPad Prism 8.4.3）により評価した。2つのデータセット間の統計的有意差を評価し、P値＜0.05を統計的に有意とした。
倫理
すべての実験は、地元の獣医当局およびテルアビブ大学の動物倫理委員会（倫理承認番号01-19-079）の承認を受け、イスラエルの法律に従って行われた。動物の苦痛を最小限に抑え、使用する動物の数を減らすためにあらゆる努力が払われた。
データの入手
本研究の結果を裏付けるデータは、ファイルS1に掲載されています。
補足資料
補足資料は、オンラインのみで入手可能です。
補足ファイル1
補足資料です。spectrum.01233-23-s0001.pdfのダウンロード, PDFファイル, 2.0 MB
謝辞
特に、SEM測定を実施してくれたZahava BarkayとAmit Gutwillig、アートワークをしてくれたGal Balushに感謝する。
B.M.M.、R.R.、K.T.は、アズリエリ財団、イスラエル科学財団（ISF grant: 2248/19）、ERC SweetBrain 851765、The Aufzien Family Center for the Prevention and Treatment of Parkinson's Disease at Tel Aviv University、イスラエル科学技術省（助成番号 3-17351）により支援を受けています。
R.R.は、チップの開発、実験の実施、データ解析、原稿執筆を行った。S.N.とD.B.は細菌実験を実施した。K.T.はMEAのデータ解析を行った。E.Z.R.とB.M.M.は、アイデアを考え、学生を指導し、原稿を執筆した。
我々は、競合する利害関係を宣言しない。
参考文献
1.
Liu W-T, Lv Y-J, Yang R-C, Fu J-Y, Liu L, Wang H, Cao Q, Tan C, Chen H-C, Wang X-R. 2018. 定量プロテオミクス解析から脳微小血管内皮細胞の髄膜炎性大腸菌感染に関する新しい知見を得た。J Neuroinflammation 15:291. Crossref. PubMed. ISI.
2.
Kim KS. 2003. 細菌性髄膜炎の発症機序：菌血症から神経細胞傷害まで。Nat Rev Neurosci 4:376-385. Crossref. PubMed. ISI.
3.
Kim KS. 2008. 血液脳関門を通過する微生物のメカニズム. Nat Rev Microbiol 6:625-634. Crossref. PubMed. ISI.
4.
Kim KS. 2010. 乳幼児および小児における急性細菌性髄膜炎。Lancet Infect Dis 10:32-42. Crossref. PubMed. ISI.
5.
マシニャーニV、ピッツァM、モクソンER. 2019. リバースワクシノロジーを用いた髄膜炎菌Bに対するワクチンの開発。Front Immunol 10:751. Crossref. PubMed. ISI.
6.
Rappuoli R, Pizza M, Masignani V, Vadivelu K. 2018. 髄膜炎菌Bワクチン（4CMenB）：研究から実世界の経験への道のり。Expert Rev Vaccines 17:1111-1121. Crossref. PubMed. ISI.
7.
Russo TA, Johnson JR. 2000. 大腸菌の腸管外病原性分離株に対する新しい包括的呼称の提案：ExPEC. J Infect Dis 181:1753-1754. Crossref. PubMed. ISI.
8.
ビランD、ロンEZ. 2018. 腸管外病原性大腸菌（Extraintestinal pathogenic Escherichia coli）。Curr Top Microbiol Immunol 416:149-161. Crossref. PubMed. ISI.
9.
Weissman SJ, Hansen NI, Zaterka-Baxter K, Higgins RD, Stoll BJ. 2016年. 米国で早期発症の敗血症および髄膜炎を発症した新生児から回収された大腸菌における抗生物質耐性関連クローンの出現（2008-2009年）。J Pediatric Infect Dis Soc 5:269-276. Crossref. PubMed.
10.
Tauzin M, Ouldali N, Lévy C, Béchet S, Cohen R, Caeymaex L. 2019. 乳児の大腸菌髄膜炎におけるシプロフロキサシンと第3世代セファロスポリンの併用療法と第3世代セファロスポリン単剤療法：多施設共同傾向スコアマッチ観察研究。Clin Microbiol Infect 25:1006-1012. Crossref. PubMed. ISI.
11.
Boyer L. 2016. Escherichia coli K1 meningitis: Analysis of the effects of CNF1 toxin in newborn mice questions its virulence function. Virulence 7:754-755. Crossref. PubMed.
12.
Mittal R, Wang Y, Hunter CJ, Gonzalez-Gomez I, Prasadarao NV. 2009. Enterobacter sakazakiiによる髄膜炎の新生児ラットモデルにおける脳障害：外膜タンパク質Aの役割。 Lab Invest 89:263-277. Crossref. PubMed. ISI.
13.
Park WS, Chang YS, Shim JW, Kim MJ, Ko SY, Kim SS, Hwang JH, Choi CW, Lee M. 2003年. 実験的新生児大腸菌髄膜炎における脳血流、脳細胞膜機能、エネルギー代謝に及ぼすドーパミン注入の影響．J Korean Med Sci 18:869-875. Crossref. PubMed. ISI.
14.
Pfister HW, Fontana A, Tauber MG, Tomasz A, Scheld WM. 1994. 細菌性髄膜炎における脳損傷のメカニズム：ワークショップのまとめ。Clin Infect Dis 19:463-479. Crossref. PubMed. ISI.
15.
Van Furth AM, Roord JJ, Van Furth R. 1996. 細菌性髄膜炎の病態生理における炎症性サイトカインと抗炎症性サイトカインの役割と補助療法の効果。Infect Immun 64:4883-4890. Crossref. PubMed. ISI.
16.
Täuber MG, Moser B. 1999. 髄膜炎におけるサイトカインとケモカイン：生物学と臨床的意義。Clin Infect Dis 28:1-11; quiz 12. Crossref. PubMed. ISI.
17.
Scheld WM, Koedel U, Nathan B, Pfister HW. 2002. 細菌性髄膜炎の病態生理：神経細胞傷害のメカニズム. J Infect Dis 186:S225-S233. Crossref. PubMed. ISI.
18.
Le Govic Y, Demey B, Cassereau J, Bahn YS, Papon N. 2022年。中枢神経系に感染する病原体。PLoS Pathog 18:e1010234. Crossref. PubMed. ISI.
19.
Kim KS. 2001. 血液脳関門における大腸菌のトランスロケーション（Escherichia coli translocation at the blood-brain barrier. Infect Immun 69:5217-5222. Crossref. PubMed. ISI.
20.
Zhao W-D, Liu D-X, Wei J-Y, Miao Z-W, Zhang K, Su Z-K, Zhang X-W, Li Q, Fang W-G, Qin X-X, Shang D-S, Li B, Li Q-C, Cao L, Kim KS, Chen Y-H. 2018. Caspr1は髄膜炎を引き起こす大腸菌の宿主受容体である。Nat Commun 9:2296. Crossref. PubMed.
21.
Wang Y, Huang SH, Wass CA, Stins MF, Kim KS. 1999. 遺伝子座yijPはEscherichia coli K1の脳微小血管内皮細胞への浸潤に寄与している。Infect Immun 67:4751-4756. Crossref. PubMed. ISI.
22.
Huang SH, Wass C, Fu Q, Prasadarao NV, Stins M, Kim KS. 1995. 大腸菌の脳微小血管内皮細胞への侵入（in vitroおよびin vivo）：侵入遺伝子ibe10の分子クローニングと特徴づけ。Infect Immun 63:4470-4475. Crossref. PubMed. ISI.
23.
Huang SH, Wan ZS, Chen YH, Jong AY, Kim KS. 2001. 大腸菌脳微小血管内皮細胞侵入遺伝子ibeAの欠失、相補性、タンパク質発現によるさらなる特徴づけ。J Infect Dis 183:1071-1078. Crossref. PubMed. ISI.
24.
Huang SH, Chen YH, Fu Q, Stins M, Wang Y, Wass C, Kim KS. 1999. 脳微小血管内皮細胞への侵入に必要な大腸菌侵入遺伝子座、ibeBの同定と特徴づけ。Infect Immun 67:2103-2109. Crossref. PubMed. ISI.
25.
Labus J, Häckel S, Lucka L, Danker K. 2014. Interleukin-1β induces an inflammatory response and the breakdown of the endothelial cell layer in an improved human THBMEC-based in vitro blood-brain barrier model. J Neurosci Methods 228:35-45. Crossref. PubMed. ISI.
26.
キャンフィールドSG、ステビンズMJ、モラレスBS、浅井SW、ヴァティーンGD、スヴェンセンCN、パレチェクSP、シュスタEV．2017. ヒト人工多能性幹細胞由来の脳内皮細胞、アストロサイト、およびニューロンからなる同系統の血液脳関門モデル。J Neurochem 140:874-888. Crossref. PubMed. ISI.
27.
Nikolakopoulou P, Rauti R, Voulgaris D, Shlomy I, Maoz BM, Herland A. 2020年。中枢神経系のトランスレーショナルエンジニアリングされたin vitroモデルにおける最近の進展。Brain 143:3181-3213. Crossref. PubMed. ISI.
28.
Cardoso FL, Brites D, Brito MA. 2010. 血液脳関門を見る：分子解剖学と調査アプローチの可能性。Brain Res Rev 64:328-363. Crossref. PubMed. ISI.
29.
Dalvi S, On N, Nguyen H, Pogorzelec M, Miller DW, Hatch GM. 2014. 血液脳関門-脂肪酸と薬物輸送の調節、p1-33。Neurochemistry. https://www.intechopen.com/chapters/46312. Crossref.
30.
Rauti R, Ess A, Roi BL, Kreinin Y, Epshtein M, Korin N, Maoz BM. 2021. 井戸をチップに変換する：モジュール式3Dプリントマイクロフルイディックチップ。APL Bioeng 5:e026103. Crossref.
31.
Renous N, Kiri MD, Barnea RA, Rauti R, Leichtmann-Bardoogo Y, Maoz BM. 2021. organs-on-chips に統合された空間的経上皮電気抵抗（S-TEER）。Lab Chip 22:71-79. Crossref. PubMed. ISI.
32.
Booth R, Kim H. 2012. 血液脳関門のマイクロ流体in vitroモデル(μBBB)の特性評価。Lab Chip 12:1784-1792. Crossref. PubMed. ISI.
33.
Prabhakarpandian B, Shen M-C, Nichols JB, Mills IR, Sidoryk-Wegrzynowicz M, Aschner M, Pant K. 2013年. SyM-BBB: a microfluidic blood brain barrier model. Lab Chip 13:1093-1101. Crossref. PubMed. ISI.
34.
Griep LM, Wolbers F, de Wagenaar B, ter Braak PM, Weksler BB, Romero IA, Couraud PO, Vermes I, van der Meer AD, van den Berg A. 2013. BBB on chip: microfluidic platform to modulate mechanically and biochemically blood-brain barrier function. Biomed Microdevices 15:145-150. Crossref. PubMed. ISI.
35.
Yeon JH, Na D, Choi K, Ryu S-W, Choi C, Park J-K. 2012. 脳血管を模倣したマイクロ流体デバイスにおける信頼性の高い透過性アッセイシステム. Biomed Microdevices 14:1141-1148. Crossref. PubMed. ISI.
36.
ハジャルC、ルロワB、カムRD、マオズBM. 2021. 血液脳関門の生物学とモデル。Annu Rev Biomed Eng 23:359-384. Crossref. PubMed. ISI.
37.
マオズBM. 2021. Brain-on-a-chip: Characterizing the next generation of advanced in vitro platforms for modeling the central nervous system. APL Bioeng 5:e030902. Crossref.
38.
Wu Q, Liu J, Wang X, Feng L, Wu J, Zhu X, Wen W, Gong X. 2020年。Organ-on-a-chip: recent breakthroughs and future prospects. Biomed Eng Online 19:9. Crossref. PubMed. ISI.
39.
Milch H, Czirók E, Madár J, Semjén G. 1977. 髄膜炎、敗血症および腸炎を引き起こすEscherichia coliの血清群の特徴づけ。II. ファージ感受性、コリシンタイプおよび抗生物質耐性によるEscherichia coli O78菌株の分類。Acta Microbiol Acad Sci Hung 24:127-137. PubMed.
40.
Milch H, Nikolnikov S, Czirók E. 1984. Escherichia coli Col V plasmids and their role in pathogenicity. Acta Microbiol Hung 31:117-125. PubMed.
41.
Babai R, Blum-Oehler G, Stern BE, Hacker J, Ron EZ. 1997. 敗血症性大腸菌O78株からの病原性パターン。FEMS Microbiol Lett 149:99-105. Crossref. PubMed. ISI.
42.
de Lorenzo V, Bindereif A, Paw BH, Neilands JB. 1986. Escherichia coli K-12のプラスミドColV-K30のアエロバクチン生合成および輸送遺伝子。J Bacteriol 165:570-578. Crossref. PubMed. ISI.
43.
de Lorenzo V, Martinez JL. 1988. 病原性因子としてのアエロバクチン産生：再評価。Eur J Clin Microbiol Infect Dis 7:621-629. Crossref. PubMed. ISI.
44.
Rauti R, Shahoha M, Leichtmann-Bardoogo Y, Nasser R, Paz E, Tamir R, Miller V, Babich T, Shaked K, Ehrlich A, Ioannidis K, Nahmias Y, Sharan R, Ashery U, Maoz BM. 2021. SARS-CoV-2タンパク質の血管透過性への影響。Elife 10:e69314. Crossref. PubMed. ISI.
45.
Srinivasan B, Kolli AD, Esch MB, Abaci HE, Shuler ML, Hickman JJ. 2015. in vitroバリアモデルシステムにおけるTEER測定技術。J Lab Autom 20:107-126. Crossref. PubMed.
46.
Gragnano F, Sperlongano S, Golia E, Natale F, Bianchi R, Crisci M, Fimiani F, Pariggiano I, Diana V, Carbone A, Cesaro A, Concilio C, Limongelli G, Russo M, Calabrò P. 2017年. 血管炎症におけるvon Willebrand因子の役割：病因から標的治療まで。Mediators Inflamm 2017:5620314. Crossref. PubMed. ISI.
47.
Drakeford C, O'Donnell JS. 2017. von Willebrand因子を介した炎症をターゲットにする。Arterioscler Thromb Vasc Biol 37:1590-1591. Crossref. PubMed. ISI.
48.
Kawecki C, Lenting PJ, Denis CV. 2017.フォンウィルブランド因子と炎症。J Thromb Haemost 15:1285-1294. Crossref. PubMed. ISI.
49.
Corbett D, Roberts IS. 2008. 大腸菌の莢膜多糖類。Adv Appl Microbiol 65:1-26. Crossref. PubMed. ISI.
50.
Kim KS, Itabashi H, Gemski P, Sadoff J, Warren RL, Cross AS. 1992. K1カプセルはラットのEscherichia coli髄膜炎発症における重要な決定因子である。J Clin Invest 90:897-905. Crossref. PubMed. ISI.
51.
Herold R, Schroten H, Schwerk C. 2019. 髄膜炎原因菌のウイルス性因子：血液脳関門を越えた脳への侵入を可能にする。Int J Mol Sci 20:5393. Crossref. PubMed. ISI.
52.
ビランD、ローゼンシャインI、ロンEZ. 2020. 大腸菌O抗原カプセル（グループ4）は血清抵抗性に必須である。Res Microbiol 171:99-101. Crossref. PubMed. ISI.
53.
Song J, Hu Y, Li H, Huang X, Zheng H, Hu Y, Wang J, Jiang X, Li J, Yang Z, Fan H, Guo L, Shi H, He Z, Yang F, Wang X, Dong S, Li Q, Liu L. 2018. miR-1303はMMP9を直接標的にしてBBB透過性を調節し、CA16感染後の中枢神経病変を促進します。Emerg Microbes Infect 7:155. Crossref. PubMed. ISI.
54.
McRae M, LaFratta LM, Nguyen BM, Paris JJ, Hauser KF, Conway DE. 2018年. 強力な内皮バリアの形成に関連する細胞-細胞接合部の変化の特徴づけ。Tissue Barriers 6:e1405774. Crossref. PubMed.
55.
Kim KS. 2016. ヒト髄膜炎関連大腸菌。エコサルプラス7. Crossref.
56.
Yang R, Liu W, Miao L, Yang X, Fu J, Dou B, Cai A, Zong X, Tan C, Chen H, Wang X. 2016年. 髄膜炎大腸菌によるVEGFAとSnail-1の誘導は、血液脳関門の破壊を媒介する。Oncotarget 7:63839-63855. Crossref. PubMed.
57.
Sarami Foroshani M, Sobhani ZS, Mohammadi MT, Aryafar M. 2018. フラーレノールナノ粒子は、インターロイキン-6およびマトリックスメタロプロテアーゼ-9の転写の減少によって、おそらく脳虚血再灌流障害時の血液脳関門遮断および脳浮腫を減少させる。J Stroke Cerebrovasc Dis 27:3053-3065. Crossref. PubMed. ISI.
58.
Siqueira M, Araujo APB, Gomes FCA, Stipursky J. 2021. エタノール妊娠暴露は、発達中の大脳皮質におけるBBB関連アストロサイト機能を制御する血管の発達と内皮の潜在力を損なう。Mol Neurobiol 58:1755-1768. Crossref. PubMed. ISI.
59.
Farmen K, Tofiño-Vian M, Iovino F. 2021. 神経細胞損傷と神経炎症、細菌性髄膜炎と神経変性疾患の間の橋渡し。Front Cell Neurosci 15:680858. Crossref. PubMed. ISI.
60.
Herrup K, Yang Y. 2007. ポストミトーシス神経細胞における細胞周期制御：矛盾か新しい生物学か？Nat Rev Neurosci 8:368-378. Crossref. PubMed. ISI.
61.
Lyman M, Lloyd DG, Ji X, Vizcaychipi MP, Ma D. 2014. Neuroinflammation: the role and consequences. Neurosci Res 79:1-12. Crossref. PubMed. ISI.
62.
Drury L. 1994. エレクトロポレーションによる細菌の形質転換。Methods Mol Biol 31:1-8. PubMed.
63.
Fiedler S, Wirth R. 1988. エレクトロポレーションによるプラスミドDNAを持つバクテリアの形質転換。Anal Biochem 170:38-44. Crossref. PubMed. ISI.
64.
Gophna U, Barlev M, Seijffers R, Oelschlager TA, Hacker J, Ron EZ. 2001. Curli fibers mediate internalization of Escherichia coli by eukaryotic cells（真核細胞による大腸菌の内在化）。Infect Immun 69:2659-2665. Crossref. PubMed. ISI.
65.
Isberg RR, Falkow S. 1985. Yersinia pseudotuberculosisがコードする単一の遺伝子座は、Escherichia coli K-12による培養動物細胞への侵入を可能にする。Nature 317:262-264. Crossref. PubMed. ISI.
66.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. 分子クローニング：実験マニュアル、第2版。コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州。
67.
向井俊彦、米司俊彦、山田耕司、藤田浩二、奈良聡、末次正樹、2020．大腸菌におけるメガベースサイズのプラスミド構築の課題を克服する。ACS Synth Biol 9:1315-1327. Crossref. PubMed. ISI.
68.
Rauti R, Qaisiya M, Tiribelli C, Ballerini L, Bellarosa C. 2020年. ビリルビンは新生児海馬ニューロンにおけるカルシウムホメオスタシスを破壊する：神経毒性の新しい経路。Arch Toxicol 94:845-855. Crossref. PubMed. ISI.
69.
Rauti R, Secomandi N, Martín C, Bosi S, Severino FPU, Scaini D, Prato M, Vázquez E, Ballerini L. 2020年. バイオ/マテリアル界面にグラフェンを導入することで、3Dポリマースカフォールドにおけるニューロン回路形成をチューニングする。Adv Biosyst 4:e1900233. Crossref. PubMed.
70.
Rago I, Rauti R, Bevilacqua M, Calaresu I, Pozzato A, Cibinel M, Dalmiglio M, Tavagnacco C, Goldoni A, Scaini D. 2019年. 支持体表面に直接成長させたカーボンナノチューブは、海馬の神経細胞ネットワークの神経活動を改善する。Adv Biosys 3:e1800286. Crossref. PubMed.
71.
Barrejón M, Rauti R, Ballerini L, Prato M. 2019. 神経細胞のシグナル伝達を制御するために設計された化学的に架橋されたカーボンナノチューブフィルム(Chemically cross-linked carbon nanotube film)。ACS Nano 13:8879-8889. Crossref. PubMed. ISI.
72.
Schindelin J, Arganda-Carreras I, Frise E, Kaynig V, Longair M, Pietzsch T, Preibisch S, Rueden C, Saalfeld S, Schmid B, Tinevez J-Y, White DJ, Hartenstein V, Eliceiri K, Tomancak P, Cardona A. 2012. Fiji：生物学的画像解析のためのオープンソースプラットフォーム。Nat Methods 9:676-682. Crossref. PubMed. ISI.
73.
Zelcbuch L, Antonovsky N, Bar-Even A, Levin-Karp A, Barenholz U, Dayagi M, Liebermeister W, Flamholz A, Noor E, Amram S, Brandis A, Bareia T, Yofe I, Jubran H, Milo R. 2013年、。リボソーム結合部位のコンビナトリーを用いた高次元の発現空間のスパニング。Nucleic Acids Res 41:e98. Crossref. PubMed. ISI.

この記事が気に入ったらサポートをしてみませんか？