モデル海綿体Ianthella bastaのほぼ完全なマイクロバイオームの代謝的再構築

環境微生物学早わかり

モデル海綿体Ianthella bastaのほぼ完全なマイクロバイオームの代謝的再構築
Joan Pamela Engelberts, Steven J. Robbins, Craig W. Herbold, Florian U. Moeller, Nico Jehmlich, Patrick W. Laffy, Michael Wagner, Nicole S. Webster
初出：2022年12月8日
https://doi.org/10.1111/1462-2920.16302
資金提供情報 欧州研究評議会、グラント/アワード番号：294343；オーストリア科学基金、グラント/アワード番号．Z-383-B
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要旨
多くの海綿は、宿主の健康の様々な側面に貢献する非常に多様なマイクロバイオームを宿主としている。海綿共生生物の個々のグループの推定機能については次第に明らかにされつつあるが、極めて多様であるため、一般に、共栄提携の特定を含むマイクロバイオーム全体の詳細な特性解明は不可能であった。インド洋海綿Ianthella bastaは共生研究のモデル生物として浮上しており、Thaumarchaeotum、Gammaproteobacterium、Alphaproteobacteriumの3つの主要共生生物とその他の低存在量または一時的分類群を宿主としているのみである。今回、I. bastaの微生物群集の90%以上を占めるメタゲノム集合ゲノム（MAG）を取得し、海綿のほぼ完全なマイクロバイオームの代謝的再構築を促進しました。この解析により、ビタミンの共有など微生物間の代謝的補完性の確認、低存在量の共生細菌の重要性、アルファプロテオバクテリアの新しい微生物-宿主付着機構の特徴などが明らかになりました。さらに、推定されるウイルス配列を同定し、真核生物に類似したタンパク質の水平伝播を通じて、I. bastaの共生を維持するためにウイルスが果たす役割を強調し、このデータをメタプロテオミクスで補完して、細菌、古細菌、ウイルスの活性代謝経路を同定しました。このデータは、I. bastaを宿主-微生物相互作用研究のモデル生物として採用するための枠組みを提供し、詳細な生理学的実験のための基礎を提供するものである。

はじめに
海綿は、世界中の水生生態系において生態学的に重要な構成要素であり、毎日数千リットルの水をろ過することによって生息地を提供し、生化学的サイクルを仲介している（Bell, 2008; de Goeij et al.） 例えば、サンゴ礁では、海綿が溶存有機物（DOM）を取り込んでバイオマスに変換し、それをサンゴ礁に住む剥 離性生物が消費してループが完成するという「スポンジループ」によって、栄養塩をリサイクルして維持しています（de Goeij et al.） 海綿は、周囲の海水とは異なる多様で安定した微生物群集を宿し（Schmitt et al.、2012；Taylor et al.、2013）、ホロビオットの健全性と全体的な機能に寄与している。例えば、海綿共生体は、DOMの同化に積極的に関与し、宿主の廃棄物をリサイクルし、有毒アンモニアを代謝し、ウイルスなどの移動性遺伝要素に対する防御を助け得る制限修飾系に富む（Hudspithら、2021；Moellerら、2019；Pitaら、2018；Robbinsら、2021；Slabyら、2017）。

スポンジマイクロバイオームの重要性にもかかわらず、その複雑さは各微生物分類群の詳細な特徴付けを妨げ、多くのスポンジ種は最大3000の異なる微生物種を宿す（ウェブスターら、2010年）。その結果、海綿共生体の詳細な記述はほとんどなく、微生物合成に関する仮説は、コミュニティの一部のメンバーに限定されたままである（Bayer et al.、2020；Moitinho-Silva et al.、2017）。さらに、すべての支配的な微生物メンバーの機能がオミックスデータから推測されている海綿種は、低存在量で存在する共生体に関するデータが不足していることが多い（Gauthier et al.、2016）。しかし、低存在量の微生物は、高存在量の微生物とは根本的に異なるプロセスを駆動することができます（Rivett & Bell, 2018）。海綿体ホロビオントがどのように機能するかを体系的に理解し、共生の確立と維持のメカニズムをさらに解明するための操作実験を可能にするためには、完全に特徴付けられたモデル生物が必要である。また、このようなモデルは、より複雑な動物と微生物との共生関係を研究する上でも非常に貴重である。

Ianthella bastaはインド太平洋全域に豊富に存在する海綿であり、Thaumarchaeotum、Gammaproteobacterium、Alphaproteobacteriumの3つの支配的な共生体のみを宿し（Luter et al., 2010; Moeller et al., 2019）、その他の低存在の分類群の範囲では、海綿共生に関するモデル確立に最適の候補となっています。Ianthella bastaのマイクロバイオームは、異なる環境にわたって安定しており（Luter et al., 2010）、垂直感染する（Engelberts et al., 2022）優勢な共生生物が、通常コミュニティの90％以上を構成しています。I. bastaのこれまでのメタゲノムおよび生理学的研究により、優占するThaumarchaeotumおよびGammaproteobacteriumが、それぞれアンモニア酸化やタウリン代謝などの重要な経路内のキープレイヤーであることが明らかになった（Moellerら、2019、2022年）。ここでは、支配的なAlphaproteobacteriumとサンプル間で持続的に存在するいくつかの低濃度微生物のMAGを回収してマイクロバイオームを完成させ、I. bastaのマイクロバイオームのゲノム的に予測できる代謝の可能性を完全に記述するだけでなく、これらの微生物間の代謝的補完性を再構築することができた。さらに、海綿の代謝能力に対するウイルスの寄与を明らかにし、メタプロテオミクスシーケンスですべてのデータを補完しています。本研究は、I. bastaを将来の操作実験に利用するための前例のない枠組みを提供する（Engelberts et al.、2021）。

実験手順
サンプル採取
Ianthella basta海綿には、紫色と黄色の2つの色彩形態があり（Freckelton et al.、2012）、そのうち組織は厚いか薄いかのいずれかに指定することができる。本研究では、2019年11月にグレートバリアリーフ中央部のオルフェウス島（18°37′S, 146°30′ E）から水深11～15mの間で、組織が薄い黄色のIanthella basta3個体をスクーバで採集した。海綿は水槽で12時間飼育した後、断片化してスナップ冷凍し、メタゲノム配列決定のためにブリスベンのオーストラリアン・エコゲノミクスセンター（ACE）に、メタプロテオーム解析のためにヘルムホルツの環境研究センター（ドイツ・ライプツィヒ）に送付された。

本研究で回収したメタゲノムがI. bastaの異なる形態に見られる支配的共生体を代表するものかどうかを判断するため、紫色で厚い形態（Engelberts et al., 2022）の3つの支配的共生体の以前に回収した16S rRNA遺伝子アンプリコン配列をBlast v2.9.0+ (Camacho et al., 2009) で我々のゲノムと比較してブラストを行った。さらに2021年2月にDavies Reef (S 18°49.354′, E 147°38.253′) から水深12～15mでSCUBAを用いて黄色、薄い個体と黄色、厚い個体3個体が採集された。これらの個体について、Engelbertsら（2022）に記載された方法に従って3つの優勢共生体の16S rRNA遺伝子アンプリコン配列を取得し、再び本研究のゲノムにブラストした（16S rRNA遺伝子アンプリコン配列は表S2参照）。

微生物濃縮、DNA抽出、およびメタゲノム配列決定
微生物細胞は、サンプルを1Xカルシウム／マグネシウムフリー海水（CMFSW）中で氷上で5分間粉砕してスポンジ組織を均質化したことを除いて、Bottéら（2019）に記載の方法に従って、I. basta全3個体のホスト組織から分離した（〜1個体あたりスポンジ湿重量3g）。サンプルをDNase I（RNase-free, New England Biolabs, M0303）で処理して、残存する宿主および細胞外DNAを除去した後、Robbinsら（2019）に記載のフェノール-クロロホルムプロトコルを使用して、DNAをせん断し得るすべての凍結-融解サイクルを省略して微生物DNAを抽出した。宿主細胞の除去により、クラミジアなどの細胞内共生体が除去される可能性があることに留意する（Engelbertsら、2022年）。抽出したDNAの量と質は、Qubitアッセイと16S/18S rRNA PCRを用いて確認した。ライブラリーは、Microba Life Sciences（オーストラリア、ブリスベン）のIllumina Nextera Flex library prep kitで調製し、Illumina NovaSeq 6000（2 × 250 bp）で配列決定した。すべてのサンプル（n = 3）は、まず平均深度5.5Gbpで配列決定してカバレッジの差分ビニングを行い（Albertsenら、2013）、その後、低存在量の微生物のカバレッジを高めるために20Gbpの深度で配列決定を行いました。

メタゲノム解析、ビニング、および分類学的割り当て
ペアエンドDNAシーケンスデータは、Illumina BaseSpace Bcl2fastq2 v2.20を使用して、インデックス配列の1つのミスマッチを受け入れながら、デマルチプレックスおよびアダプターのトリミングを行いました。すべてのリードは、metaSPades v3.14.0 (Nurk et al., 2017)を使用して組み立てられた。このデータセットを補完するために、1つの紫色で厚いI. basta個体（2011年10月にサンプリング；Moellerら、2019）上の6回の配列決定実行から以前に取得した微生物メタゲノムリードを、metaSPAdes v3.14.0（Nurk ら、2017）を使用して再集合し、本研究からのデータとともに分析した。すべてのデータのビン化（各スポンジ個体について別々に）は、ビン化アルゴリズムMetaBAT v1 (Kang et al., 2015), MetaBAT v2 (Kang et al., 2019), MaxBin v2 (Wu et al., 2015), CONCOCT (Alneberg et al., 2014), VAMB (Nissen et al., 2021) and Rosella (https://github.com/rhysnewell/rosella) を使用してAviary (https://github.com/rhysnewell/aviary) の「回復」パイプラインによって実施されました。DASTool v1.1.2 (Sieber et al., 2018)を使用して、異なるビニングアルゴリズムから生成された各スポンジ個体の最良の代表的メタゲノム集合ゲノム（MAG）について選択した。各MAGの完全性と汚染をCheckM v1.1.3 (Parks et al., 2015)を使用して決定し、5％未満の汚染で50％以上の完全性を有するMAGのみを下流の解析に保持した。

Genome Taxonomy Database (GTDB, http://gtdb.ecogenomic.org) taxonomy Release 202に基づくGTDB-Tk v1.5.0 (Chaumeil et al., 2019) を用いて、各MAGに分類を割り当てた。GTDB-Tkは、FASTANI（Jainら、2018）およびpplacer（Matsenら、2010）を使用して、120の細菌および122の古細菌マーカーのセットを使用して推測される参照木におけるそれらの配置に基づいてMAGを分類する。

MAGは、我々の研究およびMoellerら（2019）のI. basta個体から回収された重複するMAGを除去するために、それ以外のデフォルトパラメータ（Olmら、2017）を用いてDrep v2.6.2で95％の同一度でデリプレートした。回収されたMAGがI. bastaの微生物コミュニティの大部分を代表していることを確認するために、すべての生リードおよびMAGにおいて単一コピーマーカー遺伝子を同定し、その後、SingleM v0.13.2 (https://github.com/wwood/singlem) の「パイプ」および「アプレイズ」機能を用いてMAGに取り込まれたマーカー遺伝子の分率を評価した。I. bastaの全4個体（本研究から3つ、Moellerら, 2019から1つの研究）における各MAGの相対的存在量を計算するために、類似度の高いゲノムの代表間の任意のマッピングを避けるために、まずDrep v2.6.2 (Olm et al., 2017) で95%同一性の時点でMAGをデレプレートし、 CoverM v0.2.0 (https://github.com/wwood/CoverM, min-covered-fraction set to 0.1) でリードをこれらのMAGにマップした。最終的なヒートマップはR v4.0.5（R Core Team, 2013）で可視化し、本研究のI. basta 3個体のディープシーケンス実行によるリード、Moellerら（2019）のI. basta 1個体のリード、I. basta 4個体にわたって安定して存在した（すなわち、4個体のうち少なくとも3個体に存在した；図1）MAGsを表示した。これらのMAGは、I. bastaのマイクロバイオームの代謝的再構築に使用された。さらに、Moellerら（2019）の454-pyrosequencingランに由来するデータセットを分析した。このデータセットから、ThaumarchaeotalとGammaproteobacterial MAGが、本研究で回収されたゲノムと比較して、98.90％と97.78％のANI値で回収された。ただし、配列深度が浅いため、このデータは図1には含まれていない。

詳細は画像に続くキャプションに記載しています
図1
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パワーポイント
キャプション
系統樹の作成
GTDB-Tk v1.5.0 (Chaumeil et al., 2019)の「de_novo_wf」ワークフローを用いて、I. bastaの3つの優勢共生体それぞれについて、古細菌と細菌の系統樹を推論した。このワークフローは、WAG + GAMMAモデルを使用してFastTree v2.1.9 (Price et al., 2010)を使用してde novo木を計算します。各木には、それぞれのI. basta共生生物と同じ門またはクラスに属するGTDBからのすべての公開ゲノム、すなわちすべてのThaumarchaeota（合計564 MAGs）、Gammaproteobacteria（8980 MAGs）またはAlphaproteobacteria（7361 MAGs）が含まれました。図S1〜S3について、Interactive Tree Of Life (iTOL) v6.4.1 (Letunic & Bork, 2021) とInkscape v0.92.4 (https://inkscape.org/) を用いて、木ファイルをさらに視覚化し、精緻化した。

I. basta Thaumarchaeotal MAGとGammaproteobacterial 16S rRNA遺伝子アンプリコン配列（Moeller et al., 2022参照）に最も近いのは、I. bastaと同じくイガイガ科に属するHexadella detritiferaという海綿であった。I. basta由来の支配的なAlphaproteobacterialおよびGammaproteobacterial MAGが、H. detritiferaで見つかった微生物共生体とも最も密接に関連しているかどうかを解明するために、H. detritiferaからの既発表の生リードを組み立ててビニングした（Zhang et al., 2019）。その結果、α-およびガンマプロテオバクテリアのMAGが系統樹に加えられた（補足注1参照）。

MAGの機能アノテーション
EnrichM v0.6.3（https://github.com/geronimp/enrichM）の「annotate」機能を用いて、MAGsにKyoto Encyclopaedia of Genes and Genomes (KEGG) Orthologies (KOs) およびPFAMデータベース（Kanehisa et al, 2015; Mistry et al., 2020）、さらにdbCAN（database for Automated carbohydrate-Active Enzyme Annotation）（Yin et al., 2012）の隠れマルコフモデル（HMM）を用いて糖質活性酵素（CAZYs）を同定しています。炭素固定、ビタミン生産、アミノ酸生合成経路については、EnrichM v0.6.3 'classify' を用いて、60%以上完成している経路を特定し、結果として MAG に割り当てた。特に、コバラミン生合成のKEGGモジュールは完全なパスウェイを含んでいないため、Engelbertsら（2020）によって定義されたコバラミンモジュールを使用した。アミノ酸生合成経路の存在は、GapMind（Priceら、2020）を用いてさらに検証された。ABCトランスポーターがMAGに正に割り当てられるためには、基質特異的な構成要素と内在性膜タンパク質の両方の遺伝子が存在する必要があった。二次代謝産物クラスターは、AntiSMASH v5.0 (Blin et al., 2019)を用いて各MAGで予測された。細胞質および外膜を横断するトランスロケーションのためのシグナルペプチドが予測されるタンパク質は、SignalP v5.0 (Almagro Armenteros et al., 2019)を使用して同定された。

ウイルス配列の同定、クロスバリデーション、およびアノテーション
VirSorter v1.1 (Roux et al., 2015)を用いて、すべてのメタゲノムアセンブリにおいて推定ウイルス配列を同定した。分類を割り当てるために、推定ウイルス配列は、RefSeq Nonredundant (Nr) データベース (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/) のウイルス成分に、E値カットオフ1e-05でアライメントされた。配列はまた、交差検証のため、およびそれらの分類学的割り当てをさらに確認するために、BlastP v2.9.0 (Camacho et al., 2009) を用いてI. basta (Laffy et al., 2018) から以前に回復したウイルス配列に対してブラストした（表S6）。ウイルスコンティグは、Prodigal v2.6.3 (Hyatt et al., 2010)を用いてメタゲノム集合体のオープンリーディングフレーム（ORF）を呼び出すことによって機能的にアノテーションされた。その後、EnrichM v0.6.3 (https://github.com/geronimp/enrichM) を用いてKOおよびPFAMデータベースとORFのアノテーションを行った。

タンパク質の抽出とプロテオーム解析
本研究でメタゲノム解析されたI. bastaと同じ3個体の組織をメタプロテオーム解析のためにHelmholtzの環境研究センターに送付した。海綿組織は、ビーズビート（FastPrep-24, MP Biomedicals, Sanra Ana, CA, USA; 5.5 ms, 1 min, 3 cycles）に続き、超音波処理（UP50H, Hielscher, Teltow, Germany; cycle 0.5, amplitude 60%）と遠心分離（10000 × g, 10 min）により破砕された。タンパク質ライセートをSDS-gelにロードし、10分間反応させた。ゲル片を切り出し、洗浄し、25 mM 1,4 dithiothreitol (in 20 mM ammonium bicarbonate) で1時間、100 mM iodoacetamide (in 20 mM ammonium bicarbonate) で30分インキュベートし、脱染、脱水し、トリプシン (Promega) で37℃で一晩プロテオティック切断をした。消化されたペプチドをZipTip μC18チップ（Merck Millipore, Darmstadt, Germany）を用いて抽出し、脱塩した。ペプチドライセートを15 μl 0.1% ギ酸に再懸濁し、ナノ液体クロマトグラフィー質量分析計 (UltiMate 3000 RSLCnano, Dionex, Thermo Fisher Scientific) により分析した。溶出したペプチドライセートの質量分析は、TriVersa NanoMate (Advion, Ltd., Harlow, UK) と結合したQ Exactive HF質量分析計 (Thermo Fisher Scientific) で実施された。ペプチドライセートを、98%水/2%ACN 0.5%トリフルオロ酢酸を用いて5μl/minでトラッピングカラム（Acclaim PepMap 100 C18, 3μm, nanoViper, 75μm × 2 cm, Thermo Fisher Scientific）に注入し、300nl/minの流速で分析用カラム（Acclaim PepMap 100 C18, 3μm, nanoViper, 75μm × 25 cm, Thermo Fisher Scientific）上で分離させた。移動相は、水中0.1%ギ酸(A)と水中80%ACN/0.08%ギ酸(B)を使用。フルMSスペクトル（350-1550 m/z）は、Orbitrapで120,000の分解能で、自動ゲインコントロール（AGC）目標値3×106イオンで取得されました。

LC-MS/MS測定から得られたデータは、SEQUEST HTを使用してProteome Discoverer v2.4 (Thermo Fischer Scientific)で解析された。タンパク質の同定は、本研究のI. bastaの3個体およびMoellerら（2019）の1個体のすべてのメタゲノム集合体およびMAGにおいてProdigal v2.6.3 (Hyatt et al., 2010) により同定されたタンパク質からなるカスタムタンパク質データベースを使用して行った。すべてのタンパク質配列は、EnrichM v0.6.3（https://github.com/geronimp/enrichM）を用いてKOおよびPFAMデータベースと機能的にアノテーションされた。任意のマッピングを避けるため、タンパク質の同定には非冗長なタンパク質配列のみを使用した（100%の同一性閾値でクラスタリング）。検索は以下のパラメータで行った。酵素特異性はトリプシン、切断ミスは2回まで許容。ペプチドイオンの公差は10ppm、MS/MSの公差は0.02Daを使用した。修飾として、酸化（メチオニン）およびカルバミドメチル化（システイン）が選択されました。おとりデータベースに基づくq値が1%以上で、ペプチドランクが1であるペプチドを同定とした。冗長なタンパク質は、厳密なパーシモン原理を適用してタンパク質群に分類された。また、Proteome Discoverer v2.4で実装されたTop3アプローチにより、少なくとも1つのユニークな同定ペプチドを説明するタンパク質群のみが報告されました。

このタンパク質データセットは、Moellerら（2019）でサンプルされたI. basta個体から以前に回収したメタプロテオミクスデータで補完された。この目的のために、Moellerら（2019）からの49の生タンパク質スペクトルすべて（https://www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD012484）を、上記と同じパラメータを使用してカスタムI. bastaタンパク質データベースに対して検索した。しかし、Moellerら（2019）のMS-分析はLTQ Velos Orbitrapで行われ、MS/MSスペクトルは「ユニット分解能」-モードで測定されたので、タンパク質レポートは、1つのペプチドに基づいてタンパク質の同定を防ぐために、リストされた各タンパクが少なくとも2つのペプチドを有するようにさらにフィルタリングされた。

結果および考察
一般的なMAGの統計と選択
合計で43の微生物MAGが4つのI. basta個体から回収され、そのうち23は本研究で収集した3つのI. basta個体に由来し、20は2011年にサンプリングした個体に由来した（Moeller et al.、2019）。回収されたMAGの平均完全度は86％±13％、汚染度は1％±1％、GC含量は61％±3％であった（表S1）。海水微生物で一般的に観察される低いGC割合（Giovannoni et al., 2005）とは対照的に、海綿共生体メタゲノムでは比較的高いGC含有率（すなわち50％以上）が一般的に観察される（Horn et al., 2016; Moeller et al., 2019）。これは、栄養塩（DOMおよびDON）の濃度および海綿宿主によるタウリンの放出に由来する窒素の高い環境利用可能性（Luoら、2015）により引き起こされる可能性がある（Moellerら、2022；Rixら、2020；Robbinsら、2021）。I. basta個体間で重複するMAGを除去するために95％の同一性でMAGを再複製すると、総数が10に減少し、その中には、以前に特徴付けられた「Candidatus Nitrosospongia ianthellae」を表すThaumarchaeota門の古細菌MAGが1つ含まれていた（Moeller et al, 2019）（GTDB Release 202によるThermoproteota）、及びProteobacteria（クラスα-及びGammaproteobacteria；それぞれ3つのMAG及び1つのMAG、Gammaproteobacterial MAGは以前に分析された「Candidatus Taurinisymbion ianthellae」を表す；Moellerら、2022）、Planctomycetota（3つのMAG）、藍細菌（1）及び酸性細菌群（1））に属する、細菌MAG9つが含まれている。I. bastaの4個体から回収された3種の支配的共生生物のゲノムは、いずれもANIが96.1%から99.9%であった。I. bastaの各個体におけるMAGの相対的存在量を解析したところ、Acidobacteriota, Cyanobacteria, Planctomycetotaに属するMAG（2種類）は半数の個体で存在しないことがわかった。したがって、これらのMAGはさらなる解析から除外された。その結果、I. basta個体間で一貫して（すなわち、試験した4個体中3個体以上で）存在した6つのMAGは、相対的存在度が0.2%±0.6%から51%±11%の間であった（図1）。生リードとMAGの両方でSingleMによって同定された単一コピーマーカー遺伝子の存在に基づき、これら6つの共生生物は海綿の微生物群集の92%を占め、I. bastaマイクロバイオームのすべての主要メンバー（すなわち、ほぼ完全なマイクロバイオーム）の代謝的再構成を可能にした。検出された微生物群集の残りの8%は、食物細菌または非常に低存在の共生細菌であると思われます。

支配的な共生生物は海綿特有の共生生物クレードに含まれる
本研究で回収したメタゲノムがI. bastaの全形態で見られる優占共生細菌を代表しているかどうかを判断するため、3種の優占共生細菌の既回収（紫、太い形態）および新規回収（黄、細い形態および太い形態）の16S rRNA遺伝子アンプリコン配列を本研究のゲノム（黄、細い形態）と照合し、ブラストを行った。すべての16S rRNA遺伝子配列は、それぞれのゲノムに対して99.2%以上の同一性でマップされ、地理的・形態的に異なるI. basta個体に非常に類似した共生生物群集が存在することが示された（表S2）。次に、I. bastaの主要共生生物の系統配置と近縁種を決定するために、Thaumarchaeotum 'Candidatus Nitrosospongia ianthellae'（図S1）、Gammaproteobacterium 'Candidatus Taurinisymbion ianthellae' （図S2）、および豊富なAlphaproteobacterium（図S3）についての3系統樹が推論されました。この3つの共生生物は、過去に海綿から回収された微生物MAGとクラスターを形成しており、今回の知見を他の海綿種に外挿することができ、共生研究のモデル種としてI. bastaの適用性を広く支持することができました。I. bastaに最も多く共生していたThaumarchaeotum（「Ca. Nitrosospongia ianthellae」：Moeller et al., 2019）は、海綿Hexadella dedritiferaに関連するNitrosopumilus属のMAGと最も近縁であった（Zhang et al, 2019）（GB_GCA_003724325.1に対する64.00％の平均アミノ酸同一性［AAI］；図S1）、これはI. bastaと同様に海綿科Ianthellidaeの一員である。'Ca.である。Nitrosospongia ianthellae」は、海産デモスポンジCoelocarteria singaporensis由来のNitrosopumilus関連MAGともクラスター化した（Botté et al.、2019）。Ianthella bastaの支配的なガンマプロテオバクテリウム（'Ca. Taurinisymbion ianthellae'; Moeller et al., 2022）は、海綿H. dedritiferaから回収したLS-SOBファミリーの2つのMAGと最も近縁だった（Hexadella_Gamma_MAG_1と79.83%AAI、Hexadella_Gamma_MAG_2と77.48%AI、補遺1参照）。これら3つのゲノムを合わせると、海綿動物Ircinia ramosa由来の1つのLS-SOB MAGと姉妹群を形成し（Engelberts et al.、2020）、さらに海綿動物Coscinoderma matthewsi（Glasl et al.）の他の6つのLS-SOB MAGと姉妹群を形成していた。2020）、Lophophysema eversa（Tian et al., 2016）、Mycale hentscheli（Rust et al., 2020; Storey et al., 2020）、Ircinia ramosa（Engelberts et al., 2020）（図S2）であった。Alphaproteobacterium（o_JABSOH01）は、3つの支配的な共生体の中で最も分解された分類学が低く、H. dedritiferaから回収したAlphaproteobacterial MAG（71.68% AAI）と最も近縁であり、これらは共に同じ目に属する深海海綿Vazella pourtalesii（Bayer et al, 2020）から見つかった6つのゲノムと姉妹グループを形成した（図 S3）。深海海綿Vazella pourtalesiiの6つのAlphaproteobacterial MAGと比較すると、I. bastaのAlphaproteobacterial MAGはGCA_014238935.1で最もAAIが高く43.87%（図S3）、同属でグループ化したMAGで典型的に見られるAAI60〜80%（Konstantinidis et al, 2017）を大きく下回ることが明らかになりました。したがって、本共生体は新属内の新種であると提案し、仮に「Ca. Luteria ianthellae」と仮称した。種名ianthellaeは、本微生物の宿主である海綿Ianthella bastaに由来する。属名は、I. bastaの基礎研究を行ったHeidi Luter博士の名前にちなんでいる。

I. bastaの3つの支配的な共生生物はすべて、H. dedritiferaの微生物共生生物と最も近縁であった。両種ともイボイソカイメン科に属することから、3つの主要共生生物はこれら2つのカイメン属の共通祖先によって獲得されたことが示唆された。今後の研究では、イボイソカイメン科のマイクロバイオームの進化の歴史をより深く理解するために、このカイメン科の他のメンバーの微生物群集の特徴づけに焦点を当てる必要があります。

メタプロテオミクスデータの全体像
合計で、11,543の発現タンパク質配列（8675非冗長）が、4つのI. basta個体、（ここで3つは本研究で、1つはMoellerらによる研究、2019で配列決定された）から回収され、そのうち6480が、（KEGG）オーソロジー（KOs）またはPFAMデータベース（表S3）によって機能的に注釈を付けることができた（S3）。I. bastaの6つの共生体のゲノムには、合計1700のタンパク質が捕捉され、そのうち1134が機能的にアノテーションされた。631 (37%) のタンパク質配列がGammaproteobacteriumに、496 (29%) がAlphaproteobacteriumに、354 (21%) がThaumarchaeotumに、124 (7%) がRuegeria (Alphaproteobacterium) に、88 (5%) がUBA1268 (Planctomycetota) に、7 (0.4%) がUBA2767 (Alphaproteobacterium; 表 S3)に割り当てられていることが明らかにされた。

Ianthella bastaのマイクロバイオミクスに関するメタプロテオゲノム解析
Ianthella bastaの完全なマイクロバイオームのメタプロテオゲノム解析により、6つの共生生物間の機能分布についてユニークな知見が得られた（図2、表S3およびS4）。例えば、微生物によるアンモニアの酸化は、アンモニアが有毒レベルにまで蓄積するのを防ぎ（Zhang et al. このステップを担う遺伝子、アンモニアモノオキシゲナーゼ（amoA）の機能解析により、Thaumarchaeotaのみがスポンジでアンモニア酸化を行えることが明らかにされ（Robbinsら、2021）、これは同位体ベースの機能アッセイによりI. bastaで確認され（Moellerら、2019）、さらにここで裏付けされた（図2）。興味深いことに、I. bastaは亜硝酸酸化剤を保有していないため、ホロビオントとしてアンモニアから亜硝酸への不完全な硝化を行う（Moeller et al.、2019年）。さらに、存在量の少ない微生物は、アンモニアの酸化によって生成される亜硝酸塩と一酸化窒素を還元するゲノムポテンシャルを有していることを示す。例えば、2つの低存在量のアルファプロテオバクテリアの1つ（g_Ruegeria）は、亜硝酸を一酸化窒素と亜酸化窒素を介して二窒素に還元する（すなわち脱窒、nirS、norBC、nosZによって触媒される）遺伝子をコードし、これはシステムから窒素を放出する可能性がある（図2、表S4）。注目すべきは、脱窒の最初の2段階は、NirKとqNORを通じてガンマプロテオバクテリア（'Ca. Taurinisymbion ianthellae'）でも行うことができ、そのうち後者はさらに'Ca. Luteria ianthellae' にコードされていたことである。Luteria ianthellae'にコードされている。あるいは、一酸化窒素は、一酸化窒素ジオキシゲナーゼ（Hmp；図2、表S4）を触媒として、他の低存在量のアルファプロテオバクテリア（g_UBA2767）を介して硝酸塩に無毒化される可能性もある。興味深いことに、同位体ベースの機能アッセイに基づき、I. bastaにおいて脱窒および硝酸塩生産が起こることが以前に示唆されたが（Moeller et al.、2019）、責任生物の特定は確認できなかった。今回の結果から、スポンジホストから窒素化合物を除去し変換するこれらの重要なプロセスは、Ruegeria属とUBA2767属の低存在量のアルファプロテオバクテリアが担っていることが示唆された。

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図2
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パワーポイント
キャプション
タウリンは海綿に天然に存在する化合物で、I. bastaでは最大6μmol/g wet weightの濃度が測定されている（Moeller et al.、2022）。ガンマプロテオバクテリア「Candidatus Taurinisymbion ianthellae」は、硫酸とアンモニアの放出と相まって、タウリンをエネルギー保存に利用する代謝能を有することが示されている（Moeller et al.） 興味深いことに、豊富な共生生物である'Ca. Taurinisymbion ianthellae」だけでなく、存在量の少ないAlphaproteobacterium (g_UBA2767) もタウリンの利用が可能であることがわかった。後者の共生体は、タウリントランスポーター（tauABC）と、タウリンを亜硫酸塩に変換する2つのタウリン分解経路の遺伝子（タウリンジオキシゲナーゼ［tauD］またはタウリンデヒドロゲナーゼ［大きなサブユニットTauYがコードされているが小さなサブユニットTauXはない］とスルフォアセトアルデヒドアセチルトランスフェラーゼ［xsc］経由）をコードしています。この共生体はさらに、亜硫酸塩をアデニル硫酸還元酵素（aprAB）を介してアデニル硫酸（APS）に変換し、APSを二機能性酵素CysN/CysC（cysNC；図2、表S4）を介して3′-ホスファデニル硫酸（PAPS）に還元する遺伝子もコードしている。AprABはさらに亜硫酸塩の酸化からキノンプールへ電子をシャトルすることができる。PAPSは活性な硫酸供与体であり、微生物が硫酸化化合物を合成するのに利用できる。また、PAPSは亜硫酸塩を経由して硫化物に変換され、システインなどのアミノ酸に取り込まれることもある。これらの反応は、それぞれphosphoadenosine phosphosulfate reductase (cysH) とsulfite reductase (sir) によって触媒されるが、後者はPlanctomycetotaのゲノム（g_UBA1268）、'Ca. Nitrosospongia ianthellae」（図2）。あるいは、APSは硫酸アデニルトランスフェラーゼ（sat）を介して硫酸に変換され、ATPを生成するため、存在量の少ないAlphaproteobacterium（g_UBA2767）はタウリンをエネルギー保存に利用することが可能である。さらに、I. bastaの共生細菌のうち、アルファプロテオバクテリア（g_UBA2767とg_Ruegeria）の2つは、硫酸透過酵素（sulP）を介して周囲の海水から硫酸を輸入すると推測される。この環境下で得られた硫酸は、同化のためにPAPSに還元される可能性もある（図2）。しかし、硫酸パーミアーゼはタウリンから生成された硫酸を輸出することも可能であることに注意しなければならず、これは以前から'Ca. Taurinisymbion ianthellae」(Moeller et al., 2022)で起こることが提案されている。これらのことから、I. bastaのマイクロバイオームにおける硫黄代謝は、アルファプロテオバクテリウム（g_UBA2767）のエネルギー獲得が主目的であり、'Ca. Taurinisymbion ianthellae "のためのエネルギー獲得と、他の共生生物のための細胞内硫黄の獲得に向けられた。注目すべきは、アルファプロテオバクテリウム（g_UBA2767）は、SOX複合体と呼ばれる硫黄酸化タンパク質（soxAB, soxXYZ）を介してチオ硫酸を硫酸に酸化することによってもエネルギーを獲得できることが予測されることである（Tian et al.、2014）。このことは、当初はDMSPも変換できる優勢なガンマプロテオバクテリアのみが行っていると考えられていたI. bastaの硫黄代謝におけるアルファプロテオバクテリア（g_UBA2767）の重要性をさらに示している（Moeller et al.、2022年）。

3番目の低存在共生生物であるPlanctomycetota（g_UBA1268）は、窒素や硫黄代謝の主要な担い手とは予測されていないが、グリコシルヒドロラーゼ（GH）や糖質エステラーゼ（CE；図2）を介して糖質や複合体の異化に重要な役割を担っている。海綿は、複合糖質の豊富な供給源である溶存有機物（DOM）を連続的に（再）循環させており、最近の研究では、海綿共生生物がこのDOMの利用に積極的に関与していることが示された（Campana et al.） 同様に、自由生活するPlanctomycetotaは複雑な糖質の代謝に重要な役割を担っている（Martinez-Garcia et al, 2020) ここで、I. bastaのPlanctomycetota（g_UBA1268）が9つのグリコシルヒドロラーゼをコードしており、特に海藻や海綿自体に多く含まれる化合物のフコース（GH29）、キチン（GH18）、シラン（GH10）、シアル酸（GH33；図2）に対して作用することを見出した（Hsieh & Harris, 2019; Kappelmann et al, 2019; Morya et al., 2012; Mutsenko et al., 2017)。これら9つのGHは、他のすべての共生生物には存在せず、広範囲の複雑な炭水化物を分解するPlanctomycetota（g_UBA1268）の独自の役割を強調する。興味深いことに、3つのアルファプロテオバクテリア共生生物と'Ca. Taurinisymbion ianthellae'はシアル酸三者間ATP非依存性ペリプラズム輸送体(SiaPQM)を介してシアル酸を輸入することが可能であることがわかった。GH29とGH33はI. bastaのメタプロテオームにも発現しており、多くの海綿共生体にとって重要なヒドロラーゼクラスとして以前に同定されており、他の海綿共生体Planctomycetotaにもしばしば存在した（Robbins et al., 2021）。I. bastaの共生体のゲノムで同定された糖質エステラーゼは、海綿の構造成分であるキシラン（CE1）とグリコサミン（CE11）を主に標的とし（Fernandez-Busquets & Burger, 2003; Kamke et al., 2013）、CE10というアリールステラーゼはさらにPlanctomycetotaのプロテオームに符号化されて発現した（g_UBA1268；図2、Table S3）。アリールエステラーゼは、活性酸素の解毒に関与し、ヒトでは抗酸化物質として働くが（Asare et al., 2018）、海綿動物でも同様の役割を果たす可能性がある。ThaumarchaeotumではGHおよびCEは同定されず、これは海綿に関連するThaumarchaeotaに関する以前の広範な分析（Robbinsら、2021）と一致した。注目すべきは、Thaumarchaeotaは主に独立栄養であり、主に3-ヒドロキシプロピオネート/4-ヒドロキシブチレートサイクル（図2）を介して固定から炭素を得る（Burgsdorf et al, 2021; Engelberts et al, 2020; Moeller et al, 2019; Offre et al, 2013; Robbins et al, 2021; Spang et al, 2012）、これはおそらく複合糖を分解するGHおよびCEの必要が省かれることだ。さらに、アンモニア酸化型古細菌はペプチドグリカンの細胞壁を持たず、S層を持つため、増殖中にペプチドグリカンの修飾に酵素を必要としない。

Planctomycetota (g_UBA1268) は、糖鎖や炭水化物を異化する役割に加え、ポリリン酸キナーゼ (ppk) もコードしていた。ポリリン酸キナーゼは、ATPの末端リン酸を可逆的に移動させて長鎖ポリリン酸（polyP）を形成する触媒であり、Ianthella bastaのリン封鎖に貢献しうる（Zhang et al.） この遺伝子はさらに、Gammaproteobacterial共生菌と存在量の少ない2つのAlphaproteobacteria（g_Ruegeriaとg_UBA2767）でも発見され、I. bastaのメタプロテオームで発現していることが明らかになった。

Ianthella bastaのマイクロバイオームは、シントロフィーを特徴としている
海綿共生生物は宿主と相互作用するだけでなく、互いに複雑な相互作用をする可能性を持っている。特定の化合物を自分で合成できない微生物（auxotrophy）は、環境中で存続するために、群集内の他の種が排泄する産物を食べて生きる必要がある（syntrophy）。例えば、I. bastaでは、アルファプロテオバクテリア（g_UBA2767）を除くすべての共生生物が、6種類の必須ビタミンB群、すなわちチアミン（ビタミンB1）、リボフラビン（B2）、パントテン酸（B5）、ピリドキシン（B6）、ビオチン（B7）、コバラミン（B12）を少なくとも一つ補酵素として備えていた。ビタミンB群は、分岐アミノ酸やメチオニンの生合成など、微生物の中枢代謝に必須であり（Combs Jr & McClung, 2016）、これらのビタミンを自ら合成できない微生物は、環境から獲得しなければならない。例えばチアミンは、アルファプロテオバクテリウム（g_UBA2767）とThaumarchaeotumだけが生合成できた（図2）。他の共生生物はチアミン輸送体（tbpA, thiPQ）を介してチアミンを輸入することができた。この輸送体は3つの優勢共生生物のプロテオームでコードされ発現し、Ruegeriaではコードされていた。他の必須ビタミンB群（すなわちB2、B5、B6、B7、B12）はすべて、I. bastaの共生体のうち少なくとも4つの共生体で生合成でき、それぞれのビタミンに対して従属栄養の共生体は最大2つまで残っていた（図2）。例えば、コバラミン生産に必要な遺伝子は3つのアルファプロテオバクテリア共生体とThaumarchaeotumで同定され（図2）、さらにコバラミン生産に必要な補因子であるヘムを生産する独自の能力も裏付けられました。一方、コバラミン富栄養菌であるガンマプロテオバクテリウムとプラクトミセトタ（g_UBA1268）は、環境中で存続するためにコバラミンの外部供給源を必要とします（図2）。

微生物の移動と付着
安定した共生を維持するためには、共生体は宿主細胞による貪食を回避する必要があり、このプロセスにおいて、アンキリン（ARP）、WD40、NHL、ロイシンリッチ（LRR）、テトラトリコペプチド（TPR）、HEAT repeatファミリーなどの真核生物様タンパク質（ELPs）が重要な役割を果たすと仮定されている（Jarnら、2019；Nguyenら、2014；Reynolds＆Thomas、2016）。例えば、ファージによってコードされるアンキリンドメイン含有タンパク質は、バクテリアに対する真核生物宿主の免疫反応を調節する可能性がある（Jahn et al.、2019）。I. bastaの6つの共生体はすべて少なくとも1種類のELPをコードしており、すべてのELPがI. bastaのマイクロバイオームで発現していた（表S3およびS4）。しかし、ELPの分布は共生体によって異なり、アルファプロテオバクテリウム（g_UBA2767）はARP, WD40, LRR, NHL, TPR, HEAT repeat family（合計50コピー）をコードし、最も多様なELPの配列を示したのに対し、優勢なアルファプロテオバクテリウム（Ca. Luteria ianthellae）はTPR repeat family（19コピー）だけをコードしていた。これらの違いをもたらす要因や、それぞれのELPが安定した共生を維持するために異なる機能を果たしているかどうかは、まだ解明されていない。

また、スポンジ内の微生物の生存は、宿主組織への直接の付着や、宿主組織に付着している他の微生物への付着によって促進されることもある。カドヘリンドメインやフィブロネクチン結合タンパク質など、細胞間接着やバイオフィルム形成を仲介するタンパク質は、海綿体マイクロバイオームで濃縮されていることが分かっており（Robbinsら、2021）、I. bastaにおいても共生の維持に同様に重要な役割を果たすと考えられる。カドヘリンドメインは、細胞表面やセルロース、キシラン、および関連化合物に直接結合し、宿主組織への付着だけでなく、微生物による複合糖質の分解も媒介することができる（Fraiberg et al.） フィブロネクチン結合タンパク質は、フィブロネクチンIIIドメインに結合するタンパク質であり、真核生物と原核生物の両方に存在する（Hymes & Klaenhammer, 2016; Schwarz-Linek et al, 2003）。カドヘリンドメインはPlanctomycetota（g_UBA1268）とAlphaproteobacterium（g_UBA2767）でコードされ、Gammaproteobacteriumプロテオームでコードおよび発現した（図2、表S3および表S4）。興味深いことに、これら3つのゲノムには、キシランを分解するGH10とCE1の遺伝子も含まれており、このプロセスはカドヘリンドメインを介して糖質そのものに付着することによって促進される可能性がある。フィブロネクチン結合タンパク質の遺伝子は、Planctomycetota (g_UBA1268)、Gammaproteobacterium、Thaumarchaeotumで同定された。フィブロネクチンIIIドメインはPlanctomycetota (g_UBA1268)でコードされ、Gammaproteobacteriumでコードされ発現し、バイオフィルム形成が可能であることが示された。存在量の少ない2つのアルファプロテオバクテリア（g_UBA2767とg_Ruegeria）にはフィブロネクチン結合タンパク質は見いだせなかった。興味深いことに、これらの微生物は鞭毛をコードし、鞭毛タンパク質（fliL；図2、表S3およびS4）を発現しており、これらの共生細菌が運動性を持つことが示唆された。運動性に加えて、鞭毛は接着をサポートすることができ（Kimkes & Heinemann, 2020）、ここでfliLは表面の存在を感知するのに重要な役割を果たす可能性がある（Lee & Belas, 2015）。したがって、存在量の少ない2つのアルファプロテオバクテリアは、安定した共生を維持するための代替メカニズムとして鞭毛を利用している可能性がある。

支配的なアルファプロテオバクテリア（'Ca. Luteria ianthellae'）は付着タンパク質を欠き、海綿組織内に留まるために代替的なメカニズムを用いていることが示唆された。このゲノムは、代わりに分泌システムIII（図S4、表S3およびS4）をコードし、発現した。これは、微生物が宿主に付着し、その代謝を調節するためにエフェクタータンパク質を注入するために使用できる（コスタら、2015年）。これらのタンパク質には、分泌の目印となるシグナルペプチドが含まれていることが多い。優占するAlphaproteobacteriumでは、TPR repeat proteinとユビキチン様タンパク質（すなわち、翻訳後に他のタンパク質を修飾できるタンパク質）上にシグナルペプチドが同定されました。TPRおよびユビキチン様タンパク質は、以前に宿主内での共生体の定着に関連していることから（Robbins et al., 2021; Thomas et al., 2010; Zhou & Zhu, 2015）、これらのタンパク質を注入すると、I. bastaの代謝が変化することにより海綿組織内のアルファプロテイン細菌の持続を助けることができる（図 S4）。さらに、分泌系IIIは、いわゆる病原性因子であるトランスロケート・インティミン受容体（Tir）を宿主膜に挿入することにより、病原性細菌の宿主組織への直接の付着を促進することが分かっている（Franzin & Sircili、2015；Kennyら、1997）。Tirは分泌系IIIを通じて宿主の膜に注入されると、細菌の膜にある逆オートトランスポーターに結合することができる（Kenny et al.） 優占するアルファプロテオバクテリアもインバースオートトランスポーターをコードし発現しており、Tirが分泌系IIIによってトランスロケーションされれば、共生体は宿主組織に直接固定されると考えられる（図S4）。

Tirと逆自己輸送体を介して宿主組織に付着する能力が他の海綿共生体にも存在するかどうかを調べるために、分泌システムIIIと逆自己輸送体について、利用可能なすべての海綿共生体ゲノムを検索した。両タンパク質は、3つのAlphaproteobacterial MAG (GCA_014239005.1, SAMN15855071, and SAMN15855069) (Bayer et al., 2020; Robbins et al., 2021) に見つかり、そのうちの1つは「Ca.Inthellae」と同じオーダーに属していることが分かった。Luteria ianthellae」（o_JABSOH01）、およびエンドゾイコノマド科に属する2つのMAG（GCA_0022385.1およびSAMN15854979）（Robbins et al, 2021; Slaby et al, 2017）から、この機構は様々な海綿共生体において接着を補助していることが示唆された。宿主組織に固定する能力は、緊密な共生を示し、そのような高度に依存した生活様式と一致して、I. bastaの支配的なAlphaproteobacteriumは、ペントースリン酸サイクル、ビタミン生産（コバラミンとは別）、脂肪酸B-酸化、芳香環分解、窒素代謝、dTDP-ラムノース生合成などの多数の代謝経路を欠いた（図 S4）。さらに、アミノ酸トランスポーターや糖トランスポーターなど、必須栄養素の輸入に用いられるトランスポーターを幅広くコードし、発現していた（図S4）。最後に、「Ca. Luteria ianthellae」は、海洋細菌の還元炭素や硫黄の供給源となりうるDMSP代謝に関わる遺伝子を複数コードしていた。また、DMSP代謝は、'Ca. Taurinisymbion ianthellae' (Moeller et al., 2022) にも確認され、タウリンに加えDMSPもI. basta共生生物にとって重要な基質である可能性が示唆された。

低存在量の微生物は二次代謝産物群の供給源である
海綿は生物活性が高く経済的に重要な化合物の豊富な供給源であり、その微生物共生体によって頻繁に生産され、ホロビオントの化学防御を助ける可能性がある（Rustら、2020；Tianeroら、2019；Wilsonら、2014）。I. bastaは、防汚剤として作用し、ヒト腫瘍細胞に対する細胞毒性活性を有する（Bayer et al., 2011; Greve et al., 2008）バイオテクノロジー関連二次代謝物、バスタジンを生産することが知られている（Kazlauskas et al., 1981; Kunze et al.） ここでは、I. bastaの6つの共生生物のゲノムから生理活性物質を生産する能力を検索し、合計22の生合成遺伝子クラスター（BGC）を見つけ、そのうち21が存在量の少ない共生生物のゲノムにコードされていることを明らかにした（図2、表S5）。(図2, 表S5）。ゲノムサイズとBGCの数には相関があり、Ruegeriaが最もゲノムサイズが大きく、BGCの数も多い（4.33 kb、13 BGC）、次いでUBA2767 (4.30 kb、4 BGC), UBA1267 (3.26 kb、4 BGC), 'Ca. Taurinisymbion iant. Taurinisymbion ianthellae」（2.08 kb、BGCなし）、「Ca. Luteria ianthellae」（2.08 kb、BGCなし）と続いた。Luteria ianthellae」（2.01 kb、BGCなし）、「Ca. Nitrosospongia ianthellae」（2.01 kb、BGCなし）。Nitrosospongia ianthellae」（1.78 kb、BGC1個）である。最も多いBGCは、非リボソームペプチド合成酵素（NRPS/NRPS様、6クラスタ）、ヘルラクトン（4クラスタ）、タイプIおよびIIIポリケチド合成酵素（T1PKSおよびT3PKS、3クラスタ）であった。BGCは5つしかなく、その多くが類似度30%以下であったことから、I. bastaのBGCは新規性が高いことが明らかになった（表S5）。また、PlanctomycetotaのゲノムにコードされるNRPS様クラスタ（g_UBA1267）は、1-ヘプタデセンを生成すると考えられている既知のBGCと100%の類似性を示した。興味深いことに、1-n-ヘプタデカンは脱窒細菌が嫌気的に増殖する際に利用することができる（Spormann & Widdel, 2000）が、Planctomycetotaではそうであるのか、あるいは他の共生生物がエネルギー源として1-ヘプタデセンを利用するのかはまだ不明である。I. basta の BGC は新規であるため、生成する代謝物の同定はこれ以上できないが、BGC の同定は新規生理活性物質の発見への第一歩となる。しかし、BGCs の同定は新規生理活性物質の探索の第一歩であり、今後はこれらの BGCs の活性の同定に重点を置いた研究を行うことを提案する。

イアンテラ・バスタのビロームがホロビオットの代謝能力を拡張する
海綿は、そのマイクロバイオームを形成し、宿主と微生物の相互作用を変化させ（Jarnら、2019；Pascelliら、2020）、補助代謝遺伝子（AMG）を介して宿主（真核または原核）の代謝に直接貢献する明確なウイルスコミュニティを宿主とする。ウイルスはさらに、ホロビオートのメンバー間の遺伝子の水平伝播を媒介することができる。例えば、アンキリンリピートタンパク質は、これらのタンパク質が異なる海綿種の海綿共生体に広く存在し（Reynolds & Thomas, 2016）、海綿ビロームに豊富に含まれていることから、ウイルスによって水平移動することが示唆された（Pascelli et al.、2020）。同様に、I.bastaのマイクロバイオームにおけるこれまでに述べた機能/タンパク質のいずれもが、理論的にはウイルスによって水平伝播されるか、ウイルス起源である可能性がある。

I. bastaの推定ウイルス配列を同定するために、すべてのメタゲノム集合体に対してVirSorterを実行した。その結果、合計276のウイルスコンティグが同定され、そのうち250がファージ、25がプロファージであった(表S6)。ファージと判定された250個のコンティグのうち、25個はカテゴリー1（「最も確信が持てる」予測）、157個はカテゴリー2（「可能性が高い」予測）、68個はカテゴリー3（「可能性がある」予測）の範囲内であった。プロファージについては、4個がカテゴリー2、21個がカテゴリー3であった（表S6）。全プロファージのうち、9個は細菌のMAGに、1個はThaumarchaeotal MAGに捕捉され、Type IVの毒素-抗毒素系をコードしていることが明らかになった。興味深いことに、毒素-抗毒素系は、以前に海綿に関連するThaumarchaeotaで濃縮されることが見出された（Haberら、2021年；Moellerら、2019年）。その後、ウイルスRefSeq Nrデータベースとのブラストによってすべてのウイルスコンティグに分類学を割り当て、さらにI. bastaから以前に回収したウイルス配列とのブラストによってそのウイルス起源と分類学を相互検証した。I. bastaで最も多様なウイルス分類群は、ミオウイルス科、ポドウイルス科、シホウイルス科を含むCaudoviralesのdsDNAウイルスと、マイクロウイルス科のssDNAウイルスであった（表S6）。興味深いことに、I. bastaのビロームの中にLavidaviridaeが確認された。これは、Mimiviridae科の巨大dsDNAウイルスと真核生物に共感染することが知られているウイルスファージである（Fischer、2020）。本研究ではミミウイルス科に割り当てられたコンティグはなかったが、ミミウイルス科は以前I. bastaで同定され、海綿アメーバ様細胞に感染することが示唆されている（Pascelli et al.、2020年）。

I. bastaの全体的な代謝能力におけるビロームの役割を調べるため、ビロルのコンティグを機能的に注釈付けした。全ウイルスコンティグで合計854個の遺伝子が同定され、そのうち89％が機能的注釈を付けられた（表S6）。注釈された遺伝子のほとんどは、トランスポーザブルエレメントやウイルスDNA複製遺伝子などの複製に関連する遺伝子であった（表S6）。しかし、推定される補助的な代謝遺伝子（AMG）も検出された（図2、表S6）。例えば、TPR repeat proteinやWD40 repeat proteinなどの真核生物様タンパク質は、7つのウイルスコンティグ上で発見され、そのうち2つはThaumarchaeotum（プロファージ、カテゴリー3）とAlphaproteobacterium（g_Ruegeria；プロファージ、カテゴリー2）のMAGに捕捉された。興味深いことに、TPRリピートタンパク質は以前、海綿共生体間で横方向に移動することが示唆されており（Robbins et al., 2021）、これはウイルスが媒介する可能性がある。同様に、カドヘリンを含む付着タンパク質は海綿共生体間で横方向に移動すると考えられており、I. bastaのウイルスコンティグ上で同定された（図2、表S6）。I. bastaのビロームには、スペルミジン／プトレシン輸送系（プロファージ区分2、Ruegeria属のAlphaproteobacteriumにビン詰め）など、様々なトランスポーターもコードされていることが確認された。スペルミジンとプトレシンは、細胞の分化や増殖に不可欠な役割を果たすポリアミンであり、ウイルスにコードされたスペルミジンとプトレシンの輸送系は、細胞の分化や増殖に重要な役割を果たす。したがって、ウイルスにコードされたスペルミジン／プトレシン輸送系は、I. bastaのマイクロバイオームにおける重要な化合物の輸送全般をさらに助けると考えられる。

結論と展望
海綿体ホロビオントの機能を完全に理解し、将来の実験のためのモデル種を確立するために、I. bastaのマイクロバイオームとウイルスの90%以上をメタプロテオゲノム解析し、各共生体のユニークな機能的役割とそれらの代謝的相互作用に関する重要な洞察を提供する。その結果、低存在量の微生物が主要な共生生物とは基本的に異なるプロセス（複合糖質の分解やビタミン生産など）を駆動し、窒素循環や二次代謝産物の生産に関わる重要な機能の保存場所となっていることが明らかになりました。さらに、海綿共生体のビタミン生産に対する従属栄養性と、環境中の他の微生物への依存性を明らかにした。また、Ianthella bastaの共生体は、宿主の貪食を回避し、宿主組織に付着するために様々な機構を用いることが予測されました。分泌システムIIIの存在など、これらの機構は低温電子顕微鏡を用いてさらに詳しく調べることができる。最後に、I. basta のマイクロバイオームから推定されるウイルスコンティグを同定し、各配列を過去に海綿から回収したウイルス配列と相互検証することで、I. basta のビロームの特徴を明らかにした。I. bastaのビロームの機能解析から、ELPと付着タンパク質の横方向の遺伝子伝達におけるウイルスの役割と、トランスポーターを介してホロビオットの代謝能力を拡張する能力が示唆された。このメタプロテオゲノムのデータは、I. bastaを宿主-微生物相互作用、特に海綿共生体の定着、発達、維持の研究のモデル生物として採用するための代謝的枠組みを提供するものである。

著者
Pamela Engelberts: 概念化（リード）、データキュレーション（リード）、形式分析（リード）、調査（リード）、方法論（リード）、検証（リード）、可視化（リード）、執筆-原案（リード）、執筆-レビューおよび編集（イコール）。スティーブン・ロビンス データキュレーション（支援）、形式分析（支援）、調査（支援）、方法論（支援）、監修（リード）、検証（支援）、ライティング-レビューおよび編集（支援）。Craig W Herbold: Craig W Herbold: 形式分析（同等）、調査（同等）、方法論（同等）、執筆 - 査読と編集（支援）。Florian Moeller: 調査(支援); 検証(支援)。Nico Jehmlich: データキュレーション(支援)、形式分析(支援)、調査(同等)、方法論(支援)、ライティング-レビューと編集(支援)。Patrick Laffy: Patrick Laffy: 形式的分析(支援); 調査(支援); 執筆 - レビューと編集(支援). Michael Wagner: Michael Wagner: リソース(同程度); スーパービジョン(支援); ライティング - レビューと編集(同程度). ニコール・ウェブスター Nicole Webster: リソース (同程度); スーパービジョン (支援); 執筆 - レビューと編集 (支援).

謝辞
Kenneth Wasmund博士、Bettina Glasl博士、Paul Evans博士のデータ解析と解釈の協力に感謝する。Michael WagnerはEuropean Research Council (ERC Advanced Grant NITRICARE 294343) とAustrian Science Fund FWF (Wittgenstein Award Z-383-B) の資金援助に感謝します。オープンアクセス出版は、オーストラリア大学図書館評議会を介したワイリー-クイーンズランド大学協定の一環として、クイーンズランド大学により促進された。

利益相反
著者は利益相反を宣言していない。

倫理的声明
一般的な科学的倫理規範を尊重した。