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B細胞特異的MhcIIは主にIgA非依存的に微生物叢の組成を制御する

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オリジナル研究論文
Front. 免疫学、2023年12月22日
粘膜免疫
第14巻-2023年｜https://doi.org/10.3389/fimmu.2023.1253674
B細胞特異的MhcIIは主にIgA非依存的に微生物叢の組成を制御する

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2023.1253674/full?utm_source=S-TWT&utm_medium=SNET&utm_campaign=ECO_FIMMU_XXXXXXXX_auto-dlvrit




メアリー・メリッサ・ローランド トリ・E・ピーコック ニア・ホール アーメド・ダウッド モハメド・ライアン・ボール エイミー・ジョリー セルゲイ・アレクセーエフ ニコラス・ドプキンス ミッツィ・ナガルカッティ プラカシュ・ナガルカッティ ジェイソン・L・クビナク* 病理学・微生物学教室
サウスカロライナ大学医学部病理学・微生物学・免疫学教室（米国サウスカロライナ州コロンビア市
背景 B細胞上の主要組織適合性複合体クラスII（MhcII）分子の発現は、リンパ濾胞の胚中心（GC）の発達に必要である。パイエル板（PP）は小腸（SI）の二次リンパ組織（SLO）であり、微生物叢に対して高親和性のTD抗体（主に免疫グロブリンA（IgA））を産生する。いくつかの研究で、他の免疫細胞によるMhcII抗原提示がTD IgA応答を調整し、微生物叢の構成を制御することが示されているが、B細胞特異的MhcIIが腸内微生物の生態系に影響を及ぼすかどうかは不明である。

方法：この疑問に答えるため、新規のRag1-/-養子移入モデルを開発した。このモデルでは、Rag1-/-マウスをナイーブCD4＋T細胞とMhcII欠損ナイーブB細胞またはMhcII欠損ナイーブB細胞で再構成した。その後、SI常在細菌群集と糞便細菌群集の16S rRNA遺伝子配列決定により、微生物叢組成のシフトを特徴付けた。

結果 実験の結果、T細胞とMhcII欠損B細胞を投与されたRag1-/-マウスでは、SLOの発現と抗同胞性TD IgA応答の再構成が誘導されるが、T細胞とMhcII欠損B細胞を投与されたマウスでは誘導されないことが示された。我々の16S実験の結果から、適応免疫は腸内の微生物生態を形成する宿主の関連因子であり、その影響はSI常在細菌群集に最も顕著であることが確認された。

結論 我々のデータはまた、MhcIIを介したB細胞とT細胞の同族間相互作用が、一般的に健康と関連する表現型である腸内の種の豊かさを維持することによって、この効果を制御していることを明確に立証している。最後に、予想に反して、我々の実験結果は、IgAがB細胞特異的MhcIIの喪失に起因する微生物叢への影響のいずれにも関与していないことを示している。以上より、我々の実験結果は、B細胞によるMhcIIを介した抗原提示が、IgAに依存しないメカニズムによって微生物叢の構成を制御し、種の豊富さを促進することを裏付けている。

はじめに
従来のCD4+ T細胞活性化の第一段階は、特殊な抗原提示細胞（APC）の表面にあるMhcII分子によって提示されたペプチド抗原をT細胞受容体（TCR）が認識することである（1）。TD体液性免疫応答では、B細胞上にMhcIIが発現することで、リンパ濾胞内のT細胞との相互作用が可能になる(2, 3)。腸管では、この同族間相互作用は主に濾胞境界と、SIに見られるSLOであるPPに見られるGC内で起こる(2)。濾胞GCの微小環境において、これらの相互作用は、B細胞に対するT細胞を介した選択の連続的なラウンドを促進し、最終的に高親和性抗体産生形質細胞またはメモリーB細胞の発生につながる(4, 5)。

IgAは腸内に分泌される抗体のアイソタイプの中で圧倒的に多く、常在菌と相互作用するIgAのほとんどは、T細胞非依存的（TiD）に成熟する形質細胞によって産生されると考えられている（6-9）。しかし、T細胞の機能を操作したいくつかの研究により、TD IgA応答が腸内の微生物生態や機能にも影響を与えることが明らかになっている（10-13）。さらに最近の研究では、MhcIIを介したT細胞の活性化とリンパ濾胞への遊走の制御が、抗共通性TD IgA応答の大きさを制御していることが示されている。例えば、樹状細胞（DC）上のMhcIIの発現を阻害すると、T細胞が活性化されリンパ濾胞へ移動するのに必要なGCの形成とTD応答が抑制され、その結果、腸内の微生物組成が異常になることが示されている（11, 13-15）。さらに、濾胞間境界に位置し、MhcII依存的に濾胞内へのT細胞の移動を抑制する自然免疫様リンパ球クラス3細胞（ILC3）も、抗同胞性TD IgA応答の大きさを減少させ、微生物叢組成を変化させることが示されている（12, 16）。しかし、B細胞はSLOにおけるMhcII発現APCの圧倒的多数を占める一方で、B細胞特異的なMhcII発現が微生物叢組成の制御に重要な役割を果たしているかどうかは現在のところ不明である。また、微生物叢組成に対するB細胞特異的MhcIIの影響がIgA依存的に作用しているかどうかも不明である。

組換え活性化遺伝子（Rag）欠損動物は、成熟Tリンパ球とBリンパ球の欠如を、同系遺伝子ドナーからの養子細胞移植によって再構成することができるため、腸内微生物の生態系に対する適応免疫の影響を研究するための理想的なモデルとなる。このモデルでは、Rag欠損動物は「非選択状態」に相当し、養子細胞移植に反応して生じる微生物生態の変化を定量化することによって、適応免疫の寄与を評価することができる。Rag1欠損マウスモデルを用いた先行研究は、腸内微生物の生態を制御する上で適応免疫の役割があることを最も早く裏付けている(17-22)。ここでは、我々が開発した新しいRag1-/-養子共移入モデルを用いた実験の結果について述べる。このモデルでは、ナイーブCD4+ T細胞とB細胞をRag1-/-マウスに共導入し、B細胞特異的MhcII発現とIgA産生を操作する。このモデルを用いて、我々は以下の2つの仮説を検証しようとした；B細胞特異的MhcIIを介した抗原提示が腸内の微生物生態系を制御すること、そしてB細胞特異的MhcIIによる微生物生態系への影響が粘膜IgAの合成を介して作用すること。我々の実験の結果は、Rag欠損動物を用いたこれらの初期の研究を補完／拡張し、B細胞特異的MhcII抗原提示が微生物叢の構成を制御すること、そしてこの効果がSI常在微生物叢において最も顕著であることを初めて実証した。しかしながら、当初の予想に反して、B細胞特異的MhcII発現が微生物叢組成に及ぼす影響は、主にIgA非依存的な機序によって作用するようである。

研究結果
Rag1-/-養子T：B共移植モデルの特徴づけ
すべての実験では、Rag1-/-マウスへの養子細胞移植が行われた（図1A）。実験では、同系WT C57BL/6ドナーから採取したナイーブ脾CD4+ T細胞と、同じマウスから採取したナイーブB細胞（以下、「WT T + WT B」処理と表記）、または同系MhcII-/-マウスから採取したナイーブB細胞（以下、「WT T + MhcIIΔ B」処理と表記）を分離・移入した。実験結果に対するT細胞または異なるB細胞ソースの独立した影響を決定するための対照として、Rag1-/-マウスの独立したコホートも、WT T細胞（以下、「WT Tのみ」処理と表記）、WT B細胞（以下、「WT Bのみ」処理と表記）、またはMhcIIΔ B細胞（以下、「MhcIIΔ Bのみ」処理と表記）で単回移植した。

図1
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図1 B細胞特異的MhcII抗原提示が微生物叢組成に及ぼす影響を調べるために用いたRag-/-養子T:B移植モデルの概要。(A）実験的治療群を示す。(B）実験デザインの概要を示す。(C）ナイーブ脾 CD4+T細胞の濃縮を示す代表的なフロープロットを示す。(D）脾B細胞の濃縮を示す代表的なフロープロットと、WTマウスとMhcII△ B細胞ドナーマウスの濃縮B細胞サブセットの比較を示す。(A, B) Biorender.comで作成。

適応免疫応答による免疫選択がない場合の腸内微生物生態のベースライン測定値を得るために、同腹の偽注射（PBSビヒクルのみ）Rag1-/-マウス（以下、「コントロール」処置と記す）もすべての実験に組み入れた。下流の16S配列解析において交絡変数となる母体環境と飼育ケージの影響を均等にするため、同腹の雌雄Rag1-/-マウスを実験コホートに無作為に割り付け、細胞移植後7週間の実験期間中、単独飼育した（図1B）。このような実験デザイン上の配慮が有効であったことは、移植レシピエントの糞便（補足図S1A）またはSI（補足図S1B）微生物叢組成に対する母体環境または性別の有意な影響の欠如によって証明されている。

サンプルの純度を決定し、WTマウスとMhcII-/-マウスから分離されたB細胞集団に質的な違いが存在し、それが下流の解釈を歪める可能性があるかどうかを評価するために、細胞分離の前後に脾臓CD4+ T細胞とB細胞集団に対してフローサイトメトリーを実施した。分離前のナイーブCD4+ T細胞（CD4+CD3ε+CD62L+CD44-）の相対量は、脾臓CD4+ T細胞プールの～36.6％であったのに対し、分離後は～97％に濃縮された（図1C）。これは、CD45RBhi CD4+T細胞の移入がT細胞媒介性大腸炎を誘発することから重要である（23）。脾臓B細胞（B220+）の相対量は、分離前では全リンパ球の70％程度であったが、分離後では98％程度に濃縮された（図1D）。さらに、精製B細胞プール内のB細胞サブセットのより包括的なフローサイトメトリー解析により、私たちの分離プロトコールでは主にナイーブな濾胞性B細胞（B220+IgDhiCD43-CD23+）が濃縮されることが確認された（補足図S3）。さらに重要なことは、フローサイトメトリーにより、分離後のB細胞プールのB細胞組成がWTとMhcII-/-ドナーの間で同等であることも証明された（図1D）。最後に、ELISPOTを用いて、脾臓B細胞分離における汚染Ig分泌形質細胞の相対量を測定した。これらの細胞は見つかったが、マウスに注入された全細胞の0.001％未満であった（補足図S4）。

Rag1-/-養子T:B移植レシピエントにおけるGALTおよび抗共通IgA応答の再構成
Rag1-/-マウスはPP anlageを有することが以前に示されている(24)が、Rag1-/-マウスはSIに目に見えるSLOを形成しない。われわれの実験から、T細胞とB細胞の養子的共導入から7週間後には、SIの壁に、WTマウスのPPで観察されたのと同様の組織分布で、視覚的に識別可能なSLOが見られることが明らかになった（図2A）。TDのIgA応答に関連する細胞サブセットに焦点を当て、これらの構造の細胞性を特徴付けるためにフローサイトメトリーを実施した。具体的には、総CD4+ T細胞（CD4+B220-）、CD4+ T濾胞ヘルパー細胞（TFH細胞）（CD4+B220-CXCR5loPD-1lo）の存在／存在量を評価した、 GC常在TFH細胞（GC-TFH細胞）（CD4+B220-CXCR5hiPD-1hi）（25）、ナイーブB細胞（B220+IgDhi）、活性化B細胞（B220+IgDlo）、およびGC B細胞（B220+IgDloFAS+GL-7+）（図2B）。フローサイトメトリー解析により、WT T細胞とWT B細胞を投与されたRag1-/-マウスから単離されたリンパ組織には3つの細胞サブセットがすべて含まれていたのに対し、WT T細胞とMhcIIΔ B細胞を投与されたRag1-/-マウスから単離されたリンパ組織には、CD4+ T細胞の総数は同程度であったが、GC-TFH細胞、ナイーブB細胞、活性化B細胞の存在量は有意に減少しており、GC B細胞はほとんど認められなかった（図2C）。

図2
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図2 Rag1-/-養子T:B移植レシピエントにおけるGALTおよび抗共通IgA応答の再構成。(A）Rag1-/-移植レシピエントにおける誘導SLOの代表的画像。(B）Rag1-/-移植レシピエントのGALTにおけるT細胞およびB細胞サブセットの列挙のための代表的なゲーティング戦略。(C) SI SLOにおける関連するT細胞およびB細胞サブセットの相対的存在量を示す。CD4＋ T細胞： Welchの異分散補正を用いたStudentのt検定；ns=有意でない。TFH細胞、GC-TFH細胞、ナイーブB細胞、GC B細胞： マン・ホイットニーのU検定、ns=有意ではない、=p<0.01、=p<0.0001。活性化B細胞： Studentのt検定；=p<0.0001。(D）各実験群について、7週間の実験期間中にELISA法で測定した糞便中IgA濃度を示す。(E）実験終了時点（移植後7週間）の最終糞便中IgA濃度を示す。多重仮説検定（全対全）のためのTukeyのポストホック補正を用いた多重t検定（ns=有意ではない, =p<0.05, **=p<0.01）。(E,F）Rag1-/-マウスにおけるバックグラウンドシグナルのゲーティングを示す代表的なFACSプロットを示す。実験群の糞便中のIgA結合細菌の量を示す（点線はRag1-/-コントロールの偽陽性閾値に基づく検出限界）。多重仮説検定のためのDunnettポストホック補正を用いた多重t検定（all-vs-'コントロール'）（ns、有意ではない、*=p<0.0001）。

移植後約2週間で、B細胞を投与されたすべてのRag1-/-マウスの糞便からIgAが検出され、糞便中のIgA濃度は移植後3週目で停滞し、7週目まで一定であった（図2D）。WT T細胞とWT B細胞を投与されたマウスは、WT T細胞とMhcIIΔ B細胞を投与されたマウスおよびMhcIIΔ B細胞のみを投与されたマウスと比較して、実験終点までに最大のIgA応答を生じた（図2E）。さらに、統計学的に有意ではなかったが、共導入マウスは、WT B細胞のみを投与されたマウスよりも高い力価を示し、共導入マウスにおける総管腔IgA濃度に対するTD IgA応答の測定可能な正味の正の寄与を示した（図2E）。フローサイトメトリーを用いて、常在細菌に結合する高親和性IgAの相対量も測定した。このアッセイを用いると、WT T細胞とWT B細胞をもらった動物だけが、高親和性の抗常在性IgA応答を生成できることがわかった（図2F）。

適応免疫はSI常在細菌群集の構成に影響を与える
T細胞とB細胞の養子移入は、単独でも組み合わせでも、系統組成（Unweighted UniFrac）（PERMANOVA、Pseudo-F1,105＝2.38、q値＝0.01）と種の相対存在量（Weighted UniFrac）（PERMANOVA、Pseudo-F1,105＝20.75、q値＝0.001）の両方に影響を与えることによって、SIの微生物生態系を有意に変化させた（図3A、C）。Rag1-/-コントロールマウスの微生物叢は非選択状態を反映しているため、治療群とコントロールRag1-/-マウスとの間の組成の違い（「乖離」）の大きさは、T細胞、B細胞、またはその両方の共移植が腸内微生物の生態系に及ぼす影響の程度を反映している。これを定量化するために、治療群と対照群のUniFrac距離を比較した。この分析から、SI微生物の生態系における最大の分岐は、T細胞を単独で、あるいはB細胞と組み合わせて投与されたグループに関連することがわかった（図3B、D）。一般に、養子細胞移植は、系統組成（図3B）よりも種の存在量（図3D）に大きな影響を与える傾向があることもわかった。最後に、腸内微生物組成の個体性の程度を反映する、あるグループ内の個体間の群集非類似度を比較すると、養子細胞移植がこの表現型を促進することが明らかになった（補足図S5）。この効果は以前、WTとRag欠損ゼブラフィッシュの微生物叢を比較した研究でも報告されている（26）。

図3
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図3 SI微生物叢組成に対するB細胞特異的MhcIIの効果。(A）養子移入が微生物叢の系統組成のシフトを引き起こすことを示す、β多様性の重み付けなしのUniFrac解析結果のPcoAプロットを示す。(B) 実験群の微生物群集における、対照群の微生物群集からの組成分岐を示す、重み付けなしの距離箱ひげ図。多重仮説検定（all-vs-controls）のためのダンの補正を用いた多重クラスカル・ワリス検定（ns、有意ではない、=p>0.05、=p<0.0001）。(C)養子縁組が細菌分類群の相対的存在量のシフトを引き起こすというβ多様性の重み付けUniFrac解析結果のPcoAプロットを示す。(D) 実験群の微生物群集における、対照群の微生物群集からの組成分岐を描いた重み付き距離箱ひげ図。多重仮説検定（all-vs-controls）のためのダンの補正を用いた多重クラスカル・ワリス検定（ns、有意ではない、=p<0.0001）。(E）B細胞特異的MhcIIシグナル伝達がSI常在微生物叢の系統組成に影響を与えていることを示す、β多様性の重み付けなしのUniFrac解析結果のPcoAプロットを示す。(F)α-rarefactionプロットは、コントロール動物とco-T:B移植レシピエント間のSI常在微生物多様性のサンプリングが等しいことを示す。多重仮説検定（全対対照）のためのダンの補正を用いた多重クラスカル・ワリス検定（ns、有意ではない、=p<0.01）。(G)WTのT細胞とMhcIIΔのB細胞を共移植したマウスでは、B細胞またはT細胞の単独移入では多様性の喪失を説明できないことを示す、β多様性の重み付けなしのUniFrac解析結果のPcoAプロットを示す。(H)コントロール動物とT細胞またはB細胞のみの移入グループ間で、SI常在微生物多様性のサンプリングが同等であることを示すα-rarefaction plotを示す。多重仮説検定（all-vs-controls）のためのDunnet補正を用いた多重t検定（ns=有意ではない、=p<0.01、=p<0.001）。(I) （左パネル）各処理群について、細菌の相対的存在量（クラス別）を円グラフで示す。(右パネル）共トランスファー処理群と対照群間の細菌量の有意なシフトを示す。多重仮説検定（all-vs-controls）のためのダンの補正を用いた多重クラスカル・ワリス検定（ns、有意ではない、=p<0.05、=p<0.01、=p<0.0001、***=p<0.0001）。(B, D）エラーバーは最小-最大範囲を表す。(F, H) エラーバーはS.E.M.を表す。

MhcIIを介したT:B細胞の相互作用は細菌種の豊富さを促進する
T細胞とB細胞の共移植は、コントロールと比較してSI常在細菌叢組成を有意に変化させた（図3Eおよび表1）。しかし、T細胞とWT B細胞の共移植動物と、T細胞とMhcIIΔ B細胞の共移植動物の間で顕著な違いが観察された。T細胞とMhcIIΔ B細胞の共導入は、Rag1-/-対照と比較して、T細胞とWT B細胞の共導入よりも系統組成の大きなシフトをもたらした（図3B）。どちらの処理群も、種の相対的存在量に同程度の影響を与えた（図3D）。驚くべきことに、T細胞とMhcIIΔ B細胞を投与されたマウスにおける微生物叢組成の大きな変化は、Rag1-/-対照マウスと比較して細菌種の豊富さが約2倍減少したことと関連していた（図3F）。これは、T細胞とWT B細胞を共導入したマウスでは観察されなかった（図3F）。

表1
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表1 治療群間の一対比較-T:Bの共導入。

T細胞とB細胞の共移植に特異的に起因する組成シフトを同定するために、Rag1-/-マウスにT細胞のみ、WT B細胞のみ、またはMhcIIΔ B細胞のみを移入した対照単移植実験を並行して行った（図1A）。これらの対照実験から、T細胞またはB細胞の単独移入がSI常在細菌群集のシフトを誘導できることが明らかになった（図3Gおよび表2）。しかしながら、共導入と単独導入の間にはいくつかの重要な違いが観察された。第一に、共導入群とは対照的に、単導入群（特にWT B細胞またはMhcIIΔ B細胞を投与された群）の微生物叢は、Rag1-/-対照マウスからの乖離が少なかった（図3B、D）。第2に、微生物叢組成は共移植群間で異なっていたが、WT B細胞またはMhcIIΔ B細胞のみを投与されたRag1/-マウス間では異なっていなかった（図3E、Fおよび表2）。第三に、WT T細胞、WT B細胞、またはMhcIIΔ B細胞の単独移植では、WT T細胞とMhcIIΔ B細胞を共移植したマウスで観察された種の豊かさの喪失を再現できなかった（図3H）。

表2
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表2 治療群間の一対比較-単回移植。

細菌群の相対的存在量に対する処置の効果を考慮すると、いくつかの興味深い観察結果が得られた。第一に、T細胞の単独移入またはB細胞との共移植は、真菌の増殖を促進し、うどんこ病と放線菌の生息量を縮小させた（図3I）。これらの傾向は共導入群間で一貫していたが、その大きさはWT T細胞とMhcIIΔ B細胞を共導入したマウスでより顕著であった（図3I）。第二に、B細胞のみの移入は、これらの動物で発達するIgA応答にもかかわらず、細菌量にほとんど影響を及ぼさなかった（図3I）。第3に、共移植は細菌群に対して治療依存性のユニークな効果を示した。特に、T細胞とMhcIIΔ B細胞を共導入したRag1-/-マウスでは、バクテロイデス門、クロストリジウム門、およびコリオバクテリア門の細菌が著しく減少し（一部の動物では完全に消失した）（図3I）、この治療群における種の豊富さの劇的な減少を説明した。T細胞やMhcIIΔ B細胞の単独移入ではこれらの効果が再現されなかったという事実は、これらの効果が共移植マウスにおけるこれらの細胞サブセット間の異常な相互作用によって引き起こされていることを示している。

B細胞特異的MhcIIは大腸の微生物生態に影響を及ぼすが、その程度は低い
糞便微生物叢のサンプリングは非侵襲的であるため、細胞移植の直前と実験終了時にサンプルを採取することができ、処理前（タイムポイント0（T0））と処理後（タイムポイント1（T1））の多様性を測定することができた。SI常在コミュニティと糞便コミュニティの組成シフトの大きさを比較することで、適応免疫がSIと大腸の微生物生態系を制御する程度を評価することもできた。SIで観察されたのと同様に、養子細胞移植は大腸の微生物叢組成に有意な影響を与えることがわかった。しかしながら、SIとは対照的に、T細胞とWT B細胞またはMhcIIΔ B細胞との共導入は、差のある影響を与えなかった（表2）。

我々の時系列実験によると、養子縁組移植前、ランダムに治療群に割り付けられたRag1-/-マウスの種の豊富さは同程度であった［図4A（T0）］。養子縁組移植後、WT T細胞とMhcIIΔ B細胞を投与されたマウスでは、種の豊かさの喪失が特異的に観察された［図4A（T1）］。さらに、同じマウス内でT0とT1における種の豊かさを対で比較すると、WT T細胞とMhcIIΔ B細胞をもらったマウスにおける種の豊かさの喪失は、これらのマウスのほぼすべてがこの表現型を発症したことから、高度に予測可能な表現型であることが明らかになった（図4B）。

図4
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図4 糞便微生物叢組成に対するB細胞特異的MhcIIの影響。(A）（上段）各処置群の糞便群集の種濃度を示し、養子縁組直前の種濃度が同等であることを示す（タイムポイント0（T0）サンプル）。(下段）各処置群の糞便群集から得られた種の豊かさの値を示し、観察された種の豊かさの損失が、WT T細胞とMhcIIΔ B細胞との共移植の特異的な結果であることを示す。多重仮説検定（全対対照）のためのダンの補正を用いた多重クラスカル・ワリス検定（ns、有意ではない、=p<0.01）。(B)WTのT細胞とMhcIIΔのB細胞を受け取った共移植マウスにおける種の豊かさの喪失が、非常に再現性の高い表現型であることを示す、養子細胞移植前後の動物の対になった種の豊かさの値を示す。個々の対のt検定（ns、有意ではない、=p<0.01、=p<0.001）。(C）（左パネル）タイムポイント0（T0）の各処置群について、細菌の相対的存在量（クラス別）を円グラフで示す。(右パネル）養子縁組前の細菌量は治療群間で差がない。多重仮説検定（all-vs-controls）のためのダンの補正を用いた多重クラスカル・ワリス検定（ns=有意ではない）。(D) (左パネル) 移植後7週目(T1)の各処置群について、細菌の相対的存在量(クラス別)を描いた円グラフを示す。(右パネル)共移殖処理群と対照群間の細菌量の有意なシフトを示す。多重仮説検定（all-vs-controls）のためのDunnの補正を用いた多重Kruskal-Wallis検定（ns、有意ではない、=p<0.05、=p<0.01、=p<0.0001、=p<0.0001）。(E)微生物群における群内（「対照群対対照群」）対群間（「対照群対移入群」）の組成分岐を描いた距離箱ひげ図。(左パネル）重み付けなしのUniFrac解析に基づく距離ボックスプロットは、微生物叢組成の系統的シフトが、養子移入後の糞便叢と比較してSI常在コミュニティで大きいことを示している。(右パネル）重み付けUniFrac解析に基づく距離箱ひげ図は、細菌量のシフトが、養子縁組後の糞便群集と比較して、SI居住者群集でより大きいことを示す。多重仮説検定（全対対照）のためのダンの補正を用いた多重クラスカル・ワリス検定（**=p<0.001, ****=p<0.00001）。エラーバーはデータの最小-最大範囲を反映する。

予想されたように、細菌群の相対的な存在量はT0では実験コホート間で差がなく（図4C）、T細胞およびB細胞でマウスを再構成した後（T1）で初めて明らかになった（図4D）。T1の糞便群集で観察された細菌量のシフトは、わずかな例外を除き、SI常在の群集で観察されたものと概ね同じであった。SIと一致して、T細胞の移入はB細胞の有無にかかわらず、真菌の存在量を増加させ、放線菌の存在量を減少させた（図4D）。これらの傾向は共移植グループ間で一貫していた。しかし、SIとは対照的に、T細胞とMhcIIΔ B細胞の共導入は、糞便群集におけるうどんこ病菌の存在量を減少させず、疣贅菌の増殖と関連していた（図4D）。このグループにおけるErysipelotrichiの維持とVerrucomicrobiaの拡大は、MhcIIΔ B細胞の移入によって引き起こされた可能性が高く、この処置は単一移入マウスで両方の表現型を再現するのに十分であった（図4D）。これ以外に、単回移入対照で説明できないような、共移植群における表現型の差は観察されなかった。最後に、SI常在菌群集と糞便群集の組成シフトを比較したところ、本モデルでは、適応免疫が糞便群集と比較してSI常在菌群集により大きな影響を及ぼすことが明らかになった（図4E）。

微生物叢組成に対するB細胞特異的MhcIIの効果は、ほとんどがIgA非依存的である
我々は、T細胞とB細胞を共導入したRag1-/-マウスの微生物叢で観察された組成のシフトは、これらのコホートで生成されたIgA応答の質に観察された違いによるものであるという仮説を立てた。この仮説から、我々は2つの予測を立てた。第一に、MhcII欠損B細胞のIgA分泌能の欠損は、WT T細胞およびWT B細胞を投与された動物で観察されたようなシフトを生じさせないと予測した（図3I）。第二に、IgAの欠損は、WT T細胞とMhcIIΔ B細胞を共導入したRag1-/-マウスで観察された種の豊かさの喪失とバクテロイデス属とクロストリジウム属の深刻な減少を再現すると予測した（図3F、I）。これらの予測を検証するために、Rag1-/-マウスをWT T細胞とWT B細胞、またはWT T細胞とIgA-/-マウス由来のMhcII欠損B細胞（IgAなし）(27)、またはAID-/-マウス由来のMhcII欠損B細胞（IgGまたはIgAなし）と共導入する最後の養子移入実験を行った（図5A）(28, 29)。

図5
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図5 微生物叢組成に対するB細胞特異的MhcIIの効果は、主にIgA非依存的機序によって作用する。(A）実験的治療群を示す。Biorender.comで作成。(B）SI常在微生物群集（左のパネル）と糞便微生物群集（右のパネル）の間のβ多様性の重み付けUniFrac解析のPcoAプロットは、IgAの喪失が、T細胞とB細胞の共同移入によって引き起こされる細菌量のシフトに顕著な影響を与えないことを示している。(C)実験コホート間でSI常在(上パネル)と糞便(下パネル)の微生物多様性が等しくサンプリングされていることを示すRarefactionプロットを示し、TD IgAを生成できないことが、WT T細胞とMhcIIΔ B細胞の共移植マウスで観察された種の豊かさの減少を説明しないことを示す。(D）（左パネル）SI常在菌の相対的存在量（クラス別）を円グラフにしたものを、各処置群対対照群について示す。(右パネル) 共移植処置群対対照間の細菌存在量の有意なシフトを示し、IgAを生成できないことが共移植後のSI常在細菌存在量に影響を及ぼすが、WT T細胞およびMhcIIΔ B細胞を投与された共移植マウスで観察された存在量のシフトを説明しないことを示す。多重仮説検定（all-vs-controls）のためのDunnの補正を用いた多重Kruskal-Wallis検定（ns、有意ではない、=p<0.0001）。(E）（左パネル）移植後7週目における各処置群対対照群の糞便細菌の相対的存在量（クラス別）を円グラフで示す。(右パネル)共移植処置群対対照間の細菌存在量の有意なシフトを示し、IgAを生成できないことが共移植後の糞便細菌存在量に影響を及ぼすが、WT T細胞およびMhcIIΔ B細胞を投与された共移植マウスで観察された存在量のシフトを説明しないことを示す。多重仮説検定（all-vs-controls）のためのDunnの補正を用いた多重Kruskal-Wallis検定（ns、有意ではない、=p<0.05、=p<0.0001）。(F)IgAが微生物叢を多様化させ、SI常在コミュニティ組成に最も強い影響を及ぼすことを示す。多重仮説検定（全対対照）のためのDunnettポストホック補正を用いた多重t検定（ns、有意ではない、****=p<0.0001）。エラーバーはデータの最小-最大範囲を表す。

前回と同様に、B細胞源や部位（糞便対SI）にかかわらず、細胞の養子的共導入は微生物叢組成を有意に変化させた（図5B）。しかし、治療群別のパターンを解析すると、IgA-/-またはAID-/-ドナー由来のB細胞とWT T細胞の共導入は、糞便中の微生物生態系を有意に変化させたが、SI常在の微生物生態系は変化させなかった（表3）。IgA-/-とAID-/-の共導入群間で、糞便中あるいはSI常在微生物組成に有意差は認められなかった（表3）。このことは、我々のモデルにおいて、粘膜IgGが腸内細菌叢組成の制御に無視できるほどの影響を及ぼさないことを示している。最後に、IgA-/-処置群およびAID-/-処置群と、WT T細胞およびWT B細胞を共導入したマウスとの間では、糞便またはSI常在微生物群集の系統学的組成にわずかな差異しか観察されなかった（図5Bおよび表3）。さらに、WT T細胞およびMhcIIΔ B細胞を共導入した動物で観察された種の多様性の約2倍の損失（図3F）は、IgA-/-およびAID-/-共導入群のいずれもこの表現型を再現できなかったことから、IgAの欠損では説明できない（図5C）。

表3
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表3 処置群間の一対比較-IgA実験。

SIおよび糞便群集における細菌群の相対的存在量を考慮すると、いくつかの観察結果が得られた。SI常在コミュニティ（図5D）および糞便コミュニティ（図5E）の両方において、IgA合成の喪失は、細菌の存在量に影響を及ぼすT：B細胞の共移植の能力を低下させることがわかった。具体的には、MhcIIは充足しているがIgAは欠損しているB細胞とT細胞を共移植すると、IgAを合成できるMhcII充足B細胞と共移植したマウスで以前観察されたうどんこ病菌の拡大およびうどんこ病菌と放線菌の収縮が抑制された（図5D）。これらの結果は、我々のモデルで作用する免疫選択のメカニズムの一つとして、粘膜IgAの明らかな影響を示している。しかしながら、IgAの喪失は、T細胞とMhcIIΔ B細胞を共導入したマウスで観察されたユニークな組成シフトを説明することはできなかった。具体的には、IgA合成の消失は、T細胞とMhcIIΔ B細胞を共導入したマウスのSI常在コミュニティで観察されたバクテロイデス属とクロストリジウム属の減少を再現できなかった（図5D）。糞便群集では、IgAの欠損により、真菌と疣贅菌の増殖が抑制され、コリオバクテリアが中程度に増加した（図5E）。

最後に、Rag1-/-対照マウスの非選択状態と比較した微生物群集の組成分岐を比較することにより、治療群間の免疫選択の強さを比較した。WTのT細胞とWTのB細胞を投与されたRag1-/-マウスでは、WTのT細胞とIgA欠損のB細胞を投与された実験コホートで観察されたものと比較して、対照のRag1-/-マウスからの組成分岐が有意に大きいことが観察された（図5F）。さらに、糞便微生物群集の組成分岐は処理群間で一貫していたことから、これはSI常在微生物群集に特有の効果であることが観察された（図5F）。これらの実験結果を総合すると、IgAは腸管における免疫選択に関連する力であり、その効果はSIにおいてより強いことが示された。しかし、我々のモデルでは、粘膜IgAは、B細胞特異的MhcIIが腸内の微生物生態系に影響を及ぼす主要な手段ではない。

考察
Rag欠損ゼブラフィッシュやマウスを用いた初期の研究は、適応免疫が腸内の微生物生態を形成する自然選択の力として機能することを立証する上で重要であった。例えば、初期のゼブラフィッシュ研究では、Rag欠損ゼブラフィッシュがWTの兄弟と比較して異常な微生物叢組成を形成し、Rag欠損ゼブラフィッシュへのT細胞の養子移入が特定の常在微生物の生育を制御することが示された(30)。別のゼブラフィッシュ研究では、微生物叢の組成に対するRag欠損の影響は検出できなかった（すなわち、WTとRag欠損の治療群間で組成の差はなかった）が、適応免疫が個体間のよりユニークな微生物群集の発達に寄与すること（すなわち、Rag欠損動物と比較してWTの間で微生物叢組成の非類似性が増加すること）は示された（26）。Rag1欠損マウスモデルを用いた観察は、ゼブラフィッシュで行われた観察をほぼ支持し、さらに発展させたものである(17, 21)。さらに最近、Rag1欠損マウスを用いた研究から、適応免疫反応によって微生物叢に及ぼされる選択の性質について新たな知見が得られた。具体的には、Rag1欠損マウスを用いて、適応免疫が常在微生物の分子進化速度を制御する役割を果たしている可能性が最近示された(22)。また、無害な常在微生物よりもむしろ特異的な病原微生物に焦点を当てた選択により、適応免疫系が遺伝的に異なる個体間で微生物組成の個体差を有利にする仕組みが説明できるかもしれない(31)。MhcIIを介した抗原提示は、適応免疫の中心である。B細胞によるMhcIIを介した抗原提示が腸内微生物の生態系を制御しているという仮説に取り組むため、我々はRag1-/- T:B共同細胞移入モデルを開発した。実験の結果、B細胞特異的MhcIIが、微生物群集の系統組成、種の相対的存在量、種の豊富さに影響を及ぼすことが示された。

IgAは腸内細菌叢の組成を形成し、B細胞はT細胞依存的（TD）経路とT細胞非依存的（TiD）経路の両方を通じてIgAを分泌するように誘導される。以前の研究では、腸内に分泌され常在細菌と結合するIgAの大部分は、主にB-1細胞から産生されるTiD反応に由来する多反応性IgAであることが示された(32)。しかし、われわれのモデルでは、Rag1-/-マウスの非特異的バックグラウンド染色を超えて、IgA結合細菌を検出するためには、WT T細胞とWT B細胞の共移植が必要であることがわかった。この食い違いは、脾臓（移植B細胞の供給源）に比較的低濃度で存在するB-1細胞ではなく、濾胞B-2細胞を主に単離・移植することによって、我々のモデルでTD応答に偏っているという事実によって説明できると思われる。TD IgA応答は、T細胞とSLOの3つのMhcII発現細胞サブセット（DC、ILC3、B細胞）との間の同族間相互作用によって駆動される。いくつかの研究により、抗同胞性TD IgA応答は、微生物叢の分類学的組成と機能に作用する淘汰の力であることが示されている（10, 33-36）。さらに、MhcIIコンディショナルノックアウトマウスモデルを用いた最近の研究では、DCおよびILC3によるMhcII発現が、腸SLOにおけるGC応答の強さ、常在微生物に対して生じるTD IgA応答の大きさ、ひいては微生物叢の構成に影響を及ぼすことが示された（11-16）。

これらの既往の観察に基づき、微生物叢組成に対するB細胞特異的MhcII切除の観察された効果は、TD IgA依存的に作用すると予想された。我々の実験における微生物叢組成の最も顕著なシフトは、WT T細胞とMhcIIΔ B細胞を共導入したRag1-/-マウスで発達したSI常在微生物群集で観察された。2つの重要な対照群を含めることで、この効果が主にT細胞依存的に、しかし大部分はIgA非依存的に作用することが明らかになった。第一に、IgA応答を産生するB細胞の単独移入は、観察されたこれらの組成シフトを再現しなかった。従って、これらのシフトを引き起こすにはT細胞が必要である。第二に、WT T細胞とIgA-/-マウスおよびAicda-/-マウス由来のB細胞の共移植でも、これらの効果は再現されなかった。従って、B細胞特異的MhcIIは主に、抗同胞性TD IgA応答の生成以外のメカニズムで微生物叢の組成を制御しているようである。驚くべきことに、MhcIIが介在するTD IgA応答によって特異的に駆動されると思われる微生物叢への影響は、糞便群集におけるVerrucomicrobiaの相対的な存在量の違いだけであった。我々の結果から推測すると、糞便群集におけるVerrucomicrobiaの増殖は、MhcIIΔ B細胞（単独またはT細胞との共導入）の存在と無傷のIgA応答とに特異的に関連しているようである。MhcIIΔ B細胞を投与されたマウスはTiD IgAを産生する能力しかない。したがって、IgA応答がないマウスや、MhcIIを介したTD IgA応答が可能なマウスでは、Verrucomicrobiaが増殖しないことから、B細胞特異的なMhcII発現が、大腸におけるこの細菌群の存在量を制御するために特に重要である可能性が示唆される。この結論と一致するように、以前の研究で、TD IgA応答は腸内でこの菌種に対して特異的に指向されることが示されている(37)。

我々の実験の結果、CD4+ T細胞の移入のみで、微生物叢の組成が有意に変化することが示された。具体的には、我々の実験では、T細胞は一般的に真菌の増殖を促進し、腸内のうどんこ病菌と放線菌の負荷を減少させるようである。しかし、これらの効果の大きさは、T細胞とMhcIIΔ B細胞を共導入した場合により深刻であった。さらに、T細胞を単独で移植した場合は種の豊富さに悪影響を与えなかったが、MhcIIΔ B細胞と共導入した場合は、SIと結腸の両方で種の豊富さが著しく減少し、バクテロイデス属、クロストリジウム属、コリオバクテリア属の存在量が劇的に減少した。特筆すべきは、糞便中およびSI常在コミュニティにおけるクロストリジウムの有意な減少が、T細胞とMhcII B細胞の共移植によって特異的に引き起こされる唯一の一貫した効果であったことである。これらの観察を総合すると、B細胞特異的なMhcIIを介したT細胞との同族間相互作用が、CD4+ T細胞の応答を制御し、より種の豊富な微生物群集の発達を促進することが裏付けられた。

CD4＋ T細胞は、腸のホメオスタシスに深く影響し(38)、無数のメカニズムを通じて腸内の微生物生態系に影響を与えることができる。例えば、CD4+ T細胞は、腸管上皮細胞（IEC）による抗菌ペプチド発現（14、39）、IECによる粘液産生（40、41）、腸の蠕動運動（42）、IECの代謝機能に対する自然免疫の影響（39、43）などを制御することが示されている。上述したように、DCとILC3は抗原提示細胞（APC）として機能し、T細胞の活性化／PP濾胞への遊走を調整し、それによって抗共通TD IgA反応の大きさに影響を及ぼす。IECはまた、T細胞の活性化を制御する非従来型APCとしての役割も果たしており、これは腸管幹細胞の発達と抗同胞性IgA応答に重要であることが示されている(44)。したがって、我々のモデルで観察された腸内細菌叢への影響は、B細胞が専門的APCとして機能し、T細胞の活性化を調節する能力によるものである可能性が高い。例えば、おそらくMhcIIを介した同族間相互作用がない場合、炎症性T細胞応答はサイトカインの豊富な供給源であるB細胞によって増悪される。実際、腸管におけるT細胞応答を抑制することが示されている「制御性」B細胞の免疫抑制効果（45）は、MhcIIを介した同族体相互作用に依存していることを裏付ける証拠がある（46、47）。さらに、B細胞特異的なMhcIIを介した同族間相互作用は、共抑制的なPD-1シグナル伝達経路を介してT細胞応答を抑制する可能性もある(48)。最後に、T細胞およびMhcII B細胞と共導入したRag1-/-マウスの糞便中およびSI常在コミュニティにおいて、クロストリジウムが一貫して消失していることを強調しておきたい。常在クロストリジウムは、抗原依存的・非依存的なメカニズムを通じて制御性T細胞の発達を促進することが知られている（49, 50）。このことを考慮すると、我々のデータは、B細胞内在性のMhcIIを介した同族間相互作用が、クロストリジウムによる制御性T細胞の発達において中心的な役割を果たしていることを示唆している。現在、我々の研究室では、このような代替仮説に取り組んでいる。

B細胞はSLOにおいてMhcIIを発現する細胞の圧倒的多数を占め ているが、creドライバがリークしやすいため、腸内の微生物生態系 の制御におけるB細胞特異的MhcIIシグナリングの寄与を研究することは 困難であった。具体的には、CD19creドライバーはほとんどのB細胞でMhcIIを効果的に欠失させるが、以前の研究では、MhcIIの発現を保持するごく一部のB細胞は、WTマウスで見られるのと同等のGC反応を生成するのに十分であることが示されている（ただし、そのようなGC反応の動態と出力は異常である）(51, 52)。我々は、CD19-creおよびAicda-creマウスドライバーを用いて同じ表現型を観察しており（個人的観察）、これが我々のRag1-/-養子移入モデル開発の主な動機となった。我々の実験は、このB細胞特異的遺伝子欠失モデルが、不完全なcre駆動欠失に伴う限界を克服する有用な代替モデルであることを示している。

私たちの結果は、WT T細胞とWT B細胞の養子移入により、Rag1-/-マウスにPP様SLOが（サイズと細胞数は減少しているものの）発生することを示している。我々の結果はまた、WT T細胞とWT B細胞の養子移入は、WT T細胞とMhcIIΔ B細胞の養子移入ではなく、GC B細胞プールとGC-TFH細胞プールの発生／維持につながることを示している。GC B細胞プールの維持には、GC常在TFH細胞との同族相互作用が必要である。MhcII全身ノックアウトマウスを用いた以前の研究で、GC形成における深刻な欠陥が示され、この概念をさらに裏付けている(53)。これらの以前の結果は、B細胞特異的MhcII抗原提示がGC B細胞プールの維持に中心的な役割を果たしていることを強く支持しているが、経験的に証明されたわけではない。さらに現在では、他の細胞型（DCやILC3を含む）によるMhcII発現が、GC B細胞の発生を制御していることも分かってきており、このプロセスにおけるB細胞特異的MhcIIシグナル伝達の関連性が疑問視されている。最後に、この問題の不明確さに加えて、条件付きB細胞特異的MhcII欠損マウスを用いた以前の研究では、GC B細胞の形成における欠損を明らかにできなかったという事実がある（51、52）（ただしこれは、利用されたcre-driversがB細胞上のMhcII発現を完全に欠損させることができなかったためである可能性が高い）。予想されたことではあるが、今回の実験結果は、B細胞特異的なMhcII抗原提示が、腸管SLOにおけるGC B細胞プールとGC-TFH細胞プールの両方の維持を促進するのに必要であることを示す明確な証拠を提供した点で重要である。

全体として、我々の実験結果は、適応免疫が腸内の微生物生態系を形成するために働く淘汰の方向性を持つ力であることを明確に示しており、MhcIIを介した抗原提示がこれを促進する範囲についての理解をさらに深めるものである。予想とは対照的に、我々のデータは、MhcIIが介在するT:B細胞の相互作用が、主にまだ定義されていないIgA非依存的なメカニズムによって微生物叢の構成を制御していることを裏付けている。決定的なことは、B細胞特異的MhcII発現が腸内の種の豊富さを促進／維持するようであることである。この効果は、前述のDCまたはILC3条件付きMhcIIノックアウト研究では報告されておらず、したがってB細胞によって特異的に制御される表現型である可能性がある。現在、この興味深い可能性を探る研究が進行中である。これらの動態を理解することは、実用的な意味を持つ。例えば、MhcII遺伝子は脊椎動物で知られている遺伝子座の中で最も多型であり、特定の対立遺伝子は人類のほとんどの炎症性疾患、自己免疫疾患、感染性疾患の危険因子であることが知られている。これらの疾患のほとんどは、共生細菌群における非典型的な微生物生態とも関連している。実際、マウスモデルは、MhcII遺伝子座における免疫遺伝学的変異が腸内の微生物生態に影響を及ぼし、微生物叢依存性疾患に対する感受性に影響を及ぼす可能性があることを示すのに役立っている（20, 54, 55）。もし特定のMhcII対立遺伝子が微生物叢依存的に疾患を引き起こすのであれば、その根底にあるディスバイオシスの是正に焦点を当てた介入によって治療できる可能性がある。したがって、MhcIIが共生微生物群集の生態系をどのように制御しているかを研究することは、微生物が支配的な世界で生き延びようとする進化的圧力が脊椎動物の適応免疫応答をどのように形成してきたかを理解する上で重要であるだけでなく、新規の治療アプローチにつながる知見を得る可能性もある。

方法
マウスモデル
サウスカロライナ大学のKubinak研究室では、WT、Rag1-/-、MhcII-/-、IgA-/-、AID-/-マウス（すべてC57BL/6バックグラウンド）の長期飼育コロニーを4年間維持してきた。WTマウス（Jax#000664）、Rag1-/-マウス（Jax#002216）およびMhcII-/-マウス（Jax#003584）はもともとJackson laboratoriesから購入した。ここに記載した実験に用いた動物はすべてこのコロニーに由来する。すべての実験に雄と雌のマウスを用いた。マウスは、このマウスのコロニーを収容するためだけに使用された、環境的に制御された1つの部屋で飼育され、維持された。マウスは一定の環境条件（70°F、相対湿度50％、12：12の明暗サイクル）で維持され、オートクレーブ滅菌した飲料水と照射済み大豆不使用マウス用飼料（Envigo；diet#2920X）を自由に摂取できた。すべての動物使用は、連邦規則およびサウスカロライナ大学動物飼育使用委員会（Protocol#101580）が定めたガイドラインに厳密に従った。

フローサイトメトリー
フローサイトメトリーはBD FACSAria IIセルソーター、BD Accuri C6サイトメーター、またはBD FACSymphony A5で行った。細胞染色には、1匹あたり50万個の細胞を適切な抗体カクテルで染色した（使用した抗体の全リストは補足表1を参照）。すべての抗体は最終濃度1:250で使用したが、SYBRは例外で1:200,000で染色した）。細胞は100μLの容量で暗所で20分間染色した。その後、染色した細胞を1X洗浄バッファーで2回洗浄した。洗浄した細胞を2%パラホルムアルデヒドで10分間固定し、装置で分析した。B細胞およびT細胞の純度は、脾臓細胞（分離後）をCD4抗体およびB220抗体で染色することにより決定した。PPはマウスのSIから採取し、砕いて染色した。PPには2つのパネルがあった： GC B細胞とTFH細胞である。GC-B細胞はB220+IgDloFas+GL7+として同定された。TFH細胞はCD4+B220-CXCR5+PD1+と同定された。糞便ペレットが採取され、粉砕、染色された。SYBR+、IgA+、Ig kappa light chain+と同定された。

養子B細胞移植
5週齢のRag1-/-マウスを無作為に治療群に割り付け、B細胞移植実験を行った。EASYSEP Mouse CD19 Positive Selection Kit II (STEMCELLカタログ#18954)を用いた磁気精製により、性・年齢をマッチさせたWT、MhcII-/-、AID-/-またはIgA-/-ドナーの脾臓から単離した107個のB細胞を投与した。このキットで細胞純度は98％であった（補足図S1）。治療群には、性と年齢をマッチさせた WT マウスの脾臓から 105 個のナイーブ CD4＋ T 細胞も投与した。この細胞は、EASYSEP Mouse Naïve CD4+ T Cell Isolation Kit（STEMCELLカタログ#19725A）を用いて単離した。0日目に、B細胞とT細胞を200uL容量で腹腔内注射（i.p.）し、その後動物を7週間単独飼育した。移植後7週目に動物を犠牲にし、解析のために組織を採取した。糞便中のIgAまたはIgMの検出を、B細胞の生着成功の確認とした。この基準に基づき、ドナーB細胞のi.p.注射により、100％のRag1-/-レシピエントマウスで糞便中IgAまたはIgMが検出されたと判定した。

糞便中IgAの測定
実験マウスの糞便ペレットを縦断的に採取し、養子移入治療群間のIgA反応の動態を定量化した。そのために、糞便ペレットを、養子縁組の直前およびその後7週後まで週間隔で採取した。糞便ペレットを500μLのHank's Balanced Salt Solution（HBSS）中で破砕し、4000xGで10分間遠心した。その後、上清を新しいチューブに移し、8000xGで10分間遠心した。残りの上清を回収した。続いて、これらのサンプルを、Invitrogen IgA Mouse Uncoated ELISAキット（カタログ番号88-50450-88）またはInvitrogen IgM Mouse Uncoated ELISAキット（カタログ番号88-50470-22）を用いて、ELISAによりIgAまたはIgM含量を測定した。これらのサンプルのIgA/IgM含量を測定し、値をペレットの重量で標準化した。

IgA結合細菌の測定
実験終了時にマウスからペレットを回収した。ペレットを破砕し、1mLの1X PBSに懸濁し、20分間冷蔵した。その後、サンプルを30秒間ホモジナイズし、1000xGで15分間遠心した。上清を100μmのストレーナーに通し、21,100xGで5分間遠心した。ペレットを1mLのカラムバッファーに懸濁し、再度遠心した。ペレットを200μLのカラムバッファーに懸濁し、IgA抗体4μLとIgκ軽鎖抗体4μLを各サンプルに添加した。その後、染色したサンプルに蓋をし、30分間冷蔵保存した。その後、サンプルを21,000xGで10分間遠心し、塩を含まないHBSSで2回洗浄した。ペレットを200μLのHBSS（食塩無添加）に懸濁し、10μLの1X SYBR greenを各サンプルに添加した。その後、サンプルを覆い、室温で5分間インキュベートした。完全に染色したサンプルを2% PFAと1mLのHBSS（食塩無添加）に加えた。

16S微生物叢プロファイリング
マウスから糞便サンプルおよびSI内容物を採取し、16S rRNA遺伝子配列決定を行った。糞便サンプルは、マウスを掻爬し、1.5mLマイクロフュージチューブに直接排便させ、1-2個の糞便ペレットを直接サンプリングした。すべてのサンプルはDNA抽出を行うまで-80℃で凍結保存した。DNAはQIAamp Powerfecal Pro DNA Isolation Kit（Qiagen社製）を用い、10分間のビーズビート工程で抽出した。精製したDNAをUniversity of Alabama at Birmingham Heflin Center Genomics Coreに送り、Illumina MiSeqで16Sシーケンスを行った。生のfastqリードをデマルチプレックスし、リードからフォワードプライマー配列とリバースプライマー配列をトリミングした。これにより、細菌16S rRNA遺伝子のV3/V4領域にまたがる251bpの産物が得られた。すべての16S解析はQIIME 2.0解析パイプライン(56)を用いて行った。

統計解析
すべての実験のデータセットは、3～6反復の実験からプールされたデータである（反復あたりn=4～10動物）。ほとんどの統計解析および可視化は、Prism8.0ソフトウェア（Graphpad）およびMicrosoft Excelを用いて作成および/または実行した。群間β多様性のPERMANOVA統計検定は、QIIME 2.0の'group-sgnificance.py'スクリプトを用いて行った(54)。すべてのPERMANOVAの結果は多重比較のために調整され、調整後のp値（qスコア）は原稿に報告されている。表1-3では、原稿に示されたすべてのβ多様性比較について、すべての生の統計出力（検定統計量、自由度、非調整および調整p値）が提供されている。正規性はShapiro-Wilk検定で評価し、異分散性はLevene検定で評価した。

2群間の比較では、正規分布のある同分散データセットをStudentのt検定で分析した。正規分布でないデータセットには、Mann-Whitney U 検定を適用した。これらの統計的アプローチにおける異分散性の補正は、それぞれWelchの補正またはKomogorov-Smirnov補正を用いて行った。3つ以上の群間の統計的比較では、正規分布のデータ集合は複数のStudentのt検定で分析し、正規分布でないデータ集合は複数のKruskal-Wallis検定で分析した。3群以上の統計的比較については、すべてのデータセットに適切な多重仮説検定補正を適用した。具体的には、パラメトリックなデータセットにはダンネット補正を適用し、ノンパラメトリックなデータセットにはダン補正を適用した。実験開始時［タイムポイント0（T0）］と実験終了時［タイムポイント（T1）］の同じRag1-/-マウスの糞便の種の豊富さを比較するために、両側一対のt検定を使用した。

データの利用可能性
すべての生の16S rRNA配列は、NCBI short read archive (Bioproject identifier PRJNA1045674)を通じて一般公開されている。

倫理声明
動物実験はUniversity of South Carolina Institutional Animal Care and Use Committeeの承認を得た。本研究は、現地の法律および施設要件に従って実施された。

著者貢献
JK：概念化、データキュレーション、形式的解析、資金獲得、調査、方法論、プロジェクト管理、資源、ソフトウェア、監督、検証、視覚化、執筆-原案、執筆-校閲・編集。TP: 調査、執筆 - 査読と編集。NH： 正式分析、調査、執筆-校閲・編集。AM： 調査、執筆-校閲・編集。MR: データキュレーション、形式分析、調査、方法論、執筆-原案、執筆-校閲・編集。RB: 調査、執筆-校閲・編集。AJ：方法論、執筆-校閲・編集。SA: 調査、方法論、執筆-校閲・編集。ND： 形式分析、執筆-校閲・編集。MN： 方法論、執筆-校閲・編集。PN：方法論、執筆-校閲・編集。

資金援助
著者は、本論文の研究、執筆、および/または出版のために金銭的支援を受けたことを表明している。本研究中、JK.はNIH R21（R21AI149409）、R01（R01AI155887）、R56（R56AI162986）、およびUniversity of South Carolina Center for Alternative Medicine COBREプログラム（P20GM103641；Mitzi Nagarkatti博士とPrakash Nagarkatti博士に授与）によるFDアワードの支援を受けた。この研究は、JKに授与されたS10設備助成金によっても支援された。(1S10OD032271）。

利益相反
著者らは、本研究が利益相反の可能性があると解釈されるような商業的または金銭的関係がない中で実施されたことを宣言する。

発行者注
本論文で表明された主張はすべて著者個人のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本論文で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張も、出版社によって保証または支持されるものではない。

補足資料
本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2023.1253674/full#supplementary-material に掲載されている。

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受理された： 2023年7月5日；受理された： 2023年11月30日；
発行：2023年12月22日

編集者

ロサンジェラ・サレルノ＝ゴンカルベス（メリーランド大学、米国
査読者

ヴィニ・ジョン, ワシントン大学セントルイス校, アメリカ合衆国
Tomasz Piotr Wypych, ポーランド科学アカデミー, ポーランド
Copyright © 2023 Roland, Peacock, Hall, Mohammed, Ball, Jolly, Alexeev, Dopkins, Nagarkatti, Nagarkatti and Kubinak. これはクリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス論文である。原著者および著作権者のクレジットを明記し、学術的に認められている慣行に従って本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製を許可する。これらの条件に従わない使用、配布、複製は許可されない。

*文責 ジェイソン・L・クビナク、jason.kubinak@uscmed.sc.edu

免責事項：本論文で表明されたすべての主張は、あくまで著者個人のものであり、必ずしも所属団体、出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本記事で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のあるいかなる主張も、出版社によって保証または支持されるものではありません。

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