ビロファージの分類法の更新とポリントン型ウイルスとの区別
ビロファージの分類法の更新とポリントン型ウイルスとの区別
https://www.mdpi.com/2218-273X/13/2/204
この論文では、ビロファージの分類とポリントンのようなウイルスとの区別について説明します。
1
DOEジョイントゲノム研究所、ローレンスバークレー国立研究所、バークレー、カリフォルニア州94720、米国
2
マックス・プランク医学研究所生体分子機構部、69120ハイデルベルク、ドイツ
3
フローニンゲン生命科学研究所、フローニンゲン大学、9700 AB フローニンゲン、オランダ
4
スミス大学生物科学部（米国マサチューセッツ州ノーサンプトン、01063
5
国立生物工学情報センター、国立医学図書館、国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州、20894、米国
*
著者名
Biomolecules 2023, 13(2), 204; https://doi.org/10.3390/biom13020204
受理されました。2022年11月28日 / 改訂：2023年1月2日 / 受理：2023年1月4日 2023年1月4日 / 掲載：2023年1月19日
(この記事は、Virology 130 Years After Ivanovsky-A Theme Issue Commemorating the Discovery of Viruses by Dmitri Ivanovskyに属しています。)
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要旨
ビロファージは、原生生物（微小核生物）に宿主として感染する際に、巨大ウイルスの仕組みを乗っ取る小型二本鎖 DNA ウイルスであり、ウイルスの世界では例外的な「超寄生」の事例である。ウイルファージの単離数はごくわずかであるが、多様なメタゲノムから膨大な数のウイルファージ様配列が発見されている。また、原生生物ゲノムや巨大ウイルスゲノムへの組み込みが可能であること、抗ウイルス作用に関与する可能性があることなどから、ウイルスファージは広く注目されている。しかし、このウイルス群の命名法および分類法が明確でないことが、今後の研究上の制約となっている。具体的には、ビロファージは、ポリントン様ウイルス（PLV）を含む他の「ビロファージ様」移動性遺伝要素やウイルスと文献上リンクされているが、どちらのグループ（ビロファージまたはPLV）についても正式な区分け基準や適切な命名法は存在しない。本研究では、ICTVビロファージ研究会の一員として、公開データから収集した大規模なゲノムセットと新たに作成した原生生物ゲノムを活用して、ビロファージ「sensu stricto」、すなわち原型分離株スプートニックとマウイルスに関連するゲノムの分類基準と複数の分類ランクでの分類方法を提案する。比較ゲノム解析と系統解析の組み合わせにより、このグループのウイロファージは、クラスレベルのまとまった分類群を形成していることを示し、生態学的特徴を持つ4つの目と7つの科に細分化することを提案する。最後に、提案した分類基準と分類方法がどのように使われるかを説明するために、最近発表された2つのデータセットにこれらを適用し、ビロファージと他のビロファージ関連要素を含むことを示した。この分類は、将来的にはPLVのような他のウイロファージ関連ウイルスをカバーするために拡張される必要がある。
キーワード：ウイロファージ、ポリントン、ポリントウイルス、ジャイアントウイルス、ウイルス分類学
はじめに
「ビロファージとは、真核細胞に巨大ウイルスと一緒に感染し、巨大ウイルスの仕組みを乗っ取って自己増殖するdsDNAゲノムを持つウイルスの総称である[1,2,3]。最初のビロファージは、巨大なママウイルスと一緒にアメーバ（Acanthamoeba castellanii）を宿主として発見され、ママウイルスの仕組みを衛星のように利用していることから、スプートニクと名づけられた[4]。ママウイルスと名付けられた2番目のウイルスファージは、その後すぐに特徴づけられました[5]。このウイルスは、海洋鞭毛虫のCafeteria sp.に巨大なCafeteria roenbergensisウイルス（CroV）を共感染させていることがわかり、マーベリック／ポリントンクラスの真核生物移動遺伝因子とウイルスファージの間に進化的なつながりがあることが明らかにされた。その後、一握りの追加のビロファージが培養され、その特徴が明らかにされた。その中には、異なるミミウイルス株に関連する複数のスプートニク様およびザミロンビロファージ、さらに最近では、CroV様のクロレラウイルスXW01に依存する緑藻類の最初のビロファージ、クロレラウイルスビロファージSW01 (CVv-SW01) がある [2,6,7]．以下、わかりやすくするために、スプートニク、ザミロン、マヴィルス、CVv-SW01に関連するウイルスを特に「ヴィロファージ」という用語で表すことにする。
分離されたウイロファージの比較分析により、いくつかのゲノムおよび表現型の特徴が明らかになった。これらの二本鎖（ds）DNAゲノムは約20キロベース（kb）の長さで、低GC含量を特徴とし、約20の予測されるタンパク質がコードされている[2,8]。主要なキャプシドタンパク質はダブルジェリーロール（DJR）フォールドを採用し、幅50〜75 nmの正20面体のビリオンの殻を形成している。すべてのウイロファージは、認識可能な構造遺伝子（例えば、大カプシドタンパク質と小カプシドタンパク質）に加えて、カプセル化に関与していると考えられる2つのタンパク質、Adenain様成熟プロテアーゼとFtsK-HerA様ATPaseもコードしている。最後に、これらのビロファージは原生生物宿主に巨大ウイルス、特にImitervirales目からのウイルスが共存する場合にのみ複製される。ウイルファージの複製が巨大ウイルスの複製やバーストサイズに及ぼす悪影響の程度は様々で、スプートニクやマービルスの場合は共感染によって巨大ウイルスが激しく阻害されるが、ザミロンではそうならない[3]。これらの定義的な特徴は、2016年に提案されたウイロファージの最初の分類の基礎となった[9]。簡潔に言えば、当時認識されていた3種のdsDNAウィロファージを含めるために、1科（Lavidaviridae）と2属（SputnikvirusとMavirus）が設定された。カフェテリアウイルス依存性マウイルス、ミミウイルス依存性スプートニクウイルス、ミミウイルス依存性ザミロンウイルスの3種を含む。この分類法は2020年に改正され、既存のウイルスファージ分類群をより大きなPreplasmiviricota門、Bamfordvirae王国、Varidnaviria領域に接続する上位ランクが追加された[10]。
また、スプートニクとマービルスの特徴づけにより、メタゲノム中のウイロファージ様配列の大規模検索が可能となり、環境中に存在するウイロファージの多様性が明らかになった。ビロファージ様配列は、ヒトや他の動物の腸内細菌[11,12]、南極の淡水湖[13]、北米[14,15,16]、アジア [17,18] 、ヨーロッパ [19] など多くの種類の生物圏で検出されました。さらに、メタゲノムから構築された大規模なゲノムを含む比較ゲノム研究により、これらのウイロファージ（-様）配列は多様であり、他の真核生物ウイルスや移動性遺伝要素、特にポリントン様ウイルス（PLV）を含む大きな進化的ネットワークの一部であることが示された［19, 20, 21, 22, 23］。PLVはバイロファージと同様に、マーベリック／ポリントンクラスの移動性遺伝要素に進化的に関連しているようで、巨大ウイルスと一緒に真核生物の宿主細胞に感染することができ、バイロファージのものと検出できる配列類似性はないが同等のカプセル化機構をコードしているらしい［24,25,26］。一方、真核生物宿主ゲノムへのマウイルス様ウイロファージの組み込みとその後の再活性化についてはさらに研究が進められ、高度な移動性が明らかになり、同族の巨大ウイルスに対する集団ベースの防御システムとしての役割が期待されている[27,28]。これらの異なる研究によって明らかにされた予想外の多数のウイロファージ様要素は、類似または重複する特性を持つ実体に異なるラベルが付けられるという、混乱した命名法をもたらすこととなった。具体的には、ウイロファージ関連配列は、「ウイロファージ」、「ポリントン」、「ポリントンウィルス」、「ポリントン様ウィルス」、「アディントウィルス」、「MELDウィルス」として交互に報告された[19,23,24,29]。このように異なる名称が用いられるのは、近年メタゲノム配列の報告が急速に増えているため、ウイロファージおよび関連要素の分類学的枠組みが確立されていないことを反映している。
本研究では、ICTVウイルスファージ研究会を支援し、ウイルスファージ様メタゲノム由来のゲノムと宿主関連データの包括的な再解析を行い、統一的な同定・分類の枠組みを提供することを目的としています。具体的には、まず、未培養のウイロファージに適用できるよう、ウイロファージ分類の基準を更新し、次に、系統解析と遺伝子含有量解析を組み合わせて、このウイロファージ分類群内の強固なクレードを特定する方法を評価し、最後に、メタゲノム由来の配列を総合して、ウイロファージの生態的分布や宿主範囲にどのように情報を与えるかを検討する。2.結果および考察
2.1. 2.1. ウイルスファージ分類群の定義とその境界基準
メタゲノム由来配列の分類を実用化するためには、ゲノムの特徴のみに基づき、利用可能な場合には追加情報によって補完される分類基準が必要である。現在、すべてのウイロファージが属するLavidaviridaeファミリーの公式な分類基準には、遺伝マーカーと表現型情報（「いわゆる核細胞質型大型DNAウイルスに関連する、大型dsDNAウイルスに依存または関連するウイルス」）の両方が含まれています[9,10]。遺伝子マーカー基準では、既知のすべてのウイロファージに共通する形態形成モジュールの4つの遺伝子が強調され、遺伝的類似性と共通の起源を示すために系統解析に使用できることが示された。この4つの遺伝子には、（i）「ヘクソン」タンパク質としても知られるメジャーカプシドタンパク質（MCP）、（ii）「ペントン」タンパク質としても知られるマイナーカプシドタンパク質（minCP）、（iii）FtsK-HerAファミリーDNAパッキングATPase（ATPase）、（iv）アデナインとしても知られる成熟システインプロテアーゼ（PRO）のウイルスファージ特異的なバージョンが含まれていた。これらの区分け基準が最初に提案されて以来、いくつかの研究により、MCP、ATPase、PROが完全またはほぼ完全なゲノムに共存していることが確認された[6,12]。また、ウイロファージのペントンタンパク質も最も多く検出されるが、ルーメンウイロファージ（RMV）のように、認識できないほど分岐していると思われる稀な例外もある[11]。
遺伝子量だけでスプートニクやマービルスのようなウイロファージを他の関連要素から区別できるかどうかを確認するために、まずGenBankで現在ラヴィダウィルス科に割り当てられている36配列と最大のRMV配列を、これらのマーカー遺伝子それぞれに対して以前に確立したHMMプロファイルを使って検索した[12]。ほとんどのラヴィダウイルスゲノムは4つのウイロファージマーカー遺伝子を含んでいたが、識別可能なウイロファージ様ペントンタンパク質を持たないRMVは例外であった(図1)。4つのゲノムはこれらのマーカーを全くコードしていなかった。すなわち、Phaeocystis globosa virus virophageと3つのChrysochromulina parva virus virophageである。これらのゲノムは、既にポリントン様ウイルスに近いことが知られていたため、論理的には他のウイルスファージと同じ分類群に属さない[11]。しかし、新しい分類群の境界を正式に定義する良い機会となった。特に、これらのポリントン様ウイルスの遺伝子は、どのビロファージマーカー遺伝子とも有意な類似性を示さなかった（最高hmmsearchスコア<10）。一方、ビロファージの配列は、ペントン蛋白質を除いて、通常hmmsearchスコア≥100を示した（図1B）。したがって、我々はvirophage分類群の定義基準を以下のように更新することを提案する。
Biomolecules 13 00204 g001 550Figure 1. GenBank上で現在Lavidaviridaeファミリーに分類されている配列間でのウイロファージマーカー遺伝子の検出。マーカー遺伝子は、ラヴィダヴィール科ゲノムから予測されるタンパク質と、ヴィロファージ形態形成遺伝子モジュールの4つの保存遺伝子に対して以前に構築したHMMプロファイルの間で行ったhmmsearchに基づいて検出された[12]。パネル(A)は、ビロファージ分離株、メタゲノムから構築したビロファージゲノム、GenBank上で現在ラヴィダビル科に分類されているがビロファージ保存遺伝子のいずれもコードしていないビロファージ様要素についての保存遺伝子検出パターンを示している。パネル(B)は、各マーカーのhmmsearchスコアの分布を、ウイロファージ（分離株またはメタゲノムから組み立てたもの）およびウイロファージ様要素の両方について示したものである。ここで使用した異なるゲノムのアクセッション番号を表S1に示す。
必要な機能：完全なゲノムは、ウイルスファージ様ヘキソンタンパク質、ウイルスファージ様ATPase、およびウイルスファージ様システインプロテアーゼをコードし、これらのマーカー遺伝子それぞれについて確立したHMMプロファイルに基づいてすべてが検出可能である必要がある。
ゲノムがdsDNAからなり、長さが15kbから45kbで、HMMプロファイルに基づいて検出されたvirophage様ペントンタンパク質をコードしていること。
2.2. エクステントビロファージクレードの共通起源と遺伝的多様性
上記の区分け基準で定義されたvirophageクレード内の遺伝的多様性を探るため、4つのvirophageマーカー遺伝子の同じHMMプロファイルを用いて、既発表のデータセット[12,28,30]、公開データベース（2021年10月現在）、新たに配列決定した原生生物ゲノムのvirophage配列を集めた（表S1）。具体的には、4つのウイロファージマーカー遺伝子のうち少なくとも3つが検出されたすべての配列を保持した。得られた1,869の配列は、dsDNAウイルスの標準的なカットオフ値、すなわち95%の平均塩基同一性（ANI）と85%のアラインメント率（AF）を用いて、848の異なるウイルス運用分類単位（vOTU）にクラスタリングされた[31]。これらのうち、257のvOTU代表が完全またはほぼ完全であると予測された（図S1、表S1、およびセクション4.方法を参照）。257の（ほぼ）完全なゲノムはすべてMCPとATPase遺伝子をコードし、256はPRO遺伝子をコードし、247は認識可能なペントンタンパク質（minCP）もコードしており、ウイルスファージは通常これらのマーカー遺伝子4つすべてをコードしていることが確認された。
まず、このデータセットを系統解析に用いて、ウイロファージがまとまった分類群を形成していることを確認した（図S2）。ATPase遺伝子とPRO遺伝子、すなわち他のウイルスや細胞ゲノムでホモログが同定できる2つのマーカーから構築した樹では、すべてのウイルスファージ配列が単系統群を形成していた（図S2）。唯一の例外は、ピトウイルスMAG（LCPAC001）からのコンティグにコードされたATPaseで、これはビロファージクレード内で分岐しており、巨大ウイルスゲノムの中で誤ってビン詰めされた本物のビロファージかもしれない（以下を参照のこと）。全体として、これらの2つの根付き木は、ウイロファージが単一の単系統分類群として分類できることを確認し、ウイロファージの分類に4つのマーカー遺伝子を用いることを補強するものであった。
次に、ウイルスファージゲノムにコードされている遺伝子の多様性を推定するために、de novoタンパク質クラスタリングを行った。このクラスタリングにより、形態形成遺伝子モジュールの4つのマーカー遺伝子が、データセット中で唯一、ほぼ普遍的に保存されている遺伝子であることが強調された。これ以外の遺伝子は、高感度なクラスタリングアプローチを用いても、ゲノムの半分以上では同定されなかった（図2A）。具体的には、各（ほぼ）完全なウイルスファージゲノムは平均して27個の予測タンパク質をコードしており、その大部分は単一のvOTUに固有であるか（n = 6）、ウイルスファージvOTUの10%未満にしか検出されない（n = 8）ため、ウイルスファージゲノム間の高い分岐度が強調されることになった。形態形成遺伝子についてペアごとの類似性を分析した場合にも同様のパターンが観察された。各遺伝子は主要な保存残基によって容易に同定できるが、ほとんどのウイルスファージのペアは、MCP、minCP、PRO、ATPaseのアミノ酸配列類似性が30%未満であった（図2B）。保存された遺伝子でさえも一次配列の類似性が低いことと、他の遺伝子における高い多様性を合わせると、起源が共通で保存遺伝子のセットが認識できるにもかかわらず、ウイロファージゲノムは大きく、ほとんどが特異的な遺伝的多様性をコードしていることが示される。このような多様性から、Maveriviricetesというクラスレベルの分類群を確立することを提案する。したがって、上記の区分け基準は、あるウイルスがMaveriviricetesクラスに属するかどうかを定義していると解釈されるべきである。
Biomolecules 13 00204 g002 550Figure 2. 図2 ウイルスファージゲノムにおける遺伝的多様性。(A) ウイルスファージの配列から得られた30大タンパク質クラスターのサイズ分布と機能アノテーション。4つの保存された遺伝子はオレンジ色で、機能注釈が付けられた他のタンパク質クラスターは青色で色分けされている。 B）4つの保存された形態形成遺伝子に対する全ヴィロファージ配列にわたるペアワイズアミノ酸同一性（AAI）分布。2つの標準的なAAIカットオフ（30%と40%のAAI）をそれぞれ赤と青でハイライトしている。MCP: Major Capsid Protein (hexon)。Penton：マイナーカプシドタンパク質。
2.3. ビロファージ・クレード内の分類の課題と限界
上記のように、多様な遺伝子内容と保存された遺伝子でさえも低い類似性から、ウイルスファージ・クレード内、すなわちMaveriviricetesクラス内で強固な下位分類群を確立することは困難である。現在のICTV分類学では、スプートニクとマービルスのウイロファージ種をそれぞれ1属で定義しているが、これでは追加された多様性を扱うには十分でない。ここでは、ウイロファージ間で最も保存されている遺伝子であるMCPに基づく系統樹と、ゲノム全体のアミノ酸同一性（gwAAI）に基づく遺伝子内容のクラスタリングから、一貫したクレードが得られるかどうかを検討した。この解析は、完全またはほぼ完全と同定された257のウイロファージゲノムセットに限定された（上記参照）。
メジャーキャプシドタンパク質（MCP）は、形態形成遺伝子モジュールの4つの遺伝子の中で最も長かったので、系統樹の再構築に選択された（図S3）。これまでの研究と同様に、MCPの系統樹は配列の分岐が高いために解決が難しく、結果として得られた樹には配置が不確かな長い枝がいくつか含まれていた。しかしながら、樹木の大部分において、強力な（>90）ブートストラップサポートを持つ強固な単系統クレードを定義することができ、正式な分類の基礎を形成するために使用することができます（図3A）。どのクレードが分類群として定義するのが最も適切かを特定するために、我々は、どの分類群も理想的には木における単系統のクレードにグループ化する以上の識別特性を持つべきであるという理論に基づいて、MCPツリーにゲノムの特徴（ゲノム長、MCP長、認識できるペントンの存在）、gwAAIに基づくクラスタリング、ソース環境などの補足情報を追加しました（図3A）。
Biomolecules 13 00204 g003 550Figure 3. MCP系統樹とゲノムの特徴に基づく新しいウイロファージクレードの定義。両パネルとも、完全およびほぼ完全なウイロファージゲノムに基づくMCP系統樹が示されている。パネル(A)では、内輪から外輪に向かって、(1)ゲノム全体のアミノ酸同一性（gwAAI）に基づくグループ、(2)ゲノム長、(3)Major Capsid Protein（MCP）長、(4)平均GC content、(5)HMM profilesによる典型的ウイロファージのペントン蛋白検出、(6)ゲノム入手先の生態系を含むゲノの特徴を示している。パネル(B)では、同じ木にウイロファージゲノムをキュレーションしたグループに分類したものを載せています。各グループの「コア」配列（実線、内側のリング）は、gwAAIクラスタリングに基づいてこのグループに割り当てられた単系統クレードのメンバーを表す（パネル（A）参照）。affiliated」リングは、ツリー内の全配列（セルフヒットは無視）を「ベストBLASTヒット」で所属させた結果を淡色で表示している（外側のリング）。
系統樹とゲノムのメタデータを組み合わせることで、このデータセット内に7つの異なるグループを定義することができた（図3A,B）。図3Bで "mavirus virophage "と記されている最初のグループは、マウイルス分離株の次に分岐したvirophageで、gwAAIに基づいて同じグループ（"gwAAI Group_006"）に分類されています。これは11ゲノムを含み、MCPツリー上の他のウイロファージとは遠縁にあり、ほとんどがカフェテリアゲノムに統合された配列で構成されている。同様に、"Rumen virophage "と記された小さなグループは、同じgwAAIグループ（"gwAAI Group_007"）にクラスター化した6ゲノムからなり、MCPツリー上の他のvirophageとは遠縁にあるのみである。この第2グループには、もともと「ルーメン ウイルファージ」[11]として記述された配列と、その他のメタゲノム由来ゲノムが含まれており、そのほとんどがルーメンサンプル由来である（図3Aおよび図S4）。第3のグループ（「スプートニク型ウイルスファージ」）は、ザミロン型およびスプートニク型ウイルスファージを含む47のゲノムからなる単系統クレードで形成され、その大部分（2つを除く）は「AAIグループ_002」にクラスター化している。このグループはまた、他のウイロファージと比較して短いゲノム（中央値=18.9 kb）と比較的低いGC含量（中央値=31.3%）を示す（図S4）。第4のグループは「large virophage」と呼ばれ、特徴的に大きなゲノム（中央値=31.4 kb）とMCP（中央値=938 aa）、および異常に高いGC含量（中央値=55.2%、図3Aおよび図S4）を持つ明確なクレードを形成している。最後に、「SW01 virophages」、「aquatic virophages 1」、「aquatic virophages 2」の3つのグループは、「large virophages」に隣接して分岐する146のゲノムを含むが、ゲノム長、MCP長、GC含有量は他のvirophageと同等で、3つの異なるgwAAIグループにクラスタ化されている（図3A、B、および図S4）。前者（「SW01 ウイルスファージ」）には最近単離されたクロレラ ウイルスファージSW01が含まれ、他の2つは単離された代表的なものがない[6]。
MCPツリー上で単系統のクレードを形成することに加え、これらのグループのメンバーが他の3つのウイルスファージ形態形成遺伝子から構築されたツリー上でも単系統のクレードを形成するかどうかをさらに検証した。これらのマーカーの分岐レベルは、最適でない整列と一貫した長い枝をもたらしたため、樹木の深い構造は不明なままであった。しかしながら、ATPaseとpentonの木では、すべてのクレードが広く単系統であり、矛盾した配列はほんの一握りであった（図S5）。PRO木では、ルーメンウイルスはSW01ウイルスの中で分岐し、マウイルスウイルスはスプートニクウイルスの中で分岐したが、ルーメンウイルスとマウイルスウイルスは共に長い分岐と低いノードサポート（しばしば<80）に関連していた。このことは、全体的なクレードはマーカー間で一貫しているが、異なるアラインメントの多様性のレベルを考えると、互いの相対的な位置関係を解決するのは困難であることを示唆している。これはMCPツリーにも言えることで、いくつかのゲノムは確実に配置できない長い枝を表示している（例えば、Yellowstone Lake virophage 7など）。
定義された7つのクレードの頑健性を考慮し、ICTVウイルスファージサブグループの一部として、我々は、以下のように、これらを目および科のレベルで正式な分類として確立することを提案する。
ルーメンウイルスは、新しいDivpevirales目の新しいRuviroviridaeファミリーとして、Divergent pentonタンパク質を持つウイロファージにちなんで命名された。
Mavirus virophage を、最初の単離メンバーの名前をとって Maviroviridae 科とし、Lavidavirales 目とする。この名前は、"Large virus dependent or associated" を意味する現在の Lavidaviridae 科から転用したものである。
スプートニクウィロファージを、分類群の最初の単離メンバーの名前をとって、新しいスプートニクウィロウィル科とし、新しいミビダウィル目において、"ミミウィルスに依存または関連する "という意味で命名した。
SW01 virophageは、分類群の最初のメンバー（SW01）が分離された湖の名前をとって、新しいDishuiviroviridaeファミリーとし、Maveriviricetesクラスで現在唯一確立されているPriklausovirales目に属するものとしました。
水生ウイロファージ1は、同じPriklausovirales目の淡水湖の広い地理的範囲で検出されたため、淡水環境との関連を示す接頭辞「omni」（「すべて」「どこでも」）と「limno」を用いた新しいOmnilimnoviroviridaeファミリーとして分類されました。
ガリバー旅行記」の主人公レミュエル・ガリバーにちなんで名付けられた新しいガリバーウイルス科の大型ウイルスファージは、他のウイルスファージに比べて「巨大」といえるが、関連する巨大ウイルスに比べるとまだ比較的小さいため、同じPriklausovirales目に属する。
水生ウイロファージ2は、同じPriklausovirales目の大型ウイロファージと最も近縁であることから、「ガリバーの旅」のLemuel Gulliverの妻Mary Burtonの名をとってBurtonviroviridaeファミリーとして新たに命名された。
後者の4つのクレードを1つの目（Priklausovirales）にまとめ、その他を分離するという決定は、ツリーで観察されたクレード間の分岐とペアワイズMCP AAIに基づいて行われた（図S4G）。
2.4. 混合データセットにおけるビロファージの検出と分類の割り当ての例
この新しいフレームワークに基づき、次のステップは、新しい配列をこれらのウイロファージ分類群に割り当てるための基準と運用プロセスを確立することであった。理想的には、新しいウイルスファージ配列は、上記の分類を明確にするために使用したものと同様のアプローチ、すなわち、複数の系統、ゲノムの特徴、ゲノム全体のAAIクラスタリングを組み合わせて分類されることである。しかし、この方法は場合によっては実用的でない可能性があり、参照プロファイルやデータベースとの単純な配列比較に基づいて新しい配列を既存のウイロファージ分類群に割り当てる代替方法が貴重であることを認識している。上に概説した新しく提案された分類と分界基準に基づいて、我々はそのようなアプローチを構築し、ベンチマークを行い、関連データベースと自動分類器を含む統合パッケージとして提供した（図4A、https://github.com/simroux/ICTV_VirophageSG、2022年11月15日にアクセス可能）。
Biomolecules 13 00204 g004 550Figure 4. 公開されたデータセットからのウイロファージの検出と分類。(A) ウイルスファージの同定と提案したファミリーへの割り当てに使用した hmmsearch および BLAST ベースの分類アプローチの概略図。パネル(B-D)では、3つのデータセットをパネル(A)で説明したアプローチで処理した。1つ目は、本研究の一部として収集した、完全およびほぼ完全なゲノムセットに含まれない、冗長でない既発表のウイロファージ配列（n = 591; "Incomplete virophages"）である。2つ目は、Gossenkölleseeメタゲノムから構築され、[19]で発表されたvirophageおよびPolinton様ウイルスと同定されたコンティグを含む（n = 114; "Gossenköllesee")．最後に、3番目のデータセットには、いくつかの先行研究[23,32,33]で発表されたアディントウイルスを含む（n = 64; "Adintovirus"）。パネル(B)では、Maveriviricetes（MCP HMMに基づく）として割り当てられた配列、またはPLV HMMプロファイルにヒットした配列のパーセンテージを表示しています。Maveriviricetes HMMまたはPLV HMMにヒットした配列のスコア分布を、各データセットおよび各グループについて、それぞれパネル（C，D）に表示する。
新しい配列が上記で定義したMaveriviricetesクラスに属するかどうかを決定するために、4つの形態形成遺伝子それぞれについて更新されたHMMプロファイルを構築し、特にMCPプロファイルの検出を主な分界基準として使用し、他の3つのマーカーは主にこの割り当ての確認とゲノムの完全性の指標として使用することを推奨している。Maveriviricetesの中では、完全ゲノムとほぼ完全ゲノムの比較から得られたカットオフを用い、MCPリファレンスに対するBlastPベストヒットアプローチを用いて、7つの分類群に新しい配列を割り当てることを提案する（図4A、表S2）。この「ベストヒット」アプローチは、MCPペアワイズAAIに基づくクラスタリングではなく、「分類群内」と「分類群間」の比較を区別する能力が限定的であることから選択されました（図S4G）。参照配列のセットに適用し、セルフヒットを省略した場合、BLASTに基づく所属は、MCP系統に基づいて定義された各ファミリーのすべてのオリジナルメンバーの分類を再現した（図3B）。したがって、厳密に同一ではないものの、このBLASTに基づく所属は、上で定義した系統樹主導のファミリーの有用な近似となるはずである。最後に、MaveriviricetesクラスのウイルスとPolinton-likeウイルス（PLVs）をさらに区別するために、PLVs全体で保存されているFtsK-HerA ATPaseに対応する既発表のHMMプロファイルとの比較を分類器に含めた [12,26]．したがって、Maveriviricetesに割り当てられていない配列は、このプロファイルの検出に基づいてPLVの可能性としてフラグを立てることができる（図4A）。
このプロセスが実際にどのように機能するかを説明するために、まず、我々のデータセット中の部分配列、すなわち、完全またはほぼ完全と同定されず、したがって主なMCP系統樹に含まれないウイロファージ配列に、このBLASTに基づく割り当てを適用しました。これらの配列のうち393個（66％）がファミリーレベルで割り当てられ、その大部分は新しいBurtonviroviridae提案ファミリーに分類された（割り当て配列の31％、表S3）。さらに確認として、これらの同じ配列に対して系統に基づく所属を行ったところ、BLASTに基づくアプローチとほぼ同じであった（同一の所属を持つ配列の92%、図S6）。次に、カスタム遺伝子含有率アプローチ[19]によってウイロファージ様配列が以前に同定された高地山岳湖から得られたデータセットに、BLASTベースの帰属アプローチを適用しました。その結果、4つのマーカー遺伝子すべてが検出された26配列と、4つのマーカー遺伝子のうち3つが検出された3配列を含む、31配列がMaveriviricetesクラスに分類された（図4A、表S3）。これらの31の配列は、元の研究で強調された32のウイロファージのリストとほぼ一致し、唯一欠けている配列は、MCPが検出されなかった部分ゲノムであった。また、過去に発表されたAdintovirus（n = 64）についても同様のアプローチを行ったところ、そのうちのいくつかはPreplasmiviricota phylumの中でMaveriviricetesの次に分類されているPolintoviricetesに分類された[23,32,33]。このうち、5つの配列がMaveriviricetesに分類され、いずれもウイルスファージ形態形成遺伝子のうち3つまたは4つを表示していた。さらにゲノムの比較から、これらの配列のうち4つがルーメン ウイルファージに類似していることが確認され（n = 4）、Maveriviricetes 分類群に再分類することが正当化される（図 S7）。
PLVの検出については、Gossenkölleseeデータセットで以前に「PLV」と同定された77配列のうち53配列がPLV FtsK-HerA ATPaseプロファイルにヒットを示したが、virophageは1つもヒットしなかった（図4B,C）。同様に、64種類のアディントウイルスのうち39種類がこのPLVプロファイルとヒットし、これにはPolintoviricetesクラスの2種類のICTV認識模範ゲノムが含まれています。その中には、Mayetiola barley midge adintovirus strain 2012とTerrapene box turtle adintovirus isolate 5272というPolintoviricetesクラスの2つのICTVの模範ゲノムが含まれていた。このことは，Polintoviricetesクラスが，すべてではないにしても，最終的にはほとんどのPLVの正式な分類群として機能する可能性を示唆している。注目すべきは、現在GenBankでLavidaviridaeに分類されているPgVVと3つのChrysochromulina parva virus virophageは、Maveriviricetesに分類するための上述の基準を満たさず（図1）、このPLVプロファイルに有意なヒットを示しており、これらはPolintoviricetesクラスに再分類されるべきことが示唆されていることである。
最後に、公開データベースからウイロファージを同定したところ、Maveriviricetesに分類するためのすべての基準を満たすが、現在はBacteriaまたはArchaeaに分類されている12のコンティグに気づいた（表S1-「MAG_」で始まる省略形の配列ID）。これらのコンティグはすべてメタゲノム集合ゲノム（MAGs）に由来し、誤ったビニングを反映していると考えられる。このことから、ウイロファージのコンティグは原核生物由来MAGの汚染源として過小評価されており、現在のツールでは検出されない可能性があることがわかった。
2.5. ゲノムに基づく分類を越えて。ビロファージの宿主範囲と相互作用
ビロファージおよびビロファージ様の進化の歴史と分類学をよりよく特徴づけることは、これらの要素が巨大ウイルスおよび真核生物の宿主に与える影響と長期にわたる関わりをよりよく理解するために特に重要である。スプートニクとマービルスの両者は、関連する巨大ウイルスの分子機構を乗っ取り、そうすることによって、これらの真核生物ウイルスが原生生物宿主に課す負担を軽減していると思われる。最近のPLV様要素では、巨大ウイルスと真核生物ウイルスの両方と同様の関連性を示し、巨大ウイルスの体力を低下させたことから、このライフスタイルと感染サイクルは、ウイロファージとPLVの共通の特徴である可能性が示唆されている[25]。しかし、ほとんどのウイロファージはメタゲノム解析によってのみ知られており、巨大ウイルスや真核生物の宿主となりうる生物についての情報は不足している。真核生物ゲノムは、分離株から、あるいはシングルセルゲノミクスによって得られるので、このギャップを埋めることができる。
我々のウイロファージのデータセットには、培養株から得られた真核生物ゲノムから同定された36の配列が含まれていた。そのうちの大部分（36個中34個）はCafeteria burkhardae（旧C. roenbergensis）ゲノムから検出され、そのうちの11個は以前報告したように大きな宿主領域に統合されていた[28]。注目すべきは、3つのメタゲノム由来のウイロファージゲノムが、5〜10kbの宿主と思われる領域を含む、より大きなコンティグ上で同様に同定されたことである（表S1）。これらの宿主領域は様々な原生生物分類に類似しており、これらのウイルスファージの明確な宿主予測はできないが、近い将来、メタゲノムからさらに多くのウイルスファージの組み込み事例が発見される可能性があることを示唆するものである。真核生物ゲノムから検出された他の2つのウイルスファージは、それぞれCaecitellusとAdriamonas様bicosoecid、海洋性および淡水性従属栄養鞭毛虫のゲノムから検出された（表S4；Hackl、Arndt、Fischer、未発表）。BLASTに基づくアプローチ（上記参照）によれば、前者は水生ウイロファージ・グループ2（提案されたBurtonviroviridae）に分類され、後者はMaveriviricetesクラス内に未分類のままであった。
しかし、微小真核生物は培養が困難であるため、シングルセルゲノミクスは、自動選別された、あるいは環境試料から手で採取された個々の微小真核生物のゲノム配列を得るという選択肢を提供する。我々のウイロファージのデータセットには、部分配列決定されたシングルセルゲノムから得られた32の配列が含まれており、ウイロファージの多様性に見られる真核生物宿主の種類をさらに示すものとなっている（表S1およびS4; Katz Lab, unpublished)。これらの32の配列は、精巣アメーバHyalosphenia elegansの8ゲノム（n = 16）、Loxodes属の6ゲノム（n = 13）、Halteria属の2ゲノム（n = 3）に由来するものである。その結果、Sputniviroviridae、Dishuiviroviridae、Omnilimnoviroviridae、Burtonviroviridaeに分類されるビロファージを同定し、一部の単細胞ゲノムには複数の異なるビロファージが含まれており、共感染の可能性が示唆された。しかし、原生生物に感染せず、原生生物に付着または巻き込まれているウイルスファージも単細胞ゲノムから検出されるため、このような関連性は実験的に確認されなければならない。これらの関連性候補を基に、理想的には、virusFISH [34] やdroplet digital PCR [35] などの最近開発されたin vitroアッセイを用いて、ウイロファージ-宿主間相互作用のさらなる特性評価を実施することになるであろう。
3. 3.結論
ビロファージは、巨大ウイルスや真核生物宿主に関連する、より小さなdsDNAウイルスの魅力的で複雑なネットワークの一部である。メタゲノム解析に基づくと、ビロファージは複雑な進化の歴史を持つ多様なウイルス群であり、そのため、ビロファージの範囲、命名法、分類群としての特徴に関する混乱が生じている。ICTVウイルファージ研究会のメンバーとして、我々は、stricto sensuに類似した配列に注目し、栽培ウイルスと非栽培ウイルファージの両方に適用できる最新の分類基準の確立を目指した。次に、最近発表されたメタゲノム由来のウイロファージゲノムに基づき、このウイロファージクレード内の強固な分類群を明らかにすることを試みた。その結果、スプートニクやマウイルスに類似したウイルスであるウイロファージは、Maveriviricetesクレードに属し、主にこのクレードに特有のダブルジェリーロール型主要キャプシドタンパク質バージョンと、これらのゲノムに典型的にコードされる3つの形態形成遺伝子（minCP、ATPase、PRO）に基づいて分類されるべきことが示唆された。さらに、このクラス内では、近々正式にICTVに提案される7つのファミリーレベルのグループを区別することを提案し、系統学的アプローチとゲノムのクラスタリングの組み合わせに基づいて定義している。最後に、配列類似性に基づくアプローチにより、新たに配列決定されたウイロファージをこれらの異なるグループに割り当てることを提案する。同様の枠組みは、現在ポリントウイルス科に分類されているいくつかのPLVにも使用できる可能性があり、この分野のウイルス圏の分類をさらに明確にすることができる。宿主範囲、巨大ウイルスや真核生物宿主との相互作用、あるいは新しい防御／反防御システムの可能性など、ウイルスファージとPLVの生物学に関して、発見や特性評価がまだ多く残されている[25,36]。最終的には、ウイルファージの包括的なゲノムカタログは、明確で最新の分類体系とともに、これらの魅力的なウイルスの将来の研究とより詳細な特性解明を促進する枠組みを示すものである。
4. 方法
4.1. ビロファージおよびビロファージに類似した配列の収集
本研究で用いたビロファージおよびビロファージ様ゲノム(Table S1)は、複数のソースから収集したものである。まず、NCBI NucleotideデータベースでLavidaviridaeに分類されるすべてのゲノムを2022年3月にダウンロードし、主要カプシドタンパクの一部のみを含む部分ゲノムMN151334とKJ183141を除いた。このLavidaviridaeゲノム参照データセット（n = 28）には、NCBI Nucleotideから2014年にダウンロードした配列、すなわちYellowstone Lake virophage 1〜4とAce Lake virophageも含まれている。次に、IMG/VR v3[30]でLavidaviridaeと割り当てられたすべての配列を収集し（n = 1417）、さらに2019年に発表されIMG/VR v3と一部重複するメタゲノム由来のウイルスファージの大規模セット（n = 331）、2015年にルーメンサンプルから記述された独自のウイルスファージの配列セット（n = 7）にも言及した。最後に、Cafeteria burkhardae [28]から最近記述された統合型ウイロファージのセット（「EMALEs」、n = 6）を含めた。これらの配列はすべて、ラヴィダヴィル科のメンバーの識別基準として以前に強調された、ヴィルファージ形態形成モジュールの4つのメンバーのうち少なくとも3つをコードすることが検証された[9]。この同定は、公開されたHMMプロファイル[12]に基づき、最大E値0.01、最小スコア40を用いてhmmsearch v3.3.2 [37]で検索されたものである。すべてのメタゲノム配列について、生態系情報はGoldデータベース[38]またはNCBI RefSeq[39]で利用可能なアノテーション情報から得たものである。
これらの公表済みvirophageを補完するために、新たに検出されたvirophageの配列を2セット追加した。まず、NCBI nrデータベース（2021年9月）に対するBlastP検索で、公表されたウイロファージの主要キャプシド蛋白（MCP）配列を使用し、96の推定ウイロファージを同定した。以前に収集した文献と同一の配列、および4つの保存されたウイロファージ遺伝子のうち少なくとも3つをコードしていない配列（上記参照）を除去した後、合計46の追加のウイロファージ配列が収集された。その内訳は、Cafeteria burkhardaeの全ゲノム配列決定で検出され、「EMALEs」データセット[28]と重複する28個、細菌および古細菌MAGに属し、誤ったゲノムビニングに起因すると考えられる13個、現在Adintoviridae familyまたはMELD groupに分類されているメタゲノム由来のウイルスゲノム5個[23，32，33]である。最後に、培養原生生物から新たに塩基配列を決定したゲノム（n = 2）、または手摘みアメーバや繊毛虫から全ゲノム増幅により得られた単細胞ゲノム（n = 32）から同定された4つの保存型ウイルスファージ遺伝子のうち少なくとも3つを含む34のウイルスファージ配列もデータセットに含めた。これらのウイロファージの配列は、潜在的な宿主とユニークに関連する可能性があり、最終的には分類学の分類の一部として使用できる可能性があるため、対象とした。これらの原生生物ゲノムの詳細については、表S4に記載した。
4.2. ビロファージの同定および分類のアプローチを説明するために使用した外部データセット
NCBI nrデータベース[23,32,33]の検索により、ビロファージおよび他の関連ウイルスを含むと発表された、あるいはそうであることが判明したので、ここで提案する同定および分類アプローチを説明するために2つの発表済みデータセットが使用された。前者のデータセット（「Gossenköllesee」と同定）については、著者らがウイロファージまたはPLVと同定したすべての新しいコンティグをhttps://figshare.com/s/9a7a1d16d77ea9d658a1、2022年9月23日にアクセスし、識別および分類パイプラインで処理した（n = 114）。これらのコンティグの元の所属は、[19]の表S3から得た。後者のデータセットについては、2022年8月にNCBI GenBankで入手可能なAdintoviridae科に分類されるすべてのコンティグを収集し（n = 28）、さらに未分類のウイルスを含む[23]にリストされたコンティグも収集した（n = 59）。この2つのデータセットを結合し、MUMmer v4.0.0b2 [40]を用いて、短い方の配列長の99%にわたって99%の平均塩基同一性（ANI）でデリプレートし、64配列の非冗長データセットを得た（"Adintovirus "と称する）。
4.3. ビロファージゲノムのクラスタリング、品質管理、トリミング
統合されたウイロファージに対応する可能性のある配列は、まず同一コンティグ上に見出される可能性のある宿主領域をトリミングするために精製された。Cafeteria burkhardaeゲノムで検出されたすべてのウイロファージについて、[28]と同様の手順を用いた。簡単に言うと、各ウイルファージのMCPについて、上流と下流の50kbを含む領域が抽出された。この領域の予測されるコーディング配列（cds）は、BlastP 2.10.0+ [41]を用いて、最小ビットスコア30でMavirus参照ゲノムのcdsと比較された。カスタムスクリプトを使用して、100 ヌクレオチドのスライディングウィンドウで同じ領域の GC 含量を計算した。各領域について情報を組み合わせ、個別に検査し、統合されたウイロファージの最も可能性の高い境界、すなわち、既知のウイロファージ遺伝子を含み、GC含量の明確なシフトに対応する境界を定義した[28]。IMG/VRデータベースまたは既報の大規模データセット[12]から得られたメタゲノム配列について、以下のようにして統合型ウイロファージを推定した。まず、真核生物ゲノムを原核生物遺伝子予測因子でアノテーションする際によく見られる1kb以上の遺伝子間領域について、これらすべてのコンティグをスクリーニングした（prodigal v2.6.3, "meta" option, 以下参照）。遺伝子間領域が1kb以上ある49個のコンティグをIMGウェブサイト上で目視検査し、宿主となりうる領域を特定した。その結果、9つのコンティグ（IMG_VR_0446, IMG_VR_0447, IMG_VR_0497, IMG_VR_0676, IMG_VR_0763, PE_122, PE_123, PE_131, Table S1）についてホスト領域候補のトリミングを実施した。次に、30kb以上のコンティグについて、Cafeteria burkhardaeゲノムで観察されるようなGC含量のシフトがあるかどうかを検索した。これは1つのコンティグ(IMG_VR_0457)で観察され、そのコンティグについては手作業でホスト領域を特定し、トリミングを行った(Table S1)。これらのメタゲノム由来の統合型ウイロファージについて、宿主領域で予測されるcdを、オンラインNCBI BLAST（2022年8月）を用いて真核生物分類群に限定したNCBI nrと比較し、これらの宿主領域の分類の候補を決定した。
統合プロウイルスと同定されなかったコンティグについては、5′と3′の少なくとも10塩基の同一配列に基づいて、直接末端反復を検出した（n＝81）。これらのコンティグについて、3′の重複配列をすべてトリミングし、単一のゲノムユニットのみを保持するようにした。必要に応じて、トリミングされたコンティグの開始点をずらして、コンティグの末端をまたぐcds予測を避け、不完全なタンパク質配列になるようにした。
トリミング後の全ウイルスの配列（n = 1869）を、dsDNAウイルスゲノムの標準的なカットオフ、すなわち最短配列の85%以上の95% ANI [31] に従ってvOTUに分類し、MUMmer v4.0.0b2 [40] で配列類似性を同定した。ただし、分離株や参照配列を含むvOTUについては、最も古い参照ゲノムや最も品質の高い参照ゲノムを代表として手動で選びました。最終的に848のvOTU代表、すなわち非冗長なウイルスファージゲノムのデータセットが、その後のゲノムアノテーション、タンパク質クラスタリング、系統樹などの解析の入力として使用された。
4.4. ゲノムアノテーションとデノボタンパク質クラスタリング
ゲノムアノテーションとデノボ蛋白質クラスタリング トリムした代表配列（上記参照）について、prodigal v2.6.3 の meta オプションで cd を予測した[42]。機能アノテーションのため、予測されたタンパク質配列は、hhblits 3.1.0 と以下のオプションを使用して Pdb70 [43], Pfam [44], SCOPe [45] データベースと比較されました。-Z 250 -z 1 -b 1 -B 250、最小確率スコア95 [46,47]。予測されたタンパク質配列は、以前にvirophageで使用されたものと同様のパイプラインでde novoクラスタリングされた[12]。簡単に言うと、予測されたタンパク質配列は、まずall-vs-all BlastP [41] (v2.10.0+, default parameters)で互いに比較された。次に、InfoMap [48] (v0.18.25, --two-level option)を使用して、タンパク質クラスタリングの第1レベル（"Protein clusters"）を取得しました。まず、クラスタの全メンバーをmuscle v3.8.1551 [49]（デフォルトパラメータ）でアライメントし、このアライメントからhhmake v3.1.0 [47] の-M 50と-add_consオプションでプロファイルを構築しました。プロファイルは、hhsearch v3.1.0 [47]のオプション -norealign と最大 E-value 0.001 で全対全で比較された。確率スコアが90以上で短いアラインメントの50%以上をカバーするクラスタ、または確率スコアが99以上で短いアラインメントの20%以上をカバーするクラスタ間のヒットをコンパイルし、「スーパークラスタ」、すなわち関連するタンパク質クラスタのグループを確立するための貪欲クラスタリングの入力として使用されました。
次に、個々の予測された機能性タンパク質アノテーションをタンパク質クラスタおよびスーパークラスタレベルでまとめ、クラスタ/スーパークラスタのメンバーのうち33%以上を含む場合、そのメンバー間の多数決に割り当てることにした。3J26_N (Penton), 3J26_I (MCP), 4EKF_A (PRO), またはPfam Clan: P-loop_NTPase (CL0023, ATPase) への割り当てに基づいて、正規のウイルスファージ形態形成遺伝子モジュールに相当するスーパークラスタが同定された。これらの4つのスーパークラスターは、参照ウイルスファージゲノムから対応するすべての遺伝子が期待されるスーパークラスターに属し、他のスーパークラスターがこれらの4つのドメイン/クランのいずれかに割り当てられないことを検証することによって、さらに検証された。これらの4つのスーパークラスターは、部分的および／または重複した遺伝子に対応するクラスターを除去するためにさらに改良された。その結果、MCPについては3つのクラスター、PROについては1つ、ATPaseについては2つ、Pentonについては11のクラスターが最終的に得られた。
これらのコア遺伝子を全ゲノムおよび外部データセットに対して最終的に系統的に検出するために、これらの配列に対して以下のようにHMMプロファイルを構築した。各スーパークラスタについて、タンパク質配列をall-vs-all BlastP [41] (v2.10.0+, default parameters) で互いに比較し、MCL 14-137 (inflation parameter = 5) [50] でクラスタリングし、10配列以上の各グループについて、多重整列とHMMプロファイルをそれぞれ MAFFT v7.490 [51] とhmmbuild v3.3.2 [37] で構築しました。この処理により19個のHMMプロファイル（7 MCP, 2 PRO, 4 ATPase, 7 Penton）が得られ、これを用いて848個の非冗長ウイルスファージゲノムそれぞれにおける4つの形態形成遺伝子を同定した（hmmsearch v3.3.2 [37], 最小スコア50、ゲノム別ベストヒット）。その後、SDT [52]（2014年2月版、デフォルトパラメータ）を用いて全対全アミノ酸同一性率を算出し、4つの形態形成遺伝子それぞれの配列分岐を評価した。
4.5. ATPase遺伝子とPRO遺伝子の根付き系統樹
ATPase遺伝子とPRO遺伝子は、非ビロファージゲノムにホモログがあるため、これらの他の配列に関して、ビロファージが単系統クレードを形成していることを検証する機会を提供するものである。この目的のために、2つのカテゴリーのアウトグループ配列が含まれた。(i)同様の解析に以前使用した配列[20]、(ii)NCBI nr配列で、ウイロファージ（Lavidaviridae）には属さないがウイロファージに類似している（BLAST score ≥ 100）配列である。各マーカー（ATPaseとPRO）について、得られたvirophageとoutgroupの配列をMCL 14-137（インフレーションパラメーター＝PROは4、ATPaseは9）［50］を用いてクラスタリングし、メタゲノム由来ゲノムよりも分離株を優先して各クラスタの代表を1つずつ選択した。
各クラスタについて、MAFFT v7.490 [51] (--auto option)を用いてマルチプルアラインメントを計算した。アラインメントは、部分配列や非相同配列（保存領域や残基を欠くもの）を除去するために目視で検査された。IQ-Tree v1.5.5 [53]は、最も適切な置換行列の自動検出と1000回の超高速ブートストラップにより、それぞれのキュレーションアライメントの樹形を構築するために使用された。最も適合するモデルは、PROとATPaseの両方についてLG+F+R7であった。
4.6. 完全およびほぼ完全なビロファージゲノムの同定と解析
848の非冗長性ウイルスファージゲノムのうち、完全ゲノムおよびほぼ完全なゲノムである可能性が高い配列のカテゴリーをいくつか検討した。(i) 分離株の参照ゲノム (n = 4), (ii) 2 kb以上の上流および下流宿主領域と統合された配列 (n = 7), (iii) 直接反復配列または逆方向反復配列 (n = 118, n = 8), (iv) CheckV (AAI-based prediction, n = 59), (v) 25 kb以上の線形コンティグ (n = 61)。この後者のカテゴリは、他のすべてのカテゴリから予測された完全および近完全ゲノムの長さの中央値（25,168 bp）に基づくものであった。全体として、257の配列が完全またはほぼ完全なウイロファージゲノムとみなされた。
これらの完全ゲノムおよびほぼ完全なゲノムを系統樹の入力として用い、ゲノム全体のクラスタリングを行い、ウイロファージ内のグループと潜在的な分類群を確立した。系統樹には、新しいHMMプロファイル（上記参照）を用いて257の完全ゲノムおよびほぼ完全なゲノムから検出された4つの形態形成遺伝子の配列を、部分的な遺伝子予測を取り除くためにHMMプロファイルの60%未満を覆うすべての配列を除外した後に使用した。次に、分岐度の高い配列のアライメントに特化した反復クラスタリング-アライメント-系統樹手順[54]を用いて、各遺伝子についてマルチプルアライメントを構築した。このアラインメントは、kpi-smart-gap モードを用いて clipkit v1.3.0 [55]で自動的にトリミングされ、最適な置換行列の自動検出と1000回の超高速ブートストラップを用いて IQ-Tree v2.2.0.3 [56] で樹形 成する入力として使用された。PROはQ.pfam+F+R7、ATPaseはQ.yeast+F+R8、MCPとpentonはQ.pfam+F+R8が最も適合するモデルであることが分かりました。完全ゲノムと部分ゲノムの両方を含むより大規模なMCP系統樹（図S6）については、完全ゲノムとほぼ完全ゲノムからのMCPのみを含むキュレーション多重アライメント（オプション「-add」と「-keeplength」）に基づき、MAFFT v7.490 で多重配列を計算し［51］、系統樹は、上述と同様のパラメータで木IQ-Tree v2.2.0.3 ［56］で構築された。
ゲノム全体のアミノ酸同一性（AAI）クラスタリングは、[57]のように実行された。簡単に言うと、257の完全及びほぼ完全なウィルス性病原体からの予測タンパク質配列は、diamond v0.9.24.125 [58]と以下のオプションを使用して、全対全で比較された。このとき、"--evalue 1e-5 --max-target-seqs 10,000-query-cover 50-subject-cover 50 "というオプションが用いられた。このファイルは、amino_acid_identity.pyの入力ファイルとして使用され、全ゲノムペアの平均AAIを算出します。次に、スクリプト "filter_aai.py" を用いて、最小正規化累積ビットスコアが 0.05 のゲノムのペアのみを選択しました。MCL 14-137 (inflation parameter = 1.1) [50]を用いた MCL クラスタリングの入力として、これらのペアワイズ AAI 値を使用しました。
4.7. 新しいビロファージの分類群の同定、定義基準、および分類アプローチ
新しいウイルスファージゲノムの同定と分類を可能にするために、各モデルおよび/またはクレードの調整されたカットオフとともに、HMMおよびBLASTデータベースを準備した（https://github.com/simroux/ICTV_VirophageSG, accessed on 15 November 2022）。まず、分類する配列から予測されるタンパク質を、hmmsearchと新しいHMMプロファイル（上記「ゲノムアノテーションとde novoタンパク質クラスタリング」参照）を用いて、ウイルスファージの形態形成遺伝子を検索する。入力配列をMaveriviricetesクラスに自動分類するためには、MCPプロファイルの少なくとも1つで最低50のスコアが必要である。他の3つのウイロファージ遺伝子（ATPase、PRO、Penton）の検出には、最低でも40のスコアが使用される。次に、MCPの配列を、BlastPを用いた系統樹とゲノムのクラスタリングアプローチの組み合わせに基づいて、7つの新しいグループのいずれかに頑健に分類された完全ゲノムおよびほぼ完全なゲノムからのMCPと比較する。新しい配列は、最高のBLASTヒットに基づいて7つの新しいグループの1つに所属し、最小ビットスコアカットオフは、グループ外の配列に対して得られた最高スコアに基づいて決定される（表S2）。最後に、以前に発表されたPLV関連HMMプロファイル［12］も、PLV様配列を同定するために、同じhmmsearchアプローチと50の最小スコアカットオフを使用して検索された。このアプローチは、今回研究したvirophageデータセットと2つの外部データセットに適用された。「Gossenköllesee "と "Adintovirus"(上記参照)の2つの外部データセットに適用した。
4.8. 可視化
R v4.2.1 [60]のggplot2 v3.3.6 package [59]を用いてボックスプロットと棒グラフを作成し、dplyr v1.0.10 [61] と tidyr v1.2.1 [62] パッケージを用いてデータ処理を行った。注釈付き系統樹は ggtree v3.4.2 [63,64,65,66] と ggtreeExtra v1.6.1 [67] パッケージで作成した。色付けは、ggpubfigs [68]のパレットを使用しました。ゲノムマップは、PE_004 を除き、NCBI GenBank のゲノムアノテーションを元に EasyFig v2.2.3 [69]で描画しています。
補足資料
https://www.mdpi.com/article/10.3390/biom13020204/s1, 図S1：完全およびほぼ完全なウイロファージゲノムの長さ分布；図S2：ウイロファージおよびアウトグループ配列を含むATPaseおよびシステインプロテアーゼ（PRO）ツリー；図S3：4つのウイロファージゲノムの長さ分布。4つのウイロファージ保存形態形成遺伝子の長さ分布；図S4: 提案されたビオロファージクレードの特徴；図S5：他のビオロファージマーカーから構築した系統樹上のキュレーションされたビオロファージグループの分布；図S6: 完全ゲノム、ほぼ完全ゲノム、部分ゲノムを含むビロファージ系統樹（MCP）；図S7: Maveriviricetesクラスに分類される5つのAdintovirusesの遺伝子量とゲノムマップおよび最も近い参照文献；表S1: 本研究で解析したビロファージ配列のリストと特徴、ここに含まれる多くのメタゲノムおよび/またはビロファージ配列は、過去に[2,4,5,6,11,12,13,14,15,16,17,18,23,24,27,28,29,30,32,33,70, 71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106, 107,108,109,110,111,112,113,114,115,116,117,118,119,120,121,122,123,124,125,126,127,128,129,130,131,132,133,134,135]; 表S2: BLASTによるMaveriviricetesクラス内のファミリーへの割り当てに使用したカットオフ値；表S3: 表S3：外部データセットでのマーカー遺伝子検出とBLASTによる所属の結果；表S4．原生生物ゲノムの特徴、Cafeteria burkhardaeの統合型ウイロファージゲノムは以前の研究で同定されている[28]。
著者による貢献
構想、S.R., M.G.F., F.S. and N.Y.; 方法論、S.R., M.G.F., F.S. and N.Y.; ソフトウェア、S.R.; 形式分析、S.R., M.G.F., T.H., L.A.K., F.S. and N.Y.; 執筆-原案を作成、S.R., 執筆-原案作成：S.R., M.G.F., F.S. and N.Y.; 執筆-レビューおよび編集：S.R., M.G.F., T.H., L.A.K., F.S. and N.Y. 全著者が本原稿に目を通し、合意している。
資金提供
DOE Office of Science User Facilityである米国エネルギー省合同ゲノム研究所（https://ror.org/04xm1d337）で行われた研究は、契約番号DE-AC02-05CH11231で運営される米国エネルギー省科学局から支援を受けている。M.G.F.は、マックス・プランク協会からの資金援助を受けた。L.A.K.はNIH補助金R15HG010409とNSF補助金DEB-1651908の支援を受けている。
施設審査委員会声明
該当なし
インフォームドコンセント
該当なし
データの利用可能性に関する声明
本研究で使用した全てのウイロファージゲノムのリストは、関連する出版物およびJGI提案のDOIとともに、表S1に記載されている（可能な場合）。対応する配列は、参照MCPアライメントおよび系統樹とともに、https://portal.nersc.gov/cfs/m342/virophages/(2023年1月5日にアクセス)で提供されている。virophage配列の割り当てに使用したデータベースとスクリプトは、https://github.com/simroux/ICTV_VirophageSG (accessed on 5 January 2023)で提供されている。
謝辞
比較ゲノム解析について有益な議論を提供してくれたStephen Nayfachに感謝する。
利益相反
著者らは利益相反を宣言していない。
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また、このような環境下において、「環境保全の重要性」を再認識し、「環境保全の重要性」を再認識するために、「環境保全の重要性」、「環境保全の重要性」、「環境保全の重要性」、「環境保全の重要性」、「環境保全の重要性」、「環境保全の重要性」、「環境保全の重要性」、「環境保全の重要性」、「環境保全の重要性」、「環境保全の重要性」、「環境保全の重要性」、「環境保全の重要性」、「環境保全の重要性」、「環境保全の重要性」、「環境保全の重要性」、「環境保全の重要性」、「環境保全の重要性」について検討しました。を発表した。[Google Scholar] [CrossRef] [PubMed].
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このような環境下において、水生生物は、その生態系を維持・発展させるために、様々な工夫を凝らしている。このような環境下において、「環境保全の重要性」、「環境負荷の低減」、「環境負荷の低減」、「環境負荷の低減」、「環境負荷の低減」、「環境負荷の低減」、「環境負荷の低減」、「環境負荷の低減」、「環境負荷の低減」、「環境負荷の低減」、「環境負荷の低減」、「環境負荷の低減」、「環境負荷の低減」、「環境負荷の低減」、「環境負荷の低減」、「環境負荷の低減」。[Google Scholar] [CrossRef].
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このような状況下において、「生物多様性の保全」、「生物多様性の保全」、「生物多様性の保全」という3つの基本的な考え方のもと、「生物多様性の保全」と「生物多様性の保全」の両立を目指します。Microbiome 2022, 10, 67. [Google Scholar] [CrossRef].
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共有と引用
MDPIおよびACSスタイル
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