ブラントハタネズミの出生後の体温調節における腸内細菌叢の役割

42巻 9号 2023年9月26日 113021号
論文
ブラントハタネズミの出生後の体温調節における腸内細菌叢の役割

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S221112472301032X

著者リンク オーバーレイパネルを開くTingbei Bo 1 2 6, Liqiu Tang 1 3 6, Xiaoming Xu 1 3 6, Min Liu 1 3, Jing Wen 4, Jinzhen Lv 1 3, Dehua Wang 1 5 7
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https://doi.org/10.1016/j.celrep.2023.113021
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ハイライト

腸内細菌叢は体温調節機能の発達を促進する

酪酸と胆汁酸は子犬の体温調節に関与する

これらの結果は、哺乳類における体温調節の生後発達のメカニズムを拡大するものである。

まとめ
恒温性は哺乳類にとって極めて重要である。出生後の成長は、幼い仔動物が腸内細菌叢を獲得する重要な時期である。腸内細菌叢は哺乳類の体温産生に影響を及ぼす可能性があるが、腸内細菌叢の発育調節が若い仔の体温産生能力に及ぼす影響については不明な点が多い。抗生物質を用いて、ブラントハタネズミの発育過程における腸内細菌叢の定着を阻害し、その発熱発生と制御経路を明らかにした。抗生物質による微生物叢の剥奪は、仔ハタネズミの熱発生の発達を阻害する。腸内細菌叢の代謝産物である酪酸と胆汁酸は、仔ハタネズミの体温調節に関与していた。我々は、腸内細菌叢が酪酸-遊離脂肪酸受容体-2-結合解除蛋白質-1あるいはデオキシコール酸-武田-G-蛋白受容体-5-結合解除蛋白質-1経路を介して、仔ウシの体温調節の発達を促進することを示唆した。これらの結果は、腸内細菌叢と体温発生との関係を示し、小型哺乳類における体温発生の生後発達のメカニズムを拡大するものである。

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キーワード
腸内細菌温熱発生生後発達褐色脂肪組織ブランドネズミLasiopodomys brandtiibile acids
研究テーマ
CP: 微生物CP: 代謝
はじめに
温度は哺乳類の成長と発育に影響する重要な因子である。恒温動物には出生後、独立して熱を産生する能力がなく、熱損失が生存を脅かす主な要因である。授乳期には、離乳後に最適な体温調節メカニズムが確立されるまで、仔の熱産生能力は徐々に発達する。2,3寒冷な環境では、冬に生まれた野生のげっ歯類は初期死亡率が非常に高くなることがある。BATを継続的に補充することは、他動的体温調節を発達させる上で非常に重要である。モンゴルスナネズミのBATの重量は、生後発育中に継続的に増加する。BATのミトコンドリアタンパク質含量は出生時には低く、その後徐々に増加し、生後10日で安定したレベルに達する。発育初期には毛皮の断熱性能は低く、寒冷刺激によってBATの補充が誘導される。従って、BATの成熟と加齢に伴う熱産生能の発達は、動物の生存にとって非常に重要である。実験用げっ歯類モデルを用いた研究から、寒冷条件下で生活する若いげっ歯類は通常、BATの成熟が促進されることが示されている。小型哺乳類の熱産生能の生後発達に関する研究はほとんどない。初期の研究では、Brody7がラット（Rattus norvegicus）の生後発育法を発見し、McManus8がスナネズミ（Meriones unguiculatus）の体温調節能力を報告し、Hill9がシロアシマウス（Peromysus leucopus）の生後発育を発見した。別の研究では、ブラントハクビシンの仔ネズミの生後発育において、BATが時間の経過とともに有意に増加することがわかった10。したがって、新生児のダイナミックな発育期は、BATの急速な成熟と、周囲の温度を感知するための神経回路の成熟によって特徴づけられる。

腸内細菌叢は、宿主の代謝機能と健康に密接に関係している。11,12 1990年代にはすでに、無菌状態の動物の体温は、細菌が存在する場合よりも一般に約2℃低く、無菌動物に細菌を補充すると体温が上昇することが研究で明らかになっている13。Liら14は、腸内細菌叢の主要代謝産物である酪酸を補充すると、抗生物質処理マウスのBATの熱産生が有意に増加することを発見した。上記の研究は、哺乳類の腸内細菌叢と体温調節の関係を明らかにしたものであるが、いずれも体温調節機構が完全に機能する成体動物を対象としたものである。仔マウスの場合、腸内細菌叢と体温調節能力の生後発達との関係についての研究はまだ不足している。微生物コロニー形成は、母体由来の新生児分娩、子育て行動から得られる環境微生物叢、抗生物質の早期使用など、様々な外的要因に影響される複雑なプロセスであるという証拠が増えつつある。

ブランドネズミ（Lasiopodomys brandtii）は、主に中国とモンゴルの内モンゴルの草原に生息している。典型的な草食動物である。ハタネズミは生まれつき皮膚が剥き出しで、保温性が低く、体温調節能力が低い。ChiとWang23は、17日齢以前のハタネズミの仔は、23℃の寒さにさらされた条件下で体温を一定に保つことができないことを発見した。17日齢以降は体温調節能力が高まり、体温を維持できるようになった。ブラントハクビシンの生後の体温発生に関する研究はほとんどない。いくつかの研究では、肝臓とBATのミトコンドリアが急速に成熟することが、体温発生を促進する細胞メカニズムである可能性が指摘されている23,24。ブラントハタネズミの成体を対象とした我々の以前の研究では、腸内マイクロバイオームが短鎖脂肪酸（SCFA）などの代謝産物を通じて体温発生を促進することが明らかになった25。マイクロバイオームとメタボロームの解析を組み合わせることで、本研究は、初期腸内細菌叢のコロニー形成とそれに関連する代謝産物が、ブラントツボタルの生後の体温発生を促進するという我々の仮説を支持するものである。

結果
抗生物質はブラントハクビシンの生後の体温発生を阻害する。
腸内細菌叢がBrandt's voleの熱発生能力の発達に及ぼす影響を調べるため、抗生物質を用いて子ネズミの腸内細菌叢の正常なコロニー形成を阻害した。生理食塩水投与群は、経口投与の影響をコントロールするために用いた。その結果、対照群、抗生物質投与群（Abx）および生理食塩水投与群（生理食塩水）の体重は生後年齢とともに徐々に増加し、Abx群の体重増加は最も遅く、対照群よりも常に（約2g）低かった（図1B）。仔ハタネズミの体温は月齢の増加とともに連続的に上昇し、18日齢では約37℃でほぼ安定した。Abx群の体温は徐々に上昇し、常に対照群より約1℃低かった（図1C）。21日齢では、Abx群のBATの重量は対照群よりも高かった（図1D）。ヘマトキシリン・エオジン染色により、Abx群のBATは白色化せず、脂肪細胞サイズは生理食塩水群より小さかった（図S1AおよびS1B）。急性寒冷ストレス実験は、子犬の恒温能力を調べるために用いられた。7日齢と14日齢の時点では、3群の仔マウスは恒温機構が完全に機能していなかった。30分間の急性寒冷曝露により、体温は5℃～10℃低下した（図1Eおよび1F）。21日齢のAbx群のハタネズミは、周囲温度4℃に急性暴露した場合、対照群のハタネズミに比べて体温調節機能が低下していた（図1G）。

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図1. 抗生物質はブラントハタネズミの生後の体温発生を阻害する。

(A）実験1のデザイン。

(B）体重。

(C）体温。

(D）14日齢と21日齢の褐色脂肪組織（BAT）の重量。

(E-G）7、14、21日目の30分間の寒冷曝露後の体温変化。

(H)仔犬の代表的な赤外線画像（6生物学的反復の代表）と肩甲骨間BAT周囲の表面温度。

(I) BATにおけるuncoupling protein-1 (UCP1)の相対発現をウェスタンブロット法で解析した。

(J）BATにおける武田Gタンパク質受容体-5（TGR5）の相対発現。

(K）BATにおける遊離脂肪酸受容体-2（FFAR2）の相対発現。

(L）腸におけるFFAR2の相対発現。

Abxは抗生物質を投与したハタネズミ、Salineは通常の生理食塩水を投与したハタネズミ、Ctrlはコントロールのハタネズミ。同じ文字のものは有意差がないことを、異なる文字のものは有意差があることを示す（p < 0.05）。∗p＜0.05，＊＊p＜0.01，＊＊p＜0.001。

ブラントハタネズミの生後発育過程における体温調節を測定するために、BATにおけるuncoupling protein-1（UCP1；体温調節に関係する）の発現量を測定した。その結果、Abx群の14日齢および21日齢のハタネズミでは、他の群のハタネズミに比べてUCP1レベルが低かった（図1I）。体温調節に関連する遺伝子（PGC-1α、ADRB3、Cidea）の発現は、Abx群の仔ハタネズミのBATで低下していた（図S1C-S1E）。遊離脂肪酸レセプター-2（FFAR2；SCFAのレセプター）と武田Gタンパク質レセプター-5（TGR5；胆汁酸のレセプター）はBATに分布していた。TGR5の発現は14日齢と21日齢においてAbx群で低かった（図1J）。14日齢では、FFAR2の発現はAbx群で対照群より有意に低かった（図1K）。同様に、腸管でのFFAR2発現もAbx群で低かった（図1L）。これらのデータは、Abx投与がブラントハタネズミの体温調節機能の発達を遅らせることを示唆している。

Abxはブラントハタネズミの腸内細菌叢の確立を妨げる
仔ハタネズミの腸内細菌叢の発達に対するAbxの影響を調べるため、3群のハタネズミの糞便内容物を14日齢と21日齢で採取した。16S rRNA遺伝子配列決定による微生物叢組成のプロファイリングと、それに続くシャノン指数分析により、Abxsは腸内細菌叢のα多様性を低下させることが示された（図2A；他のα多様性指標については表S1を参照）。すべてのサンプルにおいて、ファーミキューテス門とバクテロイデーテス門が最も豊富であった（図2B）。14日齢のハタネズミでは、AbxsによってMuribaculaceaeの存在量が減少したが、Enterococcaceaeの存在量は増加した（図2Bおよび2C）。Bray-Curtis距離に基づく主配置分析は、Abx群における14日齢のハタネズミの微生物相の大きな変化を示した（図2D；重み付けなしおよび重み付けUnifrac距離分析については表S2を参照）。3群のハタネズミは466個のアンプリコン配列変異（ASV）を共有しており、Abx群の14日齢ハタネズミの盲腸では261個のASVがユニークであった（図2E）。対照群と生理食塩水の14日齢ハタネズミが共有したASVの数（252）は、対照群とAbx群の14日齢ハタネズミが共有した数（50）よりもはるかに多かった。線形判別分析の効果量分析から、14日齢のAbxハタネズミではプロテオバクテリアが優勢であることが示された（図2F；表S3）。クラスタリングの結果、コントロール群と生理食塩水群は近接しており、Abx群はいずれの群からも離れていた（図S2）。生後21日目の3群の腸内細菌叢の構造は、生後14日目の腸内細菌叢の構造とは有意に異なっており（図S2）、宿主の発育過程における細菌のコロニー形成は連続的で常に変化していることが示された。Abx投与はこのパターンを破壊した-バクテロイデテスは14日齢では減少したが、21日齢では増加した（図2G）。21日齢のハタネズミでは、コリデクストリバクター、プレボテラセア_UCG-003、アリスティペス、コプロバクター、メタノブレビバクター、オシリバクター、およびプレボテラが対照群で高かったのに対し、ディスゴノモナス、フンガテラ、およびフラボニフラクターはAbx群で高かった（図S2）。Abx処理により、生後14日目のComamonasの相対量が増加し、Bacteroides_sartorii、bacterium_P3、Butyricimonas_virosaが減少した（図S3AおよびS3C）。Abx処理は21日齢でBacteroides_sartoriiの相対量を増加させ、Coprobacter_fastidiosus、Clostridium、Extibacter_murisを減少させた（図S3BおよびS3D）。

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図2. 抗生物質がブラントハタネズミの腸内細菌叢の確立を妨げた。

(A）アルファ多様性： シャノン指数。

(B）ハタネズミの腸内細菌叢の門レベルの結果。

(C）ハタネズミの腸内細菌叢の科レベルの結果。

(D）ブレイ・カーティス距離の主配置分析（PCoA）プロット。

(E）ベン図は、3つのグループで同定されたアンプリコン配列のバリアントの数を示す。

(F）微生物叢における線形判別分析スコア＞4の線形判別分析効果サイズ分析によって選択された細菌分類の違い。

(G) 抗生物質によって有意に変化した特定の門の相対存在量。

Abxは抗生物質を投与したハタネズミ；生理食塩水は通常の生理食塩水を投与したハタネズミ；Ctrlはコントロールのハタネズミ。∗p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊p＜0.001。

細菌叢移植実験では、ブラントハタネズミの生後の体温発生発達に対する「Abx腸内細菌叢」効果を調べた。糞便微生物叢移植（FMT）-Abx 14日齢群と21日齢群では、体重と体温の発達がやや遅かった（図S4AおよびS4B）。体温調節に関連する遺伝子（PGC-1α、ADRB3、Cidea）の発現は、FMT-Abx 14日齢群と21日齢群のBATで低下していた（図S4C-S4E）。

Abxはブラントハタネズミのメタボロミクス組成に影響する
代謝物は、腸内細菌叢が宿主の体温調節に関与する経路を提供する。Abxsが腸内細菌叢の代謝産物に及ぼす影響を調べるため、21日齢のAbx群と生理食塩水群のサンプルをアンターゲットメタボロミクスで解析した。これらのグループのt検定分析により、362代謝物が異なることが示され、上位50代謝物（投影値における変数の重要性に基づく）がヒートマップ用に選択された（図S5A）。直交部分最小二乗弁別解析により、Abx群と生理食塩水群のメタボローム間に有意差があることが示された（図3Aおよび3B）。さらに、単変量解析（｜log2 FC｜ [変化倍率]＞1.5、p＜0.05；図3C）により、これらの差異代謝物は主に4-グアニジノ酪酸、Υ-アミノ酪酸、ウルソデオキシコール酸、L-アルギニン、2-ヒドロキシ桂皮酸などの代謝炭水化物とアミノ酸に集中していることがわかった。代謝経路の濃縮は、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomesを用いた差分代謝物に基づいて行われた。アルギニン生合成とアンフェタミン代謝が影響を受ける2つの主要な代謝経路であることがわかった（p < 0.05）。Abx群ではアルギニン生合成経路が有意に減少し、アンフェタミン代謝経路が増加していた（図S5BおよびS5C）。胆汁酸は代謝産物から選択され、差異分析が行われた。Abxsはいくつかの胆汁酸の含量を有意に変化させた（図S5D）。胆汁酸のターゲットメタボロミクスはAbxsの影響を調べるために用いられた。直交部分最小二乗弁別分析の結果、Abx群と生理食塩水群の胆汁酸間に有意差が認められた（図3D）。両群の血清中の胆汁酸の相対含量上位10位を比較すると、グリコデオキシコール酸とデオキシコール酸（DCA）はAbx群よりも生理食塩水群で高いことが示された（図3E）。上位20の胆汁酸のヒートマップでは、2群間に有意差が認められた（図3F）。血清中の総胆汁酸含量は、21日齢のAbxハタネズミでは生理食塩水群のハタネズミに比べて有意に低かった（図3G）。SCFAの含有量はガスクロマトグラフィーで測定した。セカール酢酸、プロピオン酸、酪酸の濃度は、21日齢のAbxハタネズミでは生理食塩水群の濃度と比較して有意に減少していた（図3H-3J）。

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図3. 頭部内容物と血清メタボロミクス

(AおよびB）直交部分最小二乗弁別分析（OPLS-DA）により、Abx群（抗生物質投与）と生理食塩水投与群（生理食塩水投与）の代謝物の違いを正イオンモードおよび負イオンモードで示した（p < 0.05、並べ替え有意性検定）。

(C)単変量解析により、Abx群と生理食塩水群間の代謝物の差が示された（p < 0.05 |log2FC| > 1.5）。

(D) OPLS-DAにより、Abx群と生理食塩水群の胆汁酸代謝物の違いを示す（p < 0.05）。

(E）2群の血清中の胆汁酸上位10個の比較。

(F）2群間の上位20胆汁酸のヒートマップ。

(G）ELISAによる血清総胆汁酸濃度。

(H-J）Abx群と生理食塩水群のハタネズミの酢酸、プロピオン酸、酪酸の頭蓋内濃度。

∗p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊p＜0.001。

酪酸とデオキシコール酸は腸内細菌叢を変化させることで熱発生を促進する
4群間でシャノン多様性指数に差はなかった（図4A；表S4）。Bray-Curtis距離に基づく主配置分析は、4つのグループが互いに分離していることを示し、その差は有意であった（図4B；重み付けなしおよび重み付けUnifrac距離分析については表S5参照）。酪酸投与群のハタネズミでは疣贅菌叢が多く、デオキシコール酸投与群のハタネズミではファーミキューテス類が少なく、プロテオバクテリアは有意に減少していた（図4Cおよび4D）。ラクトバチルス属、ヘリコバクター属、スタフィロコッカス属、コマモナス属、プレボテラ属、バクテロイデス属はコントロール群に比べ、他の3群ではいずれも減少していた。対照群と比較して、酪酸菌群ではAkkermansia、Colidextribacter、Parabacteroides、Lachnospiraceaeが、Cold-FMT群ではAllobaculum、Roseburia、Rikenellaceaeが、デオキシコール酸菌群ではPrevtella、Treponema、Pygmaiobacter、Ruminocooccus、Lachnoclostridium、Blautiaが高値を示した（図4E；表S6）。t検定の結果、酪酸投与群ではFournierellaが、デオキシコール酸投与群ではDesulfovibrio、Prevotellaceae、UCG-010が高かった（図S6AおよびS6B）。

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図4. 酪酸と胆汁酸がハタネズミの腸内細菌叢を変化させた。

(A）アルファ多様性： シャノン指数。

(B）ブレイ・カーティス距離のPcoAプロット。

(C）ハタネズミの腸内細菌叢の門レベルの結果。

(D) ハタネズミのグループ間で有意に変化した特定の門の相対存在量。

(E)属ランクに分類されたアンプリコン配列バリアントの割合を示すクラスターヒートマップ。

対照：生理食塩水を投与したハタネズミ；Cold-FMT：「低温糞便微生物叢移行」を投与したハタネズミ；デオキシコール酸塩：デオキシコール酸塩を投与したハタネズミ；酪酸塩：酪酸塩を投与したハタネズミ。∗p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊p＜0.001。

酪酸と胆汁酸はブラントハタネズミの生後の熱発生の発達を促進する
実験1の結果に引き続き、デオキシコール酸と酪酸を生後7日目のブラントハタネズミに2週間経口投与し、微生物代謝産物が恒温能力の発達に変化を引き起こすかどうかを調べた。その結果、4群の体重は齢とともに増加し（図5Aに示す）、デオキシコール酸投与群の体温は他の群よりも早く上昇し、安定したレベル（37.2℃）に達した（図5B）。生後21日目のBATの重量は、デオキシコレート群の方が対照群よりも高かった（図5C）。急性寒冷暴露によっても、21日齢のデオキシコール酸および酪酸処理ハタネズミは体温調節能力の発達が促進された（図5Dおよび5E）。

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図5. 微生物代謝産物はブラントハタネズミの生後の熱発生の発達を促進する。

(A）体重。

(B）体温。

(C）生後21日目のハタネズミのBAT重量。

(DおよびE）14日齢と21日齢における30分間の寒冷曝露後の体温変化。

(F）BATにおけるUCP1の相対発現。

(G）BATにおけるTGR5の相対発現。

(H）BATにおけるFFAR2の相対発現。

(I）BATにおけるcAMP依存性プロテインキナーゼA（cAMP-PKA）の相対発現。

(J）視床下部におけるチロシン水酸化酵素（TH）の相対発現。

(K）腸におけるFFAR2の相対発現。

コントロールは生理食塩水を投与したハタネズミ、Cold-FMTは "cold-fecal microbiota transfer "を投与したハタネズミ、デオキシコール酸はデオキシコール酸を投与したハタネズミ、酪酸は酪酸を投与したハタネズミ。∗p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊p＜0.001。

デオキシコール酸を投与したハタネズミでは、対照群と比較してUCP1のレベルが高かった（図5F）。TGR5のレベルは、デオキシコレート処理したハタネズミのBATでは対照群のそれよりも有意に高く（図5G）、BATのFFAR2レベルは有意差を示さなかった（図5H）。BATのcAMP依存性プロテインキナーゼAレベルは、コントロール群よりもデオキシコレート処理群で高かった（図5I）。視床下部のチロシン水酸化酵素レベルは、寒冷-FMT群で対照群よりも高かった（図5J）。FFAR2の腸内レベルは酪酸塩群で対照群およびデオキシコール酸塩群よりも高かった（図5K）。これらのデータは、酪酸とデオキシコール酸の両方が熱発生の発現を促進することを示唆している。

考察
周産期哺乳類の生後発達の特徴と適応的意義
モルモット（Cavia porcellus）やヒツジ（Ovis aries）のような前社会的哺乳動物は、出生時によく発達しており、運動能力や体温調節能力は急速に発達する。胎生哺乳類の体温調節能力は、出生時に独立して熱を産生できるほど機能しておらず、出生後長い間、親に依存したり、身を寄せ合ったりする26。しかし、子犬の熱産生能力の発達は環境にも影響される。Taylor27は、24時間以内に周囲温度が2℃下がると、新生ラットの基礎代謝量が2倍になることを発見した。Cassin28は、マウスが出生当日に非震動熱発生を増加させることを発見した。根ハタネズミ（Microtus oeconomus）を対象とした研究では、体温調節能力の生後発達は「S」型であり、体温変動期から体温一定期への急速移行期に分けられた29。哺乳類の初期における体温調節は総エネルギー消費の主要部分を占めるため、3動物は体温調節により多くのエネルギーを費やす必要があると考えられる。そのため、Hopson30とHill31は、出生時の熱産生能力の欠如が仔動物の生存に有益である可能性を提唱した。体温調節はエネルギーを消費するプロセスであるため、熱産生に消費されるエネルギーを減らせば、相対的に成長に使われるエネルギーが増えることになる。胎児期と出生後の初期は「初期生活」と呼ばれ、腸内細菌叢が環境要因の影響を受けやすい時期である。腸内細菌叢は、動物の体温調節能力とも密接に関係していることがわかっている。本研究では、Abxの使用が微生物のコロニー形成過程を阻害し、その後、ブラントハタネズミの生後の体温調節の発達に影響を与えることを発見した。初期の細菌は代謝産物を産生することで恒温能力の発達を促進し、熱産生に必要なエネルギー消費を抑えることができ、また仔ハタネズミの早期の単独生活を助けることができると推測される。

微生物欠乏は、ブラントハタネズミの生後の体温発生能力の発達を阻害する
今回の結果から、ブラントハタネズミの体温は生後18日で安定することがわかり、これは過去の結果と一致した23。過去の研究では、ブラントハタネズミの仔は生後17日以降、23℃の暴露下で体温を一定に保つことができるようになり、熱発生能力が著しく向上することがわかった23。今回の研究では、Abxsを投与したハタネズミの仔の体温は対照群よりも常に低く、体温が一定に達するのも遅かった。これらの効果は、Abxsによって腸内細菌叢が枯渇し、代謝産物が不足し、交感神経経路を通じて熱発生関連タンパク質の発現が低下したためと考えられる。同様の研究により、腸内細菌叢の除去はUCP1の発現レベルを著しく低下させ、UCP1依存的な熱発生にダメージを与えることが判明している17。しかし、別の研究では、Abx投与マウスと無菌マウスの両方で、室温（22℃）および恒温（30℃）での白色脂肪組織の褐変表現型が見られたことが報告されており、微生物叢の枯渇は熱発生能力を高めることが示唆されている32。したがって、腸内細菌叢の枯渇が熱発生に及ぼす影響は、年齢や周囲温度の異なる動物で異なる。今回の研究では、Abx投与後にUCP1の発現が減少したことから、腸内細菌叢の確立が動物の熱発生の発達に影響を与えていることが示された。しかし、腸内細菌叢の確立はできるだけ早い方が良いとは限らない。腸内細菌叢の確立は、熱発生能力の発達と協調させる必要がある。研究によると、高地におけるシカマウス（Peromyscus maniculatus）の体温発生は、低地に比べて約2日遅かった。この遅れは、高地や低酸素条件下で若齢動物が成長速度を維持できるようにするための、進化的なコスト削減策の一環である可能性がある33。これは、高地での食料資源の不足や、腸内細菌叢のコロニー形成の遅れの結果、BATの交感神経制御が遅れることを反映しているのかもしれない。

生後発育期における熱産生に対する酪酸の効果
SCFAは、食物繊維の微生物発酵の主要な最終産物であり、ヒトのエネルギー必要量の5％～10％を供給することができる34。SCFAは、エネルギー恒常性と脂質代謝において重要な役割を担っており35,36、特に酪酸は、大腸上皮細胞にエネルギーを供給し、エネルギー吸収と免疫反応を調節することができる。また、SCFAは食欲調節、体温調節、エネルギー恒常性維持においてGタンパク質共役型受容体FFAR2およびFFAR3を介したシグナル分子として働くことができる37。研究により、酪酸は交感神経系を介して熱発生を促進する可能性があり14、酪酸の長期補充によりBATへの交感神経の調節が亢進することが示されている38。今回の結果から、Abx投与によりButyricimonas_virosaが減少し、酪酸が不足することが示された。酪酸補給群では、Brandt's vole pupsのBATでUCP1とFFAR2の発現が増加した。この増加は、宿主による酪酸の利用に寄与し、下流のプロテインキナーゼA（PKA）経路を活性化して熱発生を促進すると考えられる。Liら38は、成体マウスでAbxsにより腸内細菌叢が傷害された後、酪酸塩を経口投与で補充すると、熱発生が部分的に回復することを見いだした38。体温を一定に保つ能力のない仔マウスに酪酸塩を投与すると、体温発生が促進されたのである。この知見は、腸内細菌叢と酪酸が、子犬の熱発生プロセスにおいて重要なシグナル伝達の役割を果たしていることを示している。

胆汁酸の生後発育における熱発生に及ぼす影響
胆汁酸は肝臓でコレステロールによって合成され、さらに腸内細菌叢によって代謝される内因性分子であり、宿主の食事脂質の吸収を助ける39。胆汁酸は（ホルモンのような）シグナル伝達分子として働き40、また腸内細菌叢の組成を直接調節することもできるため、胆汁酸と腸内微生物の相互作用はヒトの健康に大きな影響を与える41,42。今回の結果は、Abx投与により、一次胆汁コール酸を7α-デヒドロキシル化によりDCAに代謝することができる二次胆汁酸産生種として知られるExtibacter murisの相対量が有意に減少したことを示している43,44。DCAは、Gタンパク質共役型TGR5を介して細胞膜を介したシグナル伝達を刺激し、それによって、マウスの褐色脂肪細胞において刺激されたTGR5を介して熱発生を増加させるなど、多様な代謝経路を制御する45,46。以前の研究では、寒冷曝露によるBATの活性化の際、胆汁酸に起因する全身のコレステロール代謝の変化が、適応的な熱発生を促進し、腸内細菌叢を変化させることが判明した49。マウスとヒトの両方の研究において、胆汁酸レベルの上昇がTGR5を介して熱発生反応を制御することが判明した47,50,51。したがって、異なる条件下では、BATにおいて胆汁酸特異的なTGR5の活性化が起こる可能性があった。胆汁酸は腸内細菌叢を形成し、寒冷暴露下で熱発生を促進することが報告されているが、出生後の発育過程における体温調節における胆汁酸の役割はまだ不明である。本研究の結果、仔マウスにデオキシコール酸を補充すると、BATにおけるTGR5の発現が増加し、TGR5シグナルがUCP1の活性化を通じて熱発生を促進することが示された。例えば、ルミノコッカス（Ruminococcus）の割合が増加し、単糖の吸収とムチンの分解を助けてエネルギーを獲得し、熱発生を促進した。さらに、デオキシコール酸で処理した子ウサギでは、プレボテラが有意に濃縮されており、脂質代謝が関与していると考えられる56。本研究は、生後発育における胆汁酸腸内細菌叢と熱発生を複合的に解析したものである。我々は、腸内細菌叢がExtibacter muris-DCA-TGR5-UCP1経路を通じて、仔ネズミの体温調節機能の発達を促進する可能性があることを示唆している。

研究の限界
本研究では、どの細菌が生後の体温調節の発達を促進するのかを明らかにすることはできなかった。一方、他のSCFA（酢酸、プロピオン酸）の役割についてはまだ研究が必要である。胆汁酸と熱発生との関係については、より詳細に検討されていない。幼若子における生後発育の熱産生メカニズムについては、さらなる研究が必要である。

結論
現在の研究から、Abxは仔ウシの腸内細菌群集の確立に重大な障害を引き起こし、それによって体温調節の生後発達に影響を及ぼすことが示されている。具体的には、腸内細菌叢はその代謝産物である酪酸とDCAを介して仔ウシの体温調節機能の発達を促進する。我々の知る限り、腸内細菌叢の発達と野生動物の体温発育との関係を明らかにしたのは本研究が初めてである。この研究により、若い仔の体温調節過程の生後発達に関する新たな理解が得られ、恒温動物の生後の体温調節発達に関する理論が拡張された。これらの知見はまた、腸内細菌叢と宿主は協調的に発達するという見解も裏付けている。今後の実験では、これらの結果の背景にある多くの相互作用メカニズムの解明を目指す必要がある。

STAR★方法
主要リソース表
試薬またはリソースのソース IDENTIFIER
抗体
アンカップリングタンパク質1 (UCP1) Abcam RRID:AB_2783809
チロシン水酸化酵素 (TH) Sigma-Aldrich AB152
プロテインキナーゼ触媒サブユニット (cAMP) Abcam RRID:AB_2170049
遊離脂肪酸受容体 2 (FFAR2/GPR43) メルクミリポア RRID:AB_2877692
Gタンパク質共役型胆汁酸受容体1 (TGR5) Abcam RRID:AB_2112165
β-チューブリン Abbkine A01030
GAPDH Abbkine A01020
ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ IgG ジャクソン RRID:AB_2313567
ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス IgG Jackson RRID:AB_10015289
化学物質、ペプチド、組換えタンパク質
5×SDS-PAGE Protein Loading Buffer Yeasen biotech、
上海、中国 20315ES20
メタノール 北京化工 B0301005
RIPAバッファー BeyotimeBiotechnology P0013C
DCA シグマアルドリッチ D4297
酪酸ナトリウム Sigma-Aldrich 137127
アンピシリンSigma-Aldrich BP021
メトロニダゾール Sigma-Aldrich M1547
ネオマイシン Sigma-Aldrich N6386
GoldBand Plus 3-color Regular Range Protein Marker(8-180 kDa) Yeasen biotech、
上海、中国 20350ES76
重要な市販アッセイ
QIAamp DNA Stool Mini Kit Qiagen, Germany 51504
Total Bile Acids Assay Kit (Colorimetric) Abcam ab239702
Ultra™ IIDNA Library Prep Kit NEB, USA E7370L
BCA タンパク質定量キット Yeasen biotech、
上海、中国 20201ES76
DAB カラー試薬キット（20×） Solarbio, Beijng, China DA1010
寄託データ
メタゲノム配列データ NCBI BioProject PRJNA743735へのアップロード
実験モデル 生物/株
ブラントハタネズミ N/A N/A
ソフトウェアとアルゴリズム
Prism GraphPad バージョン 9.0
FLIR Tools Teledyne FLIR LLC N/A
ソフトウェア R Lucent Technologies バージョン R-3.4.3
その他
PVDF 膜 Beyotime, China FFP33
高性能ガスクロマトグラフィー Agilent Technologies 7890A
Vanquish UHPLCシステム Thermo Fisher N/A
Orbitrap Q ExactiveTM HF-X 質量分析計 Thermo Fisher N/A
市販ウサギペレット 北京科央飼料有限公司 該当なし

リソースの有無
連絡先
リソースおよび試薬に関する詳細情報およびリクエストは、リードコンタクトであるDehua Wang (email: dehuawang@sdu.edu.cn)までお願いします。

材料の入手可能性
本試験では新規の試薬は得られていない。

実験モデルおよび研究参加者の詳細
すべての動物は中国科学院動物学研究所の動物飼育使用委員会の許可を得た。被験者は1999年5月に内モンゴルの草原で捕獲されたブラントハタネズミの子供で、北京の中国科学院動物学研究所で飼育されている。繁殖コロニーは3年ごとに野生個体群または別の実験室との間で若返らせた。ハタネズミは室温23±1℃、光周期16L：8Dで飼育された。水と市販のウサギ用ペレット（Beijing KeAo Feed Co.） ブラントハタネズミは授乳期に使用するため、雌雄の区別はしない。使用したハタネズミは7～21日齢である。

本研究は中国疾病予防管理センターの要求事項に従って実施した。(プロトコルID：IACUC発行番号2022-027および2020-019）。

方法の詳細
実験1. ブラントボタルの出生後の体温調節の発達に対する抗生物質の影響。

新しく生まれたブラントハタネズミの9匹の子ネズミを、各群3匹ずつ、抗生物質群（Abx）、生理食塩水群（Saline）、対照群（Ctrl）の3群に無作為に分けた。抗生物質投与群（Abx）：生後7日目から混合抗生物質（100μL/mLネオマイシン、50μg/mLストレプトマイシン、100U/mLペニシリンを含む；ドイツシグマ社製；3μL/g体重）を経口投与した。生理食塩水投与群（Saline）：7日齢より生理食塩水を経口投与した（3μL/g体重）。対照群：無処置（Ctrl）。14日齢まで経口投与した場合は、各家族から2頭の標識ハタネズミを選んで犠牲にした（n = 6）。その他のハタネズミは21日齢まで経口投与し、各腹仔から2頭の標識ハタネズミを選んで犠牲にした（n = 6）。したがって、18頭のハタネズミ（3群）が14日齢と21日齢の時点で別々に犠牲にされ、各群のサンプル数は6頭（n = 6）であった（図1A）。

実験2. 出生後の体温調節の発達に及ぼす腸内細菌叢の影響。

ブラントハタネズミの12匹の産仔を無作為に4群に分け、各群に3匹の産仔を入れた： FMT-Abx14、FMT-Abx21、FMT-Saline14、FMT-Saline21である。exp1のAbx14、Abx21、Saline14、Saline21の仔ハタネズミの「腸内細菌叢」を14日齢から21日齢まで摂取させた（3μL/g体重）。各仔ハタネズミから2頭の標識ハタネズミをサンプルとして選び、犠牲にした。

実験3. ブラントハタネズミの出生後の体温調節の発達に及ぼす腸内細菌叢の代謝産物の影響。

ブラントハタネズミの12匹の仔を無作為に4群に分け、各群に3匹の仔を入れた。酪酸群：生後7日目から6M酪酸ナトリウム（仔ウサギ1頭あたり30μL、Sigma Aldrich）を経口投与した仔ウサギ。デオキシコレート群（Deoxyholate）：7日齢からデオキシコレート（50 mg/kg、30 μL/仔）を経口投与した。陽性対照群（Cold-FMT）：7日齢から「低温微生物叢」を摂取させた仔（3μL/g体重）。対照群：7日齢から通常の生理食塩水を投与（3μL/g体重）。投与は21日齢で終了した。各仔ハタネズミから標識ハタネズミ2頭をサンプルとして選び、生け贄に捧げた。

体重の測定
午前9時に電子天秤（Sartorius Model BL 1500）を用いて体重を測定した。仔犬を紙コップ（保温のため中央に綿を入れた）に入れ、紙コップを電子天秤のトレイに載せて体重を測定する。

体温
この実験では、7～21日齢のブラントボタルの体温を腋窩温測定によって測定した。腋窩温測定では、温度プローブと腋窩皮膚との接触時間は仔の年齢とともに長くなるはずである。単純に比較した結果、各動物の肛門温と腋窩温の差は概ね0.2℃以下であることがわかった。そして、動物の腋窩温の測定は7日齢から始まります。子犬は徐々に実験的処置に慣れ、ストレスによって体温が上昇することはない。したがって、腋窩温は幼虫がやや大きくなってからも肛門温の代わりとなる。

ウェスタンブロットによる体温発生関連タンパク質の測定
BAT、空腸切片（1cm）および視床下部をRIPAバッファーでホモジナイズし、標準的な手法に従って遠心分離により清澄化した。全組織溶解物のウェスタンブロットを、UCP1（uncoupling protein 1, ab155117; Abcam）、TH（Tyrosine hydroxylase, AB152; Merck Millipore）、Anti-cAMP（Protein Kinase Catalytic subunit antibody, ab26322； Abcam）、FFAR2/GPR43（遊離脂肪酸受容体2、ABC299；Merck Millipore）、TGR5（Gタンパク質共役胆汁酸受容体1、ab72608 Abcam）、β-チューブリン（A01030；Abbkine）、GAPDH（A01020；Abbkine）を用いた。使用した二次抗体は、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギIgG（111-035-003；Jackson）、またはペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスIgG（115-035-003；Jackson）。プロテインマーカー（20351ES76; Shanghai China）を各ゲルの両面に加え、バンドを確認した。PVDF膜は強化化学発光（Beyotime China）で検出した。バンドはImage LabTM Software（Bio-Rab Laboratories）を用いて解析し、β-チューブリン／GAPDHで正規化し、相対単位（RU）で表した。

DNA 抽出および 16S rRNA 遺伝子のバーコード配列決定
すべての糞便サンプルは採取後直ちに-80℃で凍結した。QIAamp DNA Stool Mini Kit（Qiagen Germany）を用いて、糞便サンプルから細菌DNAを抽出した。

マウスの腸内細菌叢の分類学的プロフィールを特徴づけるために、ほとんどの細菌でこの領域をターゲットとするユニバーサルプライマー（341F-CCTAYGGGRBGCASCAG；806R-GGACTACHVGGTWTCTAAT-3；および各サンプルに固有の6bpバーコード）を用いて、16S rRNA遺伝子のV3-V4領域の塩基配列を決定した。ライブラリー構築にはNEBNext Ultra IIDNA Library Prep Kitを使用し、構築したライブラリーはQubitとQ-PCRで定量した。

バーコード配列とPCR増幅プライマー配列に従って、オフラインデータからサンプルデータを分離し、バーコードとプライマー配列を切り離す。FLASH (Version 1.2.11)を用いてサンプルのリードをスプライスし、Rawタグを得る。次にfastp (Version 0.20.0)を用いてRawタグを処理し、高品質のCleanタグを得る。最後にUsearchソフトウェアを用いてClean Tagsとデータベースを比較し、キメラを検出して除去し、キメラ配列を除去してEffective Tagsを得る。得られたEffective Tagsについて、QIIME2ソフトウェア（Version QIIME2-202006）のDADA2またはdeblurモジュールを用いてノイズ除去を行い、初期Amplicon Sequence Variants（ASV）を取得した（デフォルト：DADA2）。種のアノテーションはQIIME2ソフトウェアを用いて行った。各ASVの系統関係、および異なるサンプル（グループ）間の優占種の違いを調べるために、QIIME2ソフトウェアを用いてマルチプル配列アライメントを行った。ASVの絶対量は、配列が最も少ないサンプルに対応する標準配列番号を用いて正規化した。その後のα多様性とβ多様性の解析は、すべて出力された正規化データに基づいて行われた。サンプル中の群集の多様性の豊かさと均一性を分析するために、シャノン指数を含むアルファ多様性をQIIME2で計算した。主座標分析（PCoA）は主座標を求め、複雑な多次元データにおけるサンプルの違いを可視化するために行った。グループ間の群集構造の違いの有意性を調べるために、QIIME2ソフトウェアのAnosim関数を用いて解析を行った。各分類レベル（門綱目目科属種）で有意差のある種を調べるために、Rソフトウェア（バージョン3.5.3）を用いてMetaStat分析とT検定分析を行った。線形判別分析効果量（LEfSe）ソフトウェア（バージョン1.0）を用いてLEfSe分析を行い、バイオマーカーを探索した。

SCFAの測定
糞便内容物から酢酸、プロピオン酸、酪酸の3種類のSCFAを測定した。SCFA の測定は、GC オートサンプラーと FID システムを用いた高速ガスクロマトグラフィー（GC）（Agilent 7890A; Agilent Technologies Germany）で行った。検出プロセスとパラメータは、これまでの研究と同じである。

胆汁酸の測定
総胆汁酸の血清濃度は、Total Bile Acids Assay Kit (Colorimetric) (ab239702; Abcam Cambridge UK)を用いて測定した。メーカーの指示に従い、標準品と血清（25μL）を96ウェルプレートに加え、ddH2Oで50μLに調整した。その後、プローブミックス（100μL）を各サンプルと標準品のウェルに加え、プレートを37℃で10分間インキュベートした。最後に50μLの反応ミックスをウェルに加え、37℃で60分間遮光し、405nmの吸光度をキネティックモードで測定した。

非標的メタボロミクス法
100mgの糞便内容物をEPチューブに入れ、あらかじめ冷やした80％メタノールを加え、よくボルテックスして懸濁した。その後、氷上で融解し、30秒間回転させた。超音波処理を6分間行った後、5,000rpm、4℃で1分間遠心した。上清を凍結乾燥し、10％メタノールで溶解した。最後に、この溶液をLC-MS/MSシステム分析に注入した。UHPLC-MS/MS分析は、Orbitrap Q ExactiveTM HF-X質量分析計（Thermo Fisher, Germany）と組み合わせたVanquish UHPLCシステム（Thermo Fisher, Germany）を用いて、Novogene Co. (Ltd.（中国、北京）において、Orbitrap Q ExactiveTM HF-X質量分析計（Thermo Fisher、ドイツ）と組み合わせた。サンプルはHypesil Goldカラム（100×2.1 mm、1.9μm）に0.2 mL/分の流速で12分間のリニアグラジエントを用いて注入した。正極性モードの溶離液は、溶離液A（水中0.1％FA）と溶離液B（メタノール）であった。負の極性モードの溶離液は、溶離液A（5 mM酢酸アンモニウム、pH 9.0）と溶離液B（メタノール）であった。

UHPLC-MS/MSによって生成された生データファイルは、Compound Discoverer 3.1 (CD3.1, Thermo Fisher)を使用して処理され、各代謝物のピークアライメント、ピークピッキング、定量が実行された。主なパラメータは次のように設定された：保持時間の許容誤差0.2分、実際の質量の許容誤差5ppm、シグナル強度の許容誤差30％、シグナル/ノイズ比3、最小強度など。正規化されたデータは、付加イオン、分子イオンピーク、フラグメントイオンに基づいて分子式を予測するために使用された。そして、ピークを mzCloud (https://www.mzcloud.org/)、mzVault および MassList データベースとマッチングさせ、正確な定性および相対定量結果を得た。

統計解析は、統計ソフトR（RバージョンR-3.4.3）、Python（Python2.7.6バージョン）、CentOS（CentOSリリース6.6）を用いて行い、データが正規分布していない場合は、面積正規化法を用いて正規変換を試みた。

これらの代謝物は、KEGGデータベース(https://www.genome.jp/kegg/pathway.html)、HMDBデータベース(https://hmdb.ca/metabolites)、LIPIDMapsデータベース(http://www.lipidmaps.org/)を用いてアノテーションした。

胆汁酸ターゲットメタボノミクス
この実験では、39種類の胆汁酸を測定した（補足表参照）。胆汁酸標準物質を秤量し、メタノールで最終濃度1000μg/mLの混合標準原液となるように調製した後、原液を30%メタノールで希釈し、10標準まで希釈する。すべてのストック溶液および実用標準溶液は-20℃で保存した。サンプルは600μLのメタノール（-20℃）に100mgのガラスビーズを加え、60秒間ボルテックスして抽出した。12,000rpm、4℃で10分間遠心し、上清を400μLとり、真空濃縮器で乾燥するまで濃縮する。100μLの30％メタノールを加えて再構成する。上清を0.22μmメンブランでろ過し、ろ液をLC-MSボトルに加えた。

ガスクロマトグラフィー条件 ACQUITY UPLC BEH C18カラム（2.1×100mm、1.7μm、Waters、USA）を使用し、注入量は5μL、カラム温度は40℃、移動相はA-0.01％ギ酸水、B-アセトニトリルであった。グラジエント溶出条件は、0〜4分、25%B、4〜9分、25〜30%B、9〜14分、30〜36%B、14〜18分、36〜38%B、18〜24分、38〜50%B、24〜32分、50〜75%B、32〜33分、75〜90%B、33〜35.5分、90〜25%Bであった。

マススペクトル条件 エレクトロスプレーイオン化(ESI)イオン源、負イオン化モード。イオン源温度は500℃、イオン源電圧は-4500V、コリジョンガスは6psi、カーテンガスは30psi、噴霧ガスと補助ガスはともに50psi。スキャンは多重反応モニタリング（MRM）を用いて行った。

定量と統計解析
データは、反復分散測定、一元配置分散分析、T検定分析、線形判別分析効果量（LEfSe）、およびKruskal-Wallisによって分析された。すべての統計解析は、IBM SPSS Statistics (22.0, IBM Corporation, Armonk, NY, USA)およびGraphPad Prism version 9.00 (GraphPad Software, San Diego, CA, United States)を用いた。確率（P）値＜0.05を統計的に有意とみなした（＊p＜0.05、＊＊p＜0.01、＊＊p＜0.001）。異なる上付き文字は異なる群間の有意差を示す（p＜0.05）。データは平均値±平均値の標準誤差（SEM）で示した。

謝辞
メタボロミクスデータ解析にご協力いただいたChengrui Wang氏（エンジニア、Weikemeng Techology Group、中国）に深く感謝する。本原稿の草稿の英文を校正してくれたLiwen Bianji (Edanz) (https://www.liwenbianji.cn/)のCharles Allan, PhDに感謝する。本研究は、T.B.に中国国家青年自然科学基金（32200381）、CASTによる若手エリート科学者支援プログラム（2021QNRC001）およびISZS、D.W.に中国科学院戦略的重点研究プログラム（XDPB16）および中国国家自然科学基金（32270508）、X.X.に中国博士研究員基金（2023M733486）の支援を受けた。

著者貢献
構想、T.B.およびD.W.、方法論、T.B.、L.T.およびX.X.、ソフトウェア、T.B.、L.T.、X.X.およびJ.W.、調査、T.B.、X.X.およびJ.L.、執筆-原案、T.B.およびX.X.、執筆-校閲および編集、D.W.、資金獲得、T.B.およびD.W.、監督、D.W.

利益申告
著者らは、競合する利益はないと宣言している。

補足情報

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ドキュメントS1。図S1-S6および表S1-S8。

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資料S2. 論文と補足情報。

データとコード

メタゲノムデータはSRA (NCBI Sequence Read Archive: PRJNA837089)に寄託されており、公開日現在入手可能である。

本論文ではオリジナルのコードは報告していない。

本論文で報告されたデータを再解析するために必要な追加情報は、要望があれば主任研究者から入手可能である。

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