腸-肝臓軸の縦断的マルチオミックス解析により、C型肝炎感染と肝硬変における代謝異常が明らかになった

公開：2022年12月15日
腸-肝臓軸の縦断的マルチオミックス解析により、C型肝炎感染と肝硬変における代謝異常が明らかになった

https://www.nature.com/articles/s41564-022-01273-y?mibextid=Zxz2cZ

Rabab O. Ali, Gabriella M. Quinn, ...Theo Heller 著者を表示する
Nature Microbiology (2022)この記事を引用する

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指標詳細

概要
腸と肝臓は門脈を介してつながっており、腸内細菌叢を含むこの関係は腸肝軸と表現される。C型肝炎ウイルス（HCV）は肝臓に感染し、慢性感染で線維化を引き起こす。HCVは腸内細菌叢の変化と関連していますが、これらの変化が腸肝軸全体の代謝にどのような影響を与え、それが疾患の重症度や時間によってどのように変化するかは不明です。ここでは、門脈および末梢血、糞便、肝臓組織のマルチオミクス解析を用いて、線維化の重症度勾配に沿ったHCV患者の腸-肝臓軸の特徴を、ウイルスが検出されない、すなわちウイルス学的反応の持続前（n = 29）と6ヶ月後（n = 23）に明らかにしました。脂肪酸は、HCVの肝臓、門脈、腸内細菌叢全体にわたって、特に肝硬変患者で障害された主要な代謝産物であった。肝ペルオキシソームとミトコンドリアによる脂肪酸分解の減少は、門脈を介した肝臓への遊離脂肪酸（FFA）流入の増加と相まって、脂肪酸の分解が促進された。メタトランススクリプトミクスにより、Anaerostipes hadrusを介した脂肪酸合成が門脈FFAに影響を及ぼしていることが示唆された。微生物による脂肪酸合成と門脈FFAの両方が、肝線維化の亢進と関連していた。Bacteroides vulgatusが介在する腸管糖鎖分解は、門脈糖鎖産物と関連しており、このことはHCVにおける門脈炎症の亢進と相関していた。両時点での患者サンプルの一対比較から、肝代謝、特にペルオキシソームにおける代謝が、ウイルスとは無関係に肝硬変において持続的に異常であることが示された。ウイルス学的反応の持続は、メタノブレヴィバクター・スミティーの有益な役割の可能性と関連し、それは肝疾患の重症度マーカーと相関していた。これらの結果は、HCVおよびHCV以外の肝疾患の病因における腸-肝臓軸の理解を深めるとともに、将来の治療法の基盤を提供するものである。

主な内容
腸内細菌は、カロリーや環境の利用を最大化するための宿主による遺伝子のアウトソーシングであり、宿主のエネルギー調節、代謝、免疫に直接影響を与える1,2。肝臓は、腸と宿主の残りの部分をつなぐ結節点であり、それ自体がこの複雑な生物学の摂動に対して脆弱である3,4。腸-肝臓軸の変化は、非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）および非代謝性病因による慢性肝疾患においてよく証明されています5。C型慢性肝炎ウイルス（HCV）を含むウイルス性肝炎は、肝臓に持続的な炎症とそれに続く線維化をもたらす肝疾患の主要な原因である。この肝線維化は、最終的に肝硬変として知られる末期肝疾患に進行します。肝硬変の初期は、「代償性肝硬変」と呼ばれ、肝機能に異常はありません。しかし、時間の経過とともに、「代償性肝硬変」と呼ばれる肝機能障害に進行することがあります。このような代償性肝硬変の患者さんでは、腸内細菌の正常な構成が変化していることが報告されており、腸内細菌症としても知られています5。過去10年間、直接作用型抗ウイルス剤の登場により、持続的ウイルス学的奏効（SVR）と呼ばれるHCV感染症の消失が現実のものとなってきました。しかし、肝硬変はSVR直後から持続し、数年かけて徐々に線維化が退縮していきます。したがって、HCV関連肝疾患は、最初の引き金であるHCVの存在の有無にかかわらず、線維化による腸-肝臓軸の変化を明らかにするためのモデルとして役立つ。最後に、腸肝循環の研究を完成させるためには、腸内細菌と肝臓の間の最も直接的な情報伝達経路である門脈を調査する必要がある。これら3つの生物学的コンパートメントにおける中核的な異常、肝疾患の重症度による統合、および経時的な変化については、詳細な特性解明がなされていない。

この論文では、慢性肝疾患における腸肝循環の役割を明らかにするために、HCV患者の門脈を2つの時点、すなわち、HCV感染による慢性代償性肝疾患（HCVi）とHCV排除後約6カ月で線維化の重症度別に調査しました（図1）。そのため、SVRの前後という2つのタイミングで、末梢静脈と門脈からの血液サンプル、肝生検、糞便を同時に採取しました。具体的には、経口ウイルス複製阻害薬であるsofosbuvirとvelpatasvirの併用療法により、SVRを達成しました。血清のメタボローム解析、肝臓と糞便のRNAトランスクリプトーム解析、糞便の微生物16SリボソームRNA解析を行い、腸肝軸の代謝的相互作用を探索した。肝線維化の重症度は、HCViおよびSVRの両タイムポイントにおいて、Ishak6が開発したスコアリングシステムを用いて病理組織学的サンプルで測定しました。ハイスループット分子技術を最大限に活用した多層的な統合的解析により、我々は、腸内マイクロバイオーム、門脈、肝臓、および肝疾患の重症度の異なる段階におけるそれらの相互作用における生物学的景観を特徴付けている。これは、HCVをモデルとして、HCVの病原性よりもむしろ線維化における腸-肝臓軸の役割を明らかにするための仮説構築研究であった。

図1：研究デザイン

図1
HCViとSVR後6ヶ月という2つのタイムポイント解析による臨床プロトコルの概要。各時点で、末梢血清、門脈血清、肝生検、糞便から試料を採取した。実験手順、解析および統合は、Methodsに記載されたとおりに実施した。DAA、直接作用型抗ウイルス療法。

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我々の包括的なマルチオミクス解析により、脂肪酸（FA）代謝の優勢な崩壊を伴う、腸-肝臓軸におけるエネルギー恒常性調節異常が明らかになりました（拡張データ図1）。肝臓では、HCViではペルオキシソームとミトコンドリアに代謝異常が局在し、SVR後も進行した線維化で持続していた。マイクロバイオームでは、HCViの重症化に伴い、Anaerostipes hadrusのFA合成を介した転写活性の亢進とムチン分解を行うBacteroides vulgatusの機能的優位が見られた。3つの生物学的コンパートメントを統合することにより、これらの肝および微生物の代謝擾乱は、門脈に循環する免疫および代謝シグナルを介して、HCViの宿主炎症に直接関連することを明らかにした。

研究成果
合計29名の患者が初期評価（HCVi）を完了し、23名の患者がSVRの約6ヵ月後、すなわちソホスブビル/ベルパタスビルの投与開始から平均0.99年（範囲0.73-1.25年）で再評価を完了した（図1）。すべての患者は、両時点で門脈および末梢血、糞便、肝組織のサンプリングを受け、ペア解析が行われた。線維化に関連する腸-肝臓軸の摂動を明らかにするため、HCViおよびSVRタイムポイントの肝生検のIshak線維化スコア6を用いて、患者を層別化した。Ishak線維化スコアが0-4の患者を非硬化型、5-6の患者を肝硬化型とした（補足表1）。HCViとSVRの間で線維化や直達門脈圧に差はなかった（Extended Data Fig.2）。

HCViと線維化では宿主代謝がダウンレギュレートされている
HCViとSVRのペア肝生検でトランスクリプトミクスを実施し、SVRと比較してHCViで7,866個の異なる発現遺伝子（DEG）を同定した（DeSeq2、FDR（偽発見率）P値＜0.1）。過剰発現解析は、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) を用いてDEGsに対して行われた（FDR P値<0.1）（図2a）。予想通り、HCViはSVRと比較して、インターフェロン遺伝子に富む肝炎および抗ウイルス経路のアップレギュレーション、ならびにIFNGおよびIFNL1の肝発現の増強を示した（出典データ図2）。興味深いことに、HCViでダウンレギュレートされたすべての経路は、FAs、分岐鎖アミノ酸、芳香族アミノ酸、ペルオキシソーム、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（PPAR）シグナルの代謝を含む代謝経路であった。Gene Ontology（GO）を用いて細胞成分別に解析すると、HCViで発現が低下した遺伝子は、エネルギーと酸化還元バランス7に重要な役割を果たすオルガネラであるペルオキシソームとミトコンドリアに局在した（過剰発現解析、Fisherの正確検定、FDR P値＜0.1）（図2b）。FA酸化におけるミトコンドリアとペルオキシソームの機能不全は、HCVを含む肝臓疾患の病因全体で示されている8,9。FA分解（FoldEnrichment -5.23, FDR P値<0.0001）、ペルオキシソームFA酸化（例えば、ACOX FoldChange -0.67, FDR P値<0.0001）、カタラーゼ（CAT）（FoldChange -0.66, FDR P値<0.0001）、レチノール代謝（FoldChange -0.66, FDR P値<0.0001）が抑制された。 0001）、レチノール代謝（DHRS4 FoldChange -0.32, FDR P値0.029）。HCViにおけるペルオキシソームの役割は、肝臓疾患におけるレドックス不均衡を例示しています10、11（図2cおよび拡張データ図3）。

図2：縦断的評価により、SVRと比較してHCViでは、対応する代謝物の高い循環レベルとともに、ペルオキシソームおよびミトコンドリアにおける肝代謝が減少していることが明らかにされた。
図2
a, NetworkAnalystソフトウェアを用いてKEGGパスウェイデータベースにマッピングされたSVRと比較したHCViにおけるFDR P値<0.1の肝臓DEGsの過剰発現解析。FDR P値＜0.1の最も濃縮された20の肝KEGGパスウェイが可視化されている。青く塗られたバーは、HCViで発現が増加したDEGに富む肝臓パスウェイを表し、オレンジ色に塗られたバーは、SVRと比較してHCViで発現が減少したDEGに富むパスウェイを表す（n = 22）。SVRと比較してHCViで減少した肝DEGsの最も濃縮された10の細胞位置が可視化されており、FDR P値<0.1 (n = 22)。SVRと比較して、fold change >0（つまりHCViで増加）、fold change <0（つまりHCViで減少）のDEGを青で強調表示（n = 22）。 d、e、HCViとSVR間の血清代謝物レベルの変化のペア比較（両側ウィルコクソン一致ペアサインランクテスト、FDR P値<0.1）。SVRと比較してHCViで上昇した代表的な門脈（d）および末梢（e）代謝物の視覚化で、肝代謝が低下しているカテゴリーに属する（n = 23）。

出典データ

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次に、肝代謝の機能低下が循環動態の変化につながるかどうかを検討しました。SVRと比較して、HCViは幅広い代謝物の末梢および門脈レベルの上昇を示し、その多くは肝分解が低下したカテゴリーに属していた（FDR P値＜0.1）（図2d,e）。このような代謝物の増加は、HCViにおいて、エネルギー抽出の障害や代謝活性化合物の過剰から、インスリン抵抗性、オンコメタボリズム、肝脂肪症、サルコペニア12,13,14,15に影響を与える負の結果をもたらす可能性がある。

最後に、HCVの肝異常が線維化に関係し、SVR線維化で持続するかどうかを評価した。HCViとSVRの両方で共発現し、HCVとは無関係に肝臓疾患の重症度に関連する肝臓遺伝子と門脈代謝産物を、ペアのHCViとSVRサンプルについてコンセンサス重み付け遺伝子相関ネットワーク解析（WGCNA）を用いて探索した。HCViとSVRの両方で、1つの肝モジュール「MEred」だけが線維化と逆相関し（ピアソン相関係数-0.47、未調整P値0.02）、1つの門脈代謝物モジュール「MEYELLOW」だけが直接門脈圧と正の相関を示した（ピアソン相関係数0.60、未調整P値0.002）（図3A、図3B）。肝「MEred」モジュールは、代謝、特にFA分解（FoldEnrichment 8.87, FDR P value <0.0001）、PPARシグナル伝達（FoldEnrichment 4.78, FDR P value 0.0013） およびペルオキシソーム（FoldEnrichment 3.84, FDR P value 0.010）に富むことがわかり、門「MEYELLOW」モジュールが最も自由脂肪酸（FFAs）に富むことがわかりました（図 3c,d）. これらの知見は、HCVおよびSVR16における血清代謝の変化に関する現在の知見を拡大するものである。

図3：線維化は肝FA代謝の低下と、門脈直圧はHCVに依存しない門脈FFAの増加と関連していた（n = 22）。
図3
a、肝疾患重症度マーカー（x軸）と、両時点で保存されているコンセンサスWGCNA肝遺伝子モジュール、すなわちHCViとSVRの両方で共発現している肝遺伝子（y軸）の相関ヒートマップ。ME」は共発現している遺伝子のモジュールまたはクラスターであり、各MEモジュールにはランダムに色が割り当てられている。各セル内の上段はピアソン相関係数、下段の括弧内は両側フィッシャー漸近法未調整P値を示す。グレーに塗られたセルは、HCViとSVRのピアソン相関係数が逆方向のため、コンセンサスが形成されていないことを示している。肝モジュール「MEred」のみが、HCViとSVRの両方で線維化と逆相関している。 b, 図3aと同様に、肝疾患重症度マーカー（x軸）とHCViとSVRの両方で保存されたコンセンサスWGCNA門脈代謝物モジュール（y軸）の相関ヒートマップ。ME」は、互いに最も強い相関を持つ代謝物のモジュールまたはクラスターであり、各MEモジュールにはランダムに色が割り当てられています。c, コンセンサスWGCNAモジュール'MEred'における肝臓遺伝子の過剰発現解析 (NetworkAnalyst, FDR P値 <0.1) d, コンセンサスWGCNAモジュール 'MEyellow' に含まれる個々のFFA。 z-KME はKME（eigengeneベースの連結性または代謝物モジュールのメンバーシップ）に対するzスコア、 P-KME はそれぞれのKME値に対して計算した両側未調整P値、を示す。

ソースデータ

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要約すると、今回の結果は、HCV肝硬変における肝ミトコンドリアおよびペルオキシソームFA異化作用とPPARシグナルのダウンレギュレーションに関する知識を拡張するものです9。これらの代謝概念の多くは、特にFA代謝とペルオキシソーム機能に関連しており、SVR後の進行した線維化では依然として障害されている。

HCVi肝疾患における門脈代謝産物と腸内細菌叢
線維化で強調される肝代謝異常という我々の知見は、線維化における腸-肝臓軸を探る機会となった。門脈は、腸内細菌と肝臓の間の代謝シグナルの主要な導管であるため、HCViの肝疾患の重症度にわたって門脈メタボロミクスと腸内細菌を探索した。まず、門脈および末梢血清で測定した1,541代謝物について、類似性ネットワーク融合（SNF）およびスペクトルクラスタリング分析を用いて、HCViにおける血清代謝シグネチャーを線維化に関連して分析した17（図4a）。門脈メタボロミクスSNFから得られた患者群の平均Ishak線維化スコアには有意差がありましたが（P = 0.0066）、末梢メタボロミクスSNFに基づく差異は認められませんでした（P = 0.23）。このことは、ロジスティック回帰モデリングを用いて検証した（補足表6）。次に、個々のスーパーパスウェイから生成した25のHCVi患者ネットワークに対してスペクトルクラスタリングを実施した（補足表7）。FFAは、HCVi患者グループが、門脈（P＝0.005）のスペクトルクラスタリングに基づく平均イシャク線維化スコアにおいて有意差を示した唯一のスーパーパスウェイであったが、末梢FFA（P＝0.49）ではなかった（図4b）。これはロジスティック回帰を用いて検証された（補足表6）。

図4：門脈メタボロミクスのみで、HCVi患者を線維化の初期と進行にクラスター化した。HCVi疾患の重症度は、転写活性の高いA. hadrusとB. vulgatusによって駆動される微生物のFA合成と糖鎖分解の増加に関連していた。
図4
a, HCViの1,541代謝物に対して行われたSNFとスペクトルのクラスタリング。門脈（末梢ではない）メタボロミクスからのSNFは、HCVi患者を、平均Ishak線維スコア（SNF、Welchのt検定、無調整両側P値）が有意に異なるグループにクラスタリングしました（n = 29）。末梢メタボローム群1：最小値および下限値（25パーセンタイル）1、中央値（50パーセンタイル）3、最大値および上限値（75パーセンタイル）6、外れ値なし；末梢メタボローム群2：最小値1、下限値（25パーセンタイル）2. 75、中央値（50パーセンタイル）5、最大値・上限値（75パーセンタイル）6、外れ値なし；門脈メタボロミクス群1：最小値・下限値（25パーセンタイル）1、中央値（50パーセンタイル）2、最大値6、上限値（75パーセンタイル）3、外れ値なし；門脈代謝物質群2：最小値1、下限値（25パーセンタイル）3. 75、中央値（50パーセンタイル）6、最大値および上限値（75パーセンタイル）6、外れ値なし。 b、主要代謝カテゴリー内で、門脈（末梢ではない）FFAから得られたHCVi患者ネットワークは、HCVi患者を平均イシャク線維症スコアが著しく異なるグループに分類できた（スペクトラルクラスター、ウェルチのt検定、無調整両側P値）（n＝29）。末梢FFA群1：最小値1、下限値（25パーセンタイル）2.25、中央値（50パーセンタイル）4.5、最大値および上限値（75パーセンタイル）6、外れ値なし、末梢FFA群2：最小値1、下限値（25パーセンタイル）2、中央値（50パーセンタイル）3、最大値6、上限値（75パーセンタイル）5.5、外れ値なし、門脈FFA群1：最小値2、下限値（25パーセンタイル）3. 75、中央値（50パーセンタイル）5.5、最大値および上限値（75パーセンタイル）6、外れ値なし；門脈FFA群2：最小値および下限値（25パーセンタイル）1、中央値（50パーセンタイル）2、最大値6、上限値（75パーセンタイル）と3、外れ値なし c, SCCbg.adj. によるHCViにおける微生物のKEGG機能モジュールと肝臓線維の相関性, 両側FDR P値<0.1（n = 26）。

出典データ

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HCVi患者を門脈メタボロームプロファイルのみに基づいて線維化の初期と進行に不偏的にクラスタリングした結果、HCViにおける腸内細菌組成と転写活性の調査が促された。糞便中の16S rRNA解析では、微生物の系統や属とHCViにおける線維化との間に有意な関係は認められなかった（Extended Data Fig.4a,b および補足図1a,b）。次に、HCViの糞便メタトランススクリプトミクスを調べることで、組成の変化に先行すると考えられる転写活性の変化を探った。微生物RNA配列をMetaHIT Consortiumにアラインメントし、889,668塩基配列を取得し、4,718個の微生物KEGG Orthology（KO）遺伝子をアノテーションし、KO遺伝子を背景調整中央値スピアマン相関（SCCbg.adj）を用いて肝臓病重症度マーカーと相関するKEGG機能モジュールにグループ化した18。この微生物機能の偏りのない探索により、HCViにおける線維化および肝壊死炎症とFA、アミノ酸、糖鎖を含む微生物エネルギー代謝の直接的な関連性が明らかになった（図4c、拡張データ図5a、b）（FDR P値＜0.1）。特に、線維化は微生物によるFA生合成、開始（SCCbg.adj. 0.22, FDR P値0.092）および伸長（SCCbg.adj. 0.21, FDR P値0.092）と正の相関があり、β酸化（SCCbg.adj. -0.11, FDR P値0.45）とは関係がないことが示された。肝壊死炎症は、微生物の糖鎖分解と正の相関があった。ヘパラン硫酸（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）, SCCbg.adj. 0.25, FDR P値 0.040；γ-glutamyl transferase（GGT）, SCCbg.adj. 0.21, FDR P値 0.059）およびデルマタン硫酸（GGT, SCCbg.adj. 0.28, FDR P値0.094）分解は、微生物の糖鎖分解と相関していた。

転写活性の高い微生物種を決定するために、MGS canopy アルゴリズム19 を用いた Co-Abundance クラスタリングにより、微生物メタトランススクリプトームの de novo アセンブリーを行った。分類学的に注釈されたコ・アバンダンス遺伝子群（CAG）は、リーブワンアウト解析18を用いて分析された。線維症に関連する微生物の「FA生合成開始」は、CAG003：未培養細菌、次いでCAG015で駆動された。FAを合成する腸内常在菌であるA. hadrusであった20,21(補足表2)。同様に、GGTに関連した微生物の「ヘパラン硫酸分解」は、CAG007が主に駆動していた。B. vulgatus、糖鎖代謝を行う腸内常在菌である22。

HCViにおける門脈代謝産物と関連する微生物機能
門脈循環を介した微生物代謝の宿主への影響を解明するために、門脈代謝物WGCNAモジュールと転写活性の高い微生物CAG（SCCbg.adj.、FDR P値＜0.1）を相関させた（図5a）。FA生合成のための主要な転写活性微生物種CAG015: A. hadrusは、複合脂質とFFAを主に含む門脈モジュールM02（SCCbg.adj. 0.28, FDR P値0）およびM07（SCCbg.adj. 0.27, FDR P値0）と最も強い関連性を示した。門脈FFAへの微生物の寄与は，門脈FFAとCAG015との直接的な関連性から補強された．A. hadrus（例えば、門脈パルミチン酸、スピアマン相関係数0.50、未調整P値0.0084）および微生物のFA生合成のKO遺伝子との門脈FFAとの直接的な関連から補強された（補足表3）。注目すべきは、CAG015とFFAの関連性である。A. hadrusは長鎖のFFAに限定されており、短鎖のFFAは含まれていなかった。これは、A. hadrusが短鎖FA合成を通じて宿主の健康に影響を与えることが知られており、我々の知る限り、長鎖FA合成におけるその役割に関する既存の文献がないため、興味深いことであった20,21。我々の発見は、A. hadrusが媒介するFA生合成が、門脈循環における長鎖FFAの利用可能性に対して役割を果たすことを支持するものであった。さらに、長鎖FFAと肝酵素、炎症性サイトカイン、マクロファージ活性化との強い相関は門脈でのみ見られた（例えば、門脈FFA16：0とAST、スピアマン相関係数0.61、未調整P値）。 61, 未調整 P値 0.0003; IL-8, Spearman相関係数 0.66, 未調整 P値 ≤ 0.0001） HCVi肝疾患進行における微生物由来長鎖FFAの病態的意味を示唆している（Fig. 5b）。

図5：HCViにおいて、転写活性の高いA. hadrusとB. vulgatusは、それぞれ門脈FFAと糖鎖生成物に直接関連していた。微生物由来の門脈シグナルと疾患関連微生物の機能は、循環系および肝の炎症経路の亢進と相関していた。
図5
a、HCViにおける転写活性微生物種（CAG）と門脈代謝産物WGCNAモジュールとの間の相互オミックス関連性の相関ヒートマップ。SCCbg.adj., Mann-Whitney U test, two-sided, FDR P value +, 0.05-0.1, *0.05-0.01, **0.01-0.001, ***<0.0001) (n = 26)．ポータルモジュールはM01からM08までの番号が付けられており、最も一般的な代謝サブパスに注釈が付けられている。PC、ホスファチジルコリン；LPC、リゾホスファチジルコリン；CE、セラミド；PE、ホスファチジルエタノールアミン。 b、HCViにおける門脈（上）および末梢（下）血清FFAと肝臓疾患の重症度および炎症のマーカー間の相関ヒートマップ（スピアマンR、両面FDR P値 +, 0.05-0.1, *0.05-0.01, ***0.01-0.001, ***<0.0001）(n =29)．SCFA, 短鎖FFA; MCFA, 中鎖FFA; LCFA, 長鎖FFA; DPP, 直接門脈圧; IF, Ishak fibrosis score. c, 転写活性型CAG007.B.vulgatusは、B.vulgatusの転写活性型CAG007.B.vulgatusと相関があった。d, HCVi-NCと比較して、GlNAc-GalNAcはHCVi-Cirrで高かったが、門脈血清でのみ高かった（両側Mann-Whitney, HCVi-Cirr n = 13 vs HCVi-NC n = 16）。e, 微生物のKEGG機能モジュール（x軸）と肝臓のKEGGパスウェイ（y軸）の間の相互の関連性を示す相関ヒートマップ。左のy軸の青い列で示すように、Ishak線維症スコア（IF）、ASTおよびGGTと正の相関を示した（FDR P値＜0.1）肝パスウェイおよび微生物機能モジュールのみを表示（SCCbg.adj., Mann-Whitney U test, aと同様の両側FDR P値）（n = 26）。

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HCViでは、粘膜糖鎖分解の転写活性種CAG007: B. vulgatusが、ほとんどの疾患関連微生物機能の主要なドライバーであった（図4d）。これは、微生物の糖鎖代謝が腸のホメオスタシスと炎症に影響を与えることから重要であった23,24。カロリーバランスが崩れると、B. vulgatusはエネルギー抽出を粘膜の糖鎖にシフトし、ムチンを分解することでバリア機能障害と炎症を引き起こす病原体となることが、炎症性腸疾患（IBD）22,25で最もよく研究されている。我々の発見は、「カロリー不均衡」に似た肝代謝機能障害を伴うHCVi肝疾患におけるこの概念を浮き彫りにするものである。末梢血からの移行を推測すると、肝処理前の腸管由来のシグナルを正確に評価することができない。門脈シグナルの直接評価により、B. vulgatusの門脈糖鎖産物への寄与の可能性と門脈糖鎖産物の炎症性役割という、肝疾患では十分に検討されていない概念が明らかにされた。転写活性の高いCAG007 B. vulgatusは、N-アセチルグルコサミン／N-アセチルガラクトサミン（GlNAc-GalNAc）およびN-アセチルノイラミン酸／シアル酸を含む多様な糖鎖を含む門脈モジュールM03 (SCCbg.adj. 0.60, FDR P value 0) と強い相関を示した（図5a）。CAG007: B. vulgatusは、門脈血清でのみGlNAc-GalNAcと直接相関し（スピアマン相関係数0.62、未調整P値0.0007）、末梢血清では相関しない（スピアマン相関係数0.12、未調整P値0.559）（図5c）。門脈血清では、HCVi-CirのGlNAc-GalNAcはHCVi-NCに比べて上昇した（図5d）。GlNAc-GalNAcとシアル酸はともに、AST、アルカリフォスファターゼ（ALP）、GGT、sCD14、sCD163、IL-6、IL-8、TNFα、CXCL9およびHMGB1などの炎症マーカーと強い相関があった（例えば、門脈GlNAc-GalNAcとTNFα、スピアマン相関係数0. 63、未調整P値0.0003）；CD4およびCD8 T細胞、腸管α4β7 T細胞；および好ましくない脂質プロファイル（補足表4）であった。B. vulgatusが介在する糖鎖分解の負の結果は、SVRと比較してHCViでは腸内細菌症（IL-18）および腸機能障害（ゾヌリン）のマーカーが上昇していることからも裏付けられた（Extended Data 図6）。相関的ではあるが、門脈の代謝および免疫マーカーを調べることで、B. vulgatusを介した糖鎖分解がHCVi肝疾患において腸の恒常性を損なう可能性があることが明らかになった22。門脈の糖鎖産物およびその関連物質である腸管透過性、ディスバイオシス、炎症シグナル、α4β7 T細胞は、IBDの新たな治療標的であり、我々の発見は肝疾患における治療テーマを示唆している26,27。

我々は、疾患に関連する微生物機能と肝免疫恒常性との関係の可能性を転写レベルで探りました。このインターオミックス統合により、微生物のFA生合成と腸管糖鎖分解が、炎症、免疫、ディスバイオシスの複数の肝経路に直接関連することが示された（SCCbg.adj., FDR P値＜0.1）（図5e）。肝脂質酸化を伴わない肝外FFAは、肝疾患における酸化ストレスと炎症を増強する可能性があり、この概念はNAFLDで最も研究されているが、HCV8,28においても同様である。線維化が進行したHCVi患者では、A. hadrusに由来する高い門脈長鎖FFAが、肝ミトコンドリアおよびペルオキシソームの機能障害による肝損傷を増強すると推測される。このような微生物由来長鎖FFAの病態的役割については、十分に解明されていない29,30,31,32。

SVR後の腸内細菌群の再評価による洞察
SVR後の腸内細菌群の再評価により、メタン代謝の優占古細菌であるMethanobrevibacter smithiiがHCVを持たない肝硬変において推定される役割を担っていることが明らかにされました。共発現している微生物機能KO遺伝子モジュールは、SVR後の肝疾患重症度マーカー（WGNCA）と相関していた（図6a）。MEGreen」のみが肝疾患の重症度と逆相関していた（線維症、ピアソン相関係数-0.49、未調整P値0.02；門脈圧直下、ピアソン相関係数-0.59、未調整P値0.003）。このモジュールはメタン代謝に最も濃縮されていた（over-representation analysis, FoldEnrichment 7.79, FDR P value <0.0001）（図6b）。メタン代謝」のKO遺伝子18個のうち、BLASTNを用いてM. smithiiに分類注釈されたKO遺伝子16個は、同一性99%以上、カバー率95%以上であった（補足表8）。

図6：SVR後の線維化において減少したMethanobrevibacterとメタン代謝の有益な役割、n = 23.
図6
a、SVR（WGNCA）における肝疾患重症度マーカー（x軸）と共発現微生物機能KO遺伝子モジュール由来の相関ヒートマップ（y軸）。ME」は共発現している遺伝子のモジュールまたはクラスターであり、各MEモジュールにはランダムに色が割り当てられている。各セル内、上段はピアソン相関係数、下段は括弧付き両側フィッシャー漸近法無調整P値を示す。b, MicrobiomeAnalyst R package, Shotgun Data Profilingを用いた'MEGreen'モジュール内の微生物KO遺伝子のパスウェイ濃縮、未調整P < 0.05。Methanobrevibacter属との相互作用が統計的に有意（両側偽P値<0.05）となった25の微生物属が表示されている。ノードは、構成する分類学上の目によって色分けされた微生物属を表しています。線は、SparCC相関係数を表す図の横の目盛りごとに青またはオレンジに着色。

ソースデータ

フルサイズ画像
M. smithiiは、腸のエネルギー恒常性維持に重要である。水素を除去することで、糖質分解菌による糖鎖発酵を確実にし、エネルギー収穫を最大化する33,34。SVRにおけるMethanobrevibacterの微生物間連鎖の関連性は、Sparse Correlations for Compositional data (SparCC) 35を用いた16S rRNAの腸内生態系解析によって示された（両側偽P値<0.05）（図6c）。Methanobrevibacter属は、糖質分解を行うClostridiales属と最も有意な分類学的連関を示した。メタノブレヴィバクター属の有益な役割は、メタノブレヴィバクター属の16S rRNA量とM. smithii転写活性が、SVRの肝酵素、サイトカインおよび好ましくない脂質プロファイルと抗炎症的に関連していることからも示唆されている（補足表5）。

我々は、SVR後の進行した線維症におけるM. smithiiメタン代謝の低下が、内腔pH、糖分解性腸内常在菌、短鎖FFAの利用可能性、ひいては腸の恒常性を変化させると推測しており、生物学的に深い意味を持つ概念である21。

考察
宿主-微生物間のクロストークを行う主要な経路である門脈を含む包括的なマルチオミクス統合により、HCViにおける腸-肝臓軸の基本的な障害としてエネルギー代謝、特にFA代謝が明らかにされた。時間的な研究デザイン（図1）により、肝硬変はSVR後もペルオキシソームを中心とした代謝異常の持続的な状態であることが示された。私たちは、肝疾患の変化のアトラスを描き、真のヒトの病態生理を明らかにした。

慢性炎症は、代謝の中心的臓器である肝臓で発生した場合、代謝に大きな影響を与えるエネルギー要求性の高い状態である36,37。肝臓の代謝異常、特にミトコンドリアFA代謝は、肝疾患の病因を問わず研究されている38。ミトコンドリア機能障害は、FAからのエネルギー抽出を妨げ、肝内脂質の蓄積、レドックス不均衡およびインフラマソームの活性化を促進する8。我々の発見は、HCViにおいて肝ミトコンドリアFA異化作用が低下し、肝硬変においてそれが顕著になることを示すものである。しかし、重要なことは、HCViおよびSVRにおける線維化の悪化を伴うFA代謝異常の主要な部位としてペルオキシソームが同定されたことである。ペルオキシソームとミトコンドリアは共依存関係にあり、ペルオキシソームはエネルギー、脂質代謝およびレドックスバランスに関与しているにもかかわらず、肝疾患においては十分に評価されていない7,39,40。PPARシグナルは、肝臓の脂肪の利用に重要であるため、線維化におけるペルオキシソームの機能障害は、脂肪酸による肝臓の酸化ストレスにつながる可能性がある41。この概念の治療上の関連性は、NAFLDや原発性胆汁性胆管炎を含む肝臓疾患の病因におけるPPARアゴニストの使用によって裏付けられている42,43. したがって、HCVは現在治癒可能であるにもかかわらず、我々の研究は、代謝標的治療に対する生物学的洞察を加え、HCViの早期治療の重要性を強調し、SVR肝硬変におけるペルオキシソーム救済という刺激的な治療法を提供する。

私たちの知る限り、門脈の代謝産物は、代償性肝硬変においてのみ研究されています44,45,46。代償性肝疾患における門脈メタボロームランドスケープの特性は、我々の研究の重要な要素でした。末梢血清とは異なり、HCVi線維症では腸由来の門脈FFAが多く、肝ミトコンドリアおよびペルオキシソームFA代謝の低下と相まって、実際に肝損傷を加速させる可能性があることが門脈メタボロミクスによって浮き彫りにされた。

肝疾患における腸内細菌に関する研究は、病因の組み合わせや組成から機能を推測するものであり、疾患の誘因を除去した後に再評価したものはごくわずかであった47,48。本研究では、1つの病因に焦点を当て、微生物のメタトランススクリプトームを探索し、SVR後に再評価することで、これらの欠点に対処している。さらに、転写活性の高い微生物種と門脈シグナルの間の関連性をマッピングした。微生物組成との関連はないものの、明確な微生物機能がHCVi線維化と関連していた。HCViの線維化では、肝のFA代謝が低下しているため、微生物によるFA合成が増加していた。転写活性を持つ A. hadrus は、この逆説的な微生物 FA 合成の上昇に関与していた。A. hadrusは短鎖FA合成を介してヒトの健康に影響を与えるが、我々のインターオミクス解析では、A. hadrusが宿主の長鎖FFAに直接寄与していることが示唆された20,21。このことは、腸内細菌がヒトの病態生理に及ぼす影響について、まだ発見されていない側面があることを明確に示しています。

線維化と微生物によるFA合成との間に正の相関があるという我々の知見とは対照的に、先行研究では微生物による長鎖FAは肝臓や腸の傷害に有益な役割を果たすことが示唆されている31,32。この対比は、種、傷害の鋭さや性質の違い、門脈ではなく内腔のFAをサンプリングしていることに起因すると思われる。もう一つの理由は、マイクロバイオームが宿主に与える影響の文脈依存的な性質である可能性がある。例えば、Lachnospiraceaeを介した脂質代謝は、「局所レベル」では大腸の健康に有益であるが、肝機能障害、すなわち原発性硬化性胆管炎の有無にかかわらずIBDでは、逆説的に有害である49。肝疾患における肝外FFAの病理学的役割を考えると、A. hadrusと微生物のFA合成を治療的に操作して、肝の酸化的傷害を減らし、最終的に線維化の進行を遅らせる機会があることが示唆される8,28。

我々は、B. vulgatus が HCVi 肝疾患の重症度に関連するほとんどの微生物機能を担う主要な転写活性種であると同定しました。B. vulgatusは、カロリー不均衡時にムチンを分解し、IBD22,23,24,25,26で最もよく研究されている腸の炎症とディスバイオシスを媒介することができます。HCViでは、B. vulgatusは粘膜糖鎖分解の主要な機能的活性種であるだけでなく、炎症経路の肝転写の増強に直接関連していた。このように、HCViでは、B. vulgatusの機能的優位性が、他の肝疾患の病因で研究されているように、エネルギーおよび免疫のホメオスタシスに悪影響を及ぼすことが明らかになった46, 50. 微生物群の相対的な存在量に差がなかったことから、我々は、B. vulgatusの機能的な変化が、主に代償性肝硬変で報告されている組成の変化に先行することを提案している47,48。食事や腸管免疫の操作によってB. vulgatusの介在する糖鎖分解を抑制することは、慢性肝疾患における腸管恒常性を維持するための早期治療的介入となる可能性がある。

縦断的な解析から方向性を推測すると、HCVによって引き起こされた炎症による肝代謝機能障害は、「好ましくない」微生物代謝経路の機能的過剰発現につながるという仮説が成り立つ。この推測は、B. vulgatusと肝脂質、胆汁酸、ビタミンAの変化を関連づけた研究によって裏付けられている51,52,53。注目すべきは、この分析が関連性を持っていること、そして門脈の長鎖FAと糖鎖が腸内細菌に直接由来するのではなく、疾患との関連性を共有しているかもしれないことで、この概念はさらに探求される価値がある。

我々は、ヒトの研究の本質的な性質上、ここで示されたデータは観察的で相関的であることを認識している。仮説生成型の研究であるため、偶然による関連を最小化するために、多重検定補正を行った。結果の妥当性は、生物学的コンパートメントおよび患者サブセットにわたる所見の一貫性によって裏付けられている。本研究の大きな強みは、HCV排除の前後で同じ患者から得られたペアのデータを用いた縦断的なデザインであり、これにより方向性を推論することが可能となったことである。このような方法で真のヒト生物学を探求することは、今後の研究によってメカニズム的な検証を必要とするプロセスを明らかにする第一歩となる。特に、肝、門脈、微生物によるFA代謝の同時変化については、慢性肝疾患の動物モデルで検証する必要がある。FA合成と糖鎖分解の微生物機能、およびこれらの機能の主要な転写活性微生物種、すなわちA. hadrusとB. vulgatusを操作して、肝疾患の重症度の変化を評価することが可能である。同様に、肝ペルオキシソームやミトコンドリアのレスキュー、例えばPPARアゴニストを用いて、疾患や疾患に関連する微生物機能の変化を調べることも可能である。動物ベースの実験モデルは、ヒトのコホートを使用することの2つの限界にも対処することができる。第一に、時間的解析により、HCVと改善したと思われる状態（SVR）を比較することができたが、健康な対照者の門脈血や肝組織サンプルを得ることができなかったため、完全な治癒を確認することができない。第二に、腸-肝臓軸の構成要素で、さらなる洞察を加えるであろうが、サンプリングされていないのは、腸リンパ管、胆汁および管腔微環境である。

我々は、肝代謝異常におけるミトコンドリアとペルオキシソームの中心的役割を強調し、HCVi肝疾患において転写活性の高いA. hadrusとB. vulgatusが駆動する微生物FA生合成と糖鎖代謝の亢進を明らかにした。門脈を評価することによってのみ、腸内細菌と肝臓の間で共有されるこれらの代謝シグナルが、門脈および肝炎の増強に関与し、その結果、肝疾患を促進する可能性があることが示された。腸-肝臓軸におけるこのグローバルなエネルギー調節異常は、肝脂肪症、サルコペニア、栄養失調、脳症などの肝臓疾患症状における臨床的意義を持っている54。時間的な解析を行うことで、最初の引き金（HCV）を取り除いた後でも、線維化が進行した肝臓の代謝障害が持続していることが示された。この研究は、肝硬変におけるエネルギー代謝の中心性を明らかにし、HCV以外の原因による肝硬変との関連性を示唆するものである。微生物による糖鎖代謝の概念とペルオキシソームレスキューの治療的役割は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2やメタボリック症候群などのウイルス感染症で報告されており、宿主とマイクロバイオームの関係から慢性炎症における治療的意味を持つ普遍的メカニズムを示唆しています1、55、56、57。

研究方法
患者選択と試験デザイン
登録前に、サンプルサイズを以下のように計算した：1群7人のサンプルサイズは、2群間の門脈微生物産物の検出率に60％の差を検出するために、95％の信頼水準で80％の統計的検出力を持つ研究を提供します。サンプルサイズは、肝硬変患者でより高い割合で発生する可能性のある脱落や技術的失敗を考慮して、最小線維化群では10人、進行性線維化群では20人に増やされました。National Institutes of Health Clinical Centerで36名の慢性HCV感染患者が評価され、そのうち30名（登録上限）が適格と判断され、参加に同意した。主な参加除外基準は、他の病因による慢性肝疾患、肝硬変、肝細胞癌を含む癌、週7杯以上のアルコール使用などであった。1名の患者は、署名後に肝細胞癌の偶発的な発見があったため除外された。すべての患者は、The National Institute of Diabetes, Digestive and Kidney Diseases, and the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal Diseases, Institutional Review Board at the National Institutes of Health approved protocol (NCT02400216) への参加についてインフォームドコンセントにサインをした。患者は試験参加に対して補償を受けた。HCViの最初の29人の患者のうち、1人が死亡し、4人が再登録を拒否したため、合計23人が治療後の評価のすべての要素を完了しました。1人の患者は再参加を承諾したが、SVR後にサンプル収集を完了しなかったため、SVRのタイムポイントではすべての解析から除外された。すべてのデータは、国立衛生研究所の臨床センターで収集・処理された。募集は2015年5月29日に開始され、2016年3月11日に終了した。データ収集は2015年6月1日に開始され、2017年2月14日に終了した。

本試験は無作為化対照試験ではなかった。本試験は概念実証であった。そのため、ランダム化比較試験を行うことを意図したものではない。むしろ、本試験のデザインは、介入（HCV治療）の前後でペアのサンプルを比較することを目的としたものであった。

すべての患者はHCV RNA >5,000 IU ml-1を有し、ジェノタイプ分布が記録されていた（補足表1）。肝硬変の患者はChild-PughスコアA（代償性肝疾患）であった。薬剤の使用と既往症は補足表9に報告した。登録前3カ月以内に抗菌薬を使用していた患者はおらず、初回登録時にプロトンポンプ阻害薬を使用していた患者は29例中3例のみであった。また、糖尿病と診断されたことのある患者さんが1名いました。HCViとSVRの時間間隔では、肥満度やヘモグロビンA1cに有意な変化はなかった（補足表1）。

検体採取
門脈遠位枝に近接した左または右肝葉を17G針で経皮的超音波ガイド下穿刺を行った。同軸に導入した18G Temno針（Temno Evolution, MeritMedical）で肝コア生検標本を2枚採取した。その後、17G針は超音波ガイド下で近位門脈枝を穿刺するように再ポジショニングされた。門脈のカテーテル挿入は、0.018インチのガイドワイヤーにグレブセット（Teleflex社製）を用いて透視下に行われた。門脈圧と静脈血は5F編組シースから採取した。その後、シースを肝実質内に引き抜き、穿刺痕をGelfoam pledgets（Pfizer Medical）で塞栓して止血した（補足ビデオ）。

末梢血は、3.5mlのZ Serum Sep. Clot Activator (Ref 454067P, Greiner Bio-One)に採取した前十二指腸静脈から採取した。各患者について、これは門脈サンプリングと同時に行われた。血清サンプルは、採取後4時間以内に2,000gで10分間の遠心分離により処理し、その後分析まで-80℃で保存した。

便サンプルは血清サンプル採取後2日以内に密閉可能な容器で採取し、便容器は採取後すぐに+4 °Cで保存された。サンプルはエッペンドルフチューブに分注され、最初の採取から8時間以内にさらなる分析のために-80 °Cで保存された。

なお、HCViコホートでは、血液、糞便および肝組織のサンプルは盲検下で採取され、分析された。同じ患者がSVRのために戻ってきたため、SVRにおける血液、糞便および肝組織サンプルの採取は盲検化されていない。しかし、採取後、すべてのSVRサンプルはコード化され、盲検化された状態で分析された。

食事に関する調査
栄養士は、糞便サンプルの前日の食事摂取量を決定するために、コンピュータ支援（栄養調整センターの研究用栄養データシステム）のマルチパス法を用いた24時間リコールを実施した。慢性的な食習慣を評価するために、被験者は電子的に食事歴質問票II過去1年分（ポーションサイズ版）を記入するよう求められた。これは150の質問からなる食物頻度質問票で、161種類のマクロおよび微量栄養素の消費量の相対量を測定するものである。HCVi患者28名とSVR患者23名の計4名が本解析を完了した。

各分析のサンプルサイズ
個々のタイムポイントにおける血清、血漿、全血、微生物16Sデータに関するすべての分析について、HCVi患者29人とSVR患者23人が含まれた。患者は、HCViとSVRのタイムポイントに対応する肝生検のIshak線維化スコアを用いて層別化された。Ishak線維化スコア0〜4は非硬化型、Ishak線維化スコア5と6は硬化型とした。1人の患者はSVR後にIshakスコアが「6」から「0」に変化したが、サンプルサイズが不十分で（9mm）、SVRタイムポイントでは直達門脈圧の上昇が変わらなかったため、この患者を肝硬変と層別した。したがって、SVRコホートでは、元のHCVi Ishak線維化スコアに基づいて肝硬変と層別された。この結果、患者の全体的な分布は、HCVi-Cirr n = 13およびHCVi-NC n = 16; SVR-Cirr n = 9およびSVR-NC n = 14となった。患者サンプルが品質管理パラメータを満たしていなかったため、肝トランスクリプトームの解析では、HCVi n = 27 (HCVi-Cirr n = 12 and HCVi-NC n = 15) とSVR n = 23 (SVR-Cirr n = 9 and SVR-NC n = 14)となりました。データのフィルタリングにより、微生物トランスクリプトームに関する解析は、HCVi n = 26、SVR n = 23であった。最後に、血清、血漿、微生物の16S rRNAデータのペア解析はn=23、肝臓のトランスクリプトミクスと微生物のメタトランススクリプトミクスは、上記のようにデータをフィルタリングした結果、n=22であった。

肝生検の組織学的および RNA シークエンス解析
肝生検サンプルは、肝病理学者David Kleiner博士により盲検化された方法でスコアリングされた。線維化はIshak線維化スコアを用いて、炎症はHepatic Activity Index (HAI)6,58を用いてスコアリングされた。RNA配列解析のために、肝組織サンプル（10 mg）をスナップ冷凍し、-80℃で保存した。HCViおよびSVRのタイムポイントで採取した肝生検に対して、同時にTotal RNA抽出を行った。バッチ効果を最小化するために、サンプルはそれぞれのタイムポイントに関係なくコード化され、盲検法で処理された。これは、TRIzol（カタログ番号15596026）およびQiagen RNA Extraction Kit（カタログ番号74104）を用いて行われた。NEBNext Poly (A) Selection kit (カタログ番号 E7490S)を用いて、トータルRNAサンプルにポリAセレクションを実施した。ポリA選択したRNAとScriptSeq RNA library Prep Kit（カタログ番号SSV21106）を用いてRNAライブラリーを調製した。すべての相補的DNAライブラリーは、KAPA Biosystems Illumina qPCR Kit（Roche、カタログ番号07960140001）を用いて定量し、正規化し、Illumina HiSeq 4000シーケンス用にNIDDK Genomics Coreに提出された。生シーケンスファイルは、Partek Flow (Version 10.0) のSTARを使用してHomo sapiens hg38参照ゲノムにアライメントした（コンピュータソフトウェア、Partek Inc.2020）。配列は、すべての50bp配列についてPhredスコア<30を持つ<4000万リードのカットオフ閾値を使用してフィルタリングされた。同定された24,380遺伝子のうち、バッチ効果除去、解析前データフィルタリング、および遺伝子発現の差分をDESeq2 Rパッケージを使って行った。2名の患者（HCViコホート）が品質管理に失敗し、HCViの肝臓トランスクリプトームデータを含む解析から除外され、HCViではn = 27、SVRではn = 23となった。

肝疾患の臨床的マーカー
生化学的アッセイはCobas C 501システムで行い、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）、AST、アルブミン、総ビリルビンおよび直接ビリルビンを測定した。全血球数は3 ml K2 EDTAチューブ（Ref 367856, Becton, Dickinson and Company）で採血し、Sysmexシステムで測定した。

血清免疫・微生物マーカー
HCViコホートでは合計65の血清マーカーが測定され、SVRでは65の血清マーカーのうち61が再測定された。IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-13, TNFαはV-PLEX Proinflammatory Panel 1 Human Kit (Meso Scale Diagnostics, catalogue number K15049D-1), GM-CSF, IL-1α, IL-5, IL-7, IL-12/IL-23p40, IL-15, IL-16, IL-17 とTNFβは V-PLEX Cytokine Panel 1 Human Kit (Meso Scale Diagnostics, catalogue number K15050D-1) によって評価された。IL-18はHuman IL-18 Kit (Meso Scale Diagnostics, catalogue number K151MCD-2)で、インターフェロン（IFNα、IFNβ、IFNγ、IFNλ）はU-PLEX Interferon Combo Human (Meso Scale Diagnostics, catalogue number K094K-1)で測定された。VEGFR1、bFGF、PIGF、Tie2、VEGF-A、VEGF-C、VEGF-Dは、V-PLEX Angiogenesis Panel 1 Human Kit (Meso Scale Diagnostics, catalogue number K15190D-1)を用いて測定した。E-selectin, P-selectin, sICAM3, thrombomodulinはHuman Vascular Injury Panel 1 Human Kit (Meso Scale Diagnostics, catalogue number K15135C-1)を用いて測定した。SAA、CRP、sVCAM1、sICAM1は、V-PLEX Vascular Injury Panel 2 Human Kit (Meso Scale Diagnostics, catalogue number K15198D-1)を用いて測定した。TGFβは、Human TGF-β 1 Kit (Meso Scale Diagnostics, catalogue number K151IUC-1)を用いて測定した。Eotaxin、MDC、CCL26、MIP1α、MIP1β、TARC、MCP1、MCP4、CXCL10はV-PLEX Chemokine Panel 1 Human Kit (R&D Systems, catalogue number K15047D-1); soluble CD163（sCD163）、sCD14はヒトsCD163、ヒトsCD14用 Quantikine ELISA kit (R&D Systems, Catalog number DC1630, and DC140 respectively) にて測定を行った。PDGF-AA と PDGF-BB は、Human/Mouse PDGF-AA Quantikine Elisa Kit と Human PDGF-BB Quantikine Elisa Kit (R&D Systems, catalog number DAA00B and DBB00, respectively)で測定した。CCL5、CXCL4、CXCL9はHuman CCL5/RANTES Quantikine ELISA Kit、Human PF4/CXCL4 Quantikine ELISA Kit、Human CXCL9/MIG Quantikine ELISA Kit (R&D Systems, catalog number DRN00B, DPF40 and DCX900, respectively); FGF19は Human FGF-19 Quantikine ELISA Kit (R&D Systems, catalogue number DF1900) により測定した。ゾヌリンは、Mybiosource Human Zonulin ELISA Kit（カタログ番号MBS706368）を用いて測定した。リポポリサッカライドは、Lonza QCL-1000 120 Test Kit（カタログ番号50-647U）を用いて測定した。エンドトキシンはLonza Kinetic-QCL 192 Test Kit（カタログ番号50-650U）、リポテイコ酸はGeneral LTA ELISA Kit（カタログ番号MBS288308）、ペプチドグリカンはMybiosource Human Peptidoglycan (PG) ELISA Kit（カタログ番号MBS751887）、1，3-β-DグルカンはFungitell 1,3-β-D-Glucan ELISA Kit (Associates of Cape Cod Incorporated）（カタログ番号FT001）により、測定された。HMGB1は、ELISA HMGB1, 96DET Reagent, HMGB1 ELISA kit（Tecan社製、カタログ番号ST51011）を用いて測定した。PDGFRaはPDGFRa Human ELISA Kit (Cedarlane Labs, catalogue number SEC060HU)で、iC3bはMicrovue iC3b (Quidel, catalogue number A006)で測定した。各アッセイは、各製造元のプロトコールに従って実施した。すべてのアッセイは、血清中で二重に実施した。

フローサイトメトリー
EDTA抗凝固末梢血および門脈血試料を、全血溶解法を用いてフローサイトメトリーに処理し、蛍光抗体で染色し、FACS Canto II（Becton Dickinson）で収集し、FCS Expressソフトウェア（De Novo）を使用して分析した。リンパ球は、前方散乱と側方散乱により設定したゲート（補足図2）に基づいて同定し、抗CD45と抗CD14を用いて確認した。B細胞は、直接結合したモノクローナル抗体（抗CD20、抗CD19、抗CD5、抗CD10、抗IgM、抗CD38、抗CD27）により同定された。バックグラウンド染色を確認するために、無関係な直接結合型マウスIgG1が使用された。すべてのモノクローナル抗体は、抗Vβ-11および抗CD45RA（Beckman-Coulter）、抗IgMおよび抗Vα-24（BioLegend）、抗CD4、抗CD45、抗CD14、抗CD19、抗CD10および抗CD27（Life Technologies）および抗α4β7（NIH AIDS Reagent Program、国立アレルギー・感染症研究所（NIAID）、NIH）以外はBecton Dickinsonから取得された。使用した抗体の希釈率/量、会社名、カタログ番号については、補足表10を参照。

ノンターゲットグローバル代謝物プロファイリング
Metabolon社は、以下に詳述するように、両タイムポイントにおいて末梢および門脈の血清中のグローバルメタボロミクスアッセイを実施しました。サンプルハンドリング、品質管理、データ抽出、生化学的同定、データキュレーション、定量化、データ正規化については、以下に詳述するように実施しました59。

29名の患者から得られたオリジナルのHCViメタボロームデータには、合計1,541の代謝物が含まれ、HCVi内のメタボローム解析に使用されました (SourceData_Metabolites_IndividualCohorts)。同様に、23人の患者のSVRメタボロームデータには合計1,786の代謝物が含まれており、SVR内のメタボローム解析に使用されました（SourceData_Metabolites_IndividualCohorts）。HCViとSVRの両コホートの23人の患者についてペア解析を行うために、HCViコホートの12個のアンカーサンプルまたはテクニカルレプリケートを再提出して、SVR血清サンプルと同時に分析し、2つのデータセットの統合を促進しました。統合のために各代謝物について50%の充填値が必要であり、その結果、この基準を満たさない代謝物は最終的な統合データセットから除外されました。このアンカー解析により、HCVi と SVR コホート間のペア解析に使用する 1,256 の代謝物が生成されました (SourceData_Metabolites_PairedCohorts)。すべてのサンプルは、Metabolonのグローバル代謝プロファイリング（HD4）および複合脂質パネル（CLP）プラットフォームで分析されました。実験サンプルは、分析プラットフォーム間でバランスのとれた等価な方法でロードされ、さらなる正規化なしで分析されました。

代謝物は、メタノールで2分間激しく振盪しながら抽出し（Glen Mills Genogrinder 2000）、その後遠心分離した。得られた抽出物をアリコートに分け、乾燥させた後、酸性または塩基性の液体クロマトグラフィー（LC）適合溶媒に再構成し、4種類の高速液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析（UPLC-MS/MS）法60で分析した。2つのアリコートを、それぞれ親水性化合物または疎水性化合物用にクロマトグラフィー的に最適化した、酸性のポジティブイオン条件を用いて分析しました。親水性化合物の検出には、0.05%のパーフルオロペンタン酸と0.1%のギ酸を含む水とメタノールを用いたC18カラム (Waters UPLC BEH C18-2.1 × 100 mm, 1.7 µm) から抽出物をグラジエント溶出させた。疎水性化合物については、メタノール、アセトニトリル、水、0.05%パーフルオロペンタン酸、0.01%ギ酸を用いたC18カラム (Waters UPLC BEH C18-2.1 × 100 mm, 1.7 µm) から抽出液をグラジエント溶出し、有機物含有量を全体的に高くして運用しました。3番目のアリコートは、塩基性マイナスイオン最適化条件を用い、水と6.5mM重炭酸アンモニウム含有メタノールを用いた別の専用C18カラム（Waters UPLC BEH C18-2.1 × 100 mm, 1.7 μm）でグラジエント溶出して分析されました。最終アリコートは、水と10 mMギ酸アンモニウムを含むアセトニトリルからなるグラジエントを用いたHILICカラム（Waters UPLC BEH Amide 2.1 × 150 mm, 1.7 µm）から溶出後、負電離で分析されました。質量分析 (MS) 分析は、ダイナミック排除を使用して MS とデータ依存の MS2 スキャンを交互に行い、スキャンは 80 ～ 1,000 m/z の範囲で行いました。代謝物は、保持時間、分子量（m/z）、好ましい付加体およびインソースフラグメント、ならびに関連するMSスペクトルを含む化学標準エントリーの参照ライブラリと実験サンプルのイオンフィーチャーを自動比較することによって同定され、品質管理のためにMetabolon61で開発したソフトウェアを使用して目視検査によってキュレーションされました。

循環短鎖FAsの測定
末梢血漿および門脈血漿の短鎖FAの検出と定量は、Thermo Scientific Vanquish UPLCおよびThermo Scientific Altisトリプル四重極質量分析計を用い、加熱エレクトロスプレーイオン化（ESI；HESI-II, Thermo Scientific）の負イオンモード（3500 V）で分析および特性評価した。内部標準溶液は、2-エチル酪酸を含むMeOHで調製した。短鎖FFA標準は、酢酸（C2）、プロピオン酸（C3）、酪酸（C4）、吉草酸（C5）およびカプロン酸（C6）を異なる範囲の濃度で混合した。50マイクロリットルの混合短鎖FFA標準溶液を300マイクロリットルのIS溶液に加え、5分間ボルテックスした後、250マイクロリットルの混合溶液をLC-MSバイアルに移しました。血漿サンプル50μlにIS溶液300μlを加え、5分間激しくボルテックスした後、4℃で遠心分離し、透明上清250μlをLC-MSバイアルに移した。標準品、試料とも200 mM 3-ニトロフェニルヒドラジン20 µl、75%メタノール中の320 mM N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide, HCl (EDAC) 20 µl、メタノール中の16%ピリジン20µlを加えて誘導体化した。誘導体化反応は4℃で24時間インキュベートされた。最後に、誘導体化溶液（2μl）はUPLC-ESI-MS/MSによって分析された。逆相分析は、Acquity UPLC BEH C 18 カラム (1.7 μm, 2.1 × 100 mm) を介して40℃で行い、サンプルはオートサンプラーで4℃に維持した。溶媒A (水中0.1%ギ酸) と溶媒B (アセトニトリル中0.1%ギ酸) からなる移動相を流速 0.35 ml min-1 で送り、各注入に12分かかった。グラジエント溶出は以下の通りであった。B% = 15, 15, 55, 100, 15 (0, 0.25, 7.25, 8.75, 11.25 min)とした。短鎖FFAの定量は、MS/MSトランジションに基づいて行った。標準試料はR2 > 0.99で校正されました。

循環リポ蛋白粒子の測定
門脈および末梢血漿脂質（総コレステロール、トリグリセリド、高密度リポタンパク質（HDL）-C）を Cobas6000 (Roche Diagnostics)で測定した。血漿リポ蛋白粒子数は、Lp4 deconvolution algorithm (LP4) を用いてリポ蛋白亜種を定量化する Vantera Analyzer (LabCorp) の核磁気共鳴法 (NMR) で測定された。NMRは本来、大きさがわずかに異なるHDL粒子を識別する高い解像力を持つが、これまでのアルゴリズムではこの能力を十分に活用できていなかった。LP4アルゴリズムでは、7種類のHDL亜種を精度よく測定し、HDL粒子の絶対濃度の系統的な過大評価（apoA-1/HDL-P比があり得ないほど低かった原因）を修正した62。NMRサブクラス信号面積を血漿アポA-1濃度に対して回帰することにより、新しいHDLサブクラス信号から粒子への変換係数が決定され、従来のHDLP値よりも30%程度低い「キャリブレーション済み」HDL粒子濃度（cHDLP）が算出されました。このプラットフォームでは、H1PからH7Pまでの6種類のHDL亜種を、最も低いHDL粒子濃度（H1P）から最も高いHDL粒子濃度（H7P）まで定量化することができます。また、従来のデコンボリューションモデルでは、血漿タンパク質のバックグラウンド信号の不完全なモデル化により、LDL粒子濃度が系統的に過小評価されていた点が修正されました。その結果、キャリブレーションされたLP4 LDL粒子濃度（cLDLP）は、約350 nmol l-1高くなったが、以前のLDL-P値と高い相関（r = ~0.95）を保ち、心血管疾患との強い関連性も同等に保たれたままであった。最後に、大規模な集団サンプルから得られたコレステロール、トリグリセリド、アポリポタンパクの独立した化学的測定値に対するサブクラス信号領域の線形回帰により、NMR由来の脂質およびアポリポタンパク濃度の報告を可能にする変換係数が生成されました。現在のソフトウェアでは45のパラメータが報告され、同時に新しいNMR炎症バイオマーカー（GlycA）62と、糖尿病リスクの評価や長寿の予測のために選択したNMRパラメータを「スコア」に結合する5つのマルチマーカーが測定されています。これらは、Lipoprotein Insulin Resistance Index (LP-IR), Insulin Resistance Diabetes Risk Factor Index (IRDRF), Short-term Diabetes Risk Factor Index (SDRF), 5-Year Diabetes Risk Factor Index (DRF5) and NMR Longevity Index (LGVX) を含んでいる。門脈および末梢血漿で測定したリポ蛋白粒子から算出したこれらのスコアを報告した。

オミックスデータのバイオインフォマティクスと統合的解析
SNF
Wangらによって開発されたSNFは、異なるデータソースから共有される情報と補完的な情報の両方を体系的に捉えるデータ統合手法であり17、我々はこれを利用した。計算はすべてR 4.0.2 (R Core Team 2020) 上で、RパッケージのSNFtoolとbnstruct (https://www.r-project.org) を用いて実施した。

HCVi代謝物
まず、末梢と門脈のデータセットが同じ分析物のセットを含んでいることを確認しました。各データセット内には、脂質、ヌクレオチド、アミノ酸など、25のパスウェイクラスにまたがる1,541の代謝物が含まれています。各データセットに対して、互いに独立した以下のステップを実施しました。各代謝物クラスは standardNormalization 関数を用いて正規化し、これを用いて dist2 関数を用いて患者（n = 29）間の距離を計算した。得られた 29 x 29 の距離行列は，スケーリングされた指数関数的類似性カーネルを通して親和性行列に変換された．変換にはaffinityMatrix (K = 10, σ = 0.5)関数を使用した。Kは最近傍の数を表し、σは局所モデルの分散を測定するハイパーパラメータである。親和性行列Wは、患者iとj間のエッジが、患者間の類似度であるエッジ重みW(i,j)を持つ患者類似度ネットワークグラフを記述している。このプロセスを25の経路クラスすべてについて繰り返し、25の親和性行列を得た。これらの行列は、SNF (K = 10, t = 25) 関数を用いて融合された。KはSNF解析アルゴリズムのk-nearest neighboursの部分における近傍の数を表し、tは融合プロセスにおける反復の数である。融合された行列は、25人の患者ネットワークの包括的な情報を含んでいる。最後に、融合された親和性行列にspectralClustering(C=2)関数を適用して、患者を2つのグループにクラスタリングしました。Welchのt-testを用いて、各群の平均Ishakスコアを比較した。

HCViサイトカイン
まず、末梢血と門脈のデータセットが同じ分析物セットを共有していることを確認しました。データセット間で65種類のサイトカインが共通していました。サイトカインデータの前処理として、欠損データの省略とインピュテーションを行った。Wangらに従って、20%以上の欠損データを持つサイトカインは解析から除外された（このカットオフに該当するものはなかった）。残りの欠損データは、Rパッケージbnstructのk-nearest neighbours'アルゴリズムを用いてインプットされました。代謝物のデータセットでは、パスウェイクラスに基づいて分析物をグループ化することができましたが、サイトカインではグループ化する明確な方法がありませんでした。したがって、各データセットについて1つのアフィニティーマトリックスを作成しただけであり、この場合、融合アルゴリズムは必要なかった。我々は前述のステップに従い、患者の類似性情報を伝える2つのアフィニティマトリックス（1つは末梢血データセット用、もう1つは門脈データセット用）を構築した。スペクトルのクラスタリングを用いて、2つのグループを得た。Welchのt検定を用いて、各群のIshakスコアの平均を比較した。

ロジスティック回帰
ロジスティック回帰のモデリングには、Python パッケージの Scikit-Learn (https://scikit-learn.org) を利用した63。すべての計算はPythonバージョン3.9.5で行われた。患者のイシャクスコアは、バイナリ変数に変換された。患者を均等にするために、3以下のイシャクスコアは「0」、3より大きいスコアは「1」とラベル付けされた。スペクトラルクラスタリングのアルゴリズムに従い、親和性行列の正規化ラプラシアンであるLを求め、Lの最小の固有値2つと関連する固有ベクトルを列とする29×2行列を構築した。この29×2行列に対してロジスティック回帰モデルの訓練とテストを行った。モデルは23個のトレーニングサンプルと6個のテストサンプルを持つ20通りのトレーニング/テストセットの組み合わせでトレーニングおよびテストされた。モデルの精度は、テストセットの平均精度と平均F1スコアで評価した。

糞便サンプルの16S rRNA解析
HCViおよびSVRの糞便サンプルを採取し、-80℃で急速凍結保存した。PowerSoil DNA Isolation Kit（MO BIO、カタログ番号 12888-100）を用いて、糞便からの DNA 抽出のための修正プロトコールに従って、全 DNA を抽出した64。カラム結合精製の代わりに磁気ビーズ精製を使用した。16S SSU rRNAのV4領域をターゲットとするプライマー（515f-806r）を用いて、全DNAから16S領域を増幅した。16Sアンプリコンのペアエンドシーケンスは、NIDDK Genomics CoreがIllumina MiSeq（2 × 150 bp）を用いて実施した。ペアエンドFASTQファイルは、メリーランド州ベセスダのNIAID Office of Cyber Infrastructure and Computational Biology (OCICB) https://nephele.niaid.nih.gov のNepheleプラットフォーム上のQIIME v1.9.1 で処理および解析された。前処理として、Phred quality scoreの最小値は19、Phred offsetの最小値は33とした。リードの結合は、max bad run length 3、minimum overlap length 10、overlap内の差分25%というパラメータで行った。アライメントには、参照データベースGreengenesを用い、配列類似度99%で既知の細菌配列と操作上の分類単位をマッチングさせた。

SparCCを用いた糞便中の16S rRNAの腸内生態系解析
糞便16S rRNAから分類群間相関を推定するために、組成データから相関値を推定する手法であるSparCC35を活用した。計算はPython 3.9.5上でPythonモジュールSparCC (https://github.com/JCSzamosi/SparCC3)を用いて行った。まず、糞便中の16S rRNAから得られる微生物属の相対存在量の相関を計算した（合計342属）。次に、Friedman et al.が記述したように、100個のシャッフルデータセットを生成し、それぞれのシャッフルデータセットについて相関を計算した。最後に、各成分ペアについて、相関の統計的有意性を両側比較で判定するため、擬似P値を算出した。各成分対の擬似P値は、対応する相関値が少なくとも元のデータと同様に極端であるシャッフルされたデータセットの割合として定義される。

糞便サンプルの微生物メタトランススクリプトミクス解析
16S rRNA解析の項で述べたのと同じ糞便サンプルを用いて、TRIzol（カタログ番号15596026）とQiagen RNA Extraction Kit（カタログ番号74104）を用いてtotal RNAの抽出を行った。DNAase (Ambion Turbo DNA Free Kit; Invitrogen, カタログ番号 AM1907) を加えてDNAを消化し、RNAを残してcDNAライブラリーを形成した。すべてのcDNAライブラリーは、KAPA Biosystems Illumina qPCRキット（Roche、カタログ番号07960140001）を用いて定量化した。cDNAライブラリーは正規化され、Illumina HiSeq 4000シーケンス用にNIDDK Genomics Coreに提出された。すべての糞便サンプルは、各塩基対で最低Phred quality scoreが30になるようにトリミングされた最低4000万のシングルエンドリードを有していた。

メタトランスクリプトミクス参照遺伝子カタログの作成とサンプルの定量化
HCViの26の糞便サンプルとSVRの23の糞便サンプルのイルミナ生メタトランススクリプトミクスデータを、MOCAT2パイプライン65を用いて処理した。簡単に説明すると、FastXプログラム（http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/）を用いて、長さ30 bp、品質20 bpのカットオフで生シーケンスリードをトリミングし、品質フィルター（MOCAT.pl rtf）をかけた。高品質リードは、SOAPAligner (version 2.21) を用いて、提供されたヒトゲノムデータベース (hg19, Genome Reference Consortium Human Reference37) に対してヒト汚染がないかスクリーニング (MOCAT.pl -s hg19) された。スクリーニングされたリードは、SOAPDenovoソフトウェア（バージョン2.04）を用いて、最小長500 bpの連続配列（コンティグ）（MOCAT.pl -a -r hg19）にアセンブルされました。MOCAT.pl -make_gene_catalog -assembly_type assembly -r hg19は、MetaGeneMarkソフトウェア（バージョン3.38）により、長いコンティグから遺伝子を予測し、CD-HITにより、非冗長遺伝子群にクラスタリングして構築されたものである。

高品質リードは、SOAPAligner (version 2.21) を用いて、95%同一性カットオフで注釈付き遺伝子カタログにマッピングされ (MOCAT.pl -s samples.padded -r hg19 -identity 95) 、一意にマッピングされたすべての配列は、微生物転写物の定量に用いられた65。

共分散クラスタリングによるメタトランススクリプトームのデノボアッセンブリー；分類学的アノテーション
遺伝子カタログは、co-abundanceによってクラスタリングされた19。簡単に説明すると、Canopy クラスタリングアルゴリズムは、データが収束するまで、多次元ピアソン相関空間における点（予測遺伝子）の永久的な反復を実行する。https://github.com/fplaza/mgs-canopy-algorithm。この方法により、メタトランススクリプトームのde novoアセンブリを行うことができる。Co-abundanceクラスタリングの結果、HCViでは696のCAG、SVRでは642のCAGが得られた。HCViでは24個、SVRでは14個のCAGが存在し、それぞれ700個以上の遺伝子を持つ最大のCAG（転写活性の高い微生物種と呼ばれる）だけが下流解析のために選択された。転写活性微生物種を分類学的に注釈するために、各CAGからのカタログ遺伝子を、95％の同一性の閾値でBLASTN（バージョン2.10.0+, NCBI ntデータベース, March 2020 release https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome ）を使用して既知の参照ゲノムにマッピングし、100bpより長いアラインメントを持つ遺伝子についてフィルタリングを行った。転写活性の高い微生物種は、与えられたゲノムに最も豊富な種を割り当てた。サンプル全体の遺伝子転写発現の中央値を用いて、主要なドライバー種のカウントテーブルを構築した。SVRにおけるM. smithiiとの相関については、微生物のmRNAシーケンスリードをNCBIデータベースにマッピングし、NCBI分類学的レベルに基づいて転写活性を定量化した。

機能的オルソログのプロファイリングと分類学的アノテーション
KO 遺伝子から微生物機能プロファイルを作成するために、300 万以上の異なる核酸配列からなる MetaHIT Consortium のカタログを参照した66。MetaHit の 889,668 個の核酸配列を、Partek Flow (Version 10.0) の Bowtie (Computer software, Partek 2020) を用いてサンプルのトリミングリードにアライメントした。次に、この異なる塩基配列を4,718の微生物KO遺伝子にまとめた。これらのKO遺伝子は、2014年1月14日にダウンロードしたアノテーションに基づいてマイクロバイオーム機能KEGGモジュール67にまとめられ、下流解析のためのメタトランススクリプトミクス機能ポテンシャルを形成した。個々の機能的オーソログは、99％の同一性と95％のカバレッジの閾値でBLASTN（バージョン2.10.0+、NCBI ntデータベース。 2020年3月リリース）を使用して分類学的に注釈を付けた。

転写活性の高い微生物種に関するドライバー種解析またはリーブワンアウト解析
KEGG 機能モジュールと臨床表現型の関連性に最も寄与する転写活性微生物種を特定するために、leave-one-out 解析を行った18,68。各反復において、与えられた転写活性微生物種からの遺伝子を除外した後、表現型と KEGG 機能モジュールの関連性を計算した。そして、ある種の転写活性を持つ微生物種の遺伝子を除外した結果、KOと臨床表現型の間のスピアマン相関係数の中央値の変化が最も大きいものを、その種の重要性と定義した。

データ次元削減
知識駆動型次元削減
GAGE R パッケージ（バージョン 2.201）の kegg.gsets 関数を用いて、最新のヒト KEGG パスウェイ遺伝子セットを作成した（文献 69）。合計 19,960 個の肝臓遺伝子が KEGG パスウェイ67 にグループ化され、合計 319 個のパスウェイが作成されました。微生物 KO 遺伝子は、上記のように KEGG 機能モジュールにマッピングされた。

データ駆動型クラスタリング
HCVi および SVR のタイムポイントにおいて、どの肝遺伝子または門脈代謝物が同様のクラスタに共発現しているかを評価するため、R パッケージとして提供されている WGCNA (version 1.69) フレームワーク70を用いて、肝トランスクリプトームおよび 600 Human Metabolome Database マッピング門脈代謝物に対してコンセンサスクラスタを実施した。コンセンサスクラスタは、記述されているように、WGCNA標準に従って、HCViとSVRの2つのタイムポイントにおけるペアサンプルから構築されたモジュールを使用して割り当てられました70,71。肝臓トランスクリプトームのコンセンサス WGCNA 構築のためのパラメータ選択には、ソフト閾値 β/power 16、minModuleSize 30、deepSplit 2、および門脈代謝物についてはソフト閾値 β/power 12、minModuleSize 30、deepSplit 2 が含まれています。コンセンサスWGCNAモジュールは、色でラベル付けされた70,71。

WGCNAは、HCViおよびSVRにおける独立した解析のために、門脈メタボロミクスおよび微生物KO遺伝子のクラスタリングにも利用された。HCViではHuman Metabolome Databaseにマッピングされた合計600の門脈代謝物、SVRではMetaHIT Consortiumデータベースへのアライメントから生成された微生物メタトランススクリプトームKO遺伝子を用いて、それぞれ6つの門脈代謝物モジュールと9つの微生物KOモジュールが生成されました。共発現相関は、biweight midcorrelations（データ中の外れ値の存在に対してより頑健な中央値ベースの相関指標）を実行するbicor関数を使用して計算された。スケールフリーのトポロジー基準を適用してソフト閾値β=6を選択し、符号付き重み付け代謝物ネットワークを構築した。門脈代謝物および微生物 KO 遺伝子が密に相互接続したモジュールまたはクラスターは、門脈代謝物には 4 の deepSplit、微生物 KO には 2 の deepSplit、両方のデータセットには 30 の minModuleSize を使用して、動的分岐切断法71 を実装して決定されました。あるクラスターを構成する代謝物および微生物の KO プロファイルは、クラスター固有ベクトル（代謝物量の第一主成分）で要約されます。コンセンサスWGCNAモジュールと区別するために、シングルタイムポイントWGCNAポータル代謝物モジュールは、M01からM08までの番号としてラベル付けされた（ソースデータ図5）。

次に、モジュールを、ピアソン相関、フィッシャーの漸近両側未調整P値<0.05を用いて、Ishak線維症スコア、直接門脈圧、HAI、ALT、AST、ALP、GGT、総ビリルビン、プロトロンビン時間（PT）、プロトロンビン時間国際正規化比（PT INR）およびアルブミンなどのHCViおよびSVRタイムポイントで肝臓病のマーカーとの関連性についてテストした。

パスウェイエンリッチメントとデータの可視化
HCViとSVRを比較した肝臓トランスクリプトームにおけるパスウェイのエンリッチメント
SVRと比較してHCViで変化したパスウェイを特定するために、HCViとSVRを比較するDeSeq2ペア解析で得られたFDR P値<0.1のDEG（アップレギュレートDEG 2,743 とダウンレギュレートDEG 2,380 ）を使用しました。NetworkAnalyst https://www.networkanalyst.ca を使用して DEGs の過剰発現解析を行い、パスウェイを KEGG データベースにアノテーションし、hypergeometric test を使用して濃縮度の FDR 補正 P 値を計算した。各パスウェイのFold enrichmentは、実際の遺伝子ヒット数と予想される遺伝子ヒット数の比として計算された。また、GAGE Rパッケージ（バージョン2.201）（文献69）を用いて、KEGGデータベース67からキュレートした遺伝子セットを用いて、上記DEGの遺伝子セットエンリッチメントを実施した。そして、有意に変化したパスウェイ（FDR P値<0.1）は、PathView Rパッケージ（バージョン1.20.1）を用いて可視化した。

HCViとSVRを比較する肝パスウェイの優勢な細胞位置の同定
SVRと比較してHCViでダウンレギュレートされた肝DEGsの優勢な細胞位置を特定するために、細胞成分データベースによるGOを使用した。具体的には、PANTHERのHomo sapiens referenceデータベースを用いて、FDR P値<0.1でフィッシャーの正確検定を行い、過剰発現解析を行った（参考文献72）。この細胞位置の濃縮は、HCViの線維化と逆相関する42の代謝経路をグループ化するためにも利用された。GO細胞成分パスウェイ解析において、ミトコンドリアおよび／またはペルオキシソームにFDR＜0.1で少なくとも1つヒットしたパスウェイは、ミトコンドリアおよび／またはペルオキシソームとして分類されることになった。ミトコンドリアおよび/またはペルオキシソームがヒットしないパスウェイは「その他」に分類された。

GSEAによる線維化に基づく肝パスウェイの決定
肝硬変における肝機能変化を明らかにするため、HCVi肝トランスクリプトーム（n = 27）についても、既報の濃縮法を用いて遺伝子セット濃縮解析（GSEA）を実施した73。肝硬変を疾患表現型としたpre-ranked解析は、HCVi-CirrとHCVi-NCサブグループ（HCVi-Cirr n = 12およびHCVi-NC n = 15）の比較をDeSeq2出力で行った。プレランキングの計算式はGSEAプロトコルに従った（-log10 unadjusted P value × sign (log fold change)）。参照遺伝子セットは、Baderlabs AllPathways_Go_noiea_keggappended (updated April 2019)からキュレーションしたものである。Cytoscapeで濃縮ネットワークを生成するための濃縮パラメータは、1,000回の順列による重み付け分析、遺伝子セットサイズが15〜200でフィルタリングした濃縮ネットワーク、濃縮-未調整P < 0.005 およびFDR P値 < 0.05、Jaccard重複複合係数0.375および定数0.5を含んでいた。HCVi-Cirで発現している遺伝子セットの数が多いため、ClusterMaker、WordCloudアノテーションを用いて、HCVi-Cirで発現している379のパスウェイ中の4,434遺伝子をさらに整理し、最終的にサマリーネットワークを得るために基礎生物学的プロセスに基づいて遺伝子セットを手動でグループ分けを行った73。

GSEAは、肝硬変によって層別されたサブグループ、つまり非肝硬変サブグループと肝硬変サブグループ内でHCViとSVRの間のパスウェイ濃縮解析を行うために利用された。この場合、HCVi-NC対SVR-NC、HCVi-Cirr対SVR-Cirrのペア解析では、DeSeq2出力に対して事前ランク付け解析が行われた。注目すべきは、両方のタイムポイント評価を完了した22人の患者のうち、2人の患者がHCViとSVRのタイムポイントの間で線維化カテゴリーに変化があったため、この解析から除外されたことである。すなわち、Ishak線維化スコア5～6に基づくHCVi-CirrとSVR-Cirr、n=7、Ishak線維化スコア0～4に基づくHCVi-NC vs SVR-NC, n=13であった。SVRサブグループと比較してHCViでダウンレギュレートされたパスウェイの濃縮ネットワーク可視化は、上記と同じパラメータでCytoscapeを用いて図示された。

SVRにおける微生物メタトランススクリプトーム上のパスウェイエンリッチメント
SVRのWGCNAを用いて構築した微生物機能KO遺伝子モジュール「MEgreen」に対して、一般に公開されているソフトウェアMicrobiomeAnalyst（MicrobiomeAnalystRパッケージ）を用いてパスウェイエンリッチメントを実施した。MEgreenのKO遺伝子リストをShotgun Data Profilingパイプラインの入力として使用し、MEgreenに濃縮された統計的に有意なKEGG機能パスウェイを明らかにした(https://www.microbiomeanalyst.ca)。

サブグループ比較のための統計解析
統計解析は、GraphPad Prism 8.0（GraphPad Software）およびRソフトウェア（バージョン3.5.0および4.0.2）を使用して実施した。相関と比較にはノンパラメトリック検定を専ら用いた。すべてのP値は両側で、該当する場合はFDRを用いて調整した。記述的特性は、中央値および四分位範囲（IQR）を用いて要約された。興味のあるパラメータ間の相関は、Spearman相関を用いて評価した。ペア比較は両側Wilcoxon matched-pairs signed-rank testで行い、疾患重症度に基づく非ペア比較は両側Mann-Whitney U testで行った。すべての統計解析において、データ分布は正規分布と仮定したが、正式な検証は行わなかった。

データ統合のための統計解析
すべての統計解析は、R（バージョン3.5.0）を用いて行った。3個体未満に存在する転写活性ドライバー種（CAG）、肝遺伝子、微生物KOは解析から除外された。異なるオミックスデータタイプの統合は、パイプライン18,68を使用することで実現した。要約すると、肝 KEGG パスウェイおよびマイクロバイオーム KEGG 機能モジュールのモジュールを構築した後、臨床表現型、すなわち Ishak 線維症スコア、および/または肝酵素（ALT、AST、ALP、GGT）と有意に関連する特徴のみを選択してデータセットをフィルタリングした（ベンジャミニ・ホーチバーグ FDR ＜ 0.1）。表現型の相関解析は、Pedersenらが報告したSCCbg.adjを用いて、肝パスウェイおよび微生物モジュールのバックグラウンド分布を補正したスピアマン順位相関検定で行った18。クラスタレベルでのクロスオミックス関連は、Mann-Whitney U-検定を用いて、与えられたKEGGパスウェイまたはKEGG機能モジュール内の肝遺伝子および微生物KOの順位と残りの肝遺伝子またはKOの順位を比較することで計算された。

追加資料
プロトコルの臨床試験登録番号は NCT02400216 です。

報告書概要
研究デザインに関する詳細な情報は、この論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryに掲載されています。

データの利用可能性
微生物と肝臓のトランスクリプトーム配列および微生物の16S rRNA配列データセットは、BioProjectリポジトリで公開されていることにご留意ください。このレポジトリのアクセッション番号はPRJNA727609です。血清メタボロームデータはソースデータ（SourceData_Metabolites_IndividualCohortsとSourceData_Metabolites_PairedCohorts）としてアップロードされています。図や知見を解釈するために必要な最低限の追加入力データは、必要に応じてソースデータとして提供されています。Homo sapiens hg38 reference genomeは、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000001405.26/。 ソースデータは本論文に添付されています。

コードの有無
本研究で使用したカスタムコードや数学アルゴリズムはありません。

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論文

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論文

キャス

グーグル・スカラー

参考文献のダウンロード

謝辞
患者の参加、スタッフの支援、M. W. Krause, J. E. Balow, T. J. Liangの施設支援、J. H. Hoofnagle, J. Hanover, J. Lackの原稿の重要な修正、プロトコルを承認した施設審査委員会に謝意を表する。財政的支援は、National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (DK054514) (T.H.), National Cancer Institute and Clinical Center of the National Institutes of Healthの学内プログラムにより提供された。さらに、このプロジェクトはNIH Bench to Bedside and Back Program Awardの学内助成を受けている。Mechanisms of microbial translocation in hepatitis C related liver disease 2014 (T.H.)。

著者情報
著者および所属
米国国立衛生研究所糖尿病・消化器・腎臓病研究所トランスレーショナル肝疾患セクション（メリーランド州ベセスダ、米国

Rabab O. Ali, Gabriella M. Quinn, James A. Haddad, Grace Y. Zhang, Elizabeth C. Townsend, Lisa Scheuing, Kareen L. Hill, Meital Gewirtz, Ohad Etzion & Theo Heller （米国国立糖尿病・消化器病研究所肝臓病研究部

米国国立衛生研究所糖尿病・消化器・腎臓病研究所肝臓疾患部門（メリーランド州ベセスダ、米国

Regina Umarova & Christopher Koh

米国国立衛生研究所臨床センター実験医学部免疫学サービス（メリーランド州ベセスダ

Shakuntala Rampertaap & Sergio D. Rosenzweig

米国国立衛生研究所心臓・肺・血液研究所心臓血管・肺部門（米国メリーランド州ベセスダ

Alan T. Remaley

米国国立衛生研究所・糖尿病・消化器・腎臓病研究所・生体モデリング研究室・計算医学セクション（米国メリーランド州ベセスダ

ジョン・ミン・ハン（Jung Min Han）、ヴィプル・ペリワル（Vipul Periwal

米国国立衛生研究所・糖尿病・消化器・腎臓病研究所（米国メリーランド州ベセスダ） 臨床質量分析コア

蔡宏儀・ピーター J. ウォルター

米国国立衛生研究所 臨床センター インターベンショナル・オンコロジー・放射線・画像科学センター （メリーランド州ベセスダ

エリオット・B・レヴィ

米国国立衛生研究所・国立癌研究所・米国メリーランド州ベセスダ・病理学研究室

David E. Kleiner

寄稿
すべての著者がこの研究に大きく貢献した。すべての著者は、最終提出版の原稿に承認を与えた。データの取得、解析、解釈は全著者が行った。G.M.Q., R.U., J.A.H., E.C.T., M.G. および O.E. が実質的に修正した。O.E.は本研究の設計に貢献した。R.O.A.とT.H.は、本研究のデザイン、データの取得、分析、解釈に責任を持ち、最初の著作を起草し、実質的な改訂を行った。さらに、T.H.は本研究の構想に携わった。

対応する著者
Rabab O. Ali または Theo Heller に連絡すること。

倫理に関する宣言
利益相反
著者らは、競合する利害関係を宣言していない。

査読
査読情報
Nature Microbiologyは、Pieter Dorrestein、鎌田信彦、Eric Meissner、およびその他の匿名の査読者の方々によるこの論文の査読に感謝します。

その他の情報
出版社からのコメント Springer Natureは、出版された地図や所属機関に関する管轄権の主張に関して、中立的な立場を維持しています。

拡張データ
Extended Data 図1 グラフィカルアブストラクト。
慢性HCV感染者（HCVi）では、ペルオキシソームとミトコンドリアにおける肝代謝がSVRと比較して低下している。HCViにおける線維化および壊死性炎症は、Anaerostipes hadrusを介した脂肪酸合成およびBacteroides vulgatusを介した腸内糖鎖分解の転写活性の上昇と関連していた。微生物由来の脂肪酸と糖鎖生成物は門脈循環で上昇し、HCViの門脈および肝炎の亢進に関連している。SVR後6カ月で肝および門脈の炎症が減少したにもかかわらず、線維化が進行したSVRでは肝代謝およびペルオキシソーム機能は低下したままである。Methanobrevibacter smithiiはSVR線維化で機能低下を示し、抗炎症作用がある可能性が示された。

Extended Data 図2 HCViではSVRに比べ、生化学的・組織学的な炎症マーカーが上昇していた。
Wilcoxon matched pairs signed rank test, 両側無調整p値。SVRと比較して、HCVi患者は、肝細胞の炎症に関する血清マーカー（ALT、アラニンアミノトランスフェラーゼ p < 0.0001; AST、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ p < 0.0001; GGT、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ p = 0.0001 ）、炎症の組織マーカー（HAI、肝臓活性指数） p < 0.0001; および血清総ビリルビン p = 0.0010 が上昇した。HCViは、線維化p=0.2483、門脈圧直達p=0.8175、アルカリフォスファターゼp=0.1172に有意差を認めなかった。散布図は棒グラフ、データは中央値＋/-IQRで表示。

Extended Data 図3 SVRと比較した場合のHCViにおける肝脂肪酸分解の減少。
SVRと比較してHCViで有意にダウンレギュレートされた肝KEGG機能パスウェイ「脂肪酸分解」のGAGE Rによるグラフ表示（FDRp < 0.1）。各パスウェイ内で有意なDEGは、SVRと比較してHCViでfold-change >0の場合は青色に、fold-change<0の場合は赤色にハイライトされています（FDRp < 0.1）。

Extended Data 図4 HCViまたはSVRにおける肝硬変の有無に基づく門レベルでの腸内細菌組成に有意差はない。
糞便サンプルで16 S rRNA分析を行った。肝硬変に基づく患者サブグループの円グラフにプロットされた門の相対的存在度 a) HCVi-Cirr (n = 13) と HCVi-NC (n = 16) b) SVR-Cirr (n = 9) と SVR-NC (n = 14)．解析はQIIMEを用いて行った。

Extended Data 図5 微生物メタトランススクリプトーム解析により、HCViの肝細胞傷害に関連する微生物の機能が明らかになった。
HCViコホートにおいて、AST（a）およびGGT（b）は、ヘパランおよびデルマタン硫酸分解を含む糖鎖分解に関する微生物KEGG機能モジュールと有意に相関した（SCCbg.adj、両側、FDRp<0.1）。

Extended Data Fig. 6 SVRと比較してHCViで上昇した腸内細菌の血清マーカーと腸の機能不全。
HCViとSVRコホート間の血清IL18（腸内細菌叢の異常のマーカー）とゾヌリン（腸上皮の完全性のマーカー）のペア比較（両側Wilcoxon matched pairs signed rank test、HCVi vs. SVR）。棒グラフ、データは中央値 + /- IQRで表示。Metabolonプロトコルに基づく代謝物の相対定量。

補足情報
補足情報
補足結果、図1～8、参考文献。

報告書の概要
補足表1
補足表1-16とそのタイトル、レジェンド。

補足データ1
Supplementary Fig. 1 のソースデータ。

補足資料2
Supplementary Fig. 3 のソースデータ。

補足資料3
補足図4の出典。

補足資料4
補足図5.のソースデータ。

補足資料5
末梢血、門脈血で測定されたリポ蛋白の出典データ。

補足資料6
補足表2のソースデータ。

補足動画1
HCViコホートで門脈カニュレーションを受ける患者さんの動画説明。

出典データ
ソースデータ Fig.2
Fig.2のソースデータ。

ソースデータ Fig.3
Fig.3のソースデータ。

ソースデータ Fig.
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ソースデータ Fig.
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ソースデータ Fig.
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Ali, R.O., Quinn, G.M., Umarova, R. et al. Longitudinal multiomics analyses of the gut-liver axis reveals metabolic dysregulation in hepatitis C infection and cirrhosis.（腸肝軸の縦断的マルチオミックス解析により、C型肝炎感染および肝硬変における代謝異常が明らかになった。Nat Microbiol (2022)。https://doi.org/10.1038/s41564-022-01273-y。

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2021年7月18日

受理済
2022年10月18日

掲載
2022年12月15日発行

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https://doi.org/10.1038/s41564-022-01273-y

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生理活性低下
肝臓疾患
この記事の引用元
HCV感染症における腸-肝臓軸
キラ・L・ニューマン鎌田信彦
ネイチャー・マイクロバイオロジー (2022)

ネイチャー・マイクロバイオロジー（Nat Microbiol） ISSN 2058-5276 (オンライン)

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