鎌状赤血球症の腸内細菌叢：その特徴と潜在的意義

2023年11月17日 09:51

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研究論文
鎌状赤血球症の腸内細菌叢：その特徴と潜在的意義

https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0255956

ハッサン・ブリム, ジェームズ・テイラー, ムニール・アッバス, キンバリー・ヴィルメネイ, モハマド・ダレミポウラン, スディール・ヴァルマ, [...続きを表示 6続きを表示...], ハッサン・アシュトラブ
要旨
背景
鎌状赤血球症（SCD）は、溶血性貧血、疼痛、臓器障害、早期死亡につながる遺伝性血液疾患である。重合した脱酸素化ヘモグロビン、硬直した鎌状赤血球、血管閉塞性クリーゼ（VOC）が特徴である。SCD患者の腸で低酸素再灌流障害が再発すると、組織傷害、透過性、細菌の移動が増加する可能性がある。このような状況において、健康と疾病の主要な担い手である腸内細菌叢は重要な影響を及ぼす可能性がある。本研究では、SCDにおける腸内細菌叢の特徴を明らかにすることを目的とした。

方法
健常対照者（n = 14）およびSCD被験者（n = 14）から便および唾液サンプルを採取した。また、Berkマウス、Townesマウス、対照マウスを含むヒト化SCDマウスモデルからも便サンプルを採取した。増幅した16S rDNAを次世代シーケンス（NGS）を用いた細菌組成解析に使用した。ペアワイズグループ解析により、多くの分類レベルで細菌グループの差異が認められた。DeSeqソフトウェアを用いて細菌群の存在量と差分を確立した。

結果
SCD患者では主要な細菌異常が観察された。これらの患者では、ファーミキューテス/バクテロイデーテス比が低かった。SCD患者では以下の細菌ファミリーがより豊富であった：酢酸菌科、アシダミンコッカス科、サッカリバクテリア科、ペプトストレプトコッカス科、ビフィズス菌科、ベヨネラ科、放線菌科、クロストリジウム科、バクテロイダクテリウム科、フソバクテリウム科。このdysbiosisは、420の異なる操作分類学的単位（OTU）に変換された。Townes SCDマウスもまた、ヒトのSCDに見られるような腸内細菌叢異常症を示した。

結論
SCD患者では、強力な炎症誘発因子として知られる細菌について、主要なディスバイオーシスが観察された。Townesマウスも同様に腸内細菌叢の形成異常を示し、腸内細菌叢の調節とSCDの病態生理への影響を研究する良いモデルとなりうる。

引用 Brim H, Taylor J, Abbas M, Vilmenay K, Daremipouran M, Varma S, et al. (2021) 鎌状赤血球症における腸内マイクロバイオーム：鎌状赤血球症における腸内細菌叢：その特徴と潜在的意義。PLoS ONE 16(8): e0255956.

編集者スザンヌ・L・イシャク、メイン大学、米国

受理された： 2021年3月3日受理：受理：2021年3月3日；受理：2021年7月27日；発行：2021年8月25日 2021年8月25日発行

データの利用可能性：すべての関連データは原稿とそのSupporting Informationファイル内にある。

資金提供この研究は、NIHのNHLBIからNIH Research Grants 1P50HL118006、NIHのNIMHDから5G12MD007597、KGへの助成金UO1 HL117664およびRO1 HL147562の支援を受けた。内容は著者らの責任によるものであり、必ずしもNHLBI、NIMHD、NIHの公式見解を示すものではない。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と解析、発表の決定、原稿の作成においていかなる役割も担っておらず、研究実験を行うための資金援助のみを行った。

競合利益： HiThru Analytics社のオーナーであるSudhir Varma博士に関しては、本研究における彼の主な役割は、16S rDNA次世代シーケンスのデータ解析と数値の作成を行うことであった。このことは、データおよび資料の共有に関するPLOS ONEポリシーの遵守を変更するものではない。

略語 SCD、鎌状赤血球症；VOC、血管閉塞性クリーゼ；OTU、操作分類学的単位

はじめに
鎌状赤血球症（SCD）は、アフリカで発生したヘモグロビンのβ-グロビンサブユニットをコードするHBB遺伝子の突然変異による遺伝性の血液疾患である。SCDはおよそ10万人のアメリカ人が罹患しており、アメリカではアフリカ系アメリカ人の365人に1人の割合で発症している。鎌状ヘモグロビンの変異は赤血球の機能と形状に影響を及ぼし、その結果、重症度が異なる様々な症状を引き起こします。疾患症状は急性または慢性であり、一部の患者では血管閉塞性クリーゼ（VOC）の繰り返しと予測不能な疼痛エピソードによる頻繁な入院を伴う。実際、鎌状赤血球（RBC）は、脱酸素化した変異型ヘモグロビンの重合により、形状が変化して硬くなり、溶血しやすくなっている。硬直した鎌状赤血球は毛細血管や静脈を閉塞し、VOC、臓器への血液・酸素供給障害、末端臓器障害を引き起こす。溶血や血管閉塞性合併症を軽減する治療法としては、ヒドロキシ尿素、L-グルタミン、クリザンリズマブ、ボクセロトール、慢性輸血療法があり、幹細胞移植は実験的ではあるが、治癒の可能性がある。VOC疼痛の緩和は依然として入院の主な原因であるが、抗生物質の予防投与はSCDの機能的無脾症による感染症を予防し、幼児期の死亡率の有意な減少につながる [2] 。しかし、生後5年間の抗生剤投与は、抗生剤の影響とSCDによる不顕性腸虚血の両方により、腸内細菌叢の多様性と組成を変化させる可能性がある [3] 。

腸内細菌叢は、私たちの体内で最も重要な微生物叢である [4] 。複数の研究により、SCDの病態生理学的特徴のいくつかに影響を及ぼす可能性のある多くの全身的プロセスにおいて、腸内細菌叢が中心的な役割を果たしていることが強調されている。実際、腸内細菌叢は代謝、腸-脳軸、全身および局所免疫の主要な担い手である [5-8] 。また、腸上皮の完全性の維持にも重要な役割を果たしている。このような完全性が損なわれ「リーキーガット」になると、多くの微生物毒素や微生物が全身を循環し、感染や血流の低下により手足の切断につながる可能性がある [3, 9]。腸内細菌は、全身性の炎症や院内感染への感受性に有害な役割を担っており、SCD患者の一部は、頻繁な入院の結果、このような感染症にさらされている [10-14] 。

培養に依存した手法では、腸内細菌叢の構造と組成を部分的にしか把握できない。培養に依存しない次世代のハイスループットテクノロジーの出現により、腸内細菌叢の構造を探索し、その組成を包括的に同定する可能性が出てきた。そこで本研究では、SCDモデルマウスとSCD患者における腸内細菌叢を解析し、臨床症状との関連性を評価した。これらの結果は、大規模な患者コホートで確認されれば、SCDにおいてバランスのとれた腸内細菌叢を確立するための今後の調整プロトコルの設計に役立ち、そのような介入が臨床転帰を変化させるかどうかを決定するのに役立つはずである。

材料と方法
患者およびサンプル収集
本研究におけるすべての調査はヘルシンキ宣言に従って実施された。すべての対象者は、米国ワシントンDCのHoward University Hospitalにおいて、承認されたInstitutional Review BoardのプロトコルIRB-16-MED-17に基づいて登録された。2016年6月から9月にかけて、22歳から57歳の28人の成人被験者をこのプロトコルのために募集した。すべての被験者が書面によるインフォームド・コンセントを提供した。これらの被験者は、14人の健常な非SCD対照群と14人のSCD層が確立された被験者から構成された。対照群とSCD群は年齢と性別を一致させ、抗生物質を服用している者はいなかった。28名全員がアフリカ系アメリカ人であった。SCDの臨床症状に関するデータを収集するため、医療記録が詳細に検討された。SCD患者は、採用された年の疼痛による入院の頻度に基づいて、レトロスペクティブに7人ずつの2群に分けられた。軽症群（SCDM）は年間入院回数が3回未満であり、重症群（SCDS）は年間入院回数が3回以上であった。全対象者に便および唾液採取キットが配布された。患者には検体採取の手順が説明された。検体は、前述したように、即日配達便で郵送され、受領後直ちに-80℃で保存された[15, 16]。

DNA抽出および16S rDNA分析
QIAamp DNA Stool Mini KitおよびQiagen DNA Blood抽出キット（Qiagen, Germantown MD, US）を用いて、それぞれ製造者の指示に従って便および唾液サンプルからDNAを抽出した。DNAの質は、Nanodrop 2000とゲル電気泳動を用いて評価した。すべての検体から、細菌群集分析に適した質と量のDNAが得られた。16S rDNA解析のために、次世代シーケンシング（NGS）の前にPCR増幅を行った。簡単に説明すると、16S rRNA V3-V4遺伝子領域を標的とするプライマーを用いてDNA抽出物を増幅した。これらのプライマーには、アダプター配列と、各サンプルが固有のバーコードを持つようにリバースプライマーに組み込まれた固有の12bpバーコードが含まれていた。約100ngの抽出DNAを用い、Platinum Taqポリメラーゼ（Invitrogen, CA, USA）を用いて、以下のサイクリング条件でアンプリコンを生成した： 95℃、5分間の初期変性ステップに続き、以下のサイクルを35回繰り返した： [95℃、30秒、55℃、30秒、72℃、30秒]のサイクルを35回繰り返した後、72℃、7分間の最終伸長工程を行い、4℃で保存した。PCRアンプリコンはQIAquick PCR purification kit (Qiagen Valencia, CA, USA)を用いて精製し、定量、正規化した後、製造元のプロトコル（Illumina Inc.）

NGSデータ処理とアノテーション
データ処理の最初のステップでは、生成された配列データをサンプルバーコードを使用してデコンボリューションし、各サンプルからの配列を同定した。バーコード、プライマー、アダプター配列もこのステップの一部としてトリミングされた。PCRアーチファクト「キメラ」はChimeraSlayerプログラム（http://microbiomeutil.sourceforge.net; reference http://genome.cshlp.org/content/21/3/494.long）を用いて同定し、ダウンストリーム解析の前に除去した。デコンボリューションされ、フィルターされた配列データは、Ribosomal Database Project (RDP)分類器を用いて分類（属レベルまで）され、サンプル-属数マトリックスが作成された。OTU（Operational Taxonomic Unit）解析には、Mothurソフトウェアを使用し、その後cd-hitを用いて97％の配列同一性でクラスタリングし、OTUを生成した[16, 17]。OTUの存在量は、パッケージ[18]を使用してR（バージョン3.5.1）にロードした。希釈曲線はRパッケージveganを用いて計算した。RパッケージDESeQ2 [18]を用いて、解析グループ内で有意に存在量の異なる分類単位を同定した。各分類群ランクで、各分類群内のOTUに該当するリードカウントを合計した。これらのカウントを負の二項分布と仮定して、差分存在量解析に使用した。統計的有意性の閾値は偽検出比（FDR）<0.05とした。ファーミキューテス/バクテロイデーテス比については、2つの系統の総カウント数を計算し、各サンプルのカウント数の比を計算した。比の差分分析には、各グループ（CTRL対SCD、SCDM対SCDS）の比についてWilcoxon Rank Sum検定を用いた。

SCDマウスモデル
臨床サンプルとの比較には2種類のSCDマウスモデルを用いた。すべてのマウスは、Institutional Animal Care and Use study（関連するコントロールマウス）およびUniversity of Minnesota, MN（バークレーSCDモデルおよび関連するコントロールマウス）のそれぞれのローカルプロトコールに従って飼育され、処置された。SCDマウスとコントロールマウスは同腹仔ではなく、同じマウスに由来する。AAとSSは異なる産仔から引き抜かれた。マウスは同じ遺伝子型と性別のマウスと一緒に飼育された。ケージ、環境、食餌はすべて異なる遺伝子型間で標準化した。糞便は雌雄両方のマウスから採取した。便サンプルは、2つの研究機関の共同研究者により採取され、ドライアイスで輸送された。プロトコール終了後、マウスは炭酸ガスベースのプロトコールで安楽死させた。

すべてのマウスはJackson laboratory（Bar Harbor, ME）から入手した。最初のモデルは、B6:129-Hbatm1(HBA)Tow Hbbtm2(HBG1,HBB*)Tow /Hbbtm3(HBG1,HBB)Tow/J系統、ここではTownes(SCD)マウスと呼ぶ[19, 20]を用いた。Townesマウス（ホモ接合体HBSS、およびコントロールのHBAA）はマウスヘモグロビンを発現しない。ホモ接合体Townes（hα/hα:βS/βS、HBSS）マウスはヒト正常α（hα）および鎌状ヘモグロビンβ（βS）遺伝子を持ち、ヒト鎌状ヘモグロビンの90％以上を発現する[21]。対照Townes（hα/hα:βA/βA、HBAA）マウスは、ヒト正常hαおよびβA遺伝子を持ち、胎児ヘモグロビンを含む正常ヒトヘモグロビンを発現している[20-23]。繁殖ペアはJackson Laboratoryから入手し（ストック番号013071 Bar Harbor, ME）、我々の動物施設で繁殖させた。遺伝子型は既述のように決定した[24]。便サンプルは7AA対照マウスおよび13SS Townesマウスから採取した。また、12匹のホモ接合体HBSSバークレーマウスおよび12匹のコントロールHBAAマウスから便サンプルを得た。バークレーSSモデルマウス（Berk）は、マウスαグロビンとβグロビンを欠失させ、99％以上のヒトシックルHbを発現するヒトαとβSの導入遺伝子を挿入した混合遺伝学的背景で開発された。ホモ接合体Berkマウスは99％以上のヒトシックルHbを発現している[25-27]。マウスは繁殖され、等電点集束法によってホモ接合性の表現型が決定され、通常の半無菌施設に収容された[28]。

DNAは上記のように動物の便サンプルから抽出した。DNA の定量後、保存された細菌 16S rRNA 断片の PCR 増幅を行った。PCR産物はNext Generation Sequencing（Illumina）を用いて塩基配列を決定した。生成されたデータを解析し、上記のヒト臨床サンプルについて説明したように、各マウス群内の細菌組成および特異性を定義した。

結果
レアファクション曲線により、ヒトおよびマウスサンプルの両方でシーケンス深度が適切であることが明らかになった
各ヒト（便および唾液）および2つのSCDマウスモデルのシーケンスリード数は、S1ファイルのS1-S4表に報告されている。各サンプルセットについてレアファクション曲線が確立された。すべてのサンプルについて、すべての曲線がOTU検出飽和に達したため、シーケンスの深さとリード数は適切であった（S1図）。

ヒトSCD被験者および対照群における便マイクロバイオームの特性解析
ファーミキューテス/バクテロイデーテス比は腸内細菌叢の恒常性の重要な指標である。非SCD対照者の便の比率は1.00004であったが、SCD対象者の比率は0.65801であった（p値=0.0212）。SCDMとSCDSの状態を比較したところ、SCDMの比率は0.58936と低く、一方、入院頻度の高いSCDMの比率は0.7341141（p値=0.901）であった。唾液サンプルでは、ファーミキューテス/バクテロイデーテス比は健常対照群で1.66356、SCDで1.42042、SCDMとSCDSを比較すると1.09763、1.75703であった。唾液検体ではいずれも有意な差は認められなかった。

便サンプルの存在量分析では、健常対照者とSCD患者では24クラス中10クラスで有意差があった（図1A）。Deseq解析の結果、これらのクラスのうち4クラスがSCD患者においてより一般的であることが明らかになった：すなわち、Saccharribacteria、Negativicutes、Actinobacteria、Bacteroidiaである。残りの6つのクラスは有意に異なっていた：残りの6つのクラス、すなわち、真菌類、デルタプロテオバクテリア属、エンティスファテリア属、スピロカエティア属、メタノバクテリア属、オピツテア属は、SCDではより少なかった（図1A）。

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図1.
SCD患者と健常対照者の便検体における細菌のクラス（A）、次数（B）、科（C）の違い。

doi:10.1371/journal.pone.0255956.g001

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クラスレベルでのこれらの違いは、31の細菌オーダーのうち11のオーダーの違いにつながり、以下のオーダーがSCD患者においてより豊富であった： Rhodospirillales、Candidatus Saccharibacteria、Bifidobacteriales、Selenomonadalesであり、Pasteurellales、Desulfovribrionales、Bacillales、Victivallales、Spirochaetales、Methanobacteriales、Opitutalesは対照群でより豊富であった（図1B）。

ファミリーレベルでは、62の細菌ファミリーのうち20ファミリーが有意に異なっていた。SCD患者でより多かったのは以下の細菌であった：酢酸菌科、アシダミンコッカス科、サッカリバクテリア科、ペプトストレプトコッカス科、ビフィズス菌科、ベヨネラ科、放線菌科、クロストリジウム科、バクテロイデス科、フソバクテリウム科であった。残りの10科、すなわち Pasteurellaceae、Bacillaceae、Desulfovibrionaceae、Christensenellaceae、Victivallaceae、Methanobacteriaceae、Oxalobacteriaceae、Kopriimonadaceae、Verrucomicrobiaceae、Prevotellaceaeの10科は、対照群で有意に多かった（図1C）。

ファミリーレベルでの上記の違いはOTUレベルにも反映され、SCDでは208 OTUが多く、非SCD対照群では有意に多かったため、このグループでは212 OTUが減少しており、大きなdysbiosisが観察された（図2）。

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図2. SCD患者と健常対照者の便サンプル間のOTUの違い。
doi:10.1371/journal.pone.0255956.g002

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SCD内のサブグループ解析では、入院頻度の高い患者と低い患者（SCDM群とSCDS群）の間で、Class、Order、Family、OTUレベルでの有意差は認められなかった。

ヒトSCDと対照群の口腔マイクロバイオーム解析
SCD患者の腸内細菌叢における主要なディスバイオーシスを示唆する便サンプルで観察された差異をより正確に把握するために、唾液サンプルを用いて同じ患者の口腔内細菌叢を解析した。

対照群とSCD患者の口腔内マイクロバイオームには違いが認められたが、これらの違いは便サンプルで観察されたものほど顕著ではなかった。クラスレベルでは、両生類、頭足類、藍藻類がSCD患者において有意に少なく、これらのクラス内の3つの目、すなわちOscillatoriales、Enterobacteriales、Pseudomonadales細菌がSCD患者において少ないことが示された（図3Aおよび3B）。

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図3.
SCD患者と健常対照者の唾液サンプル間の細菌のクラス（A）、目（B）、科（C）の違い。

doi:10.1371/journal.pone.0255956.g003

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100科中2科のみが有意差を示し、SCD患者の唾液では腸内細菌科とシュードモナダ科の細菌が少なかった（図3C）。OTUレベルでの解析では、健常対照群では28のOTUがより多く検出されたのに対し、SCD患者では12のOTUがより多く検出された（図4）。

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図4. SCD患者と健常対照者の唾液サンプル間のOTUの違い。
doi:10.1371/journal.pone.0255956.g004

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SCD群内の口腔マイクロバイオームを解析した結果、入院回数の多いSCD患者と少ないSCD患者（SCDM対SCDS）では、いずれの分類学的レベルにおいても有意差は認められなかった。

SCDマウスモデルにおけるマイクロバイオーム解析
臨床サンプルで得られた知見を比較し、腸内細菌叢調節研究のモデル系を開発する可能性を検討するため、2種類のSCDマウスモデル、すなわちBerkマウスとTownesマウス、およびそれらに関連するコントロールマウスの腸内細菌叢を特徴付けた。便サンプルは、12AAおよび12SSのBerkマウスと、7AAおよび13SSのTownes SCDマウスから得た。

BERKマウスの腸内細菌叢の構成は、AA遺伝子型マウスと比較してSS BERKマウスで少ないコプリイモナ科の1つを除いて、どの分類群レベルでも有意差はなかった。多くのOTUの存在量に差があったが、統計的に有意なものはなかった。

一方、Townesマウスでは、患者の便サンプルで観察されたものと同程度の有意な差が認められた。実際、SSマウスでは藍藻類（Cyanobacteria|gloeobacteria Class）のOTUが少なく、一方、β蛋白質細菌（Betaproteobacteria Class）のOTUが多かった（図5A）。この2つのクラス内の4つのOrderも有意に異なり、SSマウスではArachnida|AraneaeとGloeobacteria|gloeobacteralesが少ないのに対し、SS TownesマウスではBetaproteobacteria|burkholderialesとBetaproteobacteria|rhodocyclalesが多かった（図5B）。

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図5.
SSとAA Townesマウスの便サンプル間の細菌のクラス（A）、目（B）、科（C）の違い。

doi:10.1371/journal.pone.0255956.g005

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Familyレベルでは、SS Townesモデルでより少ないFamilyで統計的に差があったのは、Araneae|salticidae、Gloeobacterales|gloeobacteraceae、Clostridiales|oscillospiraceae、Clostridiales|clostridiales family xiii. incertae sedis、Clostridiales|catabacteriaceae、Burkholderiales|sutterellaceae、Rhodocyclales|rhodocyclaceaeがSS Townesマウスでより多かった（図5C）。OTU解析の結果、これらのFamilyのうち37のOTUがAAマウスとSS Townesマウスで有意に異なっていた。SSマウスでは20のOTUが多く、17のOTUが少なかった（図6）。

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図6. SSとAAのタウネスマウス便サンプル間のOTUの違い。
doi:10.1371/journal.pone.0255956.g006

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考察
我々はSCD患者において包括的な腸内細菌叢解析を行い、特に同じ被験者の唾液（口腔）微生物叢と比較した場合、大きな腸内細菌叢異常が明らかになった。このようなSCDに関連した腸内細菌叢異常は、ヒト化SCDマウスモデル（Townes）で確認されたが、一般的に使用されている別のマウスモデル（Berk）では観察されなかった。

SCD患者の便中ファーミキューテス/バクテロイデーテス比は低く、健常対照群で観察された比の約半分であった。成人のSCD患者におけるFirmicutes/Bacteroidetes比は、乳幼児や高齢者について以前に報告された比と同程度である[29]。SCD患者は乳幼児でも高齢者でもないことから、この比率は、健常成人では観察されない腸内細菌叢の発達的進化が阻害されていることを示している可能性が高い。これは、SCD患者における虚血状態や、SCDのような遺伝的要因や生後5年間の予防的ペニシリン使用のような環境的要因によって、出生時から腸内細菌叢に選択圧がかかっている結果である可能性がある [30] 。SCD患者と健常対照者の唾液サンプルにおけるファーミキューテス/バクテロイデーテス比は、対応する腸内細菌叢比で観察された値よりも、特にSCDではそれぞれ同程度で高かったことは注目に値する。SCDにおける腸内細菌叢の進化は、予防的投与と発熱の評価のために病院で投与される静脈内投与の両方における、幼少期の抗生物質の多用にも影響されている可能性が高い。

Bifidobacteriales目の細菌がSCD患者に多くみられることがわかった。この目の細菌は、ヒトの腸内細菌叢の初期のコロニー形成者の一部であり、通常、後期には存在量が減少するはずであるが、SCDの腸内環境の結果として維持されている可能性が高い。この知見は、SCDにおけるプロバイオティクスの今後の試験に示唆を与えるものである。次世代プロバイオティクスは、一般的なビフィズス菌/乳酸菌プロバイオティクスではなく、SCD腸内細菌叢の特異的なニーズを補完する可能性がある。

SCDマイクロバイオームのさらなる解析により、コントロール群との比較で、10の細菌群、11のOrders、20のfamilyで有意差が認められたことから、より高い分類学的レベルでdysbiosisがあることが明らかになった。OTUレベルでは、420のOTUに違いがあり、そのうち208がSCD患者で有意に多かった。観察された腸内細菌叢異常の大きさを理解するために、同じ被験者の唾液サンプルを用いて口腔マイクロバイオーム解析を行った。その結果、クラスレベルでは、SCD患者では2つのファミリーにのみ有意な差が認められ、存在量が少なかった：すなわち、腸内細菌科とシュードモナス科である。OTUレベルの分析では、28のOTUが健常対照者により多く存在するのに対し、12のOTUがSCDにより多く存在することが明らかになった。唾液サンプルの違いは、本研究におけるSCDとコントロールの腸内細菌叢の違いの重要性を浮き彫りにした。さらに、今回報告したSCDの腸内細菌叢異常は、Limらが報告したSCD患者とAS Conrols [31]の間の属レベルでの違いはあるが、より高い分類学的レベルでの違いはないと報告したものよりも顕著である。腸内細菌叢は全身の健康にとって最も重要な微生物叢であり、SCD患者の腸内細菌叢を網羅的に解析した結果、SCDの病態を悪化させる可能性のある主要な腸内細菌叢異常が明らかになった。

SCD患者はIL-6やTNF-αを含む炎症性サイトカインを高濃度に発現し、高レベルの炎症を示す [32] 。SCDの腸内細菌叢を規定する細菌ファミリーの中には、多くの強力な炎症誘発因子が存在した。抗炎症薬は、SCD患者の予防薬として、ヒドロキシ尿素とともに、あるいはヒドロキシ尿素の代わりに使用されることが示唆されている [33] 。実際、最近承認されたクリザンリズマブは、炎症経路を直接標的とし、VOCの年間発生率を低下させる初めてのSCD治療薬である [34, 35]。

SCDの主な細菌科のうち、酢酸菌科は、特発性リンパ節炎、特に慢性肉芽腫性疾患患者の症例に関与しており、細菌病原体のグループに含まれている [36] 。Veillonellaceaeもまた、若年性特発性関節炎患者の便サンプルで増加していることが報告されている。口腔内や消化管内に常在し、以前は非病原性と考えられていたVeillonellaceaeは、連鎖球菌株の病原性を高めるバイオフィルムを形成する能力で知られており、骨髄炎、髄膜炎、心内膜炎の症例に関連することが多くなっている [38] 。フソバクテリウム属細菌は、歯周炎の症例や、口腔から全身循環に移行することによる心血管疾患の決定因子として報告されており、最近では大腸がん感受性との関連も指摘されている [39, 40]。放線菌科には多くの病原体が存在するが [41]、ペプトストレプトコッカス科は実験的に誘発された大腸炎 [42]において一般的に多く存在し、その炎症性の可能性を示すもう一つの証拠となっている。

微生物叢と免疫系、特に自然免疫における好中球との間のクロストークは、チャレンジ時の好中球を介した炎症の大きさを調整する一方で、常在菌に対する好中球の反応を防ぎ、日和見病原体の繁殖を可能にする [43] 。より具体的には、腸内細菌叢はSCD患者の血管閉塞性クリーゼにおいて主要な役割を果たす好中球の老化活性化過程に影響を及ぼすことが報告されている [44] 。これらの相関関係をさらに明らかにするためには、腸内細菌叢の組成と特定の免疫シグネチャーを相関させる研究が必要である。

SCDグループ内のサブグループ解析では、Class、Order、Family、またはOTUレベルでは、頻繁な入院の有無（SCDSグループとSCDMグループ）で有意差は認められなかった。この所見は、小集団（各群n = 7）であるために関連性を検出するための統計的検出力が限られている結果かもしれないし、あるいは腸内細菌叢と疼痛エピソードとの間に相関がないことに起因する可能性もある。これらの点については、より大規模な試験や、入院や疼痛事象の頻度についてのより正確な表現型解析を通じて、さらに調査が進められるであろう。

腸内細菌叢異常症の関連解析に影響を及ぼす可能性のある因子は、炎症因子や他の宿主遺伝因子など他にもある。Tozatto-Maioらは最近、ブラジル、フランス、セネガルの国際的なSCDコホートにおいて、Toll様受容体2（TLR2）の遺伝子変異がSCD患者における細菌感染の発生を調節することを報告した [45] 。このように、腸内細菌叢の異常と疼痛などの臨床症状との相関関係を明らかにするためには、TLR2遺伝子変異や腸内細菌叢とのクロストークに関与する他の遺伝子を調べる必要があるかもしれない。同様に、胎児ヘモグロビン値や他の宿主遺伝因子などの他の因子も、疼痛による入院と関連している。

臨床サンプルの所見を検証し、腸内細菌叢の調節実験のためのモデルを得るために、我々は2種類のSCDマウスモデル、すなわちBerkマウスとTownesマウスでも腸内細菌叢の特徴を調べた。Berkモデルでは、コプリイモナド科を除き、どの分類学レベルでも腸内細菌叢の構成に有意差は認められなかったが、Townesマウスでは、SCDにおけるヒトの便中細菌叢に匹敵する有意差が認められた。実際、SSマウスではβプロテオバクテリア（Betaproteobacteria）クラスの細菌がより一般的であった。このクラス内の2つの目（Burkholderialesとrhodocyclales）がSCD SS Townesマウスで有意に多く、さらに2つのBetaproteobacteria科（Burkholderiales|sutterellaceaeとRhodocyclales|rhodocyclaceae）が優勢であった。OTU解析の結果、これらのファミリーのうち37のOTUがAAマウスとSSマウスで有意に異なり、20がSSマウスで多く、17がAAマウスで多かった。これらの知見は、ヒトとマウスの腸内細菌叢には本質的な違いがあるため、臨床サンプルと直接比較することはできないが、少なくとも1つのSCDマウスモデルが腸内細菌叢の異常を示唆していることを示している。さらに、一般的なプロテオバクテリアやβプロテオバクテリアは、酢酸菌、フソバクテリア、アクチノバシルチア、ペプトストレプトコッカス科など、SCD患者に広くみられる細菌ファミリーと同様の役割を果たす可能性のある病原体や日和見病原体を多く含むことが知られている。年齢、性別、抗生物質への曝露などの交絡因子の影響を最小化するために、SCD患者と対照を注意深く選んだが、よく制御されたマウス実験環境は、Twonesマウスで観察されたディスバイオーシスが、SCD表現型に関連する条件によってのみ、そして主に引き起こされていることを示唆しているかもしれない。これらの知見は、SCDにおける腸内細菌叢調節効果研究のために、このマウスモデルをさらに検討することを支持するものである。これらの研究では、健康なヒトやSCD患者からの糞便移植を受けることができる無菌マウスTownesを用い、これらのマウスが移植された腸内細菌叢に反応し、再形成されるかどうかを調べることもできる。また、このような実験では、移植したマウスの病原体コロニー形成抵抗性や関連する免疫応答を評価するために、移植マウスにチャレンジすることも考えられる。

結論として、我々はSCD成人における腸内細菌叢の記述的解析を行った。我々のデータは、SCD患者向けに特別にデザインされた次世代プロバイオティクスの応用を開始するための基盤となるものであり、腸内細菌叢が駆動する炎症を軽減し、最終的にVOCや他の最終臓器障害の重症度を軽減する可能性がある。

参考情報
S1 図：各サンプルセットについてレアファクション曲線を作成した。

すべてのサンプルについて、シーケンスの深さとリード数は適切であり、すべての曲線がOTU検出飽和に達した。

doi:10.1371/journal.pone.0255956.s001

(TIF)

S1ファイルヒト検体（便および唾液）および2種類のSCDマウスモデル便検体のシーケンスリード数。

doi:10.1371/journal.pone.0255956.s002

(PDF)

S2ファイル SCD患者と健常対照者間の操作上の分類単位の違い。

doi:10.1371/journal.pone.0255956.s003

(DOCX)

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鎌状赤血球症の腸内細菌叢： その特徴と潜在的意義

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