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タコの温度依存性RNA編集は神経プロテオームを広範に再編成する

哉百名


記事｜186巻12号 p2544-2555.e13, 2023年6月8日発行
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タコの温度依存性RNA編集は神経プロテオームを広範に再編成する

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(23)00523-8

マシュー A. バーク
ノア・リスコビッチ・ブラウアー
マシュー・J・ドミンゲス
R. ブライアン・サットン
エリ・アイゼンバーグ
ジョシュア・J・C・ローゼンタール 9
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DOI:https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.05.004
PlumX メトリクス
ハイライト

Octopus bimaculoidesは寒冷地で20,000以上の部位でAtoI RNA編集を増加させる

編集のシフトは数時間以内に起こり、野生の個体群でも観察される

機能的な例として、寒冷化によりキネシンの運動性を変化させる部位がある

別の低温誘導部位は、シナプトタグミンのCa2+結合親和性を変化させる。
まとめ
ウミケムシでは、温度変化による生理機能の統合が課題となっている。行動学的に洗練された甲殻類の複雑な神経系では、この問題はかなり深刻である。アデノシン脱アミノによるRNA編集は、環境適応に適したメカニズムである。我々は、Octopus bimaculoidesの神経プロテオームが、温度チャレンジ後にRNA編集を介して大規模な再構成を受けることを報告した。13,000以上のコドンが影響を受け、その多くが神経プロセスに不可欠なタンパク質を変化させている。温度感受性の高い2つの例では、再コード化によってタンパク質の機能が調整されている。Ca2+依存性の神経伝達物質放出の主要な構成要素であるシナプトタグミンは、結晶構造と裏付け実験から、編集によってCa2+結合が変化することが示された。軸索輸送のモータータンパク質であるキネシン-1では、編集によって微小管の輸送速度が制御される。また、野生の標本を季節ごとに採取すると、温度依存的な編集が野外でも起こることが示された。これらのデータは、タコや他のコレオイドにおいて、A-to-I編集が温度に応じて神経生理学的機能を調整することを示すものである。

グラフの抄録
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キーワード
ADAR
頭足類
キネシン
シナプトタグミン
馴化
RNA編集
温度
エピトランスクリプトーム
RNA修飾
神経可塑性
はじめに
海洋生物が経験する温度は、潮汐、温度勾配、季節などの環境要因によって、空間的、時間的に大きく変化することがある。水の熱伝導率は高いため、このような変化は、特に神経系において、様々な分子的・生理的プロセスを適切に統合する必要があるため、海産生物に生理的な課題をもたらす。興奮性はその好例で、静止膜電位と活動電位の各要素が異なる温度依存性を持つことがある。
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これらの複雑なプロセスを統合することの難しさを強調するために、適度な急性の温度変化であっても、神経系の障害によって死に至ることがあります。
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したがって、分子的・生理的な温度順応は、生物の成功の重要な原動力となる。
mRNAの遺伝情報は、その一過性の性質から、温度順応の理想的なターゲットとなります。多くの研究で、温度に反応してRNAの発現、局在、スプライシングが変化することが確認されている（Someroによる総説）。
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). アデノシン脱アミノによるRNA編集は、メッセンジャーRNAがコードするものを直接変えることができるため、順化のための強力かつ特異性の高い代替メカニズムになる可能性がある。ADAR（RNAに作用するアデノシンデアミナーゼ）ファミリーの酵素によって触媒され、特定のアデノシンは、翻訳や他の生物学的プロセスにおいてグアノシンの模倣物であるイノシンに変換される。
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編集がmRNA内のコドンの非同義位置で起こると、そのコドンは別のアミノ酸に再コード化される。このように、編集は環境変化に応じてアミノ酸を空間的・時間的に変化させる可能性を持っている。DNA内の変化とは異なり、RNAの編集はバイナリーではなく、RNAの集団全体で可変的な浸透率で起こりうる。RNA編集は、一過性で特異的、かつ非常に汎用性の高い遺伝情報の改変能力を持っているため、環境適応のためのメカニズムとして十分に位置づけられると考えられる。しかし、RNA編集がこのような目的に使われるという考えを裏付けるデータはほとんどない。
RNA編集は、ほとんどの生物でタンパク質の再コード化に使われることはほとんどない。ヒトのmRNAには数百万の編集部位がある、
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マウスでは数千の編集部位が同定されている、
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が、その大部分は非コード部分の逆反復要素によって形成された二本鎖RNA（dsRNA）構造内に存在する、
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であり、その役割は、異常な自然免疫反応を防ぐことである。
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リコーディングサイトの出現率は非常に低い。ヒトのメッセージのうち、リコーディングサイトが存在するのは約3%に過ぎず、そのほとんどは弱く編集されているに過ぎない。
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さらに、哺乳類の系統を通じて保存されているリコーディングサイトは、わずか数十箇所しか知られていない。
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哺乳類には機能的に重要な編集部位が存在するが、編集部位の多くは適応的な利点を与えない可能性が高い。
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RNA編集は無脊椎動物全体では広く評価されていないが、少数の分類群からのデータから、哺乳類と同様、再コード化はまれであることが示されている。RNA編集はショウジョウバエで最も広範囲に研究されており、ショウジョウバエのメッセージの約4%に約1,300の再コード化部位が同定されている。
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これらの部位の多くはショウジョウバエの系統を超えて保存されており、正の選択下にあると考えられている。
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いくつかの再コード化部位は、タンパク質の機能を変化させることが示された、
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であり、ショウジョウバエにおけるRNA編集の主な役割は、神経機能の微調整であることが示唆されている。
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このように、プロセスは利用されているが、その範囲は限定的である。
コイル状の頭足類（タコ、イカ、コウイカ）は、このパターンの明らかな例外である。イカの脳内転写物（Doryteuthis pealeii）の60％以上には少なくとも1つの再コード化部位があり、多くは複数の部位で編集されている。
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編集は、神経細胞プロセスに関与するタンパク質をコードする転写物に多く見られる。他のイカ（Euprymna scolopesとSepioloidea lineolata）、イカ（Sepia officinalis）、2種のタコ（Octopus vulgarisとOctopus bimaculoides）でも同様の編集が見られるが、オウムガイ（Nautilus pompilius）やAplysia californicaでは見られないことから、高レベルな再コード化はコロイド頭足類の革新であるという結論に至った。
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さらに、高度に編集された部位は再コード化される傾向があり、これらの多くは、編集を推進する構造とともに、コレオロイドの分類群間で保存されている。
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これらのデータは、頭足類の編集が正選択下にあり、表現型の優位性につながるという考えを支持するものである。
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個々の再コード化部位は、特にイオンチャネルやイオン輸送体などのタンパク質機能に直接影響を与える可能性がある。
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頭足類は例外的に変化に富んだ海洋環境に生息しているため、その豊富な再コード化が環境変化に対応するために一般的に使用されているかどうかが中心的な疑問である。
過去の研究では、編集が温度順応に利用される可能性が示唆されている。例えば、多様なタコ類から得られた相同電圧依存性K+チャネルメッセージを調べた研究では、位置編集の頻度が標本を採取した熱環境とよく相関していることが示された。
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さらに、チャネルの膜貫通スパンの1つである特定の再コード化イベントは、チャネルの閉鎖速度を加速し、この位置での編集頻度は、動物が捕獲された水温が低下すると増加することが示されました。この先行研究では、急性の温度変化は検証されていないため、編集の変化が順化なのか適応なのかは不明であった。Drosophila melanogasterを用いた研究では、異なる温度の微気候に生息する集団は、多数の部位で編集頻度に違いが見られた。
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関連する研究では、ショウジョウバエの編集が急性の温度変化に反応することが示された。しかし、これらの研究は、ほんの一握りの転写物に限定されたものであった、
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は、温度感受性のある再コード化部位をかなり少ない数（<50）検出した、
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または、非常に小さな編集の変化を発見した。
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本研究では、Octopus bimaculoidesの神経トランスクリプトームにおいて、RNA編集部位の数が多く、温度環境が多様であることを利用して、温度が再符号化に及ぼす影響を調べた。その結果、温度は全リコーディングサイトの約33%に影響を与え、数時間以内に編集の変化が起こることがわかった。ほとんどの場合、編集頻度は温度と負の相関があり、低温でより広範囲に編集される20,000以上の部位を同定した。さらに、一部の部位が神経生理学の鍵となるタンパク質の機能に影響を与えることを明らかにした。キネシンをコードするメッセージにある、温度感受性の高い1つの編集部位が、軸索輸送の2つの重要な指標であるモーターの輸送速度と微小管に沿った走行長に影響を与えている。また、シナプトタグミンの編集済みバージョンと未編集バージョンの構造を解明し、イオン結合を測定することで、別の温度感受性の高い編集部位が、シナプス伝達の重要な生理的特性であるCa2+結合を制御することを明らかにした。最後に、研究室で観察された編集の変化は、複雑でダイナミックな環境に直面するフィールドでも起こることを実証する。
研究成果
Octopus bimaculoidesでは寒冷下でRNA編集が盛んに行われている。
Octopus bimaculoidesは、太平洋の南カリフォルニアと北バハカリフォルニア沖の近海に生息する。
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季節的な温度変化が比較的大きく、ゲノムの配列が高品質であることから、本研究の対象として理想的な生物種である、
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また、神経トランスクリプトーム全体の編集部位の包括的なマップが構築されている。
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RNA編集の温度依存性を評価するため、野生で捕獲したO. bimaculoidesの成魚をMarine Biological Laboratoryに移し、温度制御された水槽で2-3週間、周囲条件に平衡させた。実験の開始時に、温度を∼13℃または22℃のいずれかに徐々にシフトさせた（図1A）。温度データロガーは各水槽に設置し、温度変化の時間経過をモニターした（図S1）。寒冷地での温度シフトは10-12日でほぼ完了した。一方、温位温度シフトは、最終温度が開始時の水槽周囲温度に近かったため、より早く完了した。その後、目標温度は12～24日間維持された。馴化期間終了後、動物を犠牲にした。高レベルで編集することが知られている末梢神経系の運動中枢である星状神経節から抽出されたRNA、
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は、これまでにマッピングされたすべての編集部位において、神経トランスクリプトーム全体のRNA編集レベルを評価するために配列決定された。
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これらのデータから、多数の部位における編集頻度が温度に敏感であることが明らかになった。十分なカバレッジを持つ62,661の編集サイト全体では、約33%（20,850）が22℃と比較して13℃で有意に高い編集レベルを示した（低温誘導）一方、約1%（789）だけが13℃と比較して22℃で高い編集レベルを示した（温暖誘導）（図1B；表S1およびS2）。さらに、これらの温度感受性の高いサイトのうち数千は、編集割合がしっかりと変化していた（5%以上、51%まで、図1C）。コドンを再コード化する編集でも結果は同様で、33%（13,285）のサイトが低温で誘発され、わずか1%（550）が温暖で誘発されました（図2A）。RNA編集による寒冷誘導型タンパク質再コード化は、トランスクリプトーム全体に豊富に存在したが、特徴的なパターンでも出現していた。
図1低温にさらされたオクトパスはより強いRNA編集活性を示す
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図S1図1、2に関連する長期温度インキュベーション実験前と実験中の水槽の水温
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図S2図2に関連するアミノ酸の再コード化現象
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図2コールドで誘発されたリコーディングサイトは、微妙な共通アミノ酸置換に富んでいる
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温度感受性の高いリコーディングサイトは、メッセージ全体にランダムに分布しているわけではありませんでした。まず、10%以上の低温誘導性編集変化を示すリコーディングサイトを持つ転写物は、特定のクラスのタンパク質をコードする傾向があった。膜タンパク質、特にシナプスタンパク質、カルシウム結合または依存性タンパク質、および自食性タンパク質が特に濃縮されていた（表S3）。膜関連タンパク質のうち、寒冷誘導部位は特定のタンパク質領域（例えば、細胞内、細胞外、膜貫通スパン）に優先的に見出されることはなかった。第二に、寒冷誘導型再コード化イベントは、温暖誘導型サイトや温度による有意な変化のないサイトよりも、アミノ酸の極性を保存し（χ2検定、p = 1.51e-23, 図2BおよびS2）、進化的に保存された置換（すなわち、正のBLOSUM80（ブロック置換行列80）スコア、t検定、p = 8.22e-9, 図2CおよびS2）生成する傾向がある。これらの傾向は、低温で誘発された編集は、稀で劇的な変化よりも、微妙で一般的なアミノ酸の置換を好むことを示唆している。
これらの結果から生じる自然な疑問は、編集部位によって異なる温度感受性を制御しているものは何かということである。そのメカニズムは複雑で、グローバルな要因と部位特異的な要因の両方が関与している可能性がある。我々は、編集に温度感受性を付与する可能性の高い3つの候補を評価した。まず、A-to-I RNA編集を触媒する酵素であるADARの温度依存的発現を調べたところ、タコのADARパラログはともに
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は、寒冷馴化と温暖馴化のRNA-seqデータセットで同様に発現していることがわかった（t検定、ADAR1：p = 0.79, ADAR2：p = 0.40, Figure S3A）。
図S3STAR Methodsに関連する温度依存性編集の可能なメカニズム
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第二の可能性は、ADARが認識するdsRNAの構造に関するものである。RNAの平衡構造は、エネルギーとエントロピーの温度依存的なバランスによって決定され、すべての構造は低温でより安定になる。温度に敏感な編集部位を囲む構造が低温で安定性を増すことで、より編集しやすくなるのかもしれない。この考えを検証するため、Avram-Shperlingら（61）に従い研究を行った。
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に従い、13℃と22℃で、すべての既知の編集部位を囲むRNA構造をインシリコで検索し、dsRNAの安定性の変化により、低温で観察される高い編集性を説明できるかどうかを検討した。予想通り、dsRNAの安定性はほとんどのケースで低温で増加し、より高い編集を行うという一般的な傾向と一致した。しかし、温度変化による自由エネルギーの変化と、低温で誘導された部位で観察された編集レベルの変化との間に、区別できる関係は確認できなかった（図S3BおよびS3C）。しかし、in silicoのRNA構造予測では検出できないような微妙な構造の変化が、編集レベルに影響を与えている可能性もある。
温度感受性の高い編集を説明する第三のメカニズムとして、ADARの活性を制御するトランス作用タンパク質の温度依存的な発現が考えられる。ADAR相互作用因子による部位特異的な制御は、多くの生物の神経系で実証されている、
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が、頭足類のADAR相互作用物質については何も知られていない。そこで、ヒトのADARと相互作用する310種類のタンパク質のリストを作成し、タコにおけるそのホモログの発現の温度依存性を調べた。興味深いことに、65個が低温で発現が上昇し、一方、暖かい温度では9個しか上昇しなかった（図S3D；表S4）。これらのデータは、これらの相互作用因子の一部が温度感受性編集に関与している可能性を示唆しているが、ほとんどの場合、これらのタンパク質がヒトのADAR活性を上昇させるか低下させるかは不明であり、頭足類におけるこれらの役割の保存については何も分かっていない。全体として、これらの結果は、複雑な温度依存性制御ネットワークの可能性を提起している。しかし、温度依存性編集のメカニズム的基盤は、未解決のままである。
RNA編集は数時間で温度に反応する
頭足類は、温度が急速に変化する（例：サーモクライン）、あるいはゆっくりと変化する（例：季節による）、ダイナミックな温度環境に直面することが多い。したがって、RNA編集がメッセージのプールを再コード化するスピードは、そのプロセスの有用性に影響を与える。編集レベルがどの程度急速に変化するかを評価するために、時系列実験を行った。1つのシリーズでは、O. bimaculoidesの幼生を水槽内で24℃に1週間平衡させた後、20時間かけて14℃まで温度を下げた（図3A）。その逆で、14℃に平衡化した後、24℃に昇温させた（図3B）。これらの温度は、南カリフォルニアでこの種が経験する温度範囲と妥当な一致である。
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20時間の馴化は、急激な温度変化による温度ショックを避けるために必要であった。動物は温度変化の直前と、温度変化が完了してから 0～96 時間後に犠牲となった。RNAを抽出し、塩基配列を決定し、温度感受性の高い18箇所の編集部位を定量した（データS1参照）。寒冷による編集は数時間以内に見られ、約4日以内に定常状態に達する。編集レベルの統計的に有意な変化は、20時間の温度シフトの間（14℃→24℃シリーズ）、およびその後のほぼすべての時点において、温→冷および冷→温の両方の実験において観察された（図3Cおよび3D；表S5）。温度変化から96時間後に動物で観察された編集頻度は、図1に示した長期の温度順応時のものと区別がつかず（paired t test, cold: p = 0.951, warm: p = 0.362） 、どちらの温度でも4日以内に新しい定常状態に到達したことを示唆していた。これらのデータは、RNA編集の温度依存的な変化の時間経過を説明し、このプロセスを温度順化に利用できる最小限の時間についての参考となる。
図3RNA編集は温度変化から数時間で変化し、数日で定常状態に達する
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寒冷化によって変化するキネシンの運動性
13,000を超える低温誘導性編集部位が存在することから、中心的な疑問は、これらの変化がどの程度、タンパク質の構造や機能を変化させるのか、ということである。この疑問を直接解決するために、私たちは神経系の機能に重要なタンパク質に存在する2つの温度感受性の高い再コード化部位に注目した。最初の部位は、軸索の微小管を前向きの方向に荷物を移動させる主要な分子モーターであるキネシン-1のリジンをアルギニン（K282R）にリコードしたものである（座標はデータS1参照）。この位置にあるゲノム上のリジンは、4系統162種で普遍的に保存されており（図S4A）、精製選択を示唆するもので、微小管に面したキネシンのモータードメインに位置している（図4A）。このため、キネシンの輸送ダイナミクスに影響を与える可能性があると予想された。この部位の編集は、10℃の温度変化に対して30%のシフトを起こす（図4B）。キネシン-1の運動性への影響を調べるために、完全なモータードメインとC末端にHaloTagを持つ二量体化ストークの一部を含むO. bimaculoidesキネシン-1構築物を利用した（図S4B.） 編集版と非編集版のタンパク質を、21℃と11℃のTIRF顕微鏡を使って、タキソールで安定化した微小管上を歩いて可視化した。これらの実験から、タコキネシンの編集版は、温冷両温度において野生型よりも速度が低いことがわかった（t検定、温：p = 1.7e-6, 冷：p = 0.0007; 図4C）。興味深いことに、編集版は、21℃と11℃の両方で速度が同等であるように、本質的に温度不変の速度を示した（t検定、p = 0.312）。また、編集版は野生型に比べて、どちらの温度でもランの長さが短かった（t検定、warm p = 0.029, cold p = 8.9e-7, 図4D）。最後に、編集されたキネシン-1は両方の温度で静止する傾向が強かった（図4E）。キネシン-1タンパク質全体でリジンが保存されていることから、アルギニンへの再コード化が種を超えて同様の効果を持つことが示唆された。実際、ラットのキネシン-1（KIF5C）のK283Rを変異させると、速度と走行距離が同様に減少した（図S4BとS4C）。これらの結果から、Octopus bimaculoidesキネシン-1モータードメインの保存残基の再コード化は、温度依存的に輸送速度や走破長などの運動特性を変化させることが示唆された。
図S4キネシンの方法論、図4関連
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図4キネシンのモータードメインの編集部位（K282R）は、温度感受性が高く、運動性に強い変化をもたらす。
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低温で誘発される編集がシナプトタグミンの構造とCa2+結合を変化させる
別の温度感受性の高い編集部位がタンパク質の機能にどのような影響を与えるかを調べるために、シナプス伝達に関わる重要なタンパク質であるシナプトタグミン-1（Syt1）のI→Vリコーディングイベントを調べた（座標はデータS1参照）。I248V編集は非常に温度感受性が高く、寒冷地では24%増加する（図5B）。32の軟体動物配列のうち、60%以上がこの位置にIまたはVを持ち、残りの配列はほとんどが他の非極性残基を含んでいた。Syt1は、神経伝達物質を含むシナプス前小胞とシナプス前膜の界面に存在する。シナプス前刺激時に細胞内Ca2+濃度が上昇すると、Ca2+イオンがシナプトタグミンに結合し、シナプス前膜への小胞ドッキングの開始を促す構造変化を引き起こす。シナプトタグミンは、シナプス小胞に埋め込まれたN末端の膜貫通ドメインと2つのカルシウム結合ドメイン（C2AおよびC2B）から構成されている。各C2ドメインは、少なくとも2つのCa2+イオンとリン脂質膜を結合することができる。
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C2Aドメインは8枚のβシートからなり、高親和性Ca2+イオン結合部位と低親和性Ca2+イオン結合部位が隣接しています。結合したCa2+イオンによって促進されるリン脂質結合は、イオン結合と同じ位置で起こり、いずれもドメインの一端にある。
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図5 シナプトタグミン-1のC2Aドメイン上の低温誘導編集部位（I248V）がタンパク質のコンフォメーションを変化させ、Ca2+結合の親和性を変化させる
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ラットのタンパク質構造から、I248Vの編集部位はC2AドメインのCa2+イオン結合部位とは反対側にあることがわかった。
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この編集の影響を評価するために、まず野生型とI248VのC2Aドメインの構造をX線結晶構造解析で解きました。Octopus Syt1 C2Aの高分解能（1.85Å）結晶構造は、ラットSyt1 C2Aドメインと非常によく一致し、一次構造の相同位置にマッピングされた8枚のβシートで構成されていた（RMSD= 0.552 Å、表S6）。248の位置は、βストランド6と7の間の露出したループ内にあり、イオン結合部位とは反対側のドメインにある（図5A）。編集前のSyt1 C2Aドメイン構造では、I248はドメインの疎水性コアと直接接触しており、溶媒アクセス面（SAS）は25 Å2と比較的低い。編集版では、側鎖は完全に溶媒にさらされ、SASは103Å2となり、これは1つのメチル基を除去したことによる変化である。さらに、この位置を含むβ6-7ループはかなり硬くなっている。野生型C2Aドメインの全体のBファクターは45.26Å2である（表S6）。編集前のC2Aドメインのβ6-7ループを構成する残基（残基238-250）の平均Bファクターは60.1Å2であり、ループはドメインの疎水性コアと関連しているにもかかわらず、平均して高分子そのものよりも柔軟であることが示された。しかし、編集されたC2A構造では、編集された残基（V248）を持つループは溶媒にさらされ、まだ比較的硬い状態である。編集されたドメイン全体のBファクターは35.2Å2であり、ループ周辺の残基範囲の精製Bファクターは35.7Å2である。しかし、ループの相対的な剛性にもかかわらず、野生型C2Aドメインのβ6-7ループは内側に反転しており、I248残基が疎水性コアに直接接触しているが、編集C2Aドメインの同じ残基（V248）は外に反転していた。野生型と編集されたC2Aドメインの構造には、他に大きな構造上の違いはない。このように、編集によって非常に特異的な変化が生じ、機能を微調整する態勢が整っている可能性がある。
次に、この小さな構造変化が、Ca2+イオン結合部位から離れた場所にあるにもかかわらず、Ca2+イオン結合に影響を与えるかどうかを調べた（図5A）。等温滴定カロリメトリー（ITC）を用いて、編集済みと未編集の組み換えタンパク質のCa2+結合親和性を直接調べました。驚くべきことに、I248V編集は、最初に結合したCa2+（KD1）の結合親和性を60%近く低下させるが（t検定、p = 0.003）、2番目のCa2+（KD2）の親和性は変化しない（t検定、p = 0.59, 図5C）ことが判明した。これらの結果から、Syt1のC2Aドメイン上のメチル基を1つ取り除くと、温度に応じてCa2+結合のダイナミクスが変化するほど、タンパク質のコンフォメーションが変化することが示された。
野生個体群は温度感受性の高いRNA編集を行う
私たちが実験室で飼育した動物のデータから、温度によって編集レベルが変化することが、厳密に制御された条件下で実証された：動物は温度以外では同一の条件下で飼育されたのである。そこで、ダイナミックで変化に富んだ環境にある野生個体に対して、温度が季節ごとに同様の効果をもたらすかどうかが、当然の疑問となる。そこで、冬から夏の終わりにかけて、米国カリフォルニア州ロングビーチ近郊の浅瀬でO. bimaculoidesの成魚標本を採集した。採集前にタコの巣穴の近くに温度データロガーを設置し、採集前の1〜2ヶ月間、水温を記録した。採集前1週間の水温は、晩夏は21℃～22℃、冬は約15℃であった（図S5）。採集後、キネシン-1 K282RとシナプトタグミンI248Vの編集の程度を、PCRと直接塩基配列決定によって決定した。両部位とも寒冷時に編集頻度の強固な増加を示し（図6A、t検定、p = 0.0001, p = 0.001、それぞれ）、その大きさはラボ飼育の動物で観察されたものと驚くほど似ていた（図4B）。次に、これらの部位における温度依存的な再コード化が進化的に保存されているかどうかを検討した。Octopus bimaculatusはO. bimaculoidesの近縁種であり、同じ地理的範囲に生息している。
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カリフォルニア州サンタカタリナ島沖で、O. bimaculoidesを採集したのと同じ月にSCUBAを用いてO. bimaculatusの標本採集を行った。これらの実験のデータロガーは、冬には約16℃、夏の終わりには約22℃の温度を示していた（図S5）。キネシン-1 K282RとシナプトタグミンI248Vの部位での編集はこの種で保存されており、季節の値がO. bimaculoidesからのものと密接に一致することから、同様の温度依存性を示した（図6B、t検定、p = 0.002, p = 1.22e-8 ）。これらのデータから、これら2つの温度依存性部位のRNA編集は、これら2つの種間で進化的に保存されていることが示された。
図S5図6に関連する、捕獲前の数週間のサンタカタリナ島（Octopus bimaculatus）およびカリフォルニア州ロングビーチ（Octopus bimaculoides）のTwo Harbors付近の水温
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図6実験室で発見された温度感受性の高い編集部位は、季節的な温度変化を受ける野生動物でも同等の温度感受性を示す。
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考察
環境適応のメカニズムとして、A→I RNA編集は理想的であると思われる。RNA編集は、必要に応じてタンパク質内の単一アミノ酸を一過性に再コード化する可能性を持っている。しかし、この考えを支持するデータは驚くほど限られている。ショウジョウバエ属の研究では、17-47の温度感受性のある再コード化編集部位が報告されている、
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と、冬眠中の地リスに関する研究では、12の再コード化部位が発見された。
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これらの部位のほとんどは、編集の小さな変化を示していた。様々なタコ種を対象とした以前の研究では、K+チャネルメッセージの特定の部位における編集が、動物を採取した熱環境とよく相関することが示されたが、これらの違いが順化または適応によるものかどうかは判断されていない。
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また、再コード化イベントの生理的影響については、タコの研究でのみ検討されていた。ここで、我々は次のことを実証した： (1) 頭足類の温度感受性RNA編集は豊富である（20,850部位）、(2) 編集の変化は温度変化後に急速に起こる（すなわち、数時間以内）、(3) 再コード化イベントは重要な神経細胞機能に関わるタンパク質の構造と機能に影響を与える、 (4) 温度依存性の再コード化は動的環境に対して堅牢である。したがって、甲殻類の頭足類、そしておそらく他の恒温動物にとって、RNA編集は温度に対応して神経生理学的機能を微調整するための貴重なツールであると思われる。
温度依存性のある部位の大部分において、編集は寒冷時に増加する。このことは、今回発見された部位だけでなく、ショウジョウバエや冬眠中のエゾリスで報告されている部位でも同様である。この現象の根底にあるメカニズムは、依然として不明である。我々は3つの可能性に取り組んだが、方法論の限界から明確な結論を出すことはできなかった。編集レベルの温度依存的な変化の程度は部位によってかなり異なるため（図1C）、グローバルなメカニズムが唯一の基礎メカニズムである可能性は低いことに留意すべきである。編集における温度感受性を駆動する因子を特定することは、このプロセスの進化をよりよく理解するのに役立つだろう。
温度依存性RNA編集は順化に利用されているのか、それとも単に温度変化の副産物なのか？再コード化イベントがタンパク質の機能にどのような影響を与えるかを詳細に調べることで、この疑問に答えるための重要なデータを得ることができる。はじめに、温度順応に使われる編集部位は、寒さを補うために反応速度を上げると予想されます。頭足類の編集の機能的効果が研究された限られたケースにおいて、それらは反応速度を加速させる。例えば、イカのNa+/K+ ATPaseのI → V編集は輸送速度を増加させ、K+チャネルの同じ変更は閉鎖速度を増加させる、
51
,
52
は温度補償と一致するが、それらの編集頻度が温度によって急変するかどうかは明らかにされていなかった。本研究では、シナプトタグミンのC2Aドメインにおいて、1つのI→V編集が、結合する2つのCa2+イオンのうちの1つに対する親和性を低下させることを明らかにした。このことは、寒冷時に頭足類のシナプス前終末がより長い時間脱分極することによって生じるカルシウム濃度の上昇を補うのに役立つかもしれない。
6
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8
Ca2+結合部位から遠く離れた編集残基の側鎖からメチル基が1つ失われただけで、結合親和性が変化するのは驚くべきことだが、これは前例がないわけではない。部位特異的突然変異誘発法では、活性部位や触媒部位から遠く離れた点変異が、軟体動物タンパク質の温度安定性や温度依存性機能を変化させることが示されている。
70
シナプトタグミンの例では、バリン残基とドメインのコアとの過渡的な相互作用によって、疎水性コアを構成する残基の小さな再配向が起こり、それによってドメインの反対側にあるCa2+結合残基が影響を受けるというメカニズムが最も有力であると考えられる。疎水性コアを介して伝達されるドメイン内のアロステリックコミュニケーションネットワークという考え方は、C2ドメインの活性を変化させる上で、あまり評価されていない概念である。イカのSyt1も同じ遺伝子座にI > M編集部位を持っている、
47
,
48
そして我々のデータでは、これも温度感受性であることが示されている（未発表データ）。配列決定された他のほとんどのシナプトタグミンC2Aドメインは、この遺伝子座に極性残基を利用しているので、これは頭足類のシナプトタグミンに特有の特徴であると思われる。
温度依存性再コード化の機能的効果の第二の例として、我々はキネシン-1のモータードメインにある低温誘導性編集部位が運動性の低下をもたらすことを発見した。寒冷化するとキネシンが加速し、寒さを補うことができると考えられるからだ。しかし、細胞内荷物の輸送速度の変化は、一般的な細胞プロセスの変化と最適に一致し、需要と供給が一致するはずであると我々は推定している。ほとんどの細胞プロセスの速度は、生物が適応する温度範囲内で、10℃ごとに2-3倍増加する。
71
同様に、様々な動物で測定された軸質輸送速度も、10℃の温度変化で2-3倍の変化を示している。
72
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73
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74
しかし、今回測定した野生型キネシンは、10℃の勾配で1.2倍の速度差しか示さず、予想よりかなり温度感受性が低い。しかし、暖かいところでは比較的速い野生型キネシンから、寒いところでは比較的遅い編集型キネシンに移行すると、その温度感受性が高まり、おそらく温度感受性が高い貨物輸送に依存する他の細胞プロセスによりよくマッチする。さらに、ある温度での細胞内の貨物輸送速度は、キネシンと細胞質ダイニンの両方が、微小管に沿って貨物を反対方向に引っ張る「綱引き」に依存している。キネシンまたはダイニンの追加の再コード化編集部位は、温度感受性があるかどうかにかかわらず、全体の輸送速度を調節する可能性もある。O. bimaculoidesのエディトームでは、
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kinesin-1 heavy-chain mRNAには17の再コード化編集部位があり、8つは温度感受性がある（ただしK282Rほど強くはない）。したがって、K282Rの編集は単独で起こるのではなく、むしろ他の編集事象と協調して起こり、エピスタティックにその機能を発揮する可能性がある。細胞質ダイニン-1重鎖には78の再コード化編集部位があり、そのうちの39は温度感受性である。これらのモーターが軸索輸送を駆動する能力は、今回測定したような個々のモーターの速度や走行距離だけでなく、貨物に対してチームとして集団で働き、輸送中の反対勢力に耐えられるかどうかにも依存する。したがって、輸送に対する再コード化部位の集団的な効果を調べることが必要になる。頭足類のモーター分子における温度感受性および非感受性の再コード化部位の膨大な数は、RNA編集の調節可能性を示す深い例である。
我々のデータは、温度依存的な再コード化が神経のトランスクリプトーム全体に広く存在することを示している。何を制御するために使われているのでしょうか？リン脂質膜は最も温度感受性の高い細胞構造の一つであり、細胞は温度を補うためにその流動性を積極的に調節する必要がある。
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膜に埋め込まれたタンパク質も、この構造体内での移動に伴う粘性抵抗を補正する必要があります。
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このことは、シナプスのような生理的にダイナミックな膜の領域では特に重要である。従って、膜関連タンパク質やシナプスタンパク質が、低温で再コード化される部位を不釣り合いに多く持っているのは当然である。さらに、編集の温度依存的な変化は数時間以内に始まり、新しい定常状態に達するまでに3-4日かかることが示された。これは、mRNAの合成速度と崩壊速度のバランスに起因していると考えられる。再コード化の効果を実現するためには、タンパク質の合成と崩壊の速度も考慮に入れなければならない。したがって、RNA編集を介したアミノ酸の再コード化は、温度変化後、新しい定常状態に達するまでに数日から1週間かかると予想されます。海洋環境では、湧昇現象、季節、季節的な移動などの要因により、数日から数ヶ月の間に温度が著しく変化することがあります。RNA編集は、潮の満ち引きやサーモクラインの通過による急激な温度変化に対応するのにはあまり適していない。
私たちは、軸索輸送とシナプス伝達という神経生理学の主要な特性に対する再コード化によって引き起こされる2つの機能的効果の例を示す。温度感受性の高い事象は非常に多いため、その影響は神経生理学的プロセス全体に及ぶと予想される。さらに、RNA編集が物理的環境の他の変化にも対応できるかどうか、興味深いところです。全体像としては、他の恒温動物ではなく、甲殻類の頭足類が高レベルのmRNA再コード化を採用するようになった進化的圧力は、依然として謎に包まれており、魅力的である。
本研究の限界
我々は、温度によって誘導されるRNA編集が、主要な神経細胞タンパク質の性能を変化させることができるという確固たる証拠を提示した。しかし、現時点では、これらの変化の機能的影響を細胞や生物のスケールで評価することはできない。近年の頭足類の遺伝子ツール開発の進歩により
77
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は、個々の編集部位の影響をより高いレベルの生物組織で研究するために、編集されたコドンまたは編集されていないコドンをトランスジェニック系統に組み込む手段を提供するかもしれない。
温度感受性を駆動する機構はまだ不明である。ADARメッセージの発現レベルは、温度差に関係なく同様であるように見える。しかし、我々のデータは、ADARタンパク質の発現を制御する転写後メカニズムを否定するものではないのである。また、温度感受性編集部位を囲むmRNA構造の熱安定性に違いは見られなかった。しかし、我々の折りたたみ予測には限界があり、バルクインシリコ折りたたみアルゴリズムでは見られない、dsRNA構造の小さな摂動が重要な役割を果たしている可能性がある。しかし、ADAR相互作用は細胞タイプや発生段階に特異的であることが知られているため、これらの結果は慎重に解釈する必要があります。
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また、ヒトの細胞株で報告されているADAR相互作用物質が、タコの神経細胞では異なる役割を担っている可能性も十分にある。さらに、多くの頭足類特異的なADAR相互作用因子が未記載のままであり、温度感受性編集に関与している可能性がある。本研究では、単一の編集部位の機能を研究した。多くの頭足類の転写物は複数の編集部位を含んでおり、これらの部位間のエピスタティックな相互作用が重要である可能性があることに留意されたい。一般に、頭足類における豊富な再コード化を推進するメカニズムは十分に理解されていない。各ADARパラログの貢献度をより深く理解することで、その過程と温度依存性をより深く理解できるかもしれない。
STAR★メソッド
主要リソース表
試薬またはリソースリソース識別子細菌およびウイルス株DH5α大腸菌細胞New England BioLabsCat#C2987H 生物試料Octopus bimaculoidesAquatic Research Consultantsfishes4study． com化学物質、ペプチド、組換えタンパク質Schneider's Drosophila mediumGibcoCat#21720024Fetal bovine serumGibcoCat#16000044Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)GibcoCat#11960Fetal Clone III serumHyCloneCat#SH30109. 03GlutaMAXサプリメントGibcoCat#35050061RNAlaterInvitrogenCat#AM7021TRIzol試薬InvitrogenCat#15596026GlycoBlue共沈剤InvitrogenCat#AM9516DNase INew England BioLabsCat# M0303SPhusion High-? New England BioLabsCat#M0530Lipofectamine LTX with PLUS reagentInvitrogenCat#15338100Janelia Fluor 552 (JF552) Halo ligandJanelia FarmsCat#JF552Trans-IT LT1MirusCat#MIR2305Protease inhibitorsSigma-AldrichCat#P8340HiLyte488 tubulin CytoskeletonCat#TL488MBiotin- ラベル化したチューブリン細胞骨格Cat#T333PHiLyte647チューブリン細胞骨格Cat#TL670MTaxol細胞骨格Cat#TXD01牛血清アルブミン（BSA）SigmaCat#A9647CaseinSigmaCat#C8654Glucose oxidaseSigma-AldrichCat#G7141- 10KUCatalaseSigmaCat#C3515AminopropyltrimethoxysilaneSigmaCat#A3648mPEGLaysan BioCat#MPEG-SVA-5000Biotin-PEGLaysan BioCat#BIO-PEG-SVA-5000Disuccinimidyl tartrateSoltec BioscienceCat#CL108NeutrAvidinタンパク質Thermo ScientificCat#31000制限酵素： NdeIN New England BioLabsCat#R0111制限酵素：XhoIN New England BioLabsCat#R0146制限酵素： EcoRIN New England BioLabsCat#R0101IPTGUBPBioCat#P1010-25His60 Ni Superflow ResinTakaraCat#635660TEV proteaseAddGeneCat#pRK793SP Sepharose Fast FlowCytivaCat#17072901Superdex 75 Prep GradeCytivaCat#17104402Critical commercial assaysRNAqueous Phenol-. フリーtotal RNA Isolation kitInvitrogenCat#AM1912TruSeq Stranded mRNA Sample Prep KitIlluminaCat#20020594AccuScript High Fidelity 1st Strand cDNA Synthesis KitAgilentCat#200820Monarch DNA Gel Extraction KitNew England BioLabsCat#T1020LGibson Assembly Master MixNew England BioLabsCat#E2611LQuikChange II Site- directed Cutagenesis kit directed Mutagenesis kitAgilentCat#200523Mix and Go！Transformation kitZymogenCat#T3001Deposited dataIllumina readsThis paperSRA: PRJNA948369X-ray crystallography structure of unedited octopus synaptotagmin-1This paperPDB: 8FAFX-ray crystallography structure of edited octopus synaptotagmin-1This paperPDB: 8FAMExperimental model： 細胞株ショウジョウバエS2細胞DGRCRRID：CVCL＿TZ72COS-7細胞（サル腎臓線維芽細胞）ATCCRRID：CVCL＿0224OligonucleotidesSee Data S1 for amplicon primersこの論文N／ARecombinant DNAPlasmid：pAc5. 1 V5-HisBDマサチューセッツ大学Patrick Emery博士N／APlasmid：ラットキネシン-1（KIF5C、残基1〜559）3タンデムmCitrine蛍光色素で付加Cai et al.
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N/APlasmid： Octopus野生型キネシンこの論文AddGene：201551Plasmid： Octopus K282R edited kinesinこの論文AddGene: 201552Plasmid： Octopus wild-type synaptotagminThis paperAddGene: 201553Plasmid： Octopus I248V edited synaptotagminThis paperAddGene: 201554Software and algorithmsNikon ElementsNikonhttps://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/software/nis-elementsFiji/ImageJ2Schindelin et al.
80
https://imagej.net/software/fijiHKLHKL Researchhttps://hkl-xray.comPhenixLiebschner et al.
81
http://www.phenix-online.orgBiopythonCock et al.
82
https://biopython.orgnanoAnalyzeTA Instrumentshttps://www.tainstruments.com/itcrun-dscrun-nanoanalyze-softwareBowtie2 (v2.1.0 and 2.3.2)Langmead and Salzberg
83
https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtmlREDItools (v1.0.4)ピカルディ、ペソーレ
84
https://github.com/BioinfoUNIBA/REDItoolsSalmon (v0.8.2)Patro et al.
85
https://salmon.readthedocs.io/en/latestR (v4.2.1)Rコアチーム
86
https://cran.r-project.orgR パッケージです： Biostrings (v2.64.0)Pagès et al.
87
https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/Biostrings.htmlDAVID Functional Annotation Tool (v6.8)Huang et al.
88
https://david.ncifcrf.govDeepTMHMMHallgren et al.
89
https://dtu.biolib.com/DeepTMHMMBLAST (v2.13.0+)Camacho et al.
90
https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/doc/blast-help/downloadblastdata.htmlPrism (v8.0.0 (224))GraphPadhttps://www.graphpad.comR package: respirometry (v1.3.0)Birk
91
https://cran.r-project.org/package=respirometryOriginal code to analyze data and create figuresThis paper; GitHub; Zenodohttps://github.com/matthewabirk/Temperature-dependent-RNA-editing; https://doi.org/10.5281/zenodo.7874071R package： DESeq2 (v1.36.0)Love et al.
92
https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.htmlR package: apeglm (v1.18.0)Zhu et al.
93
https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/apeglm.htmlRNAStructureReuter、Mathews
94
https://www.urmc.rochester.edu/rna/bpRNADanaee et al.
95
https://github.com/padidehdanaee/bpRNAOtherIllumina HiSeq2000シーケンスプラットフォームIlluminaN/A#1.5カバースリップ（キネシンイメージング用）Fisher ScientificCat#2850-18Glass slide for imaging kinesinFisher ScientificCat#12-544-3Inverted microscope Ti-E/B equipped with perfect focus system, a 100× 1. 49NA油浸TIRF対物レンズ、20mWダイオードレーザー3本（488nm、561nm、640nm）NikonN/A電子増倍型電荷結合素子検出器Andor TechnologyCat#iXon X3DU897TIRF microscope with 60× 1. 49NA対物レンズ、1.6倍ズームレンズを搭載したオリンパスIX81顕微鏡ベース（セルTIRFモジュール、50mW 488nmレーザーと100mW 561nmレーザーを搭載）OlympusN/APIDコントローラーTE TechnologyCat#TC-24-10Rigaku Screen Machine fitted a Saturn CCD detectorRigaku Americas Corporation生産終了nanoITCTA Instrumentshttps://www.tainstruments.com/pdf/brochure/BROCH-MICRO-EN.pdfHOBO pendant温度データロガーOnsetCat#UA-002-64
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リソースの有無
リード連絡先
リソースや試薬のリクエストは、リードコンタクトのJoshua Rosenthal (jrosenthal@mbl.edu)までお願いします。
材料の入手方法
本研究で作成されたプラスミドはAddGeneに寄託されています。アクセッションナンバーは、主要リソース表に記載されている。
実験モデルおよび研究参加者の詳細
オクトパスビマクロイデス
12-24日の温度実験のために、カリフォルニア産ツチダコ（Octopus bimaculoides）の成体を米国カリフォルニア州ロングビーチから商業業者（Aquatic Research Consultants）によって回収し、米国マサチューセッツ州ウッズホールのMarine Biological Laboratory（MBL）に輸送し、実験開始までフロースルー海水システムで保持しました。
時間経過実験のために、卵を持った雌成魚を米国カリフォルニア州ロングビーチから商業業者（Aquatic Research Consultants）によって採集し、米国マサチューセッツ州ウッズホールの海洋生物学研究所（MBL）に輸送し、フロースルー海水システムで保持した。孵化後、O. bimaculoides の稚魚（n=12; 0.5-4.6 g）をフロースルー海水システムで隔離飼育し、温度順化試験前と試験中に1日2回グラスシュリンプを給餌した。研究のための頭足類の使用は現在アメリカでは規制されていないが、Marine Biological Laboratoryは倫理的かつ人道的な扱いを保証するために厳しい内部方針を導入している。この研究で使用されたすべての頭足類標本は、海洋生物学研究所の「研究と教育のための頭足類の使用に関する方針」に適合しています。2022年2月以降、MBLにおけるすべての頭足類研究はIACUCの承認を必要とし、本研究は承認されたプロトコル番号22-13A～JJCRの下で実施された。
野生のOctopus bimaculoidesの幼体および成体の標本は、2019年9月（n=4、80-122g、雌2雄2、T=21℃）および2022年2月（n=4、69-107g、すべて雄、T=15℃）にAquatic Research Consultantsによって米国カリフォルニア州のロングビーチから採集されました。
オクトパス バイマキュラタス
Octopus bimaculatusの野生幼体および成体標本を、2019年9月（n=11, 42-283 g, 5 female 6 male, T=22℃）および2020年2月/3月（n=11, 106-456 g, 5 female 5 male 1 uncertain sex, T=16℃）にサンタカタリーナ島のTwo Harbors, CAからSCUBAダイビングにより採集した。
ショウジョウバエS2細胞
ショウジョウバエS2細胞は、10％（vol/vol）FBS（HyClone）を添加したシュナイダーズ・ショウジョウバエ培地（Gibco）を用いて、26℃で培養した。
COS-7細胞
COS-7細胞（サル腎臓線維芽細胞、ATCC、RRID：CVCL_0224）は、10％（vol／vol）Fetal Clone III（HyClone）および1％（vol／vol）GlutaMAX（Gibco）添加DMEM（Cat #11960 ; Gibco）中で37℃、5％CO2で培養された。
大腸菌DH5α細胞
DH5α大腸菌コンピテント細胞は、New England BioLabs（C2987H）より取り寄せた。形質転換後、細胞を抗生物質寒天プレートにプレーティングし、コロニーは抗生物質を添加したLB培地で37℃、250 rpmで培養した。
メソッドの詳細
タコの温度馴化
カリフォルニア産ツースポットタコの成体（Octopus bimaculoides
69
)を約2週間かけて13℃または22℃の海水に順応させ、これらの処理温度で12～24日間保持した（各温度についてn=3、図S1）。試験終了後、動物を犠牲にし、星状神経節を解剖した。RNA抽出のために運命づけられた星状神経節サンプルは、直ちにRNAlaterで保存した。その後、すべてのサンプルは-80℃で保存した。この試験をさらに6匹（各温度で3匹）で繰り返した。各タンクの温度変化の時間経過はデータロガーで記録し、図S1に示す。
温度感受性の高い編集部位の発見
異なる温度における部位特異的な編集頻度をトランスクリプトーム全体で評価するために、星状神経節からRNAqueous solution（Life Technologies, Carlsbad, CA）を用いてtotal RNAを抽出した。これらのサンプルから、TruSeq Stranded mRNA Sample Prep Kitを用い、メーカー（イルミナ）の説明に従ってRNA-Seqライブラリを作成し、イルミナHiSeq 2000装置で各サンプルについて1レーンを用いて塩基配列を決定しました。
RNA編集の変化の時間経過
温度に対するRNA編集レベルの変化の時間経過を評価するために、O. bimaculoidesの幼生（n=12; 0.5-4.6 g）を14℃のフロースルー海水システムで3週間以上馴化した。ベースラインとして、3個体を犠牲にし、星状神経節を解剖した。その後すぐに、海水を0.5℃/時間の速度で24℃まで加熱し、さらに24℃到達後0、8、24、96時間の時点でサンプルを採取した（各タイムポイントにつきn=2-3）。同様の実験を24℃から14℃まで行い、温度変化前と14℃到達後24時間、48時間、96時間後にサンプルを採取した（各タイムポイントにつきn=2）。すべての実験において、動物の安楽死は3％エタノールを含む海水に5分間浸漬することで行った。
これらの動物から単一の編集部位を定量化するために、組織サンプルを直ちに0.5-1.0 mLの氷冷TRIzol試薬（Invitrogen）で粉砕し、RNA単離のために製造者の説明書に従って処理した。3μLのGlycoBlue Coprecipitant（Invitrogen）を加えてRNAの沈殿を促進し、RNAペレットを20μLのDEPC処理水に再懸濁した。サンプルは、製造者の指示に従ってdNase I（NEB）で処理した。その後、オリゴ（dT）プライマーを用いて、製造者の指示に従ってAccuScript High Fidelity 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Agilent）を用いてcDNAを合成した。
編集レベルは、トランスクリプトームワイド解析から寒冷誘導が示された4つのメッセージ内の18の編集部位について定量された。4つのメッセージはアンプリコン配列決定の対象とし（編集部位とプライマー配列はデータS1参照）、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase（NEB社）を用いてPCR増幅した。アンプリコンは、Monarch DNA Gel Extraction Kit（NEB）を用いてアガロースゲルスライスから精製し、その後、Sangerプロトコルを用いて商業ベンダー（Genewiz）によって直接配列決定した。編集レベルは、標的部位に対向する鎖のエレクトロフェログラム内のTとCのピーク高さを比較することにより、18の編集部位で定量化された。アンチセンス鎖の塩基配列を決定すると、センス鎖のAまたはGのピークと比較して、ピークの精度が向上する。
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キネシンの1分子運動性アッセイ
プラスミドコンストラクト
タコのキネシン-1（KIF5、残基1-558）の野生型および編集型（K282R）を化学合成し、そのC末端にハロタグをG4S結合で付加した（図S4B）。これらの産物をギブソンアセンブリーによりpAc5.1 V5-HisBプラスミド（マサチューセッツ大学、P. Emery博士より寛大に提供）のEcoRI部位にクローニングした。その後、プラスミドをDH5α大腸菌細胞に形質転換し、最終産物をサンガー配列決定により確認した。さらに、ポジティブコントロールとして、3タンデムmCitrine蛍光色素で付加されたラットキネシン-1（KIF5C、残基1-559）をコードするプラスミドを用いた
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をコードするプラスミドを、QuikChange II部位特異的変異誘発キット（Agilent）を用いて、Octopusの282位に相当する部分を変異させ、アルギニン（ラットK283R）を作成した。
細胞培養、トランスフェクション、細胞ライセート
プラスミドを培養細胞にトランスフェクションし、タンパク質を生産した。オクトパスキネシン-HaloTagプラスミド（野生型およびK282R）を、Lipofectamine LTX with PLUS reagent（Invitrogen）を用いて、メーカーの指示に従いショウジョウバエS2細胞にトランスフェクトした。一方、50 nM JF552 Halo ligand (Janelia Farms)を成長培地に含めることにより、タンパク質を蛍光標識した。ラットキネシン-1 KIF5C(1-559)-3xmCit プラスミド（野生型およびK283R）を、Trans-IT LT1 (Mirus) を用いて製造者の指示に従ってCOS-7細胞にトランスフェクションした。
トランスフェクションの24時間後または72時間後に、それぞれCOS-7細胞またはS2細胞を、4℃での低速遠心分離によって採取した。細胞ペレットを1xPBSバッファで2回洗浄し、氷冷した溶解バッファ（25mM HEPES/KOH、115mM 酢酸カリウム、5mM 酢酸ナトリウム、5mM MgCl2, 0. 5 mM EGTA、および1% Triton X-100、pH 7.4）に、1 mM ATP、1 mM PMSF、1 mM DTT（S2細胞溶解液用）および1%（vol/vol）プロテアーゼ阻害剤（Sigma-Aldrich）を新鮮に補充。不溶性物質は、卓上型微量遠心分離機で4℃、全速力で遠心分離することによりペレット化した。上清のアリコートを液体窒素でスナップ冷凍し、さらに使用するまで-80℃で保存した。
単一分子運動性アッセイ
HiLyte488-およびビオチン標識微小管またはHiLyte647-標識微小管は、精製チューブリンおよび10％標識チューブリン（Cytoskeleton）からBRB80バッファ（80 mM PIPES/KOH pH 6. 8、1mM MgCl2、および1mM EGTA）、1mM GTPおよび2.5mM MgCl2を補充し、37℃で30分間インキュベートした。あらかじめ温めたBRB80バッファ中の20μMタクソールを加え、37℃でさらに30分間インキュベートして微小管を安定化した。微小管は室温で暗所に保存し、さらに使用した。
COS-7細胞溶解液の場合、清潔な#1.5カバースリップ（Fisher Scientific）を2本の両面テープでスライドガラス（Fisher Scientific）に貼り付け、フローセル（約10μLの容量）を組み立てた。重合した微小管は、10μMタキソールを添加したBRB80バッファーで希釈した後、フローセルに注入し、室温で5分間インキュベートしてカバースリップに非特異的に吸着させた。その後、ブロッキングバッファー［P12バッファー（12 mM Pipes/KOH pH 6.8, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA）中の15 mg/ml BSAおよび10 μMタキソール］を注入して5分間インキュベーションした。最後に、運動性混合物［2 mM ATP、0.4 mg/mlカゼイン、6 mg/ml BSA、10 μMタキソール、酸素スカベンジャー（1 mM DTT、1 mM MgCl2、10 mMグルコース、0.2 mg/ml グルコース・オキシダーゼ、0.08 mg/mlカタラーゼ）in P12バッファー］中でラット3xmCitタグ付きキネシンモーターを発現する細胞溶解液 0.5μL を加え、フローセルを溶かしたパラフィンロウで密封した。パーフェクトフォーカスシステム（Nikon）、100×1.49NA油浸TIRF対物レンズ（Nikon）、3つの20mWダイオードレーザー（488nm、561nm、640nm）、電子増倍電荷結合素子検出器（iXon X3DU897; Andor Technology）を備えた倒立顕微鏡 Ti-E/B (Nikon) を用いてTIRF顕微鏡により画像を取得しました。画像取得はNikon Elementsソフトウェアを用いて制御し、すべてのアッセイは室温（22℃）で実施した。画像は、1フレームあたり100msで300フレーム取得した。
S2細胞溶解液については、ガラス底のディッシュをプラズマ洗浄し、次に100uLのアミノプロピルトリメトキシシラン（Sigma A3648）と真空チャンバー内で1時間インキュベートすることによってアミン機能化した。さらに、mPEGとビオチン-PEG（それぞれLaysan Bio MPEG-SVA-5000とBIO-PEG-SVA-5000）の溶液で表面を機能化し、非特異的なタンパク質吸着を防止しながらビオチン化マイクロチューブに特異的に付着させた。表面上の未反応のアミン基は、ジスクシンイミジル酒石酸塩（Soltec Bioscience CL108）とのインキュベーションによって除去した。コーティングされたガラス表面に、真空グリースでステンレス製クーラーリングを取り付けた。0.5 mg/ml NeutrAvidinをクーラーリングに注入し、室温で5分間インキュベートし、その後、溶液を吸引した。ブロッキングバッファー（BRB80バッファー中の1mg/mlカゼイン）を用いてガラス底を2回リンスした。その後、重合したHilyte488およびビオチン標識微小管を、10μMタキソールを添加したBRB80緩衝液で希釈した。次に、希釈した微小管をクーラーリングに注入し、ビオチン-ノイトラビジン結合のために室温で5分間インキュベートし、その後、溶液を吸引した。ガラス底はブロッキングバッファーを用いて2回洗浄した。最後に、タコキネシンモーターを運動性混合物（2 mM ATP、0.4 mg/mlカゼイン、6 mg/ml BSA、10 μMタキソール、酸素捕捉剤（1 mM DTT、1 mM MgCl2、10 mMグルコース、0.2 mg/mlグルコースオキシダーゼ、0.08 mg/mlカタラーゼ）、P12バッファ）で発現する細胞溶解液5 uLを冷却リングに入れた。画像は、TIRF顕微鏡（50mW 488nmレーザーと100mW 561nmレーザーを装備したcellTIRFモジュール付きオリンパスIX81顕微鏡ベースに1.6Xズームレンズを搭載した60× 1.49NA対物レンズ、Andor iXon DU-897U EMCCDカメラで撮像）により取得しました。サンプルは、PIDコントローラー（TE Technology社）で制御されたサーモエレクトリック・クーラーで冷却されたアルミニウムベースからなる特注のサンプルチラーで冷却された。冷却リングは、冷却されたベースの凹部にはめ込まれ、冷却リングの外側のガラス底に堆積した水を通して熱的接触がなされる。画像は、室温（21℃）では1フレーム200msで200フレーム、11℃では1フレーム100msで400フレーム取得しました。
シナプトタグミンC2Aドメインの結晶化
プラスミド構築物
タコのシナプトタグミン-1（Syt1）C2Aドメイン（残基145-273）の野生型および編集型（I248V）バージョンを化学的に合成し、ギブソンアセンブリによってp202プラスミドのNdeIおよびXhoI部位間にクローニングした。プラスミドはDH5α大腸菌に形質転換され、その配列はサンガー配列決定により確認された。
Syt1 C2Aドメインの発現と精製
wtおよびI248V C2Aドメインをコードする発現プラスミドを、ZymogenのMix and Goキットを用いてBL21（DE3）細胞に形質転換した。形質転換体をカナマイシンプレート（50μg/ml）で選択し、10mlのLB培地＋カナマイシンに接種して飽和まで培養した。次に、コンフルエントになった細胞の10mlを1LのTerrific Brothに接種した。37℃でOD600が∼2.0になるまで細胞を培養し、その後250rpmで振とうしながら18℃まで冷却した。遺伝子発現を誘導するために400μMのIPTGを添加し、培養物を18℃でさらに18時間培養した。遠心分離により細胞を採取し、液体窒素で凍結し、必要なときまで-80℃で保存した。
細胞ペレットを氷上で解凍し、溶解バッファー（100 mM HEPES, pH7.4, 300 mM NaCl）に再懸濁した。その後、細胞懸濁液をMicrofluidicsのフルイダイザーで溶解し、SS-34ローターで45分間遠心分離を行った。上清をNi2+-NTAアフィニティ樹脂に通し、His6タグ付き-マルトース結合タンパク質（MBP）融合タンパク質を選択した。カラムを250mlの溶解バッファーで洗浄した後、250mlの溶解バッファー＋15mMイミダゾールで洗浄し、非特異的結合タンパク質を除去した。His-tagged-MBP-C2Aタンパク質は、溶解バッファー＋250mMイミダゾールで溶出された。次に、得られた融合タンパク質を、1mgのTEVプロテアーゼを用いて4℃で一晩切断し、MBP成分とC2Aドメインとを分離した。切断後、タンパク質溶液をSAE-Sepharoseカラム（Buffer A: 100 mM HEPES, pH 7.4, Buffer B: 100 mM HEPES, pH 7.4 + 1M NaCl）上でイオン交換することでさらに精製しました。MBPはフロースルー画分に溶出し、C2A成分は0から1Mの塩勾配中に単一ピークとして溶出した。精製の最終段階は、溶解バッファーに300mM NaClを加えた80cmゲルろ過カラム（Superdex 75）上で行った。すべての関連するタンパク質ピークは、PAGEゲルを用いて分析され、BioRad stainfreeシステムで画像化されました。
結晶化
精製したシナプトタグミンC2Aドメインを20mg/mlに濃縮し、多因子法を用いて結晶化条件のスクリーニングを行った。複数のヒットが発見された。構造決定のために、Octopus Syt1 C2A結晶は、100μM CHESを含む31% PEG 4000、pH 9.3上で成長した。
X線データ収集、構造解析、精密化
結晶を石英キャピラリー管にマウントし、Saturn CCD検出器を備えたリガクスクリーンマシンにより、室温でCu-KαX線データを収集した。データはHKLソフトウェアパッケージを使って統合・縮小した（表S6）。分解能のカットオフは、CC1/2値を用いて選択した。
Phenixに実装されているMolecular Replacement (MR)を使って構造を解いた。MRのテンプレートとして、ラットのシナプトタグミンC2A（4wee）の超高分解能構造を使用した。Phenixの手動モデルフィッティングおよびX線精密化を何度も繰り返した。
81
を用いたX線精密化により、Octopus synaptotagmin C2Aの構造を完成させた。マルチコンフォーマー、異方性精製を実施した。ライディングハイドロゲンが含まれていた。主要残基のSolvent Accessibility Surface（SAS）は、Biopythonに実装されているShrake-Rupley SASアルゴリズムにより決定した。
82
等温滴定カロリメトリー（Isothermal Titration Calorimetry
精製したC2AドメインのCa2+結合親和性は、TA Instruments/Waters社のnanoITCを用いて評価した（nWT=4、nI248V=6）。ITC分析前にC2Aサンプルから残留Ca2+を除去するため、タンパク質サンプルに10 mM EDTA, pH 8.0を加え、氷上で20分間平衡化させた。その後、PD-10緩衝液交換カラムを「Chelexed」緩衝液（40 mM HEPES pH: 7.4, 150 mM NaCl）で平衡化した。その後、C2A-EDTA溶液を1mlに濃縮し、PD-10カラムの樹脂ベッドに適用した。脱塩されたC2Aドメイン画分を回収し、プールした。400μM精製C2Aドメインを、10℃で10mM Ca2+分析物に対して、各2μlの25回の注入で滴定した。ミキサーの速度は250rpmに設定した。データは、nanoAnalyzeを用いて処理した。
野生における温度感受性の高いRNA編集
野生のO. bimaculoidesの標本は、2019年9月（n=4、T=21℃）および2022年2月（n=4、T=15℃）にAquatic Research Consultantsによって米国カリフォルニア州ロングビーチから採取された。Octopus bimaculatusの標本は、2019年9月（n=11、T=22℃）と2020年2月/3月（n=11、T=16℃）にサンタカタリナ島のTwo Harbors, CAからSCUBAダイビングで採取された。動物の捕獲に先立つ4～9週間、HOBOペンダント型温度データロガー（Onset）を配備して、両種の捕獲地点で気温を記録した（図S5）。種の同定は、種特異的な配列を含むチトクロームcオキシダーゼI（COI）のアンプリコン配列決定によって確認された（データS1）。
動物は、2％エタノールに5分間浸漬した後、5％エタノールに5分間浸漬することで安楽死させた。星状神経節を直ちに解剖し、RNAlaterで保存し、「RNA編集の変化の時間経過」サンプルと同じように処理した。
定量化および統計解析
温度依存的な編集部位の発見
12日間の温度馴化実験で得られた寒冷地と温暖地のサンプル間の編集の違いを調べるために、まずリードをOctopus bimaculoidesゲノムにアライメントした。
60
Bowtie2を用い、ローカルアライメント設定とデフォルトパラメータでアライメントを行った。
83
編集は、コード配列内の105,975箇所について定量化した（Liscovitch-Brauer et al.
48
表S5）、REDItoolsコマンドREDItoolKnownを用い、以下のパラメータで編集を定量化した：-v 0 -n 0.001 -c 0 -t 2 -q -30 -m 40.
84
この解析では、12サンプルのそれぞれで少なくとも100リードがカバーする編集部位のみを考慮した（62,661部位）。有意な差のある編集部位は、Benjamini-Hochberg多重検定補正をかけた2つの片側t検定（片側検定のそれぞれについて別々に、偽発見率（FDR）≦0.1）を用いて同定した。
温度感受性の高いエディトーム解析
エディトーム全体のパターンの評価
位置によって、多くのエディトがコドンを再変換することが可能である。A-to-I RNA編集による16種類のコドン置換の可能性の中で（図S2A）、異なる種類のアミノ酸の再コード化に対して系統的な温度誘導の偏りがあるかどうかを評価した。まず、図S2Bに概略を示したように、アミノ酸を非極性、極性、正電荷、負電荷のいずれかに従ってグループ分けした。そして、変化をグループ間（「変化した」）とグループ内（「同じ」）のいずれかに分類した。温熱誘導部位、温度非感受性部位、冷熱誘導部位におけるこれらの事象の割合を、ボンフェローニ調整p値を用いた一対のカイ二乗検定を用いて比較した。同様に、編集によって誘発されたアミノ酸置換も、Biostrings Rパッケージが提供するBLOSUM80スコアに基づいてグループ化した。
87
統計的有意性を検定するため、オリジナルと再コード化アミノ酸のスコアの差について、一対のt検定を適用した。
グループ間の差が編集レベルの分布の違いによるものかどうかを検証するため、編集レベルの分布が類似しているマッチンググループを作成した。編集レベルのコントロール後も、寒冷群と温暖群のBLOSUM80スコアの比較を除き、すべての有意差は有意なままであった。
さらに、どのタンパク質形質（Uniprotキーワードで表現）が温度感受性部位で濃縮されているかも明らかにした。DAVID Functional Annotation tool v 6.8 を使用した。
88
を使用し、再コード化部位を持つすべての転写物（n=5417）と比較して、編集が10%以上増加した低温誘導再コード化編集部位を含む転写物（n=571）の濃縮を検定した。Uniprot Keywordsは、FDR < 0.05のときに有意とした。膜結合タンパク質（n=218）内の大きな温度感受性コーディング部位の位置は、DeepTMHMMで予測した。
89
で予測し、再コード化編集が膜貫通部分に偏っているかどうかを評価した。
温度感受性の潜在的なメカニズム
温度感受性RNA編集を誘導するメカニズムとして考えられるのは、A-to-I RNA編集を誘導する触媒酵素であるADARの発現量の変化である。この可能性を評価するために、RNASeqリードをタコのエクソームに準マッピングしました。
60
Salmon（v0.8.2）を使用した。
85
を用い、デフォルトのパラメータでquasimapした。両触媒パラログ（ADAR1、Ocbimv22018643mおよびADAR2、Ocbimv22009676m）の発現（TPM：Transcripts per million）は、t検定を用いて温暖および低温サンプル間で比較された。
低温で誘発されるRNA編集を説明するもう一つの有力な仮説は、低温でのdsRNA構造の安定性が高いというものである。この可能性を評価するため、13℃と22℃でRNA配列を折りたたみ、dsRNAの安定性の変化で寒冷時に観察される編集率の高さを説明できるかどうかを検討した。編集部位の塩基配列は、ゲノム配列とエクソーム配列の両方から、両側400塩基対で挟まれた塩基配列をコンパイルした。RNA編集は従来、主に核で転写中に起こると考えられてきたが、頭足類では核のプレmRNAだけでなく、細胞質で成熟mRNAの編集も多く見られることが実証されているため、プレmRNAと成熟mRNAの両方を評価した。
97
RNAStructureパッケージのFoldを使用して、各配列の295.15Kと286.15Kの最低エネルギー構造を発見した。
94
をデフォルトのパラメータで使用した。その後、編集部位を囲む部分構造をbpRNAを用いて抽出した、
95
そして、1つのRNA配列を生成するために、その2つのアームを7 "N "塩基対で接続した。この部分構造の自由エネルギー（ΔG）をFoldを用いて再計算し、最も確率の高い構造を採用した。編集部位が最確構造のdsRNAセグメントに存在しない部位は、ΔG = 0とした。
最後に、既知のADAR相互作用タンパク質の温度による発現量差も調べた。RNASeqのリードをタコのトランスクリプトームに準マップした。
60
Salmon (v0.8.2)を使用した
85
を用い、デフォルトのパラメータでquasimapした。その後、DESeq2（v1.36.0）を用いて、温度によるトランスクリプトーム全体の差分発現を解析した。
92
推定数は、長さスケールのTPMを使用して存在量から生成した。推定されたlog2-fold変化は、「apeglm」パッケージのadaptive Student's t prior shrinkage estimatorを使用して調整した。
93
有意に発現量の異なる遺伝子は、調整後のp値＜0.05の遺伝子として同定された。発現量の異なる遺伝子のうち、ヒト細胞株でヒトADAR1またはADAR2と相互作用することが知られているヒト遺伝子と相同なタコ遺伝子を検索した。既知のADAR相互作用タンパク質は、BioGRID（v4.4.219）からコンパイルした。
98
相互作用の in vivo 証拠があるもの（例：アフィニティキャプチャー、n=370）だけを利用し、Freund et al.
64
(n=243). ホモログを同定するために、BLASTを使用した。
90
を使用し、各ヒト相互作用物質のクエリに対してタコがヒットするかどうかを検索した。BLAST e-value<1e-5で、クエリ遺伝子の長さの50%以上をカバーするオクトパスヒットが1つ以上あった場合、最も低いe-valueを持つヒットをオクトパスホモログと定義しました。
RNA編集の変化の時間的経過
温度に対する編集の変化の時間的ダイナミクスを、cold-to-warm実験とwarm-to-cold実験について定量化した。各タイムポイントから次のタイムポイントへの編集レベルの差を、評価した18部位それぞれについて定量化した。各タイムシフトについて一対のt検定を行い、p値はボンフェローニ法を用いて多重比較のために調整した。
個体数の制約から、タイムコース実験は96時間後に終了した。この時点で観察された編集レベルが定常状態に達したかどうかを推定するため、長期温度馴化試験終了時の同一地点の編集レベルと値を比較した。短期と長期では温度が1〜2℃異なるため、ΔTとΔ編集レベルの間に線形関係があると仮定し、長期実験で観測されたΔ編集レベルに基づいて、短期研究の編集レベルの値を適宜「按分」した。この直線性の仮定はイカで検証されている（データ示さず）。そして、「按分」された編集レベルは、paired t-testを使用して長期実験の値と比較された。
キネシンの1分子運動性アッセイ
動画から、微小管ベースのイベントを強調するために最大強度投影を生成し、Fiji/ImageJ2を使って微小管トラックに沿ってROI（幅=3ピクセル）を描くことによってキモグラフを作成した。
80
(図S4D）。4ピクセル以上続く運動性イベントは解析に含まれた。運動イベントは、時間の経過とともに位置が変化するイベントとして定義され、運動速度は、走行長（カイモグラフのx軸）を時間（カイモグラフのy軸）で割ったものとして計算されました。静止イベントは、時間の経過とともに位置が変化しないイベントと定義された。
統計解析は、Prismソフトウェア（GraphPad）を用いて行い、グラフを作成した。室温および11℃におけるWTと変異体の比較は、両側t-testを用いることで行った。タコのキネシン-1では70-100の運動イベントが、ラットのキネシン-1では400以上の運動イベントが、2-3回の独立した実験にわたって評価された。WTと変異体の温度感受性は、Rパッケージ「respirometry」のQ10関数を用いて計算した。
91
野生における温度感受性の高いRNA編集
冬と夏のサンプル間の温度感受性は、Rのt-testを使用して評価した。
86
データおよびコードの利用可能性

イルミナRNASeqデータはNCBI SRAに寄託されており、出版日現在、一般に利用可能である。アクセッションナンバーはキーリソース表に記載されている。X線結晶構造解析はRCSB PDBに寄託されており、出版日現在で一般に入手可能である。アクセッションナンバーは、key resources tableに記載されています。

すべてのオリジナルコードはGitHubとZenodoに寄託されており、出版日現在で公開されています。URLとDOIは、主要リソースの表に記載されています。

本論文で報告されたデータを再分析するために必要な追加情報は、要求に応じてリードコンタクトから入手できます。
謝辞
サンタカタリナ島で採集された Octopus bimaculatus 個体は、CA Department of Fish and Wildlife の科学採集許可証 SC-191820001 に基づいて採集された。M.A.B. は NSF Postdoctoral Research Fellowship in Biology (DBI-1907197)の支援を受けている。K.J.V.は、NIH R35GM131744の支援を受けた。E.E.は、NSF-BSF BSF 2020759, BSF 2017262, BSF 2013094の支援を受けた。J.J.C.R.は、NSF-BSF 2110074、NSF 2220587、BSF 2017262、BSF 2013094、およびNSF 1827509から支援を受けた。図中のタコの絵はすべてRoger Hallが作成したものである。本研究におけるMBLの頭足類プログラムの支援に感謝する。
著者貢献
概念化、M.A.B.、E.E.、J.J.C.R.、方法論、M.A.B.、J.D.H.、J.J.C.R.、調査、M.A.B. 、 M.J.D. 、 S.M. 、 Y.Y..、 およびJ.J.C.R.、データキュレーション、M.A.B.およびR.B.S.、正式解析、M.A.B., N.L.-B., I.T., R.B.S., and E.E、資金取得、M.A.B., K.J.V..、 E.E.、J.J.C.R.、ソフトウェア、M.A.B.、検証、M.A.B.、J.J.C.R.、可視化、M.A.B.、R.B.S. 、執筆M.A.B、 K.J.V., R.B.S.、 E.E.およびJ.J.C.R.、プロジェクト管理、K.J.V.、R.B.S.、J.J.C.R.、監督、R.B.S、 E.E. および J.J.C.R. 、リソース、 J.J.C.R.
利害関係の宣言
著者らは、競合する利害関係はないことを宣言している。
インクルージョンと多様性
本論文の著者の1人以上は、研究分野におけるマイノリティの代表性を高めることを目的としたプログラムからの支援を受けている。
補足情報
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資料S1です。データS1、表S5、S6
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表S1. 図1および図2に関連する、低温で編集された部位のリスト
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表S2. 図1および図2に関連する、温熱誘起編集サイトのリスト
ダウンロード .csv (.01 MB)
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表S3. STAR Methodsに関連する、高度に低温誘導された再コード化編集部位のDAVID機能アノテーション結果
ダウンロード .txt (.12 MB)
txtファイルに関するヘルプ
表S4. タコの星状神経節における既知のADAR-interactorホモログ（ヒト細胞株由来）の発現差、STAR Methodsおよび図S3関連
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出版履歴
掲載されました： 2023年6月8日
受理された： 2023年5月4日
改訂版受理 2023年4月24日
受理された： 2023年1月31日
識別
DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.05.004
著作権について
© 2023 Elsevier Inc.
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図版
グラフの概要
図1低温にさらされたオクトパスはより強いRNA編集活性を示す
図S1図1および図2に関連する、長期温度インキュベーション実験前および実験中の水槽の水温。
図S2図2に関連するアミノ酸の再コード化現象
図2温度によるリコーディングサイトは、微妙で一般的なアミノ酸置換に富んでいる。
図S3温度依存性編集の可能なメカニズム、STAR Methods関連
図3RNA編集は温度変化後、数時間で変化し、数日で定常状態に達する
図S4キネシンの方法論、図4と関連する
図4キネシン-1のモータードメイン上の編集部位（K282R）は、非常に温度感受性が高く、運動性の強い変化を誘導する
図5シナプトタグミン-1のC2Aドメイン上の編集部位（I248V）は、低温でタンパク質の立体構造を変化させ、Ca2+結合の親和性を変化させる。
図S5図6に関連する捕獲前の数週間のサンタカタリナ島（Octopus bimaculatus用）およびカリフォルニア州ロングビーチ（Octopus bimaculoides用）のTwo Harbors付近の水温
図6実験室で発見された温度感受性の高い編集部位は、季節的な温度変化にさらされる野生動物でも同等の温度感受性を示す
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Rangan et al.
セル2023年06月08日
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