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バクテリオファージを介した治療による糞便微生物叢移植に伴うドナーのばらつきとリスクの克服

哉百名

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マイクロバイオーム

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バクテリオファージを介した治療による糞便微生物叢移植に伴うドナーのばらつきとリスクの克服


マイクロバイオーム 12巻、記事番号：119（2024）この記事を引用する

概要

背景

糞便微生物叢移植（FMT）および糞便ビローム移植（FVT、無菌濾過ドナー糞便）は、おそらくバクテリオファージを介した腸内細菌叢の調節により、再発性クロストリジウム・ディフィシル感染症の治療に有効である。しかし、ドナーのばらつきや高価なスクリーニングといった課題、またFMTやFVTによる病原体（真核ウイルスを含む）の移行に対する懸念が、より急性度の低い疾患の治療に広く臨床応用する妨げとなっている。

方法

これらの課題を克服するために、我々は、有効性を維持し、安全性を高めながら、FVTの臨床応用を拡大する方法を開発した。具体的には、(1)バクテリオファージFVTのドナー成分を再現し、真核ウイルスを除去するためのケモスタット発酵（FVT-ChP）、(2)エンベロープウイルスを不活化するための溶媒-洗剤処理（FVT-SDT）、(3)RNAウイルスの複製を阻害するためのピロニン-Y処理（FVT-PyT）を採用した。C.difficile感染マウスモデルを用いて、これらの処理したFVTの有効性を評価し、未処理のFVT（FVT-UnT）、FMT、生理食塩水と比較した。

結果

FVT-SDT、FVT-UnT、およびFVT-ChPは、FMT、FVT-PyT、および生理食塩水（それぞれ5/8、7/8、5/7）と比較して、人道的エンドポイントに達するマウスの発生率を減少させ（それぞれ0/8、2/7、および3/8）、コロニー形成C. difficile細胞の負荷および関連する毒素A/Bレベルを有意に減少させた。FVT-SDTを投与したマウス8匹中7匹がqPCRで陰性となり、C. difficileのコロニー形成が消失した可能性があった。対照的に、他のすべての処置ではC. difficileが存在し続けた。さらに、この結果は、腸内細菌叢プロファイル、セカールサイトカインレベル、および病理組織学的所見の変化によっても支持された。FMT/FVT治療後のウイルス生着の評価および宿主とファージの相関解析から、ファージの移行が治療効果に関連する重要な寄与因子である可能性が示唆された。

結論

この概念実証研究により、FVTの特定の改変が、ドナーのばらつきや感染リスクに関連する課題に対処する上で有望であることが示された。2つの戦略により、マウスにおけるC. difficileのコロニー形成を有意に制限する治療が可能となり、溶媒／洗剤処理とドナーファージのケモスタット増殖が有望なアプローチとして浮上した。

ビデオ要約

背景

過去10年間で、再発性クロストリジオイデス・ディフィシル（Clostridioides difficile）感染症（rCDI）[3,4]など、様々な疾患が腸内細菌叢の異常と関連していることが明らかになってきた[1,2]。健康なドナーからrCDI患者への糞便微生物叢移植（FMT）は、この疾患の治癒に非常に有効であることが証明されており、成功率は90％を超えている[5,6]。しかし、FMTは、高価で手間のかかるドナーのスクリーニング [7]、治療効果や再現性の点でのドナーのばらつき [7、8]、ドナーからの病原性微生物の移行を決定的に排除できるスクリーニング方法がないため安全性への懸念といった課題に直面している。後者の重要性は、米国で2人の患者がFMT後に重篤な細菌感染症を経験し、1人が死亡したことで浮き彫りになった [9]。その後、米国食品医薬品局から安全性に関する警告が出され、FMTによる病原性微生物の移入に関連した重篤な副作用の可能性が警告されている [10,11]。

興味深いことに、2つの独立した研究 [12,13] が、0.45 µmの滅菌濾過されたドナー糞便（主にウイルスを含むが、おそらく限られた割合の無傷の細菌も含む）を用いてrCDI患者の治療に成功しており、この方法はしばしば糞便ウイルス体移植（FVT）と呼ばれている。FVTの有効性は、FMT（細菌などを含む）を用いた他の臨床研究と同程度であったことから、FMTによるrCDIの治療において、腸内ビロームが重要な役割を果たす可能性が示唆された［12,13］。腸内ビロームの大部分は、宿主特異的な細菌ウイルスであるバクテリオファージ（ファージ）で構成されているが、真核生物や古細菌のウイルスも含まれている［14］。健康な表現型から症状のある表現型にFVTを適用するという概念は、前臨床試験でさらに研究されてきた。例えば、FVTは、抗生物質による最初の擾乱後、マウスの腸内細菌叢の構成に影響を与えた [15]。さらに、除脂肪体重ドナーからのFVT投与は、3つの異なる食事誘発性肥満マウスモデルにおいてメタボリックシンドロームの症状を緩和し [16,17,18]、在胎期間中の子豚からのFVT投与は、早産子豚モデルにおける壊死性腸炎の発症を予防した [19]。FVTはFMTに比べ、生菌の移行を大幅に減少させるという利点があり、FVTはFMTに比べ、腸内微生物の構造への侵入が少なく、ブロイラー鶏の空腸に害を引き起こす可能性の減少につながることが最近実証された [20]。ウイルスに加え、これらのFVT製剤には、0.45 µmのフィルター膜孔を通過できるサイズの細菌芽胞や細胞、糞便代謝産物、細胞外小胞が一定レベルで含まれると予想されるが、これらのFVT後の観察された影響への寄与はまだ解明されていない [12、13、15、16、17、18、19、20、21]。さらに、FVTで一般的に用いられている無菌濾過プロセスでは、真核ウイルスを移行させる危険性を排除することはできない。ドナーの糞便から既知の病原性ウイルスをスクリーニングすることは可能であるが、最近の研究で、ヒトの消化管には機能未知の真核ウイルスが何百種類も存在していることが明らかになった [14,23,24]。これらのウイルスのほとんどはヒト宿主にとって無害であると考えられるが、感染後数年経ってから子宮頸がんの重大な危険因子であることが判明したヒトパピローマウイルスに代表されるように、後の疾患発症に寄与する可能性は否定できない[25]。従って、腸内細菌叢の異常に関連した状態を緩和するためにFVTを適用する場合、特に免疫系が低下している人を治療する場合には、活性のある真核生物のウイルスの移行を最小限に抑えるべき十分な理由がある。対照的に、ファージは真核細胞に積極的に感染・複製することはなく、FVT/FMTを用いた腸関連疾患の治療成功の鍵を握る存在であると考えられている[13,16,19,26,27]が、その基礎となるメカニズムはまだ十分に解明されていない。FMTとFVTは、多くの腸関連疾患の治療に革命をもたらす可能性を秘めているが、安全性の懸念とドナーのばらつきのために、広く使用される可能性は低い。したがって、われわれの目的は、治療効果を維持しつつ、これらの課題を軽減する異なる方法論を開発することであった。真核ウイルスを "含まない "FVTを作製するために、我々は真核ウイルスとファージとの基本的な特性の違いを利用した。真核生物のウイルスの大部分はエンベロープRNAウイルスであり[28,29]、複製を真核生物の宿主に依存している。一方、ファージの大部分は非エンベロープ型DNAウイルスであり[28,30]、複製には細菌宿主を必要とする。エンベロープウイルスを不活性化するために溶媒／洗剤法を適用し（FVT-SDT）、RNAウイルスの複製を阻害するためにピロニン-Yを使用し（FVT-PyT）、希釈によって大部分の真核ウイルスを除去するためにケモスタット増殖ビローム（FVT-ChP）を処理した。さらに、ケモスタット増殖には、原理的に同じ接種物からより多くの産物を生産できるという利点があり、再現性を高めることができる。C57BL/6JマウスのC.difficile感染モデル[31]で、これらの異なる処理をした糞便ビロームを評価し、生理食塩水、FMT（前臨床試験[32]でC.difficile感染を効果的に治療することが以前に示されている）、未処理のドナー濾過糞便（FVT-UnT）と比較した。

この概念実証研究は、幅広い腸関連疾患［12,13,16,19,33,34,35］を効果的に治療できる、より安全で一貫性のある治療法の開発に向けた重要な第一歩であり、FMTをファージ介在療法で補完できる可能性がある。

研究方法

研究デザイン

C. difficile感染モデルはChenら[31]に基づき、ARRIVE Essential 10ガイドライン[36]に対応した。8週齢の雌性C57BL/6J（JAX）マウス48匹をCharles River Laboratories（JAXマウスの欧州販売元）から入手し、実験医学部門（AEM、コペンハーゲン大学、デンマーク）のAAALAC認定動物施設で、週に1回交換するInnovive社製使い捨てIVCケージに収容した。ケージには、水、餌（Altromin 1324 chow diet, Brogaarden, Denmark）、寝具、段ボール製ハウジング、巣材、フェルトパッド、かじ取り棒が用意された。到着後、マウスに耳標を付け、4匹ずつのIVCケージに無作為に割り付け（単純無作為化）、1週間馴化させた（図1）。抗生物質混合液（カナマイシン0.4 mg/mL、ゲンタマイシン0.035 mg/mL、コリスチン850 U/mL、メトロニダゾール0.215 mg/mL、バンコマイシン0.045 mg/mL）を飲料水に調製し、3日間IVCを通してマウスに与えた。その後、滅菌した0.9%(w/v)NaCl水で希釈したクリンダマイシン（2 mg/mL）をマウスに腹腔内注射した（マウスの平均体重約20 gに基づく）。抗生物質の混合と治療量は、Chenら[31]の動物モデルに従って行った。抗生物質治療の目的は、C. difficileのコロニー形成能力を高める腸内細菌叢のディスバイオシスを開始することであった。同様の一連の現象は、特に長期にわたる強力な抗生物質治療後の入院中に患者がC. difficileに感染した場合にもしばしば観察される [37,38]。24時間後、マウスに1.21×104CFUのC. difficileVPI 10463（CCUG 19126）を経口経口投与した。その後、マウスを生理食塩水（陽性対照）、FMT、FVT-UnT（未処理FVT）、FVT-ChP（ケモスタット増殖ビローム）、FVT-SDT（エンベロープウイルスを不活化するための溶媒/洗剤処理FVT）、FVT-PyT（RNAウイルスを不活化するためのピロニン-Y処理FVT）の6つの異なる処理群（n= 8）に分けた。それぞれの処理液は、C. difficile接種後18時間と72時間に、それぞれ0.15 mLずつ2回に分けて経口投与した（FVT液は2×109ウイルス様粒子（VLP）/mLに標準化）（図1）。C.difficile感染によって動物が異なる時点で安楽死させられ、それによって異なる時点の比較可能性に問題が生じ、統計的検出力に影響を及ぼす可能性があることを承知の上で、1群あたり8匹のマウスというサンプルサイズを過去の実験 [16,21] に基づいて選択した。その理由は、動物モデルの重症度レベル[31]のため、動物数を減らすために3Rの原則（置換、削減、洗練[39]）に対応するためであり、選択した動物数は異なる加工FVTの潜在的治療効果を評価するのに十分であった。また、陰性対照群（すなわち、C. difficileに感染していないマウス）を除外したのは、このモデルを記述したオリジナルの研究[31]から同等のデータが得られたためであり、実験に必要な動物の数を再び減らした。ケージ(ケージ1～12)の処理とハンドリングは、生理食塩水、FMT、FVT-UnT、FVT-ChP、FVT-SDT、FVT-PyT(ケージ1～6)の順で行い、同じ群順でケージ7～12で繰り返した。交絡因子を避けるため、すべてのハンドリングは4人の著者（T. S. R., S. F., K. D. T., A. V. M.）と動物世話人で分担して行った。経口ガベージによるすべての接種/処置は、AEMの経験豊富な動物世話人が盲検下で行った。生理食塩水投与群（コントロール）のマウス1匹は、C. difficileの経口投与直後に培養液を誤って気管から投与したため安楽死させ、FVT-UnT群のマウス1匹は、2回目のFVT投与の1週間後に栄養失調につながった不正咬合のため安楽死させた。これにより、生存確率およびサイトカインプロファイルの解析において、これらのグループ（生理食塩水およびFVT-UnT）はn＝7に減少した。C. difficile感染後、動物の健康状態を盲検下でモニタリングし、マウスが人道的エンドポイントに達したかどうかを判断し、必要な場合は直ちに安楽死させた。健康状態のモニタリングの頻度はマウスの現在の健康状態に合わせて調整され、C. difficile感染後最初の3日間は4時間ごと（昼夜を問わず）、次の4日間は8～12時間ごと、そして最終的に残りの回復期の2週間は24時間ごとであった。モニタリングは試験獣医師（著者A. V. M.）が盲検下で監督した。以下の質的パラメータが用いられた：身体活動レベル（すなわち、自発的または誘発された活動の低下）、糞の固さ（水様または正常）、体位（猫背または正常）、毛皮が清潔に保たれているかどうか。マウスは、0（健康）、1（軽い症状）、2（明確な症状）の0～2のスケールで採点された。スコアが2のマウスで、その後の検診で上記のパラメーターに改善が見られなかったものは安楽死させた。4人の著者（T. S. R., S. F., K. D. T., A. V. M.）が健康モニタリング、安楽死、組織および糞便サンプリングに参加した。著者であるT. S. R.は正しい治療を確実にするため、全時点で群配分を把握していた（ただし、健康モニタリングへの参加は制限された）が、著者であるS. F., K. D. T., A. V. M.は全時点で盲検化されていた。マウスが安楽死するまで、可能な限り異なる時点で糞便を採取した（図1）。マウスの体重は0日目、8日目、15日目、16日目、18日目、23日目、30日目、35日目に測定した（図S1）。安楽死の際、盲腸と結腸から腸内容物のサンプルを採取した。盲腸組織の一部は組織学的分析用に10%中性緩衝ホルマリン（Sarstedt）で固定し、室温で保存した。盲腸組織のもう一部は、腸内容物とともにサイトカイン分析用に保存し、使用するまで-80℃で保存した。

図1

動物モデルの概要。マウスはまず、抗生物質混合液（AB）を飲料水に入れ、クリンダマイシンを腹腔内（I.P.）注射した後、C. difficile（CD、〜104CFU）を接種された。18時間後、マウスは生理食塩水（コントロール）、FMT（糞便微生物叢移植）、FVT-UnT（糞便ウイルス叢移植-未処理、すなわち無菌ろ過したドナーの糞便）のいずれかを投与された、 FVT-UnT（糞便ビローム移植-未処理、すなわち無菌濾過ドナー糞便）、FVT-ChP（FVTケモスタット増殖糞便ドナービローム、希釈により真核ウイルスを除去）、FVT-SDT（FVT溶媒／洗剤処理によりエンベロープウイルスを不活化）、FVT-PyT（FVTピロニン-Y処理によりRNAウイルスを不活化）。十字は糞便サンプリングの時点を示す。

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クロストリジオイデス・ディフィシル菌接種片

ヒト感染に由来するClostridioides difficileVPI 10463（CCUG 19126）を、Chenら[31]により記載されたマウスC. difficile感染モデルと同様に感染因子として用いた。菌は、0.02%(w/v)の1,4-ジチオスレイトール（Fisher Scientific）および0.05%(w/v)のL-システイン（Fisher Scientific）を添加した脳心筋梗塞補助培地（BHIS）[40]で培養し、ハンゲートチューブ（SciQuip）を用いて37℃で培養した。固体培地には、1.5%(w/v) 寒天（Fischer Scientific）を添加した。培養菌の光学密度（OD600nm）は、Genesys 30 Visible spectrophotometer（Fisher Scientific）を用いて測定した。C. difficileは主に定常期に毒素を合成する[42]；したがって、毒素の移行を最小化するために、指数期初期のC. difficile培養物を接種物として使用した。感染に使用したC. difficileの接種量は以下のように調製した：C. difficileの単一コロニーを10mLのBHIS培地を含むハンゲートチューブに移し、37℃で一晩培養した。次に、一晩培養したC. difficileの150μLを、10mLのBHIS培地を入れた新しいハンゲートチューブに移し、3.5時間培養した後、OD600nmを測定した。C. difficileVPI 10463の菌検量線（OD600nm対CFU/mL）を用いて、培養液を所望の濃度（～1×105CFU/mL）に希釈した。これがC. difficile接種原となった。C. difficileの正確な細胞濃度（1.21×105CFU/mL）は、BHIS寒天プレート上のCFUカウントで評価した（図S2A-D）。

宿主とファージのペア

各菌株に適した培地と温度で培養した（表S1）。異なる特徴（ゲノム、サイズ、構造）を持つ5つのファージとその宿主細菌を用い、ピロニン-Yと溶媒／洗剤処理がファージ活性に及ぼす影響を評価した： ラクトコッカスファージC2（宿主：ラクトコッカス・ラクティックDSM 4366）、コリファージT4（宿主：大腸菌DSM 613）、コリファージφX174（宿主：大腸菌DSM 13127）、コリファージMS2（宿主：大腸菌DSM 5695）、シュードモナスファージφ6（宿主：シュードモナス属DSM 21482）。固体培地は、プレートには1.5%(w/v)寒天(Thermo Fisher Scientific)を、軟寒天には0.7%(w/v)を添加した。ファージ増殖中の培地には、終濃度10 mMMgCl2と10 mMCaCl2を添加した。ファージのプラーク活性は、100 µLの細菌培養液を4 mLの軟寒天培地（温度49 °C）と混合し、寒天プレートに注ぎ、10 µLのファージ懸濁液（希釈系列）を固化した軟寒天培地の表面に付着させ、その後、特定の細菌株に従って培養するスポット試験によって評価した（表S1）。

蛍光顕微鏡観察

すべての糞便ビローム（FVT-UnT、FVT-SDT、FVT-ChP、およびFVT-PyT、図S2E）のウイルス様粒子（VLP）数を、オンライン（https://doi.org/10.17504/protocols.io.bx6cpraw）に記載されているように、SYBR Gold染色（Thermo Scientific）を用いたエピ蛍光顕微鏡検査で評価した。ウイルス濃度は SM バッファーを用いて正規化し、1 処理あたり2×109VLP/mL とした。

腸管ドナーの由来と調製

下流のFVT/FMTアプリケーション用に腸管内容物を採取する目的で、合計54匹の雄性C57BL/6Nマウスを購入した。到着時、マウスは5週齢で、3つの業者から入手した： 18匹のC57BL/6NTacマウスはTaconic社（デンマーク）から、18匹のC57BL/6NRjマウスはJanvier社（フランス）から、18匹のC57BL/6NCrlマウスはCharles River社（ドイツ）から入手した。我々は以前、3つの異なる業者の同じマウス系統の腸管内容物を混合することで高いウイルス多様性が得られること、そしてこのアプローチがレシピエントマウスの腸内マイクロバイオーム組成に効果的に影響することを経験している[16,21,43]。また、FMTで治療したC. difficile患者に関連して、ウイルスの多様性が高いことが治療成績に重要である可能性が以前に示唆されており[44]、メタボリックシンドロームの治療にFMTを用いたヒトの試験では、ウイルスの多様性がドナーのファージ生着と正の相関関係があることが報告されている[27]。マウスは到着時に耳標を付け、ベンダーに従って無作為に（単純無作為化）6匹ずつの3つのケージに割り付け、デンマークのコペンハーゲン大学実験動物モデルセクションのAAALAC認定施設で、既述の条件に従って飼育した[43]。低脂肪食（Research Diets D12450J）を13週間、予定終了時点である18週齢まで自由摂取させた。残念なことに、2匹のC57BL/6NRjマウスは不正咬合により栄養不良となり、予定終了日前に安楽死させた。すべてのマウスを頸椎脱臼により安楽死させ、盲腸と結腸から腸内容物（糞ペレットではない）のサンプルを採取し、オートクレーブ滅菌した無酸素PBS緩衝液（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、1.8 mM KH2PO4）500 μLに懸濁した。その後、すべてのサンプルを-80℃で保存した。厳密な嫌気性細菌の生存率を維持するため、各ベンダーのマウス6匹（合計18匹）を犠牲にし、直ちに室温に保たれた約93%N2、2%H2、5%CO2の雰囲気を含む嫌気チャンバー（Coy Laboratory）に移した。嫌気チャンバー内でこれらのマウスから採取されたサンプルは、FVT-ChPを生産するためのFMTおよび嫌気性ケモスタット培養に使用された。残りの34匹のマウスの腸内容物を好気条件下で採取し、FVT-UnT、FVT-SDT、およびFVT-PyT処理の下流処理のための糞便ビロームの生成に使用した。前述のプロセスを示すフロー図を示す（図S3）。すべてのFVT接種物について嫌気性増殖試験を行い、残存する生菌または芽胞のレベルを評価した（表S2）。これは、嫌気チャンバー内の非選択性岐阜嫌気性培地（GAM、HiMedia）1.5%(w/v)寒天プレート上に50 µLのFVT原液を広げて実施した。各 FVT の 2 レプリケートを、嫌気チャンバー外で嫌気サシェ（AnaeroGen、Thermo Fisher Scientific）を入れた嫌気ジャー内で 37℃で 14 日間培養した後、CFU 計数を行った。

未処理糞便ビローム（FVT-UnT）

FVT 溶液を処理するために[16]、盲腸と結腸の解凍腸管内容物を 29 mL のオートクレーブした SM 緩衝液（100 mM NaCl、8 mMMgSO4-7H2O、50 mM Tris-HCl、pH 7.5）に懸濁した。 5）、次いでBagPage+ 100 mLフィルターバッグ（インターサイエンス社製）中で、ラボ用ブレンダー（Seward社製）を用いて最高速度で120秒間ホモジナイズした。その後、フィルターおよびホモジナイズした懸濁液を、遠心分離機5920R（エッペンドルフ社製）を用いて4500×g、4℃で30分間遠心分離した。糞便上清はFVT溶液をさらに処理するためにサンプリングし、ペレットは細菌DNA抽出のためにPBS緩衝液に再懸濁した。糞便上清を0.45 µm Minisart High Flow PESシリンジフィルター（Sartorius社製）でろ過し、細菌およびその他の大きな粒子を除去した。FVT調製のこのステップは、細胞外小胞、細菌細胞、芽胞が0.45 µmフィルターを通過する可能性を決定的に排除するものではない。限外ろ過は、Centriprep Ultracel YM-30Kユニット（ミリポア社製）を用いて糞便ろ過液を濃縮するために行った。内側チューブの透過液は、外側チューブに約0.5mLが残るまで、20℃で1500×gの遠心分離中に数回廃棄され、この時点で糞便ビロームとみなされた。Centriprep Ultracel YM-30Kユニットの30 kDaフィルターを滅菌メスで取り除き、糞便ビロームに加え、ウイルス粒子が4℃で一晩拡散するようにした。特定の細菌またはウイルス分類群の起源を追跡するために、マウスの共食い行動を考慮して、糞便ビロームをケージに基づいて混合した[45]。FVT-UnT、FVT-ChP、FVT-SDT、およびFVT-PyTの限外ろ過により、30 kDa以下の代謝物の大部分が除去されることが期待される[46,47]。これらの糞便ビロームは、「未処理の糞便ビローム」であるFVT-UnTとして、3業者すべてのマウスから得られた最終混合物に混合され、直ちに-80℃で保存された。残りの糞便ビロームは、溶媒/洗剤処理でエンベロープウイルスの脂質膜を溶解するか、ピロニン-YでRNAウイルスの複製を阻害することで、糞便ビローム中の真核ウイルスを不活化する下流処理の前に4℃で保存した。

溶媒／洗剤処理糞便ビローム（FVT-SDT）

溶媒／洗剤処理は、ほとんどの真核生物ウイルスがエンベロープを持つため、エンベロープウイルスを不活化するために一般的に使用されるが、ファージを含む非エンベロープウイルスはこの処理の影響を受けない[48,49]。世界保健機関（WHO）[50]およびHorowitzら[48]による溶媒/洗剤処理血漿の臨床使用に関するガイドラインに従い、糞便ビロームを1%(w/v)リン酸トリ（n-ブチル）(TnBP)および1%(w/v)トリトンX-100を含む溶液中で、30℃で4時間インキュベートした。不活化の大部分は通常、溶媒／洗剤処理の最初の30～60分以内に起こることに注意することが重要である[50]。TnBPとTriton X-100の除去は、Treščecら[51]の方法に従って行った。簡単に説明すると、TnBPとTriton X-100の十分な除去を確実にするため、カラム内のAmberlite XAD-7の適用量を理論結合容量の150％に設定した。樹脂カラムを0.5M NaClを含む0.01Mリン酸緩衝液（Na2HPO4とNaH2PO4）pH7.1でOD280nmが<0.02になるまで平衡化した。各溶媒/洗剤で処理した糞便ビローム（ケージで混合）を別々にカラムに加え、OD280nmを測定してタンパク質（予想されるウイルス粒子および30 kDaを超える他の代謝産物）の濃度を追跡し、OD280nmが< 0.02になるまで測定した。1MのNaClを含む0.01Mリン酸緩衝液を使用して、潜在的な残留粒子を樹脂から遊離させた[51]。糞便ビロームから溶媒/洗浄剤を除去した結果、カラムから約100mLのウイルス流出液が得られ、前節で述べたようにCentriprep Ultracel YM-30Kユニットを用いて0.5mLに濃縮した。この最終産物をFVT-SDT処理物とし、使用するまで-80℃で保存した。

ピロニン-Y処理糞便ビローム（FVT-PYT）

Pyronin-Y（Merck社製）は強い赤色蛍光化合物である。一本鎖および二本鎖RNA（ss/dsRNA）には効率的に結合するが、一本鎖および二本鎖DNA（ss/dsDNA）には結合しにくいことが報告されている[52,53]。様々な濃度のピロニン-Y、インキュベーション時間、RNAファージとDNAファージの温度を用いて、ウイルス不活性化の最適条件を決定するための初期スクリーニングを行った。糞便濾液を100μMのピロニン-Yで処理し、40℃で一晩インキュベートして、RNAゲノムを含むウイルス粒子を不活化した。粒子に結合していないピロニン-Y分子を除去するため、ピロニン-Y処理した糞便濾液懸濁液を50mLのSMバッファーで希釈し、その後、Centriprep Ultracel YM-30Kユニットを用いた限外濾過で0.5mLに濃縮した。この工程を3回繰り返し、ピロニン-Y処理糞便濾液を透明な外観とし、これをFVT-PyT処理液とし、使用するまで-80℃で保存した。

糞便微生物叢移植（FMT）

無酸素下でサンプリングしたマウス腸内容物（Fig.S3）を、PBS緩衝液と20%(v/v)グリセロールからなる無酸素凍結保護剤で1:20に希釈し、使用するまで-80℃で保存した。

ケモスタット増殖糞便ビローム（FVT-ChP）

ケモスタット増殖糞便ビロームの調製は、既報[54]と同様に行った。簡単に説明すると、嫌気処理したマウスの盲腸内容物を、ドナーファージオームのケモスタット増殖に利用した。培養液は、ドナーマウスの飼料として与えられた低脂肪食（Research Diets D12450J）に似せて調製し（表S3）、温度（37℃）やpH（6.4）などの増殖条件は、マウスの盲腸に存在する環境条件をシミュレートするように設定した。ゆっくりとした希釈速度（毎時0.05容量）で発酵を行った最終培養物は、ドナーの初期微生物組成プロファイルに類似した微生物組成を示した[54]。これらのバッチを合わせてFVT-ChP処理とし、使用まで-80℃で保存した。

サイトカイン分析

予備加重した盲腸組織を400μLの溶解バッファー中でホモジナイズした（ストック溶液： FastPrep Bead Beater Homogenizer（MP Biomedicals） を用いて、10 mL Tris lysis buffer、100 μL phosphatase inhibitor 1、100 μL phosphatase inhibitor 2、200 μL protease inhibitor）（MSD inhibitor pack, Meso Scale Discovery）中でホモジナイズし、遠心分離した（8000 × g; 4 °C; 5 min）。サンプルを 1:2 に希釈し、製造元の指示に従って、カスタマイズした代謝グループ 1 U-PLEX（MSD）で IFN-γ、GM-CSF、IL-15、IL-6、IL-10、KC/GRO、MIP-2、TNF-α IL-17A/F、IL-22 を分析した。サンプルは MESO QuickPlex SQ 120 装置（Meso Scale Discovery）を用いて分析し、濃度は Discovery Workbench v.4.0（Meso Scale Discovery）ソフトウェアを用いて標準曲線から外挿した。検出範囲外の測定値には検出下限値（0 に設定）または検出上限値を割り当てた。サイトカイン分析は盲検化された研究者（著者C.H.F.H.）が行った。

組織学および細胞毒性アッセイ

盲腸のホルマリン固定、パラフィン包埋組織切片をヘマトキシリンとエオジンで染色し、盲検化された研究者（著者A.B.）が病理組織学的評価を行った。以下の病理学的特徴を考慮して複合スコアが割り当てられた： (1)免疫細胞浸潤、(2)粘膜下浮腫または出血、(3)上皮損傷： 0:なし、1:軽度、2:中等度、3:重度)で、病理学的グレードの累積は0～9とした[31]。機械的損傷のある盲腸組織サンプルは解析から除外した。

RIDASCREENC. difficileToxin A/B ELISAキット（R-Biopharm社製）を用い、メーカーの指示に従ってマウス糞便中の毒素濃度を測定した。OD450nmはVarioskan Flashプレートリーダー（Thermo Fisher Scientific）で測定した。

qPCRによるC. difficileの存在量の測定

糞便サンプル中のC. difficileは、種特異的プライマー（C.Diff ToxA Fwd： 5′-TCT ACC ACT GAA GCA TTA C-3′、C.Diff ToxA Rev：5′-TAG GTA CTG TAG GTT TAT TG-3′[55]）を用いて、Integrated DNA Technologies社から購入した。標準曲線は、C. difficileVPI 10463の単培養体から抽出した全DNAの希釈系列に基づいている。qPCRの結果は、CFX96 Touch Real-Time PCR Detections System（Bio-Rad Laboratories）および試薬RealQ plus 2× Master Mix Green low ROX（Amplicon）を用いて、既述のように得た[56]。

ウイルスとバクテリアを分離するための糞便サンプルの前処理

経時的な腸内細菌叢の変化を調査するため、ベースライン（抗生物質投与前）、C. difficile感染前（抗生物質投与後）、終了時または安楽死時の3つの異なる時点の糞便サンプルが含まれた。これは合計142の糞便サンプルに相当する。糞便サンプルからのウイルスおよび細菌の分離は、糞便ホモジネートの容量をSM緩衝液を用いて5 mLに調整した以外は、前述[43]と同様に、遠心分離および0.45 µmフィルターにより糞便ペレットおよび糞便上清を生成した。

細菌DNA抽出、配列決定、およびデータ前処理

DNeasy PowerSoil Pro Kit（Qiagen）を用いて、製造元の指示に従って糞便ペレットから細菌DNAを抽出した。最終精製DNAを-80℃で保存し、Qubit 4 Fluorometric Quantification装置（Invitrogen）でQubit HS Assay Kit（Invitrogen）を用いてDNA濃度を測定した。細菌群集組成は、前述のようにIllumina NextSeqベースの16S rRNA遺伝子V3領域のハイスループットシーケンスによって決定した[43]。リードの品質管理、複製除去、キメラリードからのパージ、およびゼロ半径操作分類単位（zOTU）の構築は、UNOISEパイプライン[57]を使用して実施し、EzTaxon for 16S rRNA遺伝子データベース[59]を使用してSintax[58]で分類を割り当てた。zOTUは、100％の類似性を持つ配列アラインメントのみが同じzOTUにマージされるユニークな配列バリアントを表す。このパイプラインを記述したコードは、https://github.com/jcame/Fastq_2_zOTUtable。糞便16S rRNA遺伝子アンプリコンの品質管理（accession: PRJEB58777、ENAで入手可能）後の平均シーケンス深度は60,719リード（最小11,961リード、最大198,197リード）であった。

ウイルスRNA/DNA抽出、配列決定、およびデータ前処理

滅菌濾過した糞便上清を、100 kDAでフィルターカットオフしたCentrisart遠心フィルター（Sartorius社製）を用いて、1500×g、4℃で遠心分離し濃縮した（https://doi.org/10.17504/protocols.io.b2qaqdse）。糞便上清（140μL）は、遊離DNA/RNA分子を除去するために、ウイルスDNA抽出の前に5ユニットのPierce Universal Nuclease（Thermo Fisher Scientific）で室温で10分間処理した。Viral RNA Mini Kit (Qiagen) を用いて糞便上清からウイルス DNA/RNA を抽出した。逆転写は、SuperScript IV VILO Master Mixを用い、製造元の説明書に従って行い、その後DNeasy blood and tissue kit（Qiagen）を用いて、製造元の説明書のステップ3-8に従うだけで洗浄した。簡単に言えば、DNA/DNAサンプルをエタノールと混合し、シリカフィルターに結合させ、2回洗浄し、40μLの溶出バッファーで溶出した。GenomiPhi V3 DNA Amplification Kit（Cytiva）を用いた多重置換増幅（MDA、ssDNAウイルスを含む）およびNextera XTキット（Illumina）を用いたシーケンスライブラリー調製は、既述[43]の方法で行い、Novogene社（英国ケンブリッジ）のシーケンス施設でIllumina NovaSeqプラットフォームを用いてシーケンスした。糞便ウイルスメタゲノームの生リード（accession: PRJEB58777、ENAで入手可能）の平均シーケンス深度は、17,384,372リード（最小53,960リード、最大81,642,750リード）であった。Trimmomatic v0.35を使用して、生のリードをアダプター用にトリミングし、低品質配列（品質95%未満、50 nt未満）を除去した。高品質のリードは、BBMap (bbduk.sh)を用いて複製を解除し、PhiXコントロールの有無をチェックした(https://www.osti.gov/servlets/purl/1241166)。ウイルス様粒子由来のDNA配列は、Spades v3.13.1を用いてサンプル内de novoアセンブリーのみを行い、最小長2200 ntのコンティグを保持した。全サンプルからのコンティグをプールし、[61]に記載され、https://github.com/shiraz-shah/VFCs で利用可能なスクリプトを使用して、同一性～95%でキメラのない種レベルのクラスタリングによりデリプライした。VirSorter2[62]（"full "カテゴリー｜dsDNAphage｜ssDNA｜RNA｜Lavidaviridae｜NCLDV｜viral quality = 1）、VIBRANT[63]（quality｜medium-quality｜complete）、CheckV[64]（quality｜medium-quality｜complete）、およびVirBot[65]によってコンティグをウイルスとして分類した。4つのソフトウェアのいずれによってもウイルス性と分類されなかったコンティグは破棄された。異なる図で使用されている「その他」、「未分類ウイルス」、「不明」の分類学的カテゴリーは異なるものである。「Other "はプロットに描かれていない残りの低存在分類群すべてを包含する。「Unknown」はウイルスである可能性があるが、ウイルス起源を確認する特定のデータ記録がないコンティグを指し、「Unclassified virus」はウイルス起源であると同定されたが、それ以上分類できなかったウイルスを表す。分類は、ウイルスORFを以下から作成したウイルスタンパク質のデータベースと照合することにより推定した： VOGDB v.217 (vogdb.org)、NCBI (14/10/2023ダウンロード)、COPSAC [61]、RNAファージデータベース[66]から作成されたウイルスタンパク質のデータベースに対して、ウイルスORFをブラストし、最小e値が10e-6のベストヒットを選択した。ファージ宿主の予測はIPhoP [67]を用いて行った。アセンブル、品質管理、アノテーションの後、bowtie2 [68]とコンティグ長とシーケンス深度を正規化したリードの分割表（ここではvOTU table (viral contigs)と定義）を用いて、全サンプルのリードをウイルス（高品質）コンティグ（vOTU）に対してマッピングした。このパイプラインを記述したコードはhttps://github.com/frejlarsen/vapline3。模擬ファージコミュニティ（ファージC2、T4、ΦX174、MS2、およびΦ6、表S1）は、FVT接種液のスパイクとして、およびssDNA、dsDNA、ssRNA、およびdsRNAの異なるゲノムタイプを含むシーケンスプロトコルの能力を検証するためのビロームシーケンスの陽性対照（各ファージについて〜106 PFU/mLに正規化）として使用された。

細菌およびウイルス配列のバイオインフォマティクスと統計解析

データセットはまず、サンプルの5%未満で見つかったzOTU/ウイルスコンティグを除去するためにクリーニングされた。にもかかわらず、得られたデータセットには総リードの99.8%以上が保持されていた。その後の解析とデータの表示にはRバージョン4.3.2を使用した。バクテリオーム解析では2200リード、ビローム解析では15,000リードを最小閾値とした。使用した主なパッケージは、phyloseq [69]、vegan [70]、DESeq2 [71]、ampvis2 [72]、ggpubr、psych、igraph、ggraph、pheatmap、ComplexHeatmap、ggplot2である。RパッケージmicroDecon [73] (runs = 1, regressions = 1)を用いて、ネガティブコントロールで検出されたリードカウントからウイルスコンティグの潜在的なコンティグを除去し、35.1%のエントリーを除去した。β多様性の解析には累積和スケーリング（CSS）を適用した。CSS正規化はmetagenomeSeqパッケージを用いて行った。α-多様性解析（シャノン多様性指数）は、バクテリオーム解析では生のリードカウントに基づき、ビロームのリードカウントはTPM（transcripts per million）に基づき正規化し、統計はANOVAに基づく。β多様性はBray-Curtis非類似度で表し、統計はPERMANOVAに基づく。DESeq2を用いて、要約された細菌種レベルおよびウイルスコンティグ（vOTUs）レベルで差分豊富な分類群を同定した。細菌zOTUとvOTU（ウイルスcontigs）間の相関ヒートマップは、ペアワイズSpearman相関とFDR補正を用いて計算した。サイトカインレベル、毒素レベル、C. difficile存在量、組織学的データは、生理食塩水を対照群とした線形モデルを用いてRで解析し、生存分布の比較にはlog-rank検定を用い、多重検定による補正にはFDRを用いた。平均値の比較はPFU数の差の算出に用いられた（https://www.medcalc.org/calc/comparison_of_means.php）。

結果

我々はここで、FVT/FMTで治療された再発性C. difficile感染症（rCDI）患者[5,12,13]に対して以前に報告された治療効果を維持しながら、FVT/FMTに関連するドナーのばらつきと真核ウイルスの感染リスクという課題を克服するために、異なる方法論を適用できるという仮説を立てた。真核ウイルスを含まない」糞便ビロームを産生するために、私たちは真核ウイルスとファージの基本的な特性の違いを利用した方法論を開発した。真核ウイルスの大部分はエンベロープ型RNAウイルス[28,29]で、複製には真核生物の宿主を必要とするが、ファージの大部分は非エンベロープ型DNAウイルス[28,30]で、複製には細菌の宿主を必要とする。エンベロープウイルスを不活性化するために溶媒／洗剤法が適用され（FVT-SDT）、RNAウイルスの複製を阻害するためにピロニン-Yが使用され（FVT-PyT）、希釈によって大部分の真核ウイルスを除去するためにケモスタット増殖ビローム（FVT-ChP）が作成された[54]。これらの異なる処理を施した糞便ビロームを、概念実証としてマウスC. difficile感染モデルで試験し（図1）、生理食塩水（偽処理）、FMT、未処理のFVT（FVT-UnT）と比較した。すべての処置は、同じ腸管内容物（糞便ペレットからではなく）に由来する。

エンベロープウイルスおよびRNAウイルスの不活化に対する方法論の適用性の評価

ファージ活性を維持したまま真核ウイルスを不活性化するための溶媒／洗剤処理とピロニン-Y処理の適用性を、エンベロープ（phi6）対非エンベロープ（phiX174、T4、C2）ファージ構造、ss／dsDNA（phiX174、T4、C2）対ss／dsRNA（MS2、phi6）ゲノムのような異なる特徴を持つファージを用いて試験した（図2AとB）。溶媒/洗剤処理はエンベロープファージΦ6のファージ活性（プラーク形成単位（PFU）/mLで決定）を109PFU/mLから検出限界以下まで完全に不活化した（p< 0.0001）。非エンベロープファージΦX174とT4の活性は0.1log10以下の減少でほとんど影響を受けなかったが、ファージC2はPFU/mLで1log10の減少を示した（p< 0.0001、図2A）。ピロニン-Yは、RNAゲノムを持つウイルスの複製を不活化するために使用された。ピロニン-Yの濃度、温度、インキュベーション時間の数多くの組み合わせに基づき、100μMのピロニン-Yと40℃で一晩のインキュベーションを選択した。この処理により、20℃でssRNAファージMS2は5log10PFU/mL（p<0.0001）、dsRNAファージphi6は4log10PFU/mL（p<0.0001）以上減少した。phi6は温度に敏感であり、40℃のインキュベーションだけで、このエンベロープファージは不活化された（p< 0.0001）。ファージC2（dsDNA）、T4（dsDNA）、phiX174（ssDNA）のプラーク形成能も残念ながら40℃でのピロニン-Y処理に影響され、それぞれ1、2.5、5log10PFU/mL減少した（p< 0.0005、図2B）。したがって、ピロニン-Y処理によって、FVT中のファージのかなりの部分が不活性化されることが予想される。これと並行して、糞便ビロームのケモスタット増殖によって、真核生物のウイルスの相対量が最小化されることを示した[54]。

図2

溶媒／洗剤処理またはピロニン-Y処理によるファージ活性（プラーク形成単位／mL、PFU／mL）の不活性化を、それぞれの細菌宿主で評価した。有意性は平均値の比較とt検定で評価し、コントロールと本研究で適用した処理との比較のみを考慮した。A3つのノンエンベロープファージ（phiX174、C2、T4）と1つのエンベロープファージ（phi6）を溶媒/洗剤（S/D）で処理し、それぞれの宿主細菌に対するプラーク活性を評価した。BssDNA (phiX174), dsDNA (C2 and T4), ssRNA (MS2), dsRNA (phi6) を表すファージをピロニン-Yで処理し、インキュベーション条件を変えてそれぞれの宿主細菌に対するプラーク活性を評価した。破線は適用したアッセイの検出限界を示す。

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エンベロープウイルスを不活化した後も、糞便ビロームは高い治療効果を維持した

主なエンドポイントパラメーターとして、FMT/FVTの治療効果、特にマウスが人道的エンドポイントに達するのを防ぐ効果を、マウスC. difficile感染モデルで評価した（図1）。異なる治療に関連する生存確率率をKaplan-Meier推定を用いて評価し（図3A）、生理食塩水で治療したマウス（2/7匹）と比較した。解析の結果、FVT-SDTで処置したマウスの生存率は有意に改善した（8/8匹、p= 0.03）が、FVT-UnT（5/7匹）およびFVT-ChP（5/8匹）で処置したマウスは、生存率の数値的な改善の傾向（p< 0.24）を示したが、有意ではなかった。一方、FVT-PyT投与マウスおよび予期せぬことに、FMT投与マウスは生存率の改善を示さなかった（それぞれ1/8匹および3/8匹）。

図3

マウスの表現型の特徴。生理食塩水投与群と比較した場合の、異なる治療に関連したマウスの生存確率を示すKaplan-Meier曲線。多重検定の補正を加えた治療群間の一対比較を行った。B盲腸組織の病理学的スコアで、C. difficileに関連した盲腸組織の損傷を予防する治療法の効果を評価した。C～L異なる処置群のマウス盲腸組織における全体的なサイトカインプロファイルを示す。安楽死させた（十字）マウスは、C. difficile感染を生き延びた（丸）マウスと区別され、したがって2つの異なる時点を表している。安楽死したマウスと生存したマウスのサンプリング時点が異なるため、病理学的スコアとサイトカインプロファイルの統計解析を行うことはできなかった。

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盲腸組織の病理学的スコア（図3Bおよび図S4A-J）および10種類の炎症性・抗炎症性サイトカインレベルは、人道的エンドポイントに達したマウスと試験終了まで生存したマウスの両方で評価されたため、異なるサンプリング時点のこれらの測定値を統計的に評価することは困難であった。そのため、盲腸の病理組織学とサイトカインプロファイルは、マウスがC. difficile感染により生存したか（試験終了時に測定したとき、炎症反応が低いかまったくなかった、○印）、安楽死したか（炎症反応が高かった、×印）を概ね反映していた（図3C～L）。したがって、これらの指標は、終了時または安楽死時の動物の疾患状態／回復を評価するためと、動物が人道的エンドポイントに達しない可能性を高めるためのさまざまなFVT／FMT治療能力を評価するために含まれた。しかしながら、平均病理学的スコアおよびサイトカインレベルの低下は、定性的な健康評価（図S4B-G）および生理食塩水対照、FMT、およびFVT-PyTと比較したFVT-UnT、FVT-SDT、およびFVT-ChP処置マウスの生存率の改善に関連する治療効果を支持した（図3Bおよび図S4A）。生理食塩水処置の平均病理学的スコアは6.7であり、C. difficileに 感染していないマウスが1.3であったのに対し、C. difficile感染マウスの病理学的スコアは7.0であったと報告したC. difficile感染マウスモデルオリジナル発表と一致していた[31]。全体として、FVT-SDTはC. difficileの重症感染を予防する優れた治療法であるように思われた。

治療が成功すると、C. difficileのコロニー形成とその後の発病が阻害された。

糞便中のC. difficile量をqPCRを用いて定量し（図4A-C）、異なる時点での感染負荷を評価した。C. difficileの接種前にはC.difficileは検出されなかった（図4A）。FVT-SDT処理マウスは、2回目の処理前の生理食塩水処理マウスと比較して、平均2 log10低いC. difficile存在量（p= 0.001）（糞便1グラムあたりの遺伝子コピー）を示し、FVT-UnT（p= 0.013）およびFVT-ChP（p= 0.039）処理では1.5log10低い存在量を示した。このことは、これら3つの処置が腸内でのC. difficileのコロニー形成を効果的に阻害したことを示唆した。対照的に、FMT-およびFVT-PyT-処置マウスは、生理食塩水処置群と同程度のC. difficile存在量であった。試験終了時には、FVT-SDT処置マウス8匹中7匹がC.difficile陰性であったのに対し、他のすべての処置群ではC.difficileの持続性が認められたことから、C. difficileのコロニー形成が消失した可能性が観察された（図4C）。C. difficile関連毒素A/BのレベルはELISAベースのアッセイを用いて測定され、qPCRデータと同様のパターンを示した（図4D-F）。2回目の処置の直前、FVT-SDT処置マウスの毒素A/Bレベルは生理食塩水群よりも有意に低く（p< 0.05）、FVT-SDT群では2匹のマウスだけが検出可能な毒素A/Bを示した。対照的に、毒素A/Bは、他のFMT/FVT処置およびコントロールのすべてのマウスで検出された（図4E）。終了時、FVT-SDT処理マウスでは毒素A/Bは検出されなかったが、他の処理群では一部のマウスで検出された（図4F）。生理食塩水で処理したマウスと比較して、FVT-UnT、FVT-SDT、およびFVT-ChP群で観察された毒素A/Bレベルの低下（図4D-F）とともに、病原性の原因物質であるC. difficileの存在量の減少（図4A-C）は、対応する生存率の上昇（図3A）と一致している。このことは、病原体の存在と毒素レベルの低下と、生存の全体的な可能性の向上との間に、支持的な関係があることを示唆している。

図4

3つの異なる時点（C. difficile接種前、2回目の治療前、試験終了時）の糞便サンプルについて、toxA遺伝子を標的としたqPCRによるC. difficileの存在量A～Cの評価、およびELISAによる関連毒素A/Bレベルの測定D～F。箱ひげ図の下の分数は、C. difficileまたはトキシンA/Bのいずれかが陽性であったマウスの数を強調している。破線は適用したアッセイの検出限界を示す。*p< 0.05,**p< 0.01

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溶媒／洗剤で処理した糞便ビロームは、腸内細菌叢の回復をサポートする。

腸内細菌叢の解析には3つの時点が含まれた：ベースライン（抗生物質投与前）、C. difficile感染前（抗生物質投与後）、計画終了時、またはマウスが試験終了前に人道的エンドポイントに達した場合。後者では、安楽死させたマウスと感染を生き延びたマウスとの間に時間差があるため、比較可能性に課題があった（図S5）。したがって、これらの腸内細菌叢プロファイルは、マウスが感染を生き延びたか安楽死させられたかを反映していた。にもかかわらず、以下の2つの主要な疑問に答えるための比較解析を容易にするために、あえて3つの時点すべての腸内細菌叢データを含めた：（1）異なるFVT/FMT治療は、ベースラインと比較して腸内細菌叢の回復に寄与したか？(2)C. difficile感染前の時点と比較して、安楽死させたマウスと生存させたマウスの時点では、どのような有意な変化が腸内細菌叢を特徴づけたか？そのために、ベースライン時（抗生物質投与前）とC. difficile感染前（抗生物質投与後）の両方で、後に安楽死したマウスとC. difficile感染を生き延びたマウスの間で、細菌性およびウイルス性の腸内マイクロバイオームプロファイルに初期差（p > 0.3）がないことを確認した（図5および図S6）。飲料水からの抗生物質摂取量はケージ間で同様であった（表S4）。全体的な細菌組成（Bray-Curtis非類似度）および多様性（Shannon多様性指数）は、異なる時点間で有意に異なっていた（p< 0.05）が、C. difficile感染前および安楽死マウスと比較して、感染を生き延びたマウスはベースラインに近い傾向があった。感染を免れたマウスの細菌分類学的プロフィールは、乳酸菌、プレボテラ属、クロストリジウム属、バクテロイデス属、ラクノスピラ科、ビフィドバクテリウム属、アッケマンシア属、ポルフィロモナド科、デスルホビブリオ属、パラバクテロイデス属、ツリシバクター属が優勢であり、これらはベースライン時のマウスでも優勢な分類群であった（Fig. C.difficile感染を免れたマウスでは、腸内細菌叢プロファイルが部分的に回復していることが示唆された（図5C-D）。人道的エンドポイントに達したため安楽死させられたマウスの細菌分類学的プロファイルは、一貫してEscherichia/Shigella、Enterococcus、Clostridioides、Bacteroides、Parasutterella、およびParabacteroidesが優勢であった（図5C-D）。Clostridioides属を除き、これらの分類群はC. difficile感染前にも多く存在しており、この時点の治療では抗生物質治療後の腸内細菌叢が十分に回復していないことを示していた。FVT-PyTを投与した2匹のマウスは、サルモネラ菌が 相対的に5～30％多くコロニー形成されており（図S7）、このことがこの2匹のマウスの安楽死につながる疾患の重症度上昇の一因となった可能性がある。FMT接種マウスからFMT処理マウスへの潜在的な細菌の生着について、16S rRNA遺伝子アンプリコンレベルで解析した。感染から生還したFMT処置マウスでは、FMT接種群でも認められた相対量が約65％であったのに対し、安楽死したマウスでは約15％であった（図S8A）。FMT接種片からのこの潜在的な細菌の生着は、特にClostridium sensu strictoに代表された（図5C-D）。

図5

16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンスに基づくバクテリオーム解析。Aベースライン時（抗生物質投与前）、C. difficile感染前（抗生物質投与後）、C. difficile感染を生き延びたマウス（投与にかかわらず）、および安楽死したマウスの細菌シャノン多様性指数（α-多様性）およびBray-Curtis非類似度ベースのPCoAプロット（β-多様性）。C感染を生き延びたマウスと安楽死させたマウスの細菌相対量（主要細菌分類群の割合）を示す棒グラフとヒートマップ。棒グラフの下の "n "は、分類学的平均に基づいたマウスの数を示す。*p< 0.05,****p< 0.0005

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感染を生き延びたマウスのウイルス組成と多様性は、C. difficile感染前のベースラインと比較して有意に異なっていた（p< 0.05）（図6A-B）。すべての時点のすべての群における優勢なウイルス分類群は、モルガン ウイルス科、アストロウイルス科、アルパウイルス科、マッドウイルス科、アルマ ウイルス科、およびイネスウイルス科であった。FVTからのウイルス移植は、ウイルスメタゲノムレベル（ウイルスコンティグ）でも調査された。FVT-UnTを除き、感染を生き延びたFMT/FVT処理マウスは、安楽死させたマウスと比較して、異なるFMT/FVT接種標本にも認められたウイルスコンティグの相対存在量が高く生着していた（図S8B）。この観察から、ファージの移入が治療効果に関連している可能性が高いことがさらに示された。

図6

全ゲノム配列決定に基づくメタビローム解析。Aベースライン時（抗生物質治療前）、C. difficile感染前（抗生物質治療後）、C. difficile感染を生き延びたマウス（治療にかかわらず）、および安楽死したマウスのウイルスシャノン多様性指数（α-多様性）およびBray-Curtis非類似度ベースのPCoAプロット（β-多様性）。Cウイルス分類の相対的な存在量をパーセンテージで示した棒グラフ（TPM（transcripts per million）ベースで正規化）。Dと Eのヒートマップは、それぞれウイルス配列に基づいて予測されたウイルスと宿主細菌の相対的な存在量の割合を示している。棒グラフの下の "n "は、分類学的平均に基づいたマウスの数を示す。*p< 0.055

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C.difficile感染前（抗生物質投与後）からマウスを安楽死させるまで、あるいは試験終了まで生存させるまでの、細菌およびウイルス成分両方の最も有意な腸内細菌叢の変化（相対存在量＞1％、p＜0.05）を特徴付けるために、存在量の差検定を用いた（図7A-C）。生存したマウスは、C. difficile感染前と比較して、Turicibacter、Clostridium sensu stricto、Akkermansia、Clostridioidesに属する細菌分類群の相対量が有意に増加（p< 0.05）し、Parasutterella、Parabacteroides、Enterococcus、Escherichia、 Bacteroides thetaiotaomicronが減少した（図7A）。クロストリジオイデス（Clostridioides）の増加は、C . difficileの定量分析（Fig. 安楽死させたマウスは、C. difficile感染前と比較して、特にClostridioides（15 log2倍変化）、Akkermansia、Bacteroidesの相対量が有意に増加し（p <0.05）、Turicibacteri、lactobacilli、Parasutterellaが減少していた（図7B）。

図7

A-C細菌分類群、D- Fウイルス分類群、G-Iウイルス配列から予測される宿主細菌の有意差（p< 0.05）、C. difficile感染前と生存マウスまたは安楽死マウス、安楽死マウスと生存マウスの3つの比較。

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ファージに関しては（図7D-F）、生存マウスはC.difficile感染前と比較して、Crassviralesと Tubulaviralesのウイルス目に属するウイルス（Vincent-、 Sonia-、 Rigmor-、 Morgan-、 Freja-、 Ella-、 Christianviridae）が増加していることが特徴的であった（図7D）。一方、安楽死させたマウスでは、主にプチウイルス目（Petitvirales）に属するファージ（Nora-,Ines-,Gokusho-,Alpaviridae）の相対量が増加していた（図7E）。ウイルスメタゲノムを用いて、6つの異なる宿主予測アプローチを利用する最近開発された機械学習フレームワークを用いて、潜在的な細菌の宿主を予測した（図7G-I）[67]。C.difficile感染前の時点と比較して、感染を生き延びたマウスでは、宿主と予測されるファージの数が有意に増加した（p＜0. 05）、プレボテラ（Prevotella）、フォカイコラ（Phocaeicola）、パラプレボテラ（Paraprevotella）、パラムリバキュラム（Paramuribaculum）、デュカニエラ（Duncaniella）、バクテロイデス（Bacteroides）のメンバーに感染すると予測されるファージが増加し、ツメバチルス（Tumebacillus）に感染すると予測されるビラが減少した、 Staphylococcus属、Schaedlerella属、Roseburia属、Lactococcus属、Fictibacillus属、Faecalibacterium属、Enterococcus属、Clostridium属、Blautia属、Mucispirillum属、Pantoea属、Acinetobacter属、Akkermansia属に感染すると予測されるウイルスが減少した（図7G）。7G). 一方、安楽死させたマウスでは、プレボテラ、バクテロイデス、アガトバクターに感染すると予測されるファージが増加し、ツメバチルス、ラクトコッカス、クロストリジウム、パラムリバクラム、コリネバクテリウム、アラクニア、アッケマンシアが減少しただけであった（図7H）。細菌のzOTUとvOTU（ウイルスコンティグ）の相対的な存在量（0.1%以上、p< 0.05）の間の宿主とファージの全体的な関係を、明確なクラスタリングパターンを示したスピアマンの相関を用いて評価した（図S9）。

Enterococcus属、Salmonella属、Clostridioides difficile属、Escherichia fergusonii属、Clostridium cocleatum属、Bacteroides thetaiotaomicron属、Parasutterella属の細菌・ウイルスクラスターAは、主に未知のウイルスと正の相関を示した。また、プレボテラ属、乳酸桿菌属、ツリシバクター属、クロストリジウム属、ポルフィロモナド属、ラクノスピラ科、バクテロイデス属、ビフィドバクテリウム属、コリオバクテリウム科の細菌・ウイルスクラスターBは、主に未知のウイルスと正の相関を示した。クラスターBの細菌属は、感染を生き延びたマウスと関連していた。したがって、このクラスターに含まれる未知のファージは、ベースラインと比較して腸内細菌叢の回復にプラスの影響を与えたファージを示している可能性がある（図S9）。しかし、ウイルスの分類が限定的であったため、FVT-UnT、FVT-SDT、およびFVT-ChPで観察された治癒効果の原動力となっている特定の宿主とファージの関係の明確な証拠を検出することはできなかった。

以上のことから、FVT-SDT治療とともに移入されたファージが、抗生物質治療後のC. difficile感染に対する腸内細菌叢の回復力を高め、それによってマウスのC. difficile感染撃退能力に影響を与えたという仮説が成り立つ。しかし、生存マウスの腸内マイクロバイオームプロファイルが、C. difficile感染のある時点で安楽死させたマウスの腸内マイクロバイオーム組成と類似していたかどうかは不明である。

真核生物ウイルスのプロフィールは、異なるFVT接種マウスの間で類似しており、相対存在量全体の0.1～3.0%を占め、主にRNAウイルスであった（図S10）。しかし、真核生物のウイルスの分類学的分解能は、真核生物のウイルスの相対存在量に関連して、処理または結果を区別するには不十分であったことに注意することが重要である（Fig.） また、FVT-SDTおよびFVT-PyTのメタビローム解析は、特定のウイルスが不活化されたかどうかの検証には使用できない。

考察

ここで我々は、腸関連疾患の治療にFMTまたはFVTを使用する際のドナーのばらつきと病原微生物の移行のリスクという課題に対処するための方法論を開発した。概念実証としてC. difficile感染マウスモデルを用いた。溶媒／洗剤処理によるエンベロープウイルスの不活化は、C. difficile感染に対する治療効果を維持しながら糞便ウイルロームを改変する優れた方法として浮上した。C. difficile感染時に観察される全身性の炎症反応は、腸組織の透過性を高めるC. difficile毒素によって引き起こされ [74,75]、腸を他の微生物感染に対してより感受性にする [76] 。したがって、未処理の糞便ドナーのビローム（インタクトな真核ウイルスを含む）を移植すると、損傷した腸組織を通して微生物が移動するため、さらなる炎症が起こる可能性がある。真核生物のウイルスの大部分はエンベロープ型である [28,29]。したがって、FVT-SDT群におけるC. difficile感染の予防効果が有望であることを考慮すると、患者への移行の前に糞便ビロームを溶媒/洗剤で処理することは、腸組織の透過性亢進を特徴とする疾患には特に関連性がある可能性がある [76]。

最も生存率が低かったのは、RNA標的化合物ピロニン-Yであった。ピロニン-YのRNAファージを不活性化する能力の初期評価中に、DNAファージも影響を受けることが明らかになった。ピロニン-Y処理によってファージの活性が低下し、それが治療の効果に影響を与えた可能性がある。このことは、治療を成功させるためにはファージ力価が高いことが重要であることを強調するいくつかの研究 [77,78,79,80]と一致し、ファージはFMTまたはFVT後の腸内細菌叢バランスの回復に重要な役割を果たす可能性がある [13,15,16,17,19,26,44,81]。

FMTは、前臨床試験［32］および臨床C. difficile感染症試験［5］において90％以上の治療効果に関連しているが、FMTを投与したマウスの生存率は、予想に反して生理食塩水投与群と同程度であった。動物モデルの構造上、この観察が生物学的な関連性を持つのか、それとも偶然の発見なのかを評価することはできない。その代わりに、我々は2つの可能性を推測している。第一に、FMT接種片にはClostridium sensu strictoが約20％含まれており、これはC. difficile 陽性の子牛 [82] や豚の下痢 [83] と関連している。FMTの接種片にClostridium sensu strictoが比較的多く含まれていたため、一般的にFMTに関連する治癒効果が相殺された可能性がある [13,32]。FMTとFVTの接種片は同じドナー材料に由来するが、FVT処理中に細菌が除去されたことが、FMTと比較してFVT-UnT、FVT-ChP、FVT-SDTで観察された高い生存率を説明する可能性がある。このことはまた、FMTに適さない糞便ドナー材料であっても、FVTに適する可能性があることを示唆している。したがって、FVTに基づく治療は、臨床FMT研究の困難な要素として報告されている適格なドナーを見つける確率を高める可能性があるかもしれない[7]。第二に、特に議論を呼びそうな推測として、我々のFMT懸濁液は、嫌気チャンバー内で無酸素的に取り扱われ、サンプリングされ、調製され、無酸素グリセロール／PBS溶液に保存／懸濁されたことが考えられる。これは、従来のFMT [84]の調製とは対照的で、サンプリングから最終的なFMT製品に至るまで、様々な調製段階を通してドナー物質を酸素にさらすのが一般的である。腸内細菌叢の構成要素は、主に厳格嫌気性菌と通性嫌気性菌からなることはよく知られている [85]。したがって、FMTに使用されるドナー材料の定期的な酸化処理により、意図せずに酸素に敏感な細菌が大量に死滅し、生菌の負荷と多様性が減少していると推測される。その結果、損傷した腸組織を通じて、さらなる炎症や組織損傷を引き起こす可能性のある新たな感染症や他の微生物が移動する可能性が減少する可能性がある。これとは対照的に、無酸素で処理したFMTでは、生育可能な嫌気性細菌［86,87］の量と多様性が高く、移入された腸内ファージの効果を打ち消している可能性がある。しかし、この推測を肯定するにも否定するにも、さらなる研究が必要である。

FVT-UnT、FVT-ChP、およびFVT-SDTで処理したマウスは、生理食塩水、FMT、およびFVT-PyTで処理したマウスと比較して、C. difficileの存在量の有意な減少を示した。われわれは、FMT/FVTとともに移植されたファージが、日和見病原体として作用する常在菌と同様に、健康な状態に関連する常在菌が感染性C. difficile株と競合できるようにする役割を果たしていると考えている。このことは、FMT/FVTによるファージ生着がマウスの感染症からの生還と関連していたことや、腸内細菌叢の回復を反映する細菌と正の相関を示した未知のウイルス群によって支持された。しかし、FVTの腸内細菌叢調整作用の根底にある正確なメカニズムは、まだ十分に解明されていない。それにもかかわらず、いくつかの研究によって、ファージドナープロファイルがFMTによってC. difficile感染症患者の腸内にある程度伝達されることが立証されている [13,44,81]。私たちの先行研究では、痩せたマウスからのFVTが、肥満マウスの腸内細菌叢組成の変化を誘導し、痩せた個体の組成に類似させることが実証された[16]。さらに、我々は最近、A. muciniphilaの存在量が比較的高いドナーを起源とするFVTが、レシピエントマウスにおける内因性A. muciniphilaの相対的存在量を有意に上昇させることを示した [21]。独立した研究グループによるこれらの観察結果は、FVTドナーの表現型形質がレシピエントに移入される可能性を示唆しており、おそらくファージがその起源と同様の生態系を確立しようとする傾向が原動力となっている。このプロセスには、ファージ感染が間接的に細菌バランスに影響を与えたgnotobioticマウスモデルで示されたように、連鎖的な事象が関与している可能性がある [26]。その結果、FVTのより複雑なウイルス群集は、我々の以前の研究 [16]で見られたように、メタボロームに影響を与える細菌生態系にも同様に影響を与え、全身的な変化をもたらす可能性がある。ファージは株特異的であるという一般的な考え方があることから、このような影響を与えるという考え方は直感に反するように思えるが、最近の研究では、ファージは遠縁の微生物宿主と相互作用する可能性があることが提唱されている［89］。また、ファージサテライトがより広い宿主範囲に寄与することも示唆されている［90、91］。さらに、温帯ファージから細菌宿主への潜在的に有益な代謝遺伝子の移入は、宿主の競争力を高め、微生物叢全体の変化に寄与する可能性がある［92、93］。これらの知見は、栄養環境と宿主環境が群集生態系に大きな影響を与えることを示す最近の研究結果と一致しており [94]、FVTによって開始されるカスケードイベントが宿主環境の変化を触媒する可能性を示唆している。細菌とファージの関係だけでなく、腸の健康における免疫系の役割も過小評価すべきではない。最近の証拠によると、ファージはTLR3やTLR9 [95,96]などのメカニズムを通じて免疫系と相互作用し、哺乳類細胞に取り込まれる [97,98]。最近の総説では、ファージの免疫原性についての現在の理解がまとめられており、真核ウイルスとの類似性が強調されている [99,100]。従って、免疫系の刺激は、FVTの効果の背後にあるもう一つのメカニズムである可能性がある。

FVT-UnT、FVT-SDT、およびFVT-ChPを投与したマウスで観察された効果では、ファージが重要な構成要素であることがよく示唆されたが、観察された効果には、代謝産物や分子サイズが30kDa（適用したウルトラフィルターのサイズカットオフ）以上の実体が寄与している可能性も残っている。これらの分子は、例えば、乳酸菌 [101]やAkkermansia属（低温殺菌細胞培養） [102]からの代謝産物、腸内細菌叢の構成に影響を及ぼす抗菌特性を持つバクテリオシン [103,104]、妊娠中の免疫調節に影響を及ぼすことが示されている細胞外ビヒクル [105,106]、炎症性腸疾患の病因に関与している可能性がある細胞外ビヒクル [107]などである可能性がある。しかし、ほとんどの代謝産物のサイズが30kDa未満であること [46、47]、FMT研究におけるドナーのファージの長期コロニー形成 [81、108、109]、再発性C. difficile感染症の治療成績にファージが関連していること [44、81]、熱処理したFVT対照の効果が報告されていないこと [15、110]、異なる病因レジームにおけるFVTの有益な効果を報告している研究 [12、13、15、16、19]を考慮すると、FVTのウイルス成分が重要な役割を担っていることが示唆される。加えて、溶媒-洗剤処理（FVT-SDT）により、脂質ベースの細胞外小胞の一定割合が溶解され、それによりFVT-SDTを用いた治療結果における潜在的役割がさらに減少したと推測される。

FVT調製プロトコールは、適用された0.45 µm濾過を通過できる微生物やその他の存在を除去しない。細菌内胞子の大きさには幅があり、0.25 µmという小さなものもあるが、典型的な大きさは0.8 µmを超える[111,112]。同様に、マイコプラズマ（Mycoplasma）、ペラギバクター（Pelagibacter）、およびアクチノバクテリア（Actinobacteria）の分類群に属する特定の細菌種は、0.2 µmという小さなサイズを達成することができる[113,114,115,116,117,118]。したがって、0.45 µmの滅菌濾過を使用すれば、大部分の細菌細胞と芽胞が除去されると予想される。このことは、調査した条件下でFVTで観察されたコロニー形成単位（CFU）数が著しく少なかったこと（表S2）、およびFVTの16S rRNA遺伝子プロファイルで、4つのFVTのうち3つで読み取り数が少なかったり、腸内関連細菌がいなかったりしたことからも裏付けられた（図S11）。0.22μmのような小さな孔径を選ぶと、細菌の混入は最小限に抑えられるが、大きなウイルスやファージは排除され [120]、一般的なファージの存在量に悪影響を及ぼすことが示されている [121]。腸の健康におけるナノサイズの細菌の存在量と重要性については、まだほとんど調査されていない [122]。したがって、これらの細菌がFVTの治療結果に影響を及ぼした可能性については、肯定も否定もできない。

多重置換増幅法（MDA）を1.5～2.0時間適用すると、ssDNA配列の存在量が過大評価され、メタゲノムの定量分析が損なわれることが報告されている[123,124]が、全ゲノム増幅の時間を30分に短縮すると、ウイルスのサンプル間相対存在量を比較するのに有効なレベルまでこのバイアスに対応できることが最近明らかになった[61]。真核生物ウイルスの分類学的分類では、主にRNAウイルスが検出され、DNAウイルスは1種類しか検出されなかった。このことは、真核生物ウイルスがRNAウイルスに支配されていることと一致している[28,29]。ファージは一般に種または株特異的であるが[14]、16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンシングに伴う細菌の分類学的解像度が限られているため、予測される宿主とファージの相関関係は細菌の属レベルに制限される。

最近の研究で、C. difficileは走化性によりムチン糖鎖成分に向かって移動するため、粘液層を感知することが示された。また、Akkermansia muciniphila、Bacteroides thetaiotaomicron、Ruminococcus torquesのようなムチン分解細菌は、C. difficileがムチン糖鎖の分解に必要なグリコシルヒドロラーゼを欠いているにもかかわらず、精製MUC2を含むがグルコースを含まない培地で共培養すると、C. difficileの増殖を可能にすることが示された[125]。興味深いことに、安楽死させたマウスがプレボテラ、乳酸桿菌、ツリシバクター、ビフィドバクテリウムのような常在菌のほとんどを失う傾向がある一方で、アッカーマンシアや バクテロイデーテス属の細菌が残存していたのは、これらの細菌群が共存していたからかもしれない。同様のマウスモデルにおいて、A. muciniphilaの高用量投与による予防的利用が、C. difficile感染に関連した症状を緩和することが示されており [126]、このことは、C. difficileとムチン分解菌との共生というよりもむしろ共存の方向を指し示している。

含まれるC. difficileVPI 10463株に関連する高い死亡率は、様々なFVTに関連する生存確率の主要なエンドポイントパラメーターを評価するのに貴重である。異なる時点で人道的エンドポイントに達した動物を安楽死させることは、当然ながら統計的検出力に影響を及ぼし、サイトカインプロファイル、病理組織学、腸内マイクロバイオーム回復の比較可能な時系列解析のような時間依存性パラメーターの評価に課題をもたらした。逆に、生存マウスが同等の組織像、C. difficileの存在量、サイトカイン・プロファイル、毒素レベル、腸内マイクロバイオーム・プロファイルを示した場合、安楽死させたマウスと同様の時点で人道的エンドポイントに達した可能性がある。この動物モデルは、3Rの原則[39]（置換、削減、改良）を遵守するために、すべての治療群にいくつかの終了点を採用する代わりに、1群あたりのマウス数を8匹に制限するように設計された。加えて、群サイズは、異なるFMT/FVT治療に関連する生存確率をスクリーニングするのに十分であると評価された。UVおよび/または熱処理したFVT対照を動物モデルの設計に含めれば、C. difficile感染症のFVT治療におけるファージの役割についてさらなる知見が得られたであろう。しかし、適用されたC. difficile感染モデルの重症度のため、2つの先行研究が熱処理FVT対照の効果を示さなかったことを考慮すると、追加の動物を含めることは3R（reduce）の原則に適合しないであろう[39]。従って、発病の重症度が低い動物モデルを用いた今後の研究において、このような対照動物を含めることは極めて重要であろう。

腸内細菌叢を回復させるファージベースの治療法に代わるものとして、最近Firmicutes 芽胞の細菌コンソーシアム（SER-109）がrCDIの治療薬としてFDAに承認された [127,128]。SER-109の治療効果は、プラセボ（60％）と比較して28％ポイント（88％）向上していることが明らかになったが [127]、別の研究では、通常のFMTはプラセボ（33％）と比較して57％ポイント（90％）の治療効果向上を示した [5]。このことは、患者群によっては、FMTが依然としてrCDIの治療戦略として望ましい可能性があることを示唆した。さらに、SER-109コンソーシアムの細菌に由来する誘導型プロファージが治療成績に果たす役割については、まだ解明されていない。したがって、ファージを用いた治療をFMTやSER-109のような細菌コンソーシアムと比較するためには、さらなる研究を実施する必要がある。

C.ディフィシル感染症の大きな課題は、再発感染のリスクである [6] 。したがって、FVT-SDTで治療した8匹のマウスのうち7匹が、治療終了時にC. difficileが検出されなかったことは興味深いことであり、これは溶媒／洗剤で改変された糞便ビロームで治療した場合、再発感染のリスクが減少することを示している。FMTにもFVTにも、糞便ドナーのばらつきと再現性という固有の課題が存在する[7,8]。2つの独立した研究により、糞便接種原液をケモスタット発酵で増殖させることで、腸内ウイルス成分を再現できる可能性が示されている[54,129]。興味深いことに、治療効果とC. difficile感染に関連した症状の減少は、ケモスタットで増殖させた腸内ビロームで治療したマウスでも顕著であった。したがって、糞便ビロームの溶媒／洗剤による方法論は、すでにWHOによって血漿を処理する安全な方法として承認されており[50]、短期的にはC. difficile感染症の治療においてFMTを補完する可能性があると言える。長期的な展望では、C. difficile感染症治療のための、費用対効果が高く、標準化され、再現性のあるケモスタット増殖腸内ファージオームは、腸内細菌異常症に関連する他の疾患のファージによる治療にも大きな可能性を持つ可能性がある。

結論

この概念実証研究の仮説は、FVTの異なる改変が、FVT/FMTに関連するドナーのばらつきと感染リスクの課題に対処する可能性を持つというものであった。特に、2つのFVT改変戦略は、感染マウスにおけるC. difficileのコロニー形成を制限する効果を示し、それによって生存の可能性を高めた。FVTの溶媒／洗剤処理によるエンベロープウイルスの不活化は、C.difficile感染に対する治療効果を維持しながら感染リスクに対処する優れた方法であると考えられた。また、ケモスタットで増殖させたFVTは、ドナーのばらつきと感染リスクの両方に対処する方法論として有望な可能性を示し、その結果、全体としてわれわれの初期仮説を確認することができた。本研究の単純性に伴う当然の限界があるため、これらの結果は、これらのFVT治療の概念を臨床環境に適用することのトランスレーション可能性と妥当性をさらに検証するための、さらなる前臨床研究を奨励するものである。

データおよび資料の入手可能性

本研究に関連するすべてのデータは、論文または補足資料に掲載されている。すべてのシーケンスデータセットはENAデータベースでアクセッション番号PRJEB58777で入手可能である。

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参考文献のダウンロード

謝辞

マウスの飼育、ハンドリング、モニタリングにご協力いただいたデンマーク・コペンハーゲン大学実験医学部（AEM）の獣医師および動物世話人のスタッフに感謝する。また、カラムクロマトグラフィーの初期セットアップを手伝ってくれたCasper Normann Nurup博士、ELISAアッセイを実施してくれたMariam Al-Batool Samir S. Bagiラボトレーニーにも感謝したい。また、本研究で使用したqPCR装置（Bio-Rad Laboratories CFX96）に資金を提供してくださったデンマーク教育研究省のFood & Health Open Innovationプロジェクト（FOODHAY）にも感謝したい。最後に、本研究を財政的に支援してくださった助成団体に感謝する。

資金提供

コペンハーゲン大学によるオープンアクセス資金提供 ルンドベック財団による助成金ID： R324-2019-1880（頭文字 "SafeVir"）およびノボ ノルディスク財団（助成金ID： NNF-20OC0063874の頭文字をとって "PrePhage "とした。

著者情報

著者および所属

  1. Section of Food Microbiology, Gut Health, and Fermentation, Department of Food Science, University of Copenhagen, Rolighedsvej 26 4, 1958, Frederiksberg, DenmarkTorben Sølbeck Rasmussen, Xiaotian Mao, Sarah Forster, Sabina Birgitte Larsen, Kaare Dyekær Tranæs, Frej Larsen, Josue Leonardo Castro Mejia & Dennis Sandris Nielsen

  2. アレクサンドラ・フォン・ミュンチョー、アクセル・コルネルップ・ハンセン、カミラ・ハートマン・フリース・ハンセン、コペンハーゲン大学獣医動物科学部実験動物モデル課

  3. デンマーク、フレデリクスベリ、1870、コペンハーゲン大学、獣医・動物科学部、比較小児科学・栄養学部門Anders Brunse

  4. タリン工科大学化学・バイオテクノロジー学部、Akadeemia tee 15, 12618, Tallinn, EstoniaSigne Adamberg & Kaarel Adamberg

貢献

概念化、TSRおよびDSN。方法論、TSR、XM、SF、FL、SBL、KDT、AVM（獣医師、健康状態モニタリングの監督）、AB（組織画像の採点）、JLCM、SA、KA、CHFH。調査、TSR、XM、SF、FL、AB、AVM、CHFH、AKH、DSN。可視化、TSR、AB、XM。資金獲得、TSRおよびDSN。プロジェクト管理、TSRおよびDSN。監督、DSNおよびAKH。執筆-原案、TSR。執筆-校閲・編集、最終原稿は全著者による批判的修正・承認。

執筆者

Torben Sølbeck RasmussenまたはDennis Sandris Nielsenまで。

倫理申告

倫理承認

C. difficile感染モデル動物（ライセンスID：2021-15-0201-00836）およびドナー動物（ライセンスID：2012-15-2934-00256）の取り扱いを含むすべての手順は、指令2010/63/EUおよびデンマーク動物実験法に従って承認され、実施された。

競合利益

著者らは、競合する利害関係がないことを宣言する。

追加情報

出版社ノート

シュプリンガー・ネイチャーは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っている。

補足情報

追加ファイル1： 図S1.

到着時（0日目）、抗生物質投与直前（8日目）、C. difficile感染直前（15日目）、1回目投与直前（16日目）、2回目投与直前（18日目）、2回目投与1週間後（23日目）、2回目投与2週間後（30日目）、終了時（35日目）に測定したマウスの体重。図S2. A)C. difficileVPI 10463のOD600nmと1mLあたりのコロニー形成数（CFU/mL）の相関を示す細菌検量線、およびB)とC)位相差顕微鏡でC. difficileVPI 10463の予想される細胞形態を確認。D) 適用されたC. difficile接種片のテクニカルレプリケートにおけるCFU数、および各マウスに移植された総CFU数。E) VLP/mLをカウントするためにSYBR Goldで染色した同様のウイルス様粒子(VLP)/mL濃度に正規化する前の、適用した異なるFVTビロームの蛍光顕微鏡画像。画像は100倍の対物レンズで撮影。C)とD)の細菌のスケールバーは4 µm、E)のVLPのスケールバーは1 µm。図S3. 腸管ドナーの由来と、異なる方法論でFVTを生成するための処理手順を示すフロー図。C57BL/6NRjマウス2匹を不正咬合に伴う栄養不良のため安楽死させた。その後、3つの異なる業者から52匹のマウスを犠牲にし、盲腸と結腸から腸内容物を採取した。ただし、34匹のマウスは酸化的条件下で、18匹のマウスは厳密な嫌気性細菌腸内細菌叢メンバーの生存率を維持するために無酸素条件下で採取した。大気条件は終始維持された。ベンダーの違いにかかわらず、腸内内容物は混合された。酸化処理された糞便混合物についてビロームの分離が行われ、抽出された糞便ビロームは、1）未処理の糞便ビローム（FVT-UnT）、2）溶媒/洗剤処理（FVT-SDT）または3）ピロニン-Y処理（FVT-PyT）を表す3つのアリコートに分けられた。無酸素処理された糞便混合物は、CDIマウスモデルにおける糞便微生物叢移植（FMT）、またはケモスタットセットアップにおける糞便ビローム増殖のための接種用（FVT-ChP）として使用するために、2つのアリコートに分割された。また、FVT-ChPはビローム分離を行い、ほとんどの代謝産物や細菌などの大型微生物を除去した。図S4. CDI症状の評価。A) 試験終了時または人道的エンドポイントに達したためマウスを安楽死させた時に採取した盲腸組織の代表的組織像。アスタリスク＝免疫細胞浸潤、矢頭＝うっ血した粘膜下血管、矢印＝偽膜形成に寄与する火山病変。組織像のスケールバー＝300μm。B-F) モニタリング中の個々のマウスの健康状態の定性的視覚評価を示すグラフ。評価は、身体活動のレベル（すなわち、自発的または誘発された活動の低下）、水様便のレベル、体の姿勢（猫背）、および毛皮が清潔に保たれているかどうかに基づいて行われた。0点（健康）、1点（軽い症状）、2点（明らかな症状）、3点（2点のマウスで次回検診までに改善が見られない場合は安楽死させた）のスコアで評価した。各グラフの下にマウスIDを示す。H-J)盲腸組織の病理組織学的評価で評価された3つのパラメータのバイオリンプロットを示す。上の数字はp値を示す。図S5. ベースライン（抗生物質投与前）、CDI感染前（抗生物質投与後）、終了時（安楽死／生存）の3時点におけるバクテリオーム（16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンス）およびメタビローム（全ゲノムシークエンス）解析。治療群は、マウスが終息まで感染を生き延びたか、終息前に安楽死させられたかにかかわらず、平均値を表している。A) & C) 細菌とウイルスのシャノン多様性指標（α-多様性）、B) & D) Bray-Curtis非類似度ベースのPCoAプロット（β-多様性）。E)細菌およびF)ウイルス分類群の塩水対照と比較した相対存在量の差を示すボルケーノプロット。図S6. ベースライン（抗生物質投与前）、C. difficile感染前（抗生物質投与後）、および投与終了時まで生存したマウス、または投与にかかわらず安楽死させたマウスの3時点におけるバクテリオーム（16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンシング）およびメタビローム（全ゲノムシークエンシング）解析。A) 細菌のシャノン多様性指標（α-多様性）とB) Bray-Curtis非類似度ベースのPCoAプロット（β-多様性）。C)生存したマウスと安楽死させたマウスに関連する優勢な細菌分類群のパーセンテージでの細菌相対量を示すヒートマップ。D)ウイルスのシャノン多様性指標とE)Bray-Curtis非類似度ベースのPCoAプロット。F)およびG)ウイルス配列に基づいて予測されたウイルス分類学および細菌宿主の相対的な存在量のパーセンテージを示すヒートマップ。図S7. C.difficile感染前（抗生物質治療後）と安楽死または生存時のFVT-PyT治療群における各マウスの相対的存在量をパーセンテージで示した分類学的棒グラフ。No.45とNo.47のマウスでは、他のマウスでは観察されなかったサルモネラ菌が比較的多く見られた。図S8. FMT/FVT接種液から処理マウスへの潜在的な細菌およびウイルスの生着を、A）16S rRNA遺伝子アンプリコンおよびB）ウイルスメタゲノムレベル（ウイルスコンティグ）で解析した。腸内細菌叢は、ドナー由来と、ベースライン（抗生物質投与前）、C. difficile感染前（抗生物質投与後）、マウスが終了まで生存した時点または安楽死させた時点の異なる時点に分けられた。FVT接種液と治療前の時点のマウスの両方で見つかったアンプリコン／ウイルスコンティグには重複があったため、この解析は細菌とウイルスの生着について部分的にしか説明していない。図S9. 細菌とウイルスの相対存在量のスピアマンの相関分析。クラスターAとBは細菌とウイルスの正の相関を示す。図S10. ベースライン（抗生物質治療前）、C. difficile感染前（抗生物質治療後）、および終了まで生存したマウスまたは安楽死させたマウスの終了時の3時点における全ゲノム配列決定に基づく、真核生物ウイルス（そのように分類できたもの）のみのメタビローム解析。A)ウイルスのシャノン多様性指数（α-多様性）およびB)Bray-Curtis非類似度ベースのPCoAプロット（β-多様性）。C) 異なるFMT/FVT接種液中の真核ウイルスの相対的存在量をパーセントで示した箱ひげ図。D) 真核ウイルスの分類学的相対存在量を示すヒートマップ。E)経時的に処理したマウスの真核ウイルスの相対量を示す箱ひげ図。ss/dsRNAおよびss/dsDNAウイルスを検出するための適用されたプロトコルの技術的コントロールとして、適用されたFMTおよび異なるFVTの接種量に定義されたファージモックコミュニティをスパイクした。図S11. FMT/FVT接種液の16S rRNA遺伝子アンプリコン配列決定による細菌プロファイルの評価。A）検出されたリード数、B）観察された細菌種の数（α-多様性）、およびC）検出された細菌分類群のパーセンテージでの相対存在度を示す棒グラフ。

追加ファイル2：表S1。

プラークアッセイに使用した細菌およびファージ菌株のリストと、菌株固有の関連情報および増殖条件。同じファージをモックコミュニティ（陽性対照）およびメタビロームシーケンス用のスパイクとしても使用し、各ファージについて106PFU/mLに正規化した。表S2. 本研究で使用したFVTは、非選択性岐阜嫌気培地（GAM）で37℃、14日間嫌気培養した。ここで、適用した各FVTについて、以下のコロニー形成単位（CFU）数を観察した。表S3. ケモスタット増殖糞便性ビローム（FVT-ChP）のケモスタット増殖に使用した増殖培地中の成分とその濃度（g/L）の一覧。表S4. 抗生物質（AB）の水消費量のリスト。量は各ケージの平均値として計算した。

追加ファイル3.

ARRIVE Essential 10チェックリスト。

権利と許可

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Rasmussen, T.S., Mao, X., Forster, S.et al.バクテリオファージを介した治療による糞便微生物叢移植に伴うドナーのばらつきとリスクの克服。Microbiome 12, 119 (2024). https://doi.org/10.1186/s40168-024-01820-1

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  • 2023年7月10日受領

  • 受理2024年4月19日

  • 2024年7月1日発行

  • DOIhttps://doi.org/10.1186/s40168-024-01820-1

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マイクロバイオーム

ISSN: 2049-2618

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