Influenza A Virus Matrix Protein 1のスレオニン108におけるリン酸化は、STRIPAK複合体との多量化状態および機能的な結合を制御する

2023年1月19日 16:24

2023年1月5日
Influenza A Virus Matrix Protein 1のスレオニン108におけるリン酸化は、STRIPAK複合体との多量化状態および機能的な結合を制御する
著者 Lu Liu, Axel Weber, Uwe Linne, Mahmoud Shehata, Stephan Pleschka, Michael Kracht, M. Lienhard Schmitz https://orcid.org/0000-0002-6984-7192 lienhard.schmitz@biochemie.med.uni-giessen.deAUTHORS INFO & AFFILIATIONS
DOI: https://doi.org/10.1128/mbio.03231-22
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ABSTRACT
A型インフルエンザウイルス（IAV）にコードされるマトリックスタンパク質1（M1）は、ウイルス複製のマスターレギュレーターとして働き、様々な細胞区画で構造および制御機能を果たしている。そのため、M1の時空間的な制御は、その構造およびpH依存性の柔軟性、細胞因子との差異のある会合、翻訳後修飾などの様々なメカニズムによって達成されている。我々は、進化的に保存されているスレオニン108 (T108) におけるM1リン酸化の機能を調べ、リン酸化されないアラニンへの変異がウイルス複製を禁止することを見いだした。T108がない場合、M1は細胞膜で自己会合が強くなり、その結果、核に入ることができず、ウイルスのリボ核タンパク質の核輸出に寄与することができなくなった。M1のT108リン酸化は、細胞内のSTRIPAK（striatin-interacting phosphatases and kinases）複合体への結合親和性も制御しており、この複合体には、リン酸化に依存したシグナル伝達ネットワークを形成する様々なキナーゼやホスファターゼPP2Aも含まれていた。IAV感染により、STRIPAKの足場となるサブユニットSTRNとSTRN3が細胞膜から細胞質および核周囲のクラスターに再分布し、そこでM1と共局在化した。STRIPAK複合体が不活性化されると、M1の重合が阻害され、IAVの複製が阻害された。
重要性インフルエンザウイルスは人間の健康にとって大きな脅威であり、毎年流行し、時には大流行も引き起こす。M1タンパク質に代表されるように、多くのウイルスタンパク質は、異なる細胞内領域で様々な機能を発揮しているが、その分子機構は未解明である。我々は、M1タンパク質のT108のリン酸化がウイルス複製に必須であり、自己会合と核局在の傾向を制御していることを報告した。このリン酸化はまた、M1タンパク質のSTRIPAK複合体への結合親和性を制御し、M1の重合とウイルス複製に寄与している。
はじめに
A型インフルエンザウイルス（IAV）は、8つの遺伝子セグメントを含むセグメント化ゲノムを持つエンベロープ型負鎖RNAウイルスである。IAVは、高いゲノム可塑性と継続的な進化により、宿主の免疫から逃れ、新しい宿主種に適応することができるため、季節的流行や時折パンデミックを引き起こす(1)。IAVの感染サイクルは、クラスリン依存性および非依存性の機構による細胞侵入に始まり、膜融合とウイルスのアンコーティング、ウイルスゲノムの転写と複製、ウイルスタンパク質の翻訳とプロセシング、ウイルスの組み立てとゲノムパッケージング、そして最終的にウイルスの放出となります（2）。IAVの8つのゲノムセグメントには最大17個のポリペプチドしかコードされていないため（3）、マトリックスタンパク質1（M1）のようないくつかのウイルスコード化タンパク質は、IAVのライフサイクルの各段階において異なる機能を有しています。成熟したビリオンでは、M1ポリマーはエンベロープの内表面で殻を形成し、そこでウイルスリボ核タンパク質（vRNP）複合体（4、5）およびウイルス糖タンパク質ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼの細胞質尾部と相互作用し、インフルエンザウイルスの構造的完全性を保証している（6、7）。IAVはビリオンの内在化後、エンドソームに収容され、弱酸性のpHによりM1が分解される。この過程は、ヒストン脱アセチル化酵素6などのアグレソーム処理装置の構成要素により支援されている(8)。M1タンパク質にある核局在配列（NLS）は、合成されたばかりのM1の核内移行に重要である（9）。核内では、M1は誘導性リン酸化ヌクレオキャプシドタンパク質NPと結合し、ビリオンRNAおよびヘテロ三量体RNA依存性RNAポリメラーゼ複合体とともに、活性型vRNPsを形成する。子孫vRNPの核輸出には、vRNP/M1複合体だけでなく、宿主クロマチンにおけるウイルス核輸出タンパク質（NEP）との相互作用も必要である(10)。NEPは、CRM1/exportin1を介した経路による核輸出（11, 12）およびカスパーゼ依存性の核膜孔拡大（13）を可能にするアダプターとして機能する。細胞質側のvRNPは、M1とは関係なく、微小管に沿って、RAB11陽性のリサイクリングエンドソームと会合しながら細胞膜に向かって移動する(14)。M1タンパク質は、ウイルス膜貫通タンパク質M2との相互作用により、細胞膜近傍に捕捉され、ウイルスの出芽をサポートする（15）。脂質膜への結合とM1の局所的な高濃度により、M1ポリマーの直鎖を含む二量体や高次構造の形成が誘導される(16)。この直鎖状のM1は、脂質二重膜の内側に沿って巻き付き、組み立てられたビリオンの内骨格を形成するのと同様のフィラメントを形成し、出芽を促進する(17-19)。
IAVのライフサイクルの様々な段階におけるM1の本質的な多機能性は、その細胞内局在と多量体化状態の差異とともに、複数のレベルでの多目的な制御を必要とする。このような制御には、段階的なタンパク質間相互作用、構造的な柔軟性、可逆的な翻訳後修飾（PTM）が含まれます（20-24）。従って、M1タンパク質は、ユビキチン化、SUMO化、Neddylation、リン酸化によって修飾される可能性がある（25-27）。リン酸化の発生は、通常、キナーゼとホスファターゼの制御された局在とバランスのとれた活性によって時間的、空間的に制限される。これらの酵素は単独で、あるいは様々な複雑さをもつタンパク質集合体として存在し、さらなるレベルの制御と基質認識を可能にしている。高度に組織化された多タンパク質複合体の一例として、進化的に保存されたSTRIPAK複合体がある。この複合体は、多くのキナーゼ（MST3、STK24、STK25、MAP4K4）、PP2Aホスファターゼ複合体のサブユニット、さらに制御タンパク質が集合する核となる4量体のStriatin足場タンパク質からなる(28)。この多機能なシグナル伝達ハブは、多様な細胞内シグナルをHippoシグナルやオートファジーなどの異なる経路に統合している（29, 30）。リン酸化は通常、（i）生化学的プロセスの連続的な発生を保証し、（ii）異なる機能を持つ異なるサブポピュレーションの発生を可能にするために、サブイキオメトリーに行われる（31）。リン酸化の時間的・空間的ダイナミクスが制御機能に必要であるため、この修飾の欠如と構成的なリン酸化の両方が機能喪失につながる可能性がある。
今回、我々は、制御されたM1スレオニン108（T108）リン酸化がIAVの複製に必要であることを明らかにしました。T108が欠損すると、リン酸化によってその核内移行とM1を介した核内vRNP輸出が禁止され、M1の自己会合が強く増加する。M1のT108リン酸化は、プロウイルス機能を発揮するSTRIPAK複合体のメンバーを含む宿主細胞タンパク質との会合も制御している。
結果
M1のT108リン酸化の制御は、IAVの複製に必須である。
M1タンパク質はT108を含む多くの部位でリン酸化されていることが、私たちがマウスに適応したH7N7型株A/Seal/Massachusetts/1/80（SC35M）に関して、また他の研究者がH1N1型実験株A/WSN/33（WSN）に関して発見した（26、32）。この部位は、膜結合と多量体化に関連する領域内にあり、NLSに隣接し、鳥類とヒトの両方の種の異なるIAV株間で高度に保存されている（図1A）。このM1リン酸化部位の機能を調べるために、T108をリン酸化欠損のアラニン（T/A）またはリン酸化を模倣したグルタミン酸（T/E）に変更した。その結果、図1Bに示すように、このリン酸化の発生も、リン酸化されていない状態とリン酸化された状態の間の動的な交互作用もない2種類の変異体が得られた。ウイルスタンパク質とRNAをコードする8つの共導入プラスミドを用いた逆遺伝学により、図1Cに模式的に示すように、293T/MDCK-II細胞の共培養を用いて組換えSC35Mウイルス変異体の作製を行った。これらの実験では、M1 T108Aを変異させたウイルスを繰り返しレスキューできなかった（図1D；補足資料の表S1も参照）が、コントロールウェスタンブロッティング実験により、M1タンパク質とその変異体が適切に発現していることが確認された（図S1）。M1 T108Eリン酸化体模倣SC35M変異体は救済することができ（図1C、表S1）、MLE-15細胞の多サイクル複製アッセイにおいて野生型（WT）SC35Mと比較して複製効率がわずかに低下したのみであった（図1D）。M1 T108A保有ウイルスを救済できないことは、I型インターフェロン遺伝子を欠くVero-E6細胞（表S2）またはM1 WTタンパク質がトランスで共発現した場合（データなし）にも生じた（図S2AおよびBを参照）。これらの実験を合わせると、制御されたM1 T108リン酸化の機能的関連性が強く示唆された。
図1

図1 M1 T108のリン酸化は、ウイルスのレスキューに必要である。(A）IAVのM1タンパク質の機能ドメインを模式的に示す；NLSおよびジンクフィンガー（ZF）モチーフを示す。(B）M1のT108リン酸化変異体と、このリン酸化の発生（T108A）または可逆性（T108E）への影響を模式的に表示したものである。(C）リコンビナントSC35Mの作製と定量を可視化したワークフロー。(D）組換えウイルスを293T/MDCK-II細胞で作製し、MLE-15細胞（MOI）＝0.001に感染させるために使用した。ウイルス上清を指示された時点で採取し、ウイルス力価を病巣アッセイにより決定した。ウイルス力価を示し、バーは3回行った独立した実験から得られた平均±標準偏差（SD）を示す。 n.s.は有意でない。
補足資料
表S1
SC35M WTおよびM1 T108変異体によって形成された病巣の数および形態。8プラスミドでトランスフェクトした293T/MDCK-II細胞からの上清をMDCK-II細胞に継代し、次いで連続1:10希釈を行った。これらを、図1Cに模式的に示すように、96ウェルプレートで増殖したMDCK-II細胞に感染させるために使用した。1日後、細胞をモノクローナルIAV抗NP抗体および西洋わさびペルオキシダーゼ標識二次抗体で免疫染色し、その後発色現像し、BioSys Bioreaderで画像スキャンした。Sheet 1は3つの独立した実験からの病巣の数を示し、Sheet 2は染色されたプレートを表示する。Table S1 をダウンロード（XLSX ファイル、2.7 MB）。
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補足資料
表S2
SC35M WTおよびM1 T108変異体が形成した病巣の数と形態。8プラスミドをトランスフェクトした293T/Vero-E6細胞からの上清をVero-E6細胞に継代し、その後1:10連続希釈を行った。これらを用いて、図1Cに模式的に示すように、96ウェルプレートで増殖させたVero-E6細胞に感染させた。1日後、細胞をモノクローナルIAV抗NP抗体と西洋わさびペルオキシダーゼ標識二次抗体で免疫染色し、その後発色現像し、BioSys Bioreaderで画像スキャンした。Sheet 1は3つの独立した実験からの病巣の数を示し、Sheet 2は染色されたプレートを示す。Table S2, XLSX ファイル、2.3 MB をダウンロードする。
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補足資料
図 S1
M1 T108の置換は、M1タンパク質の発現量に影響を及ぼさなかった。293T細胞に、WT M1またはそのリン酸化欠損型もしくはリン酸化模倣型とともにSC35Mゲノムを発現するようにトランスフェクトを行った。12時間および24時間p.t.で溶解した細胞からの抽出物を、示されるように、タンパク質発現について免疫ブロッティングによってさらに分析した。図S1、PDFファイル、0.1 MBをダウンロードする。
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補足資料
図S2
レスキュー実験。(A）293T/MDCKII細胞を、M1 WTとM1 T108Aを一緒に共導入するアプローチにおいて双方向性pHW2000プラスミドを用いてSC35Mゲノムを発現するようにトランスフェクトした。上清に含まれるIAVは滴定によってさらに特徴づけられ、ウイルス子孫は模式的に示すように個々のプラークから単離された。12個のプラークを精製し、その後、PCRを用いたM1遺伝子の増幅と配列決定を行った。(B）配列決定実験の結果を示す；T108コドンはボックスで囲んだ。図S2、PDFファイル、0.2 MBをダウンロードする。
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M1 T108のリン酸化が制御されていることは、M1の核局在とvRNPの効率的な核外輸送に不可欠である。
M1 T108はM1タンパク質のNLS（アミノ酸101から105）の近くに位置していることから、このリン酸化がM1の核内移行とその後のM1依存的なvRNPの核外輸送を制御する機能の可能性を探った。M T108A変異体を発現する組換えウイルスがない場合、293T細胞にWT M1またはそのT108リン酸化変異体を含むすべてのSC35Mタンパク質を発現するプラスミドを8個トランスフェクトさせた。間接免疫蛍光法により、トランスフェクション後12時間（h.p.t.）にWT M1が細胞質および核に局在することが明らかになった（図2A）。発表されたデータ（33-35）と一致するように、WT M1は18時間後に主に核で検出され、その後の時点では細胞質および細胞膜の近傍に局在した（図2A）。これとは対照的に、M1 T108A変異体は、トランスフェクション後のすべての時点で核からほとんど排除されていた。M1 T108E変異体の時間依存的な分布は、WT M1タンパク質とほぼ同様であったが、間接免疫蛍光法（図2A）およびその定量分析（図2B）により、36時間後には細胞質局在が増加したことが確認された。vRNPの核外輸送にM1が寄与していることが知られていることから（11, 36）、vRNPの最も豊富なタンパク質でありvRNP局在の代理として広く用いられているNPタンパク質の局在に対するM1リン酸化の影響を評価した(37-39)。WT M1タンパク質を発現する細胞は、12時間後にNPタンパク質の大部分が核内にあることを示した（図2CおよびD）。6時間後、NPタンパク質は核周辺に達し、その後の時点（24時間および36時間）では、先に述べたように細胞質へ輸送された（40）。M1 T108Aを発現する細胞は、24時間後には核周辺部にNPタンパク質が濃縮されていたが、その後の時点ではその核内輸送が著しく阻害された（図2CおよびD）。M1 T108Eを発現する細胞では、NPタンパク質の細胞質局在が減少した（消失したわけではない）ことから、M1のT108での制御されたリン酸化がvRNPの核輸出に重要であることが示唆された。これらの知見を独立した実験的アプローチで実証するために、細胞分画実験を行った。細胞は免疫蛍光分析と同じ条件でトランスフェクトされ、細胞質（C）、核小体（N1）、クロマチン（N2）抽出液に分画された。これらの実験により、M1 T108AおよびM1 T108Eの存在下では、クロマチン画分にNPが保持されるとともに、M1 T108Aが主に細胞質側に局在していることが確認された（図2E）。
図2

図2 M1 T108のリン酸化は、M1の核内移行とvRNPの核外移行に寄与している。293T細胞を、SC35Mの8プラスミド逆遺伝子系を用いてトランスフェクトし、WTまたは変異M1の細胞内局在を、示されるように免疫蛍光法によって決定した。核はHoechst 33342（青色）で染色した。写真は2つの独立した実験の代表である。(B）2つの独立した実験のそれぞれを、100個の健全な間期細胞を分析することによって、M1の細胞内分布について別々に分析した。(CおよびD）NPの細胞内局在を分析したことを除いて、パネルAおよびBについて説明したように、実験を行った。(E) 293T細胞に、免疫蛍光解析と同じ条件、またはコントロールとして空ベクター（EV）をトランスフェクトし、その後、図のように36時間p.t.後に分画を行った。(上）分画は、ウイルスタンパク質の分布をイムノブロッティングで解析し、チューブリン（C）、PARP（N1）、ヒストンH3（N2）のブロッティングで分画の純度を管理した。(下）パネルEからの3つの独立した実験により、様々な画分中のM1およびNPタンパク質量を定量化した。相対値は、画分マーカーの発現レベルに正規化した；平均±平均の標準誤差（SEM）が示されている。
M1の多量化は、T108リン酸化によって制限される。
次に、M1のリン酸化が、感染の後期に見られる膜近位空間への局在とどのような関連性があるかを調べた（41, 42）。これは、ピギーバック機構を介してM1の細胞膜領域への輸送を補助するM2タンパク質でコスト染色することにより、間接的なアプローチで行われた（15）。ヒト293T細胞に、WTまたはphospho変異型M1タンパク質を含む全てのSC35Mタンパク質を発現する8種のプラスミドをトランスフェクトし、M1およびM2タンパク質の細胞内局在を間接免疫蛍光法により検出した。M1タンパク質とその変異体は、膜近位空間においてM2タンパク質と共局在したが、M1 WTとM1 T108Eの大部分は核に局在した（図3A）。
図3

図3 M1 T108がない場合、リン酸化によりM1重合が促進される。(A）293T細胞を、WTまたは変異型M1を発現するSC35Mの8プラスミド逆遺伝子系でトランスフェクトした。細胞は24時間後に固定し、M1（緑）とM2（赤）の局在を解析した。核はHoechst 33342（青）で染色し、共局在の領域は黄色で表示される。写真は3つの独立した実験の代表的なものである。(B,左)M1ポリマー(PDB 1EA3)内のM1 T108の位置を赤で示した。(右）モノマー-1のT108は、隣接するモノマー0のヘリックス8に含まれるS157からわずか3.8Åしか離れていない。(C and D) 293T細胞に8プラスミド逆遺伝子システムを用いてトランスフェクトし、1日後に細胞を架橋剤DSG (2 mM) (C) またはDSS (2 mM) (D)で処理した。細胞溶解液は、特異的抗体を用いたウェスタンブロッティングにより分析した。単量体タンパク質は矢印で示されるが、多量体タンパク質はアップシフトしたスミアとして表示される。分子量マーカーの位置が示されている。
M1が細胞膜に結合すると、他の単量体との親和性が高まる結果、オリゴマー化が起こり、最終的にビリオンに構造的な完全性と安定性を与える(43-45)。M1のT108の位置は、M1-M1相互作用の制御における役割の可能性を示唆した（図3B）(18, 19)。M1 T108のリン酸化がM1重合に与える影響の可能性を調べるために、架橋実験を行った。293T細胞にSC35Mゲノムをトランスフェクトし、WT M1またはそのリン酸化欠損型もしくはリン酸化模倣型M1と一緒に発現させた。近接したタンパク質を、スペーサーアームの長さが異なる2種類の膜透過性二官能性リジン-リジン架橋剤、すなわちジスクシンイミジルグルタレート（DSG）またはジスクシンイミジルスベラート（DSS）を用いて架橋させた。架橋後、ウェスタンブロッティングによりM1の多量体形成が確認され、架橋したタンパク質種は複数のアップシフトしたバンドとして現れた。M1 T108Aタンパク質は、DSG（図3C）やDSS（図3D）で架橋した後に自己会合が強くなり、動的リン酸化がM1の多量体形成能力を制限していることが示された。
M1の相互作用を調べると、STRIPAK複合体との結合が明らかになった。
M1のT108リン酸化の制御がタンパク質間相互作用に及ぼす影響の可能性を、偏りのないアプローチで調べるために、図4Aに示すように、質量分析によってM1インタラクトームを同定することを目指した。293T細胞に8種類のプラスミドを導入し、SC35MゲノムをWT M1またはそのT108リン酸化変異体と一緒に発現させた。12時間または24時間後に細胞溶解物を調製し、抽出物の1アリコートを対照ウエスタンブロットアッセイに使用して同等のM1発現を確保し（図S3）、残りの材料を共免疫沈降（co-IP）および質量分析によるさらなる分析に使用した。つの独立した生物学的実験からの結果を表S3に示し、タンパク質発現の24時間後に、特異的M1相互作用体の数は、12時間p.t.後に見出された相互作用体の数に比べてはるかに大きいことを示した（図4B）。そこで、タンパク質発現24時間後にM1 WTと有意に（P≦0.05）結合する相互作用因子に着目してさらに解析を行った（Fig. 4C）。これらの57の有意な相互作用因子は異なる機能カテゴリーに割り当てることができ、最も大きなグループはタンパク質の翻訳とフォールディングを仲介するタンパク質からなり、さらに代謝の調節や細胞骨格の構成要素に関与するグループがあった（図4D）。これらはすべて、IAV感染やIAVコードポリペプチドへの結合タンパク質による影響が知られている機能カテゴリーを表していた（22、46-49）。ここで同定されたM1相互作用因子の中には、RPS3（50）、PHGDH（51）、RPS26（52）など、インフルエンザウイルス複製に寄与することが知られているものがある。また、STRIPAK複合体は、神経細胞や胚の発生、増殖、細胞の生存など多くの生理的プロセスに関与しているが、ウイルス複製における役割は不明であった（53, 54）。これらのデータを総合すると、M1は、制御因子STRIPAK複合体のメンバーを含む多くの宿主細胞タンパク質と相互作用していることがわかる。STRIPAK複合体とM1の相互作用を調べるために、我々はインタラクトーム解析で同定され、STRIPAK複合体全体を組織化する中心プラットフォームとして働くストリアチンファミリーのメンバー、ストリアチン（STRN）およびストリアチン-3（STRN3）に注目した（28）。STRNとSTRN3のM1タンパク質への結合は、ヒト293T細胞またはマウスMLE-15細胞にSC35Mウイルスを感染させた後、co-IPを用いた相補的な実験アプローチによっても観察された（図4E）。
図4

図4 M1インタラクトームの同定。(A) M1 WTまたはそのT108リン酸化変異体に結合するタンパク質を同定するために用いた実験セットアップの模式図表示。SC35Mをコードする8つのプラスミドをM1 WT、M1 T108A、またはM1 T108Eと共に発現させた293T細胞を溶解した。ライセートのアリコートをイムノブロットに用いてM1の適切かつ同等の発現を確認し、残りの材料を抗M1抗体または非特異的対照ウサギIgGを用いたco-IPに供した。免疫沈降物はその後、質量分析に供された。データは3つの生物学的複製から取得された。(B）12時間または24時間後にM1と相互作用するタンパク質をIgGコントロールと比較して同定し、M1との特異的相互作用は、統計的に有意な方法で≧1のLFCで起こると定義した（P ≤ 0.05）。これらの解析により、両時点でM1相互作用体が得られた。比較をベン図に示す。(C) M1 WTを24時間p.t.発現させた細胞のM1インタラクトームは、Volcanoプロットを用いてIgGコントロールと一対一で比較した。特異的なM1インタラクター（LFC of ≥1; P ≤ 0.05）を赤で示し、M1を緑で強調表示した。(D) STRINGデータベース（バージョン11.5）を用いて、M1相互作用体間の既知および予測される相互作用を明らかにした；タンパク質は、示されるように、その生物学的機能に従ってグループ化された。(E） SC35Mを感染させた293T細胞またはMLE-15細胞（MOI = 1）を6 hpiで採取し、細胞ライセートを調製した。ライセートの1画分を入力コントロールとして使用し、残りの材料を、示されるように、抗M1抗体を使用するco-IP実験に使用した。示されたタンパク質は、特定の抗体を用いたウェスタンブロッティング分析によって検出された。
補足資料
表S3
co-IP MS 実験の概要。SC35Mをコードする8つのプラスミドをM1 WT、M1 T108A、またはM1 T108Eと共に発現する293T細胞を溶解し、抗M1抗体または非特異的コントロールのウサギIgGを用いてco-IPに供した。免疫沈降物は、その後、質量分析に供された。データは3つの生物学的複製から取得した。詳細は本文を参照。Table S3、XLSXファイル、2.3 MBをダウンロードする。
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補足資料
図S3
質量分析による解析前のM1発現の品質チェック。SC35Mをコードする8つのプラスミドをM1 WT、M1 T108A、またはM1 T108Eと共に発現させた293T細胞を溶解した。材料の90％は、図4の凡例に記載されているように、co-IPおよび質量分析に使用されたが、ここで分析された残りの材料は、M1の同等かつ適切な発現を確実にするためにイムノブロッティングに使用された。3つの生物学的複製物すべてからの結果が示されている。図 S3、PDF ファイル、0.1 MB をダウンロードする。
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M1 T108リン酸化によるタンパク質間相互作用とSTRIPAK結合のダイナミックな制御。
次に、T108リン酸化がない場合と構成的な場合のM1インタラクトームへの影響を比較した。M1 WTとM1 T108Eのインタラクトームを比較すると、このウイルスタンパク質のリン酸化模倣バージョンは、インタラクター結合能力をほとんど失っていることがわかった。一方、M1 T108A変異体は、細胞内タンパク質と相互作用する能力が高まっていた（図5A）。これらの相互作用物質は、M1 WTと結合するタンパク質のほとんどを占めていたが、さらにM1 T108Aタンパク質は、WTの高親和性M1相互作用物質のグループには属さない110のタンパク質と結合した（図5B）。Metascapeソフトウェアを用いて、M1 WTと相互作用するタンパク質をGO/KEGGパスウェイにマッピングしたところ、これらのタンパク質がタンパク質合成や代謝調節などの機能を担っていることが明らかになりました。さらに、パスウェイマッピングの結果、M1 T108Aとさらに相互作用するタンパク質は、インターロイキン12経路の制御やタンパク質の折り畳みに関与していることが明らかになった（図5C）。12時間p.t.で見つかったM1相互作用体の数が少ないため、リン酸化がタンパク質-タンパク質相互作用に及ぼす影響について、統計的に確実な結論を導き出すことはできなかった。ボルカノプロットによるタンパク質-タンパク質相互作用データの解析から、STRIPAK複合体のすべてのメンバーがM1 WTタンパク質と優先的な相互作用を示すことが示された。個々のSTRIPAK構成要素の結合は、この修飾のダイナミクスに欠陥のあるM1変異体（T108E）に対して有意に減少し、M1 T108Aとの会合に対してはわずかに減少した相互作用が見られた（図6A）。M1 WTとSTRNおよびSTRN3との優先的な相互作用は、相互作用パートナーの一過性発現後のco-IP実験によっても再現された（図6B）。
図5

図5 M1のT108リン酸化は、M1と他のタンパク質との相互作用を損なわせる。(A）M1WTを発現する細胞とM1T108AまたはM1T108Eを発現する細胞からのインタラクトームのペアワイズ比較を描いたボルケーノプロット（LFC、≥1；P≤0.05）。(B) M1 WTとそのリン酸化変異体へのタンパク質結合の重なりを可視化したベン図。(C) M1との相互作用が豊富なタンパク質の過剰発現解析。括弧内の数字は、パネルBに示したタンパク質セットに対応する。
図6

図6 STRNおよびSTRN3のM1 WTへの優先的な結合。(A）M1WTを発現する細胞とM1T108AまたはM1T108Eを発現する細胞からのインタラクトームのペアワイズ比較（LFC、≧1；P≦0.05）。STRIPAK複合体のメンバーは赤でハイライトされ、M1は緑で示されている。(B）293T細胞は、示されるようにWTまたは変異M1を発現するSC35Mの8プラスミド逆遺伝子系でトランスフェクトされた。12時間または24時間後にライセートを調製し、そのうちの1部をインプットコントロールに使用した。残りの材料は、示されるように、M1抗体またはIgGコントロールを用いたco-IPに供された。発現・沈殿したタンパク質は、特異的抗体を用いたウェスタンブロッティング分析により検出した；代表的な実験を示す。
IAVによるSTRNとSTRN3の再局在化。
M1と両ストライアチンの共局在の可能性を調べるために、293T細胞にSC35Mを感染させ、間接免疫蛍光法でタンパク質の細胞内局在を明らかにした。STRNは主に非感染細胞の細胞膜に検出された(55, 56)。IAVの感染により、このアダプタータンパク質は細胞質および核周辺構造へと劇的に再分布し、そこでM1と部分的に共局在化した（図7A）。STRN3もまた、IAVに誘導されたダイナミックな再局在化が起こった。非感染細胞では細胞質タンパク質として存在していたが（57）、IAV感染により4時間後より核周囲にSTRN3クラスターが形成された（図7B）。感染が進むにつれて、これらのドメインは継続的にサイズと密度が増加し、図5Cに表示され、図5Dに定量化されているように、核周囲の空間の片側に非対称に濃縮された超クラスターを形成した。STRN3とM1の共局在は、これらのスーパークラスターと同様に核周辺腔で最も顕著であった。これらの実験はSTRNとSTRN3のIAVによる再局在化を示したので、逆にこれらのアダプタータンパク質がIAV複製に影響を与えるかどうかを調べることは興味深いことであった。
図7

図7 IAVによるSTRNとSTRN3の再局在化。(A）293T細胞をSC35M（MOI＝2）に、示したように様々な期間感染させた。STRNとウイルスタンパク質M1を間接免疫蛍光法で検出し、核をHoechst色素で核DNAを染色することによって明らかにした。2つの独立した実験からの代表的な共焦点画像を示す。黄色い部分は共焦点を示し、枠で囲まれた部分は6倍で表示されている。2つの独立した実験からの代表的な共焦点画像は、STRNとウイルスM1タンパク質の間の細胞内の共焦点を示す。(B) M1をSTRN3でコスト染色したことを除いて、パネルAについて説明したのと同じ実験を行った。(C）画像あたりのSTRN3パンクタの数の定量化。データは、条件ごとに少なくとも150個の細胞が定量化された1つの代表的な実験からの平均±SDである。A.U.、任意単位。
STRNおよびSTRN3を介したIAV感染のサポート。
STRNまたはSTRN3の過剰発現は、SC35M力価の増加をもたらしたが、両蛋白の複合発現は、ウイルス複製のさらなる増加をもたらさなかった（図8A）。補完的なアプローチとして、MLE-15細胞または293T細胞において、両アダプタータンパク質の役割を調べた。両タンパク質は、低分子干渉RNA（siRNA）を用いてノックダウンされた。STRNまたはSTRN3単独の欠失はSC35Mの複製に影響を与えなかったが、STRNとSTRN3の複合ノックダウンはウイルス力価の低下をもたらし、STRNおよびSTRN3のプロウイルス機能を確認した（図8B、図S4）。ノックダウンが成功したことを確認する対照のウェスタンブロット実験では、STRNのダウンレギュレーションはSTRN3量の増加をもたらし、逆にSTRN3のダウンレギュレーションはSTRN量の増加をもたらした(図8C)。この挙動は、多タンパク質複合体において頻繁に観察される特徴である、両方のアダプタータンパク質の相互代償機構を示唆している（58, 59）。また、これらのブロットとその定量分析から、ダブルノックダウンにより、ウイルスタンパク質（M1、NS1、NP）のレベルがわずかではあるが有意に減少することが示された（図8C）。STRNとSTRN3のIAV複製への関連性は、2009年のパンデミックを引き起こしたヒトIAVサブタイプA/Hamburg/4/09（H1N1pdm09）に感染した細胞でも見出された(60)。このモデルでも、STRNとSTRN3を同時にノックダウンすると、ウイルス力価が低下し、ウイルスタンパク質の発現がわずかに減少した（図S5）。このことから、STRIPAK複合体のウイルス支援機能は、あるIAV株だけに限定されないことが示された。そこで、STRNとSTRN3を介したIAVの複製支援の分子機構を調べることにした。STRNおよびSTRN3のノックダウンにより、SC35M感染細胞ではM1の多量体形成が著しく阻害された（図8D）。
図8

図8 STRN-およびSTRN3を介したIAV複製の支援。(A）STRNまたはSTRN3を発現するようにトランスフェクトした293T細胞、またはコントロールとして空ベクター（EV）。(上）細胞の1画分をSC35Mに感染させ（MOI = 0.001）、表示された時点でウイルス力価を測定した。棒グラフは、三重に行った3つの独立した実験から得られた平均値±SDを示す。*, p ≤ 0.05; **, p ≤ 0.01. (下）細胞の別の画分を、STRNまたはSTRN3の発現についてイムノブロッティングにより分析した。(B）MLE-15細胞を播種し、1日および3日後に、STRNまたはSTRN3をコードするmRNAを標的とするsiRNAまたは示されるように適切なスクランブル対照でトランスフェクションした。(左）3日後の細胞は、示されるように、未処理のまま、またはSC35M（MOI = 0.001）に感染させた。細胞をSC35M（MOI = 0.001）に感染させ、細胞培養上清のウイルス力価を示された時点で測定した。棒グラフは、三重に行った3つの独立した実験から得られた平均値±SDを示す。*はP≦0.05、はP≦0.01、unpaired t test。(C) パネルBで生成されたノックダウン細胞は、示されるように、ウイルスタンパク質の適切なノックダウンおよび発現についてウェスタンブロッティングにより試験された；非特異的バンドの位置は、アスタリスクで強調されている。下段は、3つの独立した実験の定量化を示す；コントロールにおける発現は1とし、平均±SEMを示す。(D）293T細胞におけるSTRNおよびSTRN3の発現をsiRNAによるノックダウンにより低下させ、細胞をSC35Mに感染させた（MOI＝3）。(左）6 hpiで、細胞をDSGで処理し、ライセートを図3CおよびDと同様にウェスタンブロッティングによってM1多量化について分析した。（右）3つの独立した実験を用いて、単量体M1タンパク質に対する重合体の強度比を計算するために使用した。平均値±SEMを示した。(E）本研究で調べたM1 T108リン酸化の可能な機能を模式的にまとめた。M1 T108リン酸化は、M1の完全な核輸入とvRNPの核輸出に必要であり、STRIPAK複合体によっても制御されているM1のホモポリマー化の能力に影響を与える。
補足資料
図S4
293T細胞におけるSC35M複製に対するSTRNおよびSTRN3の効果。STRNおよびSTRN3の発現は、特定のsiRNAを用いたノックダウンにより減少した。細胞はSC35Mウイルスで感染させ（MOI = 0.001）、ウイルス力価を表示された時点で測定した。棒グラフは、3回行った独立した実験から得られた平均値±SDを示す。, P ≤ 0.01. 図 S4、PDF ファイル、0.1 MB をダウンロードする。
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補足資料
図S5
H1N1pdm09の複製に対するストリアチン複合体の効果。MLE-15細胞を播種し、1日後および3日後に、Strn/Strn3をコードするmRNAを標的とするsiRNA、または示すように適切なスクランブル対照でトランスフェクションした。(左）細胞の1画分をSC35Mに感染させ（MOI = 0.001）、細胞培養上清のウイルス力価を示した時点において測定した。棒グラフは、三重に行った3つの独立した実験から得られた平均値±SDを示す。*はP≦0.05、*はP≦0.01、unpaired t testによる。(右）細胞の残りの画分を溶解し、ウェスタンブロッティングにより、示されるようにウイルスタンパク質の十分なノックダウンと発現を試験した。非特異的なバンドの位置は、アスタリスクで強調されている。下段は、3つの独立した実験からのタンパク質発現の定量化を示す。コントロールの発現を1とし、平均値±SEMを示した。図S5をダウンロード、PDFファイル、0.2 MB。
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解説
M1タンパク質は、ビリオンの完全性の維持、ウイルス転写の抑制、vRNPの核輸出の補助、ウイルスの組み立てと出芽の補助など、様々な機能を発揮する多機能な「スイスアーミーナイフ」として機能している（11, 42, 61）。したがって、このウイルスタンパク質は、異なる細胞内局在で見出され、局在や感染サイクルの段階に応じて、異なる細胞タンパク質やウイルスタンパク質と相互作用する必要がある。この機能的多様性は、生化学的なレベルでは、内在する構造の柔軟性（20, 61）、可逆的な組み立てと分解の能力、制御されたPTMの発生によって反映されている。これらの修飾は、ウイルス複製（Neddylation）やvRNP核外輸送（ubiquitination）など、多くの異なるM1機能に影響を与えている（27, 62）。M1の多くのアミノ酸についてリン酸化が報告されているが（26, 32, 33, 63）、リン酸化部位が深く解明されているのはごくわずかである。例えば、Y132でのM1リン酸化は、M1の核内移行を制御する(33)。このリン酸化は、感染後期にヤヌスキナーゼによって媒介され、おそらくM1の脂質ラフト局在と出芽ビリオンへの効率的なvRNP組み込みを促進する構造変化を誘発する（23）。私たちの研究から、M1の多量化の制御にはT108のリン酸化が関与しており、おそらくモノマー0のT108と相互作用する+1モノマーのヘリックス8に含まれるS157との相互作用を阻害することによって、M1の多量化を制御していることが明らかになった。M1の多量化は、N末端領域の既知のリン酸化部位（S2/T5とT9/Y10）によっても制限されるが（45）、M1多量化におけるこれらの潜在的役割についての実験的証明はまだ得られていない。我々は、T108やその他の残基のリン酸化によって、シグナルに導かれ、制御され、可逆的にM1の多量体形成状態を制御することができると考えている。このような機構は、感染初期にエンドソーム表面からM1シェルを放出し、核輸入を妨げるような早すぎる多量化を抑制し、細胞膜での多量化の適切なタイミングを可能にすることに寄与することができる。このモデルは、このリン酸化の発生（M1 T108A）または可逆性（M1 T108E）の欠陥が、なぜ機能不全を引き起こすのかを説明するものである。M1 T108A変異体の多量体化は、核内移行を阻害するだけでなく、M1 T108A変異体が相互作用分子のスペクトルを増加させる理由も説明できる可能性がある。したがって、M1インタラクトームを、タイムリーに、空間的に分解して、そのオリゴマー化状態に依存して定義することは、今後の重要な課題である。これらのパラメータは、M1インタラクトームの定義基準であり、過去のM1インタラクトーム研究が極めて異質な結果をもたらした理由にもなっている(64)。したがって、M1相互作用タンパク質をより深く理解するためには、近接ライゲーションアッセイなど、無傷の細胞内でタンパク質間相互作用を決定できる実験的アプローチが必要である(65)。
今回発見されたSTRIPAK複合体の構成要素とM1の結合は、核の外側では膜近位部および細胞質部の異なる領域で起こり、STRN3はM1と非対称だが未定義の超集団で共局在している。このような非対称な分布はRAB11エンドソームでも報告されているが（66）、STRIPAK複合体のメンバーはゴルジ装置、核膜、オートファゴソーム、ミトコンドリア、細胞膜など非常に多くの異なる細胞区画で発見されている（53）。このような分布から、STRIPAKはこれらの異なるオルガネラをつなぐ橋渡し複合体として機能していることが示唆されている(67)。IAVによる細胞内STRNおよびSTRN3局在の再分布の分子機構は明らかではなく、IAV感染時に起こるアクチンおよびチューブリン細胞骨格の大規模な再編成に依存しているのかもしれない(68)。注目すべきは、STRIPAKサブコンプレックスがアクチンの集合を支配することであり（53）、M1もまたアクチンの相互作用パートナーとして見いだされている（49）。M1とSTRIPAK複合体の相互作用は、M1由来のシグナル伝達事象をSTRIPAKが制御するネットワークに伝達することを可能にするかもしれず、今後の検討が必要である。STRIPAK非存在下でのウイルス力価の低下は、IAVポリメラーゼ活性の変化にもvRNP核内輸送の変化にも起因しない（図S6AおよびB）。IAV複製に対するSTRIATIN複合体の寄与は、図8Eに模式的に示すように、おそらく関連するPP2Aホスファターゼを介してM1の脱リン酸化を補助することによって、M1多量体化を支援することである。STRIPAK関連キナーゼによるM1 T108のリン酸化は考えにくい。さもなければ、STRNとSTRN3のノックダウンにより、M1 T108のリン酸化が起こらず、ウイルスの複製と相容れないことになるからである。M1 T108 LKREI(T)FHGAKEリン酸化部位の周辺配列は、PKCファミリーメンバーのPDK1やPKN1のようなAGCキナーゼ群に属するキナーゼによってリン酸化される可能性が高く、このキナーゼは-3位のK/Rと+1位のFを含むモチーフを優先的にリン酸化する(69)。したがって、関連するキナーゼの同定は、IAV感染中の個々のステップの薬理学的標的化を可能にする重要な将来の課題であり、これは抗ウイルス介入のための新しい戦略を可能にするための重要な将来の目標である。
補足資料
図S6
ポリメラーゼ活性およびウイルスタンパク質の局在化に対するSTRNおよびSTRN3の効果。(A）293T細胞において、特定のsiRNAでノックダウンすると、STRNおよびSTRN3の発現が減少した。(左）ノックダウン後、レポーター遺伝子をコードするPol Iプロモーター駆動のウイルスRNA様転写物をpCAGGSプラスミドとともに発現するように細胞をトランスフェクトし、指示されたウイルスタンパク質をコードするmRNAの発現を可能にした。1日後、細胞を採取し、ホタル・ルシフェラーゼ（vRNPポリメラーゼ活性により生成）およびレニラ・ルシフェラーゼ（正規化に使用）の活性を測定した。WT vRNPの活性は100％とした。エラーバーは3つの独立した実験からのSEMを表す。n.s., not significant. (右）細胞の一部は、示されるようにノックダウンが成功したかどうかイムノブロッティングによって分析された。(B）siRNA処理された細胞の別の画分をSC35M（MOI＝3）により感染させ、示されたタンパク質の細胞内局在を、示されたように間接免疫蛍光により決定した。核はHoechst 33342で染色した（青）。写真は2つの独立した実験の代表である。図S6をダウンロード、PDFファイル、0.4 MB。
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材料と方法
抗体、プライマー、プラスミド
本研究で使用した抗体、プライマー、プラスミドは、補足資料の表S4に記載されている。
補足資料
表S4
本研究で使用した抗体、プライマー、およびプラスミド。表S4、DOCXファイル、0.02 MBをダウンロードする。
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細胞培養とsiRNAのトランスフェクション
ヒト胚性腎臓293 T細胞、マディン・ダービーおよびイヌ腎臓細胞（MDCK-II）、Vero-E6細胞、およびマウスMLE-15肺上皮細胞を、10％（vol／vol）ウシ胎児血清、100 U／mLペニシリンおよび100 μg／mLストレプトマイシン添加ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）において培養した。細胞は、5% (vol/vol) CO2を含む加湿雰囲気中、37℃のインキュベーターで培養した。ヒトまたはマウスのSTRNおよびSTRN3を標的とする予め設計されたsiRNAを、製造業者のプロトコルに従ってOpti-MEM（Life Technologies）で希釈したLipofectamine 3000（Invitrogen）を用いてMLE-15細胞にトランスフェクションした。培地を24時間p.t.の新鮮な増殖培地に交換し、その後、最初のトランスフェクションから48時間後に、同じプロトコルを用いて細胞を2回目のトランスフェクションを行った。感染または溶解およびウェスタンブロッティングのいずれかに先立って、細胞をさらに37℃で48時間インキュベートした。
組換えIAVの作製。
WT SC35MウイルスおよびそのM1変異体は、他の場所で記載されている双方向性pHW2000プラスミド逆遺伝学システムに基づく8つのプラスミドのセットを用いて生成した(32)。108位で変異したM1をコードするプラスミドは、部位特異的変異誘発によって作製した。293T細胞およびMDCK-II細胞の共培養（比3：1）を70％コンフルエンスまで増殖させ、Opti-MEM（Life Technologies）およびLipofectamine 2000（Invitrogen）を用いることによって8つのウイルスセグメントをコードする各プラスミド1μg DNAでトランスフェクションさせた。SC35M M1 T108A変異体のレスキューは、293T細胞にM1 T108A（1μg）をWT M1（0.5μg）と共発現する9つのプラスミドをトランスフェクトした際にも試みられた。培地を6時間p.t.除去し、0.2％（wt/vol）ウシ血清アルブミン（BSA）、100U/mLペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシン（ライフテクノロジー）を補足した新鮮なDMEMを添加した。細胞培養上清を48時間後に採取し、遠心分離により細胞残渣を除去した。各上清の500μLアリコートをMDCK-IIまたはVero-E6細胞の接種に用い、これを48〜72時間インキュベートした。これらの細胞から救出したウイルスは、96ウェルプレートのMDCK-IIまたはVero-E6細胞のフォーシーズ・アセイによって滴定し、さらに使用するまで-80℃で保存した（他に記載あり）（70）。
プラーク精製およびM1配列決定。
M1 WTおよびM1 T108A変異体を共発現する9つのプラスミドでトランスフェクトした293T細胞からのウイルス含有培養上清を、病巣アッセイにより分析した。6ウェルディッシュのMDCK-II細胞のモノレイヤーをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、感染培地（0.2％［wt/vol］BSAおよびペニシリン-ストレプトマイシン添加DMEM）中のウイルス含有上清および種々の10倍連続希釈液を感染させて、37℃で1時間インキュベートした。ウェルを吸引して残留ウイルス接種物を除去し、MDCK-II細胞を2mLの1×アガロースオーバーレイ混合液（ペニシリン-ストレプトマイシン添加最小必須培地、0.4%[wt/vol] BSA、1%[wt/vol] アガロース）でオーバーレイさせた。寒天オーバーレイが固化した後、プレートを37℃、5% CO2で2日間逆さまにしてインキュベートした。精製したプラークからウイルスを増殖させるためにMDCK-II細胞に感染させるためにプラークを採取した。ウイルス感染細胞の上清の140μLアリコートから、QIAamp viral minikit（Qiagen、ドイツ）を用いて、製造業者のプロトコルに従って、ウイルスRNAを抽出した。抽出したウイルスRNAを、SuperScript IV One-Step reverse transcription-PCR (RT-PCR) system (Invitrogen) を用いて、1回の反応で逆転写し、PCRで増幅させた。簡単に言うと、7.5μLの抽出したウイルスRNAを、25μLの2×Platinum SuperFi RT-PCRマスターミックス、0.5μLの酵素ミックス、およびM1特異的プライマー（各0，4μM）と混合した。ヌクレアーゼフリー水を用いて全量を50μLに調整し、55℃、10分間のcDNA合成に供し、その後、予備変性（98℃、2分間）およびPCR増幅を行った。SC35M M1遺伝子を含む異なるPCR産物をアガロースゲルから精製し、塩基配列を決定した。
ウイルスの増殖、感染、および力価の決定。
293TおよびMLE-15細胞を、PBS++/BSA（0.2％［wt/vol］BSA、1 mM MgCl2、0.9 mM CaCl2、100 U/mL penicillinおよび100 μg/mL streptomycin を含むPBS；Life Technologies）中でIAV SC35M（H7N7）ウイルスまたはA/Hamburg/4/09（H1N1）に示したMOIで感染させた。MLE-15細胞へのマルチサイクル増殖のための感染は室温で1時間、シングルサイクルのウイルス複製のための感染は氷上で1時間行った。吸着時間後、接種物を除去し、モノレイヤーをPBS++で3回洗浄した。適量の感染培地（0.2% [wt/vol] BSAおよびペニシリン-ストレプトマイシン添加DMEM）を加え、細胞を37℃で指示時間インキュベートした。細胞上清中の感染性粒子は，96ウェルプレートで培養したMDCK-II細胞のフォーサイトアッセイによって定量化した．
間接免疫蛍光法。
293T細胞を、ポリ-L-リジンでコーティングした24ウェルプレート中のカバースリップ上で増殖させた。トランスフェクトまたは感染させた細胞をPBSで3回洗浄し、500μLの4％（vol/vol）パラホルムアルデヒドで室温で8分間固定した。PBSで3回洗浄後、0.5% (vol/vol) Triton X-100で細胞膜を透過させ、ブロッキング液（10% [wt/vol] BSAと0.5% [vol/vol] Triton X-100を含むPBS）で室温で1時間非特異抗体結合をブロッキングした。ウサギ抗M1、マウス抗NP、マウス抗M2、マウス抗STRN、またはマウス抗STRN3一次抗体と、1%（wt/vol）BSAおよび0.5%（vol/vol）Triton X-100を含むPBS中で4℃、16時間インキュベートし、細胞をPBSで3回洗浄して、アレキサフルオロ488およびCy3コンジュゲート二次抗体と室温、1時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を3回洗浄し、DNAを1μg/mL Hoechst 33342で染色した。カバースリップを再度洗浄し、Mowiol mounting medium (Carl Roth)を用いて顕微鏡用スライドにマウントした。スライドは光から保護し、4℃で保存した。
顕微鏡画像の取得。
共焦点画像は、Plan-Apochromat 63×/1.40 oil differential interference contrast M27 対物レンズを装備した Zeiss 共焦点 LSM 710 顕微鏡で取得された。サンプルは、ダイオード（405nm）レーザー、DPSS（561nm）レーザー、またはアルゴン（488nm）レーザーを用いて照明した。Zen Liteシステム（ZEN3.1, Blue edition）を用いて写真を取得し、スケールバーを計算した。STRN3スーパークラスターは、フレームサイズ512×512ピクセル、解像度0.44μm/ピクセルで、0.6のプリズームで各画像について定量化し、さらにImageJで解析した。しきい値は2×バックグラウンド強度に設定し、「粒子の分析」の設定は、サイズ0〜無限大、円形度0.20〜0.50とした。蛍光強度はImageJで定量化し、GraphPad Prism 9で統計解析した。
細胞溶解とco-IP
Co-IPのためにネイティブな条件下で細胞抽出物を調製するために、細胞を1×PBSで1回洗浄し、掻き取りによって収穫し、300×gで3分間遠心分離して回収し、適量のIGEPAL溶解バッファ（20 mM Tris-HCl [pH 7. 4]、150 mM NaCl、1% [vol/vol] IGEPAL CA-630 [Sigma]、10% [vol/vol] グリセロール、1 mM フェニルメチルスルホニルフルオリド、10 mM NaF、0.5 mM オルトバナジン酸ナトリウム、1 μg/mL leupeptine および2 μg/mL aprotin) に浸し、20分間氷上に置いてインキュベートした。ライセートは、4℃、16,000×gで10分間遠心分離して清澄化した。上清は、IP実験に使用するか、5×SDSサンプルバッファと混合して95℃で5分間煮沸し、他で述べたようにウェスタンブロッティングで解析した(71)。細胞質画分、核内可溶性画分、およびクロマチン画分への細胞内分画は、以前に記載したように行った(72)。IPは、1μgの抗M1またはコントロールIgG抗体を25μLのプロテインA/Gアガロースビーズ（Millipore）とともにIGEPAL溶解バッファー中で各サンプルに加えることによって行われた。4℃で4時間回転させた後、ビーズを冷IGEPALバッファで5回洗浄し、さらにウェスタンブロッティングまたは質量分析のために処理した。
質量分析。
磁気）ビーズに結合したサンプルを100μLの0.1M重炭酸アンモニウム溶液で3回洗浄した。タンパク質は、sequencing-grade modified trypsin (Serva)の添加により「オンビーズ」で消化され、37℃で45分間インキュベートされた。その後、上清を新しいチューブに移し、37℃で一晩インキュベートした。Chromabond C18WP spin columns (Macherey-Nagel catalog number 730522) を用いてペプチドを脱塩・濃縮した。最後に、ペプチドを5% (vol/vol) アセトニトリルおよび0.1% (vol/vol) ギ酸を含む水25μLに溶解した。サンプルの質量分析は、timsTOF Pro質量分析計（Bruker Daltonics社製）を用いて行った。質量分析計には、1.7μmビーズ（IonOpticks）を充填したAuroraカラム（25cm x 75μm）C18RPカラムを備えたnanoElute高速液体クロマトグラフィーシステム（Bruker Daltonics）をオンライン接続した。2μLのサンプル量に相当する約200ngのペプチドの一部が分離カラムに直接注入された。サンプルロードは8×103Paの一定圧力で行い、トリプシンペプチドの分離は、カラム温度50℃で、水-0.1% (vol/vol) ギ酸 (溶媒A) とアセトニトリル-0.1% (vol/vol) のグラジエントで行われました。 1%(vol/vol)ギ酸（溶媒B）を流速400nL/minで使用。18分以内に2%(vol/vol)Bから17%(vol/vol)Bまで線形増加し、続いて8分以内に25%(vol/vol)Bまで線形グラデーションし、さらに3分以内に37%(vol/vol)の溶媒Bまで線形増加した。データ解析はMaxQuant (version 1.6.17.0) とAndromeda検索エンジンを用いて行い、UniProtデータベースはアノテーションとタンパク質識別子の割り当てに使用した(73)。さらなる解析にはPerseusソフトウェア（バージョン1.6.14.0）を使用した(74)。強度値はlog2変換した。図4、6、7のt検定結果およびボルカノプロットについては、統計解析を可能にするために、欠損値を最低測定値以下である12でインピュテーションした（すべての実験で唯一の例外があった）。
M1多量体形成の解析
SC35M M1 WTまたはM1 T108A/E変異体を発現する8プラスミド逆遺伝子システムを用いて293T細胞をトランスフェクトし、24時間インキュベートした。ノックダウン実験のために、293T細胞は48時間間隔でsiRNAを2回トランスフェクトされた。回目のトランスフェクションの2日後、細胞をさらにSC35Mウイルス（MOI＝3）に氷上感染させ、37℃で6時間インキュベートした。細胞を冷たいPBSで3回洗浄し、続いて2mMの最終濃度のDSSまたはDSGの添加によって架橋させた。反応混合物を室温で30分間インキュベートした。DSSまたはDSGの除去後、架橋は、20mM Trisを含む900μLのPBSを室温で15分間加えることによってクエンチされた。その後、細胞をPBSで2回洗浄し、SDS-PAGEの前にIGEPALバッファーで溶解させた。
ポリメラーゼ再構成アッセイ。
293T細胞を48時間間隔で2回siRNAでトランスフェクションした。回目のトランスフェクションの2日後、細胞を、ホタルルシフェラーゼをコードするウイルスミニゲノム構築物pHW72-Luci（25ng）およびプラスミド（pCI-neoRenilla-Luci；20ng）とともにSC35M PB2、PB1またはPA（それぞれ125ng）あるいはNP（800ng）コードするpCAGGsプラスミドでさらにトランスフェクションさせた。24時間p.t.で、細胞を収穫し、洗浄し、150μLの1×受動溶解バッファーで15分間溶解させた。ホタルおよびレニラルシフェラーゼ活性は、製造業者のプロトコルに従って、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Promega）を使用して検出した。レニラ活性はデータの正規化に使用した。
定量化および統計解析。
Image Lab 6.0.1 (Bio-Rad) および ImageJ ソフトウェアを、ウェスタンブロットデータの画像取得およびデンシトメトリー分析に使用した。統計解析とグラフの生成には、GraphPad Prism 9 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)を使用した。統計的有意性は、SPSS 19 プログラムを用いた 2 群間比較のための対になっていない Student の t 検定を用いて算出した；≦0.05 の P 値を有意とみなした。特に断りのない限り、エラーバーは少なくとも3つの独立した実験の平均と標準偏差を示す。共焦点顕微鏡写真の処理とスケールバーの計算は、Zen Lite ソフトウェア (ZEN3.1, Blue edition) を用いて行った。タンパク質の構造解析はPyMOL (version 2.4.1.) を用いて行い、STRINGデータベース (version 11.5) を用いてM1相互作用因子間の既知および予測される相互作用を明らかにした。
バイオセーフティ
ウイルス感染は、IAVの増殖に関わるドイツのバイオセーフティ規制に従い、現地当局からその使用を認められたバイオセーフティレベル3の封じ込め実験室（RP, Giessen, Germany）を用いて実施した。
謝辞
抗NP抗体を提供してくれたS. Ludwig (Münster, Germany)、プラスミドを提供してくれたMartin Schwemmle (Freiburg, Germany), Karolien De Bosscher (Ghent, Belgium) およびRina Rosin-Arbesfeld (Tel Aviv, Israel)に感謝します。また、Kerstin Gernert、Yvonne Horn、Markus Schwinnには、優れた技術的支援をいただいた。
L.L.とM.S.が実験を行い、U.L.が質量分析実験を行い、A.W.とM.Kが質量分析データを解析し、M.L.S.が最初のバージョンの原稿を書き、L.L.、S.P、M.Kがその原稿を改訂しました。
我々は、利益相反がないことを宣言する。
本研究は、DFG（ドイツ研究財団）の助成金によって行われた。TRR81/3 (A07, project 109546710); SFB1213/2 (B03, project 268555672); SFB1021/2 (C01 [to M.L.S. and S.P.], project 197785619); GRK 2573 (RP4, project 416910386)の助成金を得た。S.P.の研究はドイツ感染研究センター（DZIF; TTU 01.806）、パートナーサイトGiessen（ドイツ）の助成を受けたものである。M.S.はAlexander von Humboldt Foundation (Georg Forster Research Fellowship)の資金援助を受けている。S.P.は、人獣共通感染症に関する全国的な研究ネットワークであるドイツFluResearchNetのメンバーである。研究助成機関は、研究デザイン、データ収集と分析、発表の決定、原稿の作成に関与していない。
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