微生物による硫酸同化還元を介したH2S：クローン病発症における見落とされた役割

哉百名

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マイクロバイオーム

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微生物による硫酸同化還元を介したH2S：クローン病発症における見落とされた役割



マイクロバイオーム 第12巻、論文番号：152（2024）この記事を引用する

概要

背景

腸管におけるH2Sの不均衡は、微生物叢の異常とバリア機能障害を特徴とする慢性炎症性消化管疾患であるクローン病（CD）の引き金となる。しかし、腸管におけるH2S生成に関する包括的な理解、およびCDにおける全身的なH2Sレベルに対する微生物叢と宿主の両者の寄与は、未だ解明されていない。本研究は、ヒトの宿主と腸内細菌叢の両方の硫化生成能に関する理解を深めることを目的とした。

結果

治療歴のないCDコホートの糞便メタゲノミックデータと生検メタトランスクリプトームデータの解析から、CDとの相関において、微生物の外因性H2S産生遺伝子の存在量の増加とともに、宿主の内因性H2S産生遺伝子の発現量の減少が明らかになった。先行研究では、異化型亜硫酸還元酵素を介した微生物H2S産生に焦点が当てられていたが、我々のメタゲノム解析では、同化型硫酸還元（ASR）経路が、ヒト腸内におけるその高い有病率と存在量から、より重要な寄与因子であることが示唆された。その後、亜硫酸還元酵素とL-システイン合成酵素遺伝子を欠失させたASR欠損大腸菌変異体∆cysJと∆cysMを作製し、我々の仮説を実験的に検証した。この変化は、細菌の亜硫酸生成能、結腸上皮細胞の生存率、結腸ムチンの硫酸化に大きな影響を与え、最終的にマウスモデルで大腸炎を引き起こした。さらなる研究により、腸内細菌がスルホ多糖類を分解し、硫酸を同化してASR経路を介してH2Sを産生することが明らかになり、大腸炎におけるスルホ多糖類の役割が強調されるとともに、食品添加物としての使用に注意が必要であることが示された。

結論

本研究は、ヒト腸内における微生物の硫黄代謝に関する理解を大きく前進させ、食事、腸内細菌叢、宿主の硫黄代謝の間の複雑な相互作用を解明した。我々は、微生物のASR経路が、見過ごされている内因性H2S産生因子であり、CDを管理するための潜在的な治療標的であることを強調した。

ビデオ要約

はじめに

クローン病（CD）と潰瘍性大腸炎（UC）は、下痢、直腸出血、腹痛、疲労、体重減少などの症状を特徴とする炎症性腸疾患（IBD）の2つの主要な病型であり、患者の生活に大きな影響を与える。IBDの罹患率と有病率は、特に新興工業地域で世界的に上昇している [1,2]。この疾患の世界的な負担の増大は、予防および治療対策の必要性を強調している [2] 。正確な病因はいまだ解明されていないが、特に遺伝的素因を持つ人では、腸内細菌によって引き起こされる粘膜免疫応答の調節異常が原因であると考えられている [3,4]。

硫黄代謝および硫黄含有代謝物は、IBDにおいて極めて重要な役割を果たしている [5,6,7]。硫化水素（H2S）は、大腸の健康という観点から最も注目されている硫黄誘導体である。消化管系では、H2S経路は、タンパク質のシステイン残基の翻訳後修飾、KATPチャネルの活性化、結腸細胞の無機燃料としての役割など、様々なメカニズムを通じて、上皮、免疫、腸神経系の健康を支えている [8,9,10]。しかし、H2Sへの過剰な暴露は宿主にとって有害であり、腸管上皮を損傷し、慢性炎症を引き起こすだけでなく、細胞増殖とアポトーシスのバランスを崩す [11]。H2S濃度の上昇とIBDとの関連は、長い間疑われてきた [12,13]。いくつかの研究から、H2Sを標的とした薬理学的介入は、制御性T細胞の分化促進、低酸素誘導因子1α（HIF-1α）の安定化、バイオフィルム形成の促進、浮遊性細菌の増殖抑制などのメカニズムにより、IBDの予後を改善する可能性が示唆されている［14,15,16］。

しかし、H2Sの生成とIBDの関係を解明する包括的なメカニズムモデルはまだない。H2Sの産生と放出は内因性因子と外因性因子の両方によって制御されているが、ヒトの全身のH2Sレベルに対する宿主と腸内細菌叢の相対的な寄与は不明なままである。内因性のH2S産生は、主に有機硫黄化合物、特にシステインの酵素分解に起因する。このプロセスにおける主要酵素には、シスタチオニンβ-シンターゼ（CBS）、シスタチオニンγ-リアーゼ（CTH）、3-メルカプトピルビン酸硫黄転移酵素（MPST）、メタンチオールオキシダーゼ（SELENBP1）などがある [17,18]。一方、微生物を介したH2S生成に関する理解はまだ限られている。とはいえ、細菌がH2Sを生成して抗生物質による酸化ストレスを緩和すること[19]、腸内代謝を形成するために不可解な酸化還元化学を駆動すること[7]、細胞内のシステインレベルを調節すること[20]、プロテオームのS-硫酸化を介して細菌の病原性に影響を与えること[21]などの研究が示されており、細菌のH2S生成メカニズムを明らかにする必要性が強調されている。

細菌は、L-システインやタウリンのような有機硫黄化合物と、硫酸塩や亜硫酸塩のような無機硫黄化合物の両方を利用してH2Sを生成する。硫酸代謝の2つの主要な経路は、硫酸をH2Sに還元し、その後システインやメチオニンの生合成に取り込まれる同化型硫酸還元（ASR）[22,23]と、硫酸還元菌に見られる同化型硫酸還元（DSR）であり、これらの微生物は硫酸からL-システインに取り込まずにH2Sを生成する[24]（図1）。

図1

外因性微生物による硫黄代謝では、無機硫酸とシステイン、タウリン、イセチオン酸、メタンチオール、アルカンスルホン酸などの有機硫黄の代謝を介して、遺伝毒性を有するH2Sが産生される（黒と緑）。内因性H2Sは、システインやホモシステインのような硫黄含有アミノ酸や有機硫黄メタンチオール（緑）の代謝を介して産生される。遺伝子名とKEGG IDはSupplementary dataset 1に記載されている。* 最近の研究で、スルファン硫黄は細菌のメタンチオールオキシダーゼ（MtoX）の直接生成物であることが証明された[25]。

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微生物の硫化生成に関するこれまでの研究では、腸内細菌叢の全身的な総H2S濃度への寄与は被験者によって大きく異なることが分かっており [26]、主に有機硫黄化合物の発酵 [5,27]と硫酸還元菌DSR [28,29]に焦点が当てられてきた。一方、硫黄を固定し有機硫黄化合物を操作するために多くの微生物が採用している一般的な戦略であるASRは、日常的に見過ごされてきた。

ここでは、ゲノムおよびメタゲノム解析ツールを用いて、新たに発症した治療歴のないCDコホートにおける宿主と腸内細菌叢の両方の大腸硫化産生能について理解を深めた。メカニズム的には、大腸菌のASR経路を遺伝子操作し、(i)大腸菌のサルフィド生成能、(ii)大腸上皮細胞の生存率、(iii)大腸炎の発症と粘液の完全性の維持への影響をマウスモデルで評価した。我々のデータは、食事性硫酸塩代謝、腸管硫黄ホメオスタシスおよび粘液の完全性における微生物ASR経路のこれまで知られていなかった役割を明らかにし、CD発症におけるその極めて重要な役割を強調した。

研究結果

CDは腸内微生物の同化性硫酸塩還元のアップレギュレーションと関連している

我々は、有機化合物（食事性L-システインやタウリンなど）や無機硫酸塩を含む様々な供給源からの硫化物生成に関与する主要遺伝子に焦点を当て、ヒト腸内細菌叢のH2S生成能力について包括的な調査を行った（図1、補足データセット1）。我々の解析は、2つの独立したIBDコホート、FAH-SYSU (Sun Yat-sen University First Affiliated Hospitalに登録された治療歴のないIBDコホート) [30]とPRISM (Prospective Registry of IBD study at MGH) [3]の便メタゲノムサンプルに基づいて行われた。ShortBREDは、関連するファミリーメンバーのユニークな配列マーカーを同定し、メタゲノムデータ中の相対的な存在量を高い特異性で定量するために採用された[31]。ShortBREDは遺伝子クラスターの同定と定量化のために特別に開発されたものではないことは注目に値する。それにもかかわらず、個々の遺伝子を用いてメタゲノミックデータセット内を検索した結果、同じクラスターに属する遺伝子間で中程度から高い一貫性が見られ（spearman r 0.59-0.94,p< 0.001, Supplementary dataset 2）、予測の正確性が確認された。

我々は、硫酸アデニルトランスフェラーゼ（cysDN）およびアデニル硫酸キナーゼ（cysC）を含むASRに関連する遺伝子が、両コホートで高い頻度で存在することを見出した。FAH-SYSUコホートでは、これらの遺伝子はCDとHCの両方に100％存在し、PRISMコホートでは、その有病率は82〜100％であった。これらの遺伝子はまた、CDおよびHCの両方において、FAH-SYSUコホートでは98.0-646.7、PRISMコホートでは20.6-57.2というRPKM値を示し、豊富であった（図2、補足データセット3）。PRISMコホートでは存在量が少なかったが、これはシークエンス手順の違いによるものであろう。ASR経路では、生物は異なる戦略を用いる： 1）アデノシン-5'-ホスホ硫酸（APS）はCysCによって3'-ホスホアデノシン-5'-ホスホ硫酸（PAPS）にリン酸化され、さらにPAPS還元酵素（CysH）によって亜硫酸塩（SO32-）に還元される；2）APSはAPS還元酵素（AprAB）によって直接還元され、アデノシン一リン酸（AMP）とSO32-を生成する。どちらのシナリオでもSO32-が生成され、さらに嫌気性亜硫酸還元酵素（AsrABC）[32]または亜硫酸還元酵素（CysJI）によって還元されて硫化物（S2-）が生成され、その後システイン合成酵素A（CysK）とシステイン合成酵素B（CysM）によってL-システインが生成される（図1）。我々は、cysH、cysJI、cysM、cysK、asrABCを含むASR下流遺伝子も、CD被験者でより多く存在することを見いだした（p< 0.01）ことから、CD患者ではSO42-からのH2S産生においてASRが重要な役割を果たしていることが示唆された（図2A、補足データセット3）。

図2

CDは内因性硫化生成遺伝子発現の低下と腸内微生物による外因性硫化生成遺伝子発現の増加と関連している。AFAH-SYSU（薄緑背景）コホートおよびPRISM（薄青背景）コホートにおけるCDと健常対照者（HC）の硫化物生成に関連する選択遺伝子を比較したドットプロット。各ドットの大きさは、各グループで検出された当該遺伝子の参加者の割合を示し、各ドットの色は、各グループにおける当該遺伝子のRPKMを示す。RPKMは、マップされた100万リードあたりのキロ塩基あたりのリード数。ASR、DSR、有機硫黄代謝に関連する遺伝子は、図1のスキームに従って色分けした。B異なるIBDコホートにおけるCDおよび非IBD対照者の粘膜でのcbs、cth、mpstおよびselenbp1遺伝子発現の解析。CBS、シスタチオニンβシンターゼ、CTH、シスタチオニンγリアーゼ、MPST、3-メルカプトピルビン酸硫酸転移酵素、SELENBP1、メタンチオール酸化酵素。* 異なるコホートでは様々な対照群を利用した。FAH-SYSUは非疾患コントロール、HMPは症候性非IBDコントロール、E-MTAB5464は非疾患コントロール、GSE83687は散発性結腸癌患者の腫瘍から離れた正常な非炎症腸管。CCD患者は、健常人と比較して、糞便微生物群集における同化硫酸還元活性の増加を示す。有意性はノンパラメトリックMann-Whitney検定により決定した。*p< 0.05、**p< 0.01、***p < 0.001

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両コホートにおいて、dsrAB遺伝子（ASR経路ではなくDSR経路の主要遺伝子）の有病率と存在量は、asr関連遺伝子と比較して顕著に低いことが観察された。PRISMコホートでは、dsrAB遺伝子はCD被験者の約30.9-32.4％で検出されたが、HC被験者ではこの割合は67.6-76.5％に増加した。さらに、その存在量は約0.48から0.60-0.72RPKMに増加した（p< 0.01）。しかし、FAH-SYSUコホートではdsrAB遺伝子に有意差は認められなかった（図2A）。さらに、DSRとASRの両方でAPSをSO32-に変換する役割を持つaprABは、CD被験者で顕著な減少を示した（図2A）。さらに、両経路に共通する硫酸トランスポーターをコードするcysPUWAについても調べた。これらのトランスポーター遺伝子は、CD患者においてより多く存在し、豊富であったことから、CD患者では微生物による硫酸輸送が亢進していることが示された。

有機硫黄代謝は、IBDおよび大腸癌(CRC)の患者において濃縮されていることが報告されている[33,34]。そこで、本研究では有機硫黄代謝に関連する微生物遺伝子を調べた。その結果、L-システインをH2Sに変換するのに重要な細菌遺伝子mpstは、両コホートにおいて、HC被験者と比較してCD被験者でより一般的かつ有意に高いレベルを示した（p< 0.001、図2A）。さらに、タウリントランスポーター（tauABC）、タウリンジオキシゲナーゼ（tauD）、スルホン酸トランスポーター（ssuACB）、アルカンスルホン酸モノオキシゲナーゼ（ssuD）を含むタウリンおよびアルカンスルホン酸代謝に関連する遺伝子は、FAH-SYSUコホートではCD被験者でより豊富であった（p< 0.001、図2A）。微生物性メタンチオールオキシダーゼ（mtoX）は、生物圏に広く分布しているが[35]、ヒト関連細菌からは検出されなかったため、ShortBRED解析では除外した。PRISMコホートでは、CD患者においてtauABCと ssuDの増加傾向が観察されたが、統計学的有意性は得られなかった。

CD患者は内因性H2S産生障害を示す

内因性H2S産生は、宿主による含硫アミノ酸の利用から生じる（図1）。内因性サルフィド生成活性を明らかにするために、FAH-SYSUコホート[36]から新たにCDと診断された患者（n = 46）と非疾患コントロール（n = 44）から採取した腸生検を用いて、宿主のcbs、cth、mpst、selenbp1の発現レベルを評価した。解析の結果、CD患者の炎症粘膜生検では、これら4遺伝子の全てが有意な減少を示した（図2B）。同様の傾向は、Mount Sinai Hospitalコホート（GSE83687）[37]、治療歴のない小児IBDコホート（E-MTAB-5464）[38]、HMP IBDコホート[4]を含む3つの独立したIBDコホートで観察された（図2B）。E-MTAB-5464コホートでは、トランスクリプトームデータは精製腸上皮細胞から作成された。このコホートにおけるCBSの生カウントは一般に10未満であったため、解析されなかった。この所見は、CD患者の内因性サルフィド生成能の大幅な低下を強く示唆している。

CD患者のH2S異化能が低下しているかどうかを明らかにするために、これらのコホートデータセットにおいて、チオ硫酸スルホルトランスフェラーゼ（TST）、チオ硫酸スルフィド：キノン酸化還元酵素（SQOR）、過硫化ジオキシゲナーゼ（ETHE1）など、宿主のH2S異化を担う主要酵素の発現レベルを調べた（図S1A）[13,39]。解析の結果、FAH-SYSUコホートのCD被験者では、tstが有意に発現低下していたのに対し、sqorは発現上昇していた。同様の傾向はHPM IBDコホートでも観察されたが、このコホートではtstはCD群と非IBD群の間で統計学的有意差には達しなかった。ethe1の発現は、FAH-SYSUとHMPの両コホートで、CD群とコントロール群に関係なく、同様であった（図S1B）。したがって、CD患者におけるH2S異化能についてさらに研究を進める必要がある。

CD患者の糞便微生物叢では、酸素非感受性ASRの方が機能的に活性が高い

CDにおけるH2S生成への腸内細菌叢からのASR経路の寄与をさらに立証するために、チオ硫酸（S2O32-2-）を唯一の硫黄源として用いたex vivo糞便培養実験を行った。DSRは厳密に嫌気性菌である硫酸還元菌で報告されているが、ASRは通性嫌気性菌や好気性菌で報告されている[40]。そこで、我々は、CDの腸内細菌叢において酸素非感受性ASR活性が亢進しているかどうかを調べるために、糞便培養を好気的にセットアップし、健常人とCD患者の糞便サンプルのH2S産生量を測定した。その結果、34検体中19検体（55.9％）でH2S産生が検出され、うち13検体で顕著な高濃度（> 10,000強度）が認められた。対照的に、健常対照者の35検体中6検体（17.1％）だけがH2S産生を示し、5検体が高レベルを示した（図2C）。このように、CD患者では酸素非感受性ASRがより活発である。

細菌のASR経路はヒトのマイクロバイオームにも広く存在する

大腸菌MG1655 [22]とサルモネラ菌ST8493 [23]のasr遺伝子クラスターと、先行研究で特徴づけられたDesulfovibrio gigasDSM 1382 [24]のdsr遺伝子クラスターを図3Aに示す。ヒト細菌におけるasr- 関連遺伝子（cysDN、cysC、cysH、cysJI、cysM、cysK、aprAB、asrABC）とdsr-関連遺伝子（dsrAB、aprAB）の分布を包括的に評価するために、これらの遺伝子を1635のヒトマイクロバイオームプロジェクト（HMP）参照ゲノムに対してスクリーニングした。この広範な解析により、asr関連遺伝子はdsrABよりも広く存在していることが明らかになった（図3B、補足データセット4）。全参照ゲノムの相当数（88.1％、1635参照ゲノム中1441ゲノム）が少なくとも1つのasr-関連遺伝子を含んでおり、主にファーミキューテス、放線菌、プロテオバクテリア、バクテロイデーテスに分布しているのに対し、dsrAB遺伝子はファーミキューテスとγ-プロテオバクテリアの0.43％（7ゲノム）にしか見つかっていない（図3B、補足データセット4）。バクテロイデーテス属のcysDN（409ゲノム）とcysC（295ゲノム）は、他のasr関連遺伝子よりも高い頻度で見つかっている。一方、cysJI（193株）とcysM（275株）は、大腸菌、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）のような通性好気性細菌を含むプロテオバクテリア（Proteobacteria）でより一般的であった（図3B、補足データセット4）。これらの観察結果は、ASR経路の実行における微生物間の協力的な相互作用の可能性を示唆している。

図3

ASR経路はヒトの微生物叢に広く分布している。A細菌におけるasr-およびdsr-関連遺伝子と遺伝子クラスターの配置。オレンジ色のORF：asr-関連遺伝子、灰色のORF：dsr-関連遺伝子。図示されていない他の遺伝子は白いORFで表されている。Bヒトマイクロバイオームプロジェクト（HMP）の1635の参照ゲノムにおけるasr-およびdsr-関連遺伝子を持つゲノムの系統学的分布。遺伝子名とゲノム名はSupplementary dataset 4に記載されている。

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同化性硫酸還元（ASR）に障害を持つ大腸菌変異体の構築

本研究では、cysJIを介するASR経路に注目した。メタゲノム解析の結果、cysJIは asrABCよりも豊富であることが示されたからである（図2A）。モデル生物として、完全なASR経路を持つことが知られている大腸菌MG1655を用いた（図4A）。cysJはSO32-2-をS2-2-に還元する亜硫酸還元酵素αサブユニット（cysIはβサブユニット）をコードし、cysMはS2-をL-システインに変換するシステイン合成酵素Bをコードしている。(図4A）。予想通り、cysJを欠損させると、SO42-を唯一の硫黄源とする大腸菌の増殖が阻害された（図4Bおよび図S2A）。大腸菌はCysMのホモログであるCysKを持っており、L-システインへのS2-の取り込みにおいてCysMを補う（図4A）。その結果、大腸菌∆cysM株は、SO42-を唯一の硫黄源とした場合、WT株と同様の生育を示した。あるいは、CysMはS2-の代わりにチオ硫酸（S2O32-）を使い、S-スルホシステインを中間体としてL-システインを生産することもできる（図4A）。そのため、大腸菌WTおよび∆cysJ変異体は、S2O32-を唯一の硫黄源として増殖したが、∆cysMは増殖速度が低下した（図4Bおよび図S2B）。

図4

cysJおよびcysMの欠損は、大腸菌のH2S硫黄生成能力を変化させ、細胞生存率を調節する。A 大腸菌MG1655硫酸同化還元経路のスキーム。B1 mM硫酸（左）またはチオ硫酸ナトリウム（右）を唯一の硫黄源とするM9培地での大腸菌WT株と変異株の生育。C 大腸菌のWT株と変異株を、硫黄源の異なるSIM培地でH2Sの定性試験を行ったところ、黒色FeSの形成が認められた。D好気的条件下で、異なる濃度のL-システインを単独硫黄源とするM9培地中で、大腸菌WT株と変異株が産生したH2Sの相対的定量試験。有意性はTukeyの多重比較による二元配置分散分析で測定した。E1 mM Na2S2O3またはNa2SO4を唯一の硫黄源として用いたM9培地中で、大腸菌WT株および変異株が産生した亜硫酸塩（SO32-）の定量。F 大腸菌WT株および変異株と共培養したNCM460細胞について、L-システイン添加（上段）またはチオ硫酸ナトリウム添加（下段）の代表的な画像と細胞死率の定量を、生細胞／死細胞の染色を用いて解析した。生細胞は緑色で、死細胞は赤色で示した。G-HCCK-8アッセイは、大腸菌WT株または変異株をあらかじめ接種した1mMNa2SO4を含むM9培地の上清で処理したNCM460細胞を用いて行った。少なくとも3回の独立した実験から得られた平均値±SEMを表示した。有意性は、Tukeyの多重比較を用いた一元および二元配置分散分析で測定した。

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様々な無機および有機硫黄源を用いて、大腸菌WT株および変異株の硫化生成能を評価した。改良Sulfur, Indole, Motility（SIM）培地では、cysJを欠損させるとL-システインからのH2S生成が増加し、cysMを欠損させるとL-システインとSO32-の両方からのH2S生成が増加することが観察された（図4C）。大腸菌WT株もL-システインからH2Sを生成し、培地がわずかに黒くなることで示された（図4C）。さらに、L-システイン濃度を変化させたM9培地で大腸菌WT株と変異株を培養したところ、すべての株が用量依存的にH2Sを産生し、∆cysJ変異株は∆cysM株やWT株よりもL-システインを硫化物に変換する効率が高いことが観察された（Fig.） 嫌気条件下では、大腸菌∆cysMは SO32-を積極的に還元してH2Sを生成した（Fig.） 一方、∆cysJ変異株は、嫌気条件下でL-システイン存在下でのH2S産生量の増加を一貫して示したが、大腸菌WT株と変異株はともに、好気条件下と比較してH2S産生量の減少を示した（図S2D）。さらに、∆cysJ変異株は亜硫酸還元酵素活性を失ったため、SO42- またはS2O32-を唯一の硫黄源とする M9 培地でSO32-を蓄積した（図4E）。これらの結果は、ASR経路の変化が無機および有機硫黄代謝の両方に与える影響を浮き彫りにした。大腸菌のWT株とASR欠損変異株では、形態学的特徴とプロテオミクスプロファイルが異なっており（Fig. S3A, B, Supplementary dataset 5）、ASR経路の改変が細菌の生理機能に大きな影響を及ぼすことが示唆された。

細菌の同化硫酸還元は上皮細胞の生存能力を調節する

細菌のASR経路の変化が大腸上皮細胞の増殖に及ぼす影響をin vitroで調べた。大腸菌WT株および変異株を、L-システインまたはS2O32-を唯一の硫黄源として、正常ヒト大腸粘膜上皮細胞株NCM460と共培養した。細胞生存率アッセイから、L-システイン存在下では、∆cysJ変異株はH2S産生の増加と同時に細胞生存率が有意に低下することが明らかになった（図4D, F）。S2O32-を唯一の硫黄源とした場合、∆cysM変異体はより顕著な細胞死を引き起こし、H2Sの生成量も増加した（図4C, F）。

∆cysJ変異体は、SO42-を唯一の硫黄源とすると培地中にSO32-をより多く蓄積することから（図4E）、このSO32-の蓄積が細胞毒性につながる可能性がある[41]。さらに詳しく調べるため、Na2SO4添加M9培地で培養した大腸菌WT株と変異株の培養上清を回収し、NCM460細胞の処理に用いた（Fig.） 細胞増殖アッセイで示されたように、∆cysJ変異株は、SO32-の高レベルと一致して、最も顕著な細胞増殖阻害を示した（図4H）。したがって、このデータは、細菌のASRがSO42-の代謝産物を通して上皮細胞の生存率を調節することを示唆している。

腸内細菌叢はDSS誘発マウス大腸炎モデルにおける血清H2Sレベルの主な要因である

IBDの主要な構成要素である大腸炎は、マウスモデルを用いて頻繁に研究されている。これらのモデルで大腸炎を誘発する方法として広く採用されているのが、飲料水によるデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）の投与である。我々の最初の目的は、H2S産生がDSS誘発大腸炎モデルと関連しているかどうかを調べることであった。その結果、DSSを投与されたマウスの血清H2Sレベルはビヒクルコントロールと比較して有意に上昇した（Fig.

図5

DSS誘発大腸炎は外因性H2S生成の増加と関連している。A正常コントロール（NC）群とDSS投与群のマウスの血清H2Sレベル。各ドットは個々のマウスを表す。NC、マウスは水を摂取していた（n = 6-7）。Bマウス大腸組織におけるcbs、cth、mpst、selenbp1の発現レベルを、DSS投与およびその後の回復期間中に評価した（GSE131032、n = 2 - 3）。P値は、ダンの多重比較を用いたノンパラメトリック一元配置分散分析により決定した。遺伝子名は図2を参照。C実験デザイン、マウスモデルのタイムライン、およびサンプリング戦略を示す模式図。D図Bに示すように、DSSに抗生物質を投与したマウス（DSS + Abx）と投与しなかったマウス（DSS）の相対体重。有意性はTukeyの多重比較による二元配置ANOVAで測定した。E-G異なる処理下にあるマウスの大腸形態（E）、大腸長（F）および血清H2Sレベル（G）。Hシスタチオニンβシンターゼ（CBS）およびシスタチオニンγリアーゼ（CTH）タンパク質レベルは、マウスの結腸上皮組織でウェスタンブロッティングにより分析した。ノンパラメトリックMann-Whitney検定は非一対比較に用いた。各ドットは個々のマウスを表す。

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以前の研究で、無菌マウスは血漿中H2S濃度が低下することが示唆されたが [42]、DSS誘発大腸炎における腸内細菌叢の全身H2S濃度への寄与は不明であった。血清H2Sの上昇と腸内細菌との関連を明らかにするために、我々は2つの研究を行った。まず、DSS誘発大腸炎を起こし、その後組織再生期を経たマウスの大腸組織トランスクリプトームデータセットを利用した（GSE131032）[43]。大腸炎期と回復期において、cbs遺伝子とcth遺伝子の発現は安定していたが、mpst遺伝子とselenbp1遺伝子の発現は大腸炎期には減少傾向を示し、回復期にはわずかに上昇した（図5B）。このことから、内因性のH2S産生はDSS誘発大腸炎中も不変か、あるいは減少していることが示唆された。したがって、観察された血清H2Sの上昇は、おそらく腸内細菌叢に由来するものであろう。次に、DSS誘発モデルマウスに広域スペクトル抗生物質（Abx）を投与したところ（図5C）、体重および結腸長測定から明らかなように、血清H2Sレベルの有意な低下とDSS誘発大腸炎の緩和が観察された（図5D-G）。cbsと cthのmRNAレベルはDSS誘発大腸炎と回復の段階を通じて安定していた（図5B）ことから、さらにAbx-challengeマウス実験でCBSとCTHのタンパク質レベルを調べたところ、2群間に有意差は認められなかった（図5H）。これらの所見を総合すると、腸内細菌叢が黄砂誘発大腸炎モデルにおける全身のH2Sレベルの上昇に中心的な役割を果たしているという説得力のある証拠が得られた。そこで、このモデルを利用して、微生物ASR経路とin vivoでの大腸炎との因果関係を調べた。

腸内細菌ASR経路は食事性硫酸塩由来の硫化物生成に寄与する

食事は腸内細菌叢の組成と代謝活性の形成に極めて重要な役割を果たしている。先行研究では主に食事性タンパク質由来の有機硫黄化合物に焦点が当てられていたが、無機硫黄（SO42-）の役割についてはまだ十分な研究がなされていない [5,27]。一般的な硫酸化多糖類の食品添加物であるカラギーナンは、UCの再発リスクと関連しており、動物モデルで腸の炎症を誘発する可能性がある [44,45]。我々は、腸内細菌叢を介するカラギーナンの分解とそれに続くH2Sの産生が、大腸炎促進作用に寄与している可能性があるという仮説を立てた。

この仮説を検証するため、まず、硫黄含有量が高い（32-39％、図6A）λ-カラギーナンを唯一の硫黄源として添加したM9培地で、大腸菌WT株および変異株を培養した。驚くべきことに、∆cysJ変異株は無機SO42-で生育できないという以前の知見とは対照的に、WT 株と変異株 の両方がH2S産生を示した（図6A）。カラギーナンは紅藻類由来のバイオポリマーであることから、∆cysJ変異体が利用できる微量の有機硫黄化合物が含まれている可能性が高い。その結果、硫黄含有量約18-20％の合成硫酸化多糖であるDSSに移行した（図6B）。

図6

腸内細菌ASR経路は食餌性硫酸化多糖由来のH2S生成に寄与する。A 大腸菌のWT株と変異株はλ-カラギーナンからH2Sを生成した。λ-カラギーナンの分子式（上）。1%λ-カラギーナンを添加したM9培地で大腸菌WT株および変異株を16時間好気的に培養した後、酢酸鉛ストリップを用いてH2Sを検出した代表例（下）。Bバクテリアを介した黄砂からのH2S産生の概略図。C3日目および5日目のマウス糞便中の黄砂残留率をabx投与群と比較。マウスの処置はFig. 一対でない比較には対のないt検定を用いた。マウスおよびヒトの糞便細菌叢による黄砂分解は、唯一の硫黄源として1％黄砂を添加したM9で試験した。細菌を接種していない培地を対照として用いた。EDSS試験によるH2S産生のフローチャート（左）。大腸菌およびP. mirabilis株によるH2S産生を酢酸鉛ストリップを用いて解析した（右）。FDSSを唯一の硫黄源として添加したM9上での大腸菌WT株および変異株の増殖。G 大腸菌WT株および変異株による黄砂分解を、1％黄砂を単独硫黄源として添加したM9で試験した。菌を接種していない培地を対照として用いた。値は少なくとも3回の独立した実験から得られた平均値±SEMである。P値は、Tukeyの多重比較を用いた通常の一元配置分散分析により決定した。

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まず、腸内細菌叢が黄砂の分解に関与しているかどうかを調べた。Abx投与マウスは、ビヒクルコントロールマウスと比較して糞便中の黄砂濃度が有意に高かったことから、in vivoでの腸内細菌叢による黄砂分解が活発であることが示唆された（図5C,6C）。マウスとヒトの便サンプルを用いた生体外実験では、一晩の培養で約35％の黄砂が消費されたことから（図6D）、微生物叢を介した黄砂分解が確認された。

我々は、黄砂の分解によってSO4 [2-]が放出され、その後、ASR経路を用いる細菌によって同化されると仮定した。この仮説を検証するため、ヒト／マウスの糞便培養液で1％黄砂を16時間培養した後、上清を回収し、大腸菌のWT株と変異株を接種する実験を開始した（図6E）。予想通り、大腸菌WT株と変異株は、あらかじめインキュベートしたDSSの存在下でH2Sを形成した。大腸菌∆cysM変異株は、統計学的有意性は得られなかったが、WT株および∆cysJ変異株よりも高レベルのH2Sを生成した（図6E）。asr遺伝子クラスターを持つP. mirabilisも同様にH2Sを生成した（図6E、補足データセット4）。大腸菌∆cysJ変異体を、黄砂を唯一の硫黄源とするM9培地で直接培養しても、増殖は見られなかった（図6F）。大腸菌WTおよび∆cysM変異体はDSSを唯一の硫黄源として生育したが、利用率は低く、DSSの分解もごくわずかであったことから、効率的な硫酸化多糖代謝のためには、細菌種間の代謝的相互摂食が重要であることが強調された（図6F-G）。

ASR経路はin vivoでDSS誘発大腸炎を調節する

Abx-cocktailを投与したSPFマウスに大腸菌WT、∆cysJおよび∆cysMを接種した後、DSSを投与した（図7A）。大腸菌∆cysJ変異体でコロニー形成されたマウスは、血清H2Sレベルおよび糞便中SO32-レベルの上昇を示し、体重減少、疾患活動性の悪化、および大腸における粘膜びらん、陰窩破壊および炎症細胞浸潤の増加を特徴とする、より重篤な腸炎によって示される疾患表現型と関連した（図7B-H）。血清H2S濃度の上昇は、大腸菌∆cysJによって触媒されるL-システインなどの有機硫黄化合物の消化管内での分解に起因すると考えられる。cysJ株でコロニー形成されたマウスでは、血漿中のウルソデオキシコール酸（UDCA）、α-およびω-ムリコール酸（MCA）が有意に減少し、コール酸-7-硫酸（CA-7S）が増加した（Fig.

図7

大腸菌ASR経路はin vivoで腸の硫酸化とDSS誘発大腸炎を調節する。A実験デザイン、マウスモデルのタイムライン、サンプリング戦略を示す模式図。B,C 大腸菌WT株、∆cysJ株、∆cysM変異株をコロニー形成したマウスの血清H2Sおよび盲腸内容物SO32-レベル。WT 群の盲腸サンプル 2 個は汚染されていたため、解析から除外した。D体重は DSS 投与後に追跡した。E実験期間中の疾患活動性。F6日目の実験終了時の大腸形態と代表的なH&E染色マウス大腸切片。G,H大腸の長さ（G）および疾患の重症度の組織学的評価（H）。Jマウス結腸切片の高鉄ジアミン-アルシアンブルー（HID-AB）染色の代表的顕微鏡写真。スルホムシンは黒色／褐色に、シアロムシンは青色に染色されている。K-L∆ cysJ、∆cysMおよびWT群のスルホムシン（K）およびスルホムシン／シアロムシン（L）面積比。Mbox-whiskersプロットは、FAH-SYSU、GSE-83687およびHMPコホートから得られたCDおよびコントロール被験者のpapss2の存在量を示した。CPMはcopy per million。中央値は中央の水平線で表される。* 各コホートにおける対照群の詳細については図2Bを参照のこと。N図7Aに示したマウスの大腸組織におけるpapss2の相対mRNAレベル。有意性は、Tukeyの多重比較による通常の一元または二元配置分散分析で測定した。ノンパラメトリックMann-Whitney検定は非一対比較に用いた。データは平均値±SEMで示した。各ポイントは個々のマウスを表す。

フルサイズ画像

cysMマウスとWTマウスでは、疾患の重症度、血清中のH2Sおよび糞便中のSO32-レベルは同程度であったが、大腸ムチン組成には有意な差が認められた。大腸粘液層は、常在細菌叢とその下にある免疫細胞との間の恒常性の維持に必須であり、主にアシドムチンで構成されている。アシドムチンは、シアル酸基または硫酸基の存在によって、シアロムチンまたはスルホムチンに大別される[47]。cysMコロニーを形成したマウスの大腸組織では、スルホムシンとシアロムシンの比率が減少しており（図 6I-K）、宿主の硫酸化がWTマウスよりも損なわれていることを示している。大腸炎予防に重要な腸の硫酸化は、宿主のPAPS合成酵素2（PAPSS2）に依存しており、PAPSS2は硫酸化のための普遍的なスルホン酸供与体であるPAPSの生成に中心的な役割を果たしている[41]。FAH-SYSU、HMPおよびGSE83687コホートから得られたトランスクリプトームデータの解析から、炎症が活発なCD患者では、非疾患および非IBDコントロールと比較して、大腸papss2遺伝子の発現が有意に減少していることが示された（図7L）。papss2を欠損したマウスは、腸内のスルホムシン含量が減少し、DSS誘発性大腸炎に罹患しやすいことが以前に証明されている[41]。従って、∆cysM-colonizedマウスにおける宿主硫酸塩の減少は、papss2のダウンレギュレーションによるものであると考えられた。実際、∆cysJ群と∆cysM群の両方で、WT群と比較してpapss2の大腸mRNA発現が減少していることがリアルタイムPCR解析で確認された（図7M）。

考察

CDやUCのような病態を含むIBDの負担は大きく、しばしば入院や外科的介入につながる[1]。現在の治療法は、主に非特異的免疫抑制剤を用いて宿主の炎症経路を標的とするものであるが、これは重大なリスクを伴う可能性があり、また必ずしも有効であるとは限らないため、代替アプローチの探求が必要とされている [48] 。H2S産生のアンバランスが、不十分でも過剰でも、CDの環境的トリガーとして作用することを示唆する証拠が増えている [29,49]。マウスモデルにおいて、H2Sドナーの投与が炎症性サイトカインの発現を抑制し、大腸炎を改善することが研究で示されている [12,50]。このことは、腸管内腔のH2S濃度を調節することが、CDを治療するためのエキサイティングな治療戦略となりうる可能性を提起している [51] 。しかし、H2SとCDの潜在的な関連性に関する研究は、ヒトの腸内における硫黄代謝に関する理解が限られているために妨げられてきた。

この知識のギャップに対処するため、我々はH2S産生における腸内細菌叢と宿主の両方の機能的能力について包括的な調査を行った。その結果、ヒト大腸内の微生物による硫黄代謝は、これまで認識されていたよりも複雑かつ広範囲に及んでいることが示唆された。独立したIBDコホートのメタゲノムデータを解析した結果、CDはASR経路を介した微生物生成の増加と関連していることが、asr関連遺伝子の存在量と有病率の増加から明らかになった。生体外糞便培養により、ASRを介したH2S発生がCD患者の便サンプルにおいて機能的に活発であることが確認された。このことは、腸壁の慢性炎症が、酸素と活性酸素を運ぶヘモグロビンの腸管内腔への放出を増加させることを示唆する「酸素仮説」と一致する [52] 。このプロセスにより、通性嫌気性菌を好む微小環境が形成される。モデル生物として大腸菌を用い、ASR経路を欠損した∆cysJおよび∆cysM変異体を作製した。我々は、in vitroおよびin vivoの研究を行い、細菌のASR経路が細胞生存能、宿主の硫酸ホメオスタシス、および大腸炎発症を調節することを検証した。我々の研究により、L-システインの利用とH2Sの生成の再構築において、ASR経路が果たす極めて重要な役割が明らかになった。大腸菌の cysJ遺伝子を欠失させると、L-システインからのH2S産生が増大する。腸内微生物によるL-システインの代謝の亢進とcysMの存在量の増加は、最近CRCと関連している[34]。我々は、asrABCがCD患者において濃縮されていることに注目した。

これまでの研究とは対照的に、我々の知見は、DSR経路がCDにおける糞便微生物の硫化生成能上昇の主な原因とは考えにくいことを示唆している。外因性H2S生成に関する先行研究では、ヒトや動物の腸内に頻繁に存在する硫酸還元菌であるDesulfovibrio属の培養と配列決定に基づき、主にDSRが中心となっていた[28,53]。しかしながら、Anantharamanら[54]は、dsrABを介した異化型硫黄代謝は、主に腸内に生息する日和見病原体であるBilophila wadsworthiaのような水平遺伝子転移に起因して、従来認識されていたよりもはるかに多様な細菌や古細菌群で予測されることを明らかにした。その結果、Desulfovibrioの定量だけに頼るのではなく、dsr遺伝子クラスターの定量に基づいてDSRを介したH2S生成を予測する方がより合理的である。腸内細菌叢はH2Sを生成するだけでなく、硫化物：キノンオキシドレダクターゼや過硫化物ジオキシゲナーゼを用いてH2Sを酸化する能力も持っている[55,56]。腸内細菌叢の硫黄代謝を包括的に理解するためには、さらなる研究が必要である。

複数のIBDコホートから得られた腸管生検のトランスクリプトームデータの解析から、CD患者では内因性硫化産生能が低下していることが明らかになった。これは主要遺伝子、特にcbs、cth、mpst、selenbp1のダウンレギュレーションから明らかである。cbs欠損の小児における重篤なCD症状が報告されている[57]。cbs mpstと selenbp1の発現低下は、UCとCDにおける炎症誘発性腸管バリア傷害の悪化に関連している [58,59,60]。動物実験では、大腸炎における内因性H2S生成の重要な役割を強調する新たな証拠が得られている。MPST-/-マウスおよびMPST±マウスは、DSS誘発大腸炎を増悪させた [59]。β-シアノアラニン、プロパルギルグリシン、O-カルボキシメチル-ヒドロキシルアミン半塩酸塩などのCBSおよびCTH阻害剤を用いた内因性H2S合成の阻害は、マウスモデルにおいて大腸炎を悪化させることが証明されている [12]。免疫不全とH2S合成の障害には相関関係があることが確認されている。IL-10がIBD患者の粘膜免疫寛容の維持に重要な役割を果たしていることは、多くの研究で証明されている [61] 。FlanniganらのIL-10-/-マウスを用いた研究では、自然に大腸炎を発症し、大腸H2S合成が著しく障害されていることが明らかになった。この障害は、遺伝子組換えIL-10の投与によって回復し、IL-10とH2S合成との相互作用が確認された［62］。

IBDの病態生理に対する食事因子の潜在的な寄与を調べるために、かなりの努力がなされている [63,64]。遺伝的、環境的、微生物的、免疫学的因子の相互作用により、食事はIBDの病因において極めて重要な要素となっている [65] 。主に無機硫酸塩とメチオニン、システイン、タウリンなどの含硫アミノ酸(SAAs)から摂取される食事性硫黄が重要な役割を果たしている [5,27]。しかし、食事中の硫黄含有量の推定では、カラギーナンや硫化剤（例えば、重硫酸カリウム、重硫酸ナトリウム）など、硫黄を含む食品改質剤や添加物が考慮されていないことが多い [66]。無機硫酸塩の1日摂取量は、1.5～16.0mmolと推定されている [66]。興味深いことに、糞便中の硫酸塩(および硫化物)の排泄量は食事からの摂取量に比べてごくわずかであることから、硫酸塩は宿主と腸内細菌叢の両方によって腸内を通過する間に糞便から積極的に除去されることが示唆される [67]。硫酸化多糖類であるカラギーナンには、カラギーナンの種類（κ、ι、λなど）や抽出に使用する海藻の種類にもよるが、約15%から40%の硫黄が含まれている [68]。カラギーナンは、西洋の食事において食品添加物として広く使用されており、その消費量は、IBDの有病率の上昇と並行して、過去50年間で大幅に増加している [69] 。CDの寛解を誘導する食事介入に成功した例では、カラギーナンを含む加工食品が除外されており、カラギーナンがIBDの炎症を誘発または増悪させる可能性があるという考えをさらに裏付けている [70] 。動物モデルにおいて、カラギーナンの投与は一貫して、ヒトのIBDに類似した腸潰瘍を病理組織学的に誘発する [45] 。我々は、カラギーナンが分解される際に放出されるSO42-が腸内微生物によって利用され、IBDの病態形成に寄与していると推論した。そこで、カラギーナンに含まれる有機硫黄に起因する合成硫酸化多糖類DSSを用いた。DSS誘発大腸炎モデルは、IBDで見られる上皮障害を一貫して模倣することで知られており、食事要素、腸内細菌叢、疾患発症の間の複雑な相互作用を強調している [46] 。DSSマウス大腸炎モデルは、遺伝的に同一のマウス間でも、また異なるマウス施設間でも、そのばらつきの大きさで知られている。最近の研究で、腸内細菌叢がこのモデル内のばらつきを助長する上で重要な役割を果たしていることが判明した [71]。

in vivoおよびex vivoの研究を通じて、我々は腸内細菌叢が黄砂を分解してSO42-を放出し、細菌のASR経路に燃料を供給できることを実証した。この微生物による硫黄代謝の変化は、最終的に疾患の重症度を調節する。我々の研究は、食事性硫酸塩代謝と大腸炎感受性における腸内微生物のASR代謝の重要な役割を明らかにした。無機硫酸塩の日常的な摂取量が多いこと、および加工食品に食品添加物として使用されているカラギーナンによって微生物のH2S産生が悪化し、粘膜障害を引き起こす可能性があることを認めることは重要である。さらに、CDの病因が単一菌種の存在と活動のみに起因するとは考えにくいことも注目に値する。ASR経路に関連する遺伝子は、ヒト細菌間で様々な分布パターンを示した。さらに、黄砂の分解において、マウスとヒトの糞便微生物群集は大腸菌単独培養よりも効率的であり、硫酸化多糖の効率的な代謝のために、異なる細菌種間での交雑摂食が行われていることが示唆された。

まとめると、本研究は微生物の硫黄代謝経路の広範な多様性を明らかにした。これらの知見は、主にASR経路を介した腸内微生物によるH2S生成の増加とともに、CDと内因性H2S生成の減少との関連を強調している。微生物のASRを介した食事性硫酸代謝は、大腸炎における重要な因子として浮上している。従って、微生物による同化性硫酸塩還元の恒常性を維持することが不可欠である。システインレギュロンの制御とCDへの影響を解明するためには、さらなる研究が必要である。我々の研究は、食事、腸内細菌叢、無機硫酸塩代謝の間の複雑な相互作用に光を当て、CDを管理するための有望な治療標的としての可能性を強調するものである。

材料と方法

被験者

すべての研究プロトコールはヘルシンキ宣言の原則を遵守し、中山大学第一付属病院の倫理委員会の承認を得た。腸管生検と便検体はFAH-SYSUコホート研究（2016年[113]）の一環として採取した。被験者の便検体はFAH、SYSU消化器科クリニックで採取し、直ちに-80℃で保存した。培養アッセイのために、糞便サンプルを採取し、10％（w/v）グリセロール溶液に糞便を再懸濁することにより10％（w/v）糞便スラリーとなるように希釈し、アリコートを-80℃の低温バイアルで使用まで保存した。すべての群に適用された除外基準は以下の通り：最近（3ヵ月未満前）の抗生物質療法の使用、現在の極端な食事（例えば、非経口栄養またはマクロビオティック食）、既知の悪性腫瘍の病歴、現在のプロバイオティクスの摂取、永久的な残渣を残す消化管手術（例えば、胃切除、肥満手術、大腸切除）、または重大な肝疾患、腎疾患、消化性潰瘍疾患。

ヒトマイクロバイオームプロジェクト（HMP）参照ゲノムにおけるasr-およびdsr-関連遺伝子の解析

HMPリファレンスゲノム（2023年6月30日現在1635ゲノム）を選択し、Joint Genome Instituteウェブサイト（https://img.jgi.doe.gov/）のIMGプログラムを通じて解析した[72]。機能（Supplementary dataset 1）を用いて、選択した全参照ゲノムに対して「機能プロファイル」を実施し、asr-およびdsr-関連遺伝子を持つものを同定した。ヒットは手作業で検査した。硫化生成遺伝子を持つゲノムを選択し、NCBI分類学に基づいてphyloT(https://phylot.biobyte.de/)を用いて系統樹を作成し、iTOL [73]を用いて可視化した。ゲノムと遺伝子のIMG IDはSupplementary dataset 4に掲載されている。

メタゲノム解析

ShortBRED [31]を用いて、FAH-SYSU (BioProject: PRJNA793776) [74]およびPRISM (BioProject: PRJNA400072) [3]データセットから得られたメタゲノム中のH2S生成に関与する遺伝子の存在量を正確にプロファイリングした。まず、同定された細菌の硫化生成遺伝子のセットをクエリー配列としてまとめた（Supplementary dataset 6）。その後、ShortBRED-Identifyを使用して、UniRef90（2023年5月）を参照リストとして、85％のクラスターID閾値で、これらの主要な細菌性硫酸生成遺伝子配列のマーカーを生成した。これらのマーカーをShortBRED-Quantifyに適用し、KneadDataワークフロー(http://huttenhower.sph.harvard.edu/kneaddata)による品質管理を経たペアメタゲノムの遺伝子量を評価した。ShortBRED-Quantifyの出力は、100万個あたりの読み取り数（reads per million reads per kilobase million (RPKM)）で表した。

野生型細菌および変異体の培養

大腸菌MG1655野生型、変異体（ΔcysJおよびΔcysM）およびProteus mirabilisATCC 29906を、トリプトン（10 g- L-1）、酵母エキス（5 g- L-1）およびNaCl（10 g-L-1）を含むルリアブロス（LB）で培養した。大腸菌野生株と変異株の増殖の特徴を調べるため、5 mL のLB中で37 ℃、振盪培養器（250 rpm）で一晩培養し、3,000 × g、10分間の遠心分離でペレットを回収した。細胞ペレットを洗浄し、新鮮なM9培地（接種 サイズ1：20、v/v）に再懸濁した。このM9培地は、NaCl（0.5 g-L-1）、KH2PO4（3 g-L-1）、Na2HPO4-12H2O（6 g-L-1）、NH4Cl（1 g-L-1）、MgCl2（95 mg-L-1）、CaCl2（11.1mg-L-1）およびグルコース（0.1％、w/v）を含んでいた。1mMのNa2SO4、Na2S2O3、L-システインまたはDSSを唯一の硫黄源として用いた。各チューブから指示された時点で200μLのサンプルを採取し、平底96ウェルプレート（各ウェル200μL）で600nmの光学濃度を測定した。上清中の亜硫酸塩は、亜硫酸塩の定量セクションに記載されているように定量した。

大腸菌MG1655におけるΔcysJおよびΔcysMの対立遺伝子交換突然変異誘発

標的遺伝子の上流および下流領域に相当するDNA断片（〜1 kb）を増幅し、続くオーバーラップPCRを用いて2つの断片を融合させ、In-Fusion HD Cloning kit（Clontech社製）を用いて、カナマイシン耐性カセット、oriT（mob）、sacBカウンター選択マーカーおよびR6K複製起点を保有する自殺プラスミドにライゲーションした。ライゲーションした自殺プラスミド（pKmobSac）をドナー株である大腸菌S17 λpirに形質転換した。並行して、大腸菌MG1655をoriR101複製起点を持つ温度感受性アンピシリン耐性プラスミド（p101-Amp）で形質転換した。次に、この自殺プラスミド（pKmobSac）をコンジュゲーションにより大腸菌MG1655に形質転換し、得られたコンジュガントをアンピシリン100ng/μL（大腸菌S17ドナー細胞に対する選択）およびカナマイシン50ng/μLを含むLB寒天プレート上で室温でスクリーニングした。次に、1つのシングルクロスオーバーインテグレーターを選択し、LSW-Sucrose寒天プレート（トリプトン10g/L、酵母エキス5g/L、グリセロール5mL/L、NaCl 0.4g/L、スクロース100g/L、寒天20g/L）[75]に再度ストリークし、アンピシリンを100ng/μLで添加し、正しいダブルクロスオーバーミュータントを選択した。その後、1つの変異体を選択し、再度播種し、サンガー配列決定とアンピシリン存在下での生育能力（カナマイシンは含まない）を通して、結合プラスミドの消失を確認した。その後、ノックアウト大腸菌MG1655変異体を37℃で培養し、p101-ampプラスミドから治癒させた。

H2Sの定量

血漿中のH2S濃度は、改良メチレンブルー法を用いて定量した。簡単に説明すると、100μLの血漿サンプルにZnACを加え、H2S、HS-、S2-および血漿タンパク質を沈殿させた。その後、130μLの2％N, N-ジメチル-p-フェニレンジアミンと130μLの20％トリクロロ酢酸を加えてZnSペレットを再溶解した。メチレンブルーの形成はFeCl3-6H2Oの添加によって開始され、分光光度計を用いて665nmで定量した。微生物培養のH2Sレベルは、ModifiedSulfur,Indole,Motility(SIM)-medium とLead Acetate Test Stripを用いて定量した。詳細はオンライン補足資料を参照。

デキストラン硫酸定量

マウス糞便ペレット中のDSS濃度を測定するため、サンプル分注（50μL）をサイズ排除カラム（SEC-150、3μM、7.8×300mm、Welch、Cat # 00237-21052）に注入し、流速1.5mL/分で溶出した。移動相は、25 mMKH2PO4、25 mM K2HPO4-3H2O、50 mM KCl、および10%エタノールから成る。溶離液はポストカラム誘導体化装置（LABRAT、LYM-1060）を通過し、そこでオンラインミキサーに接続されたポンプAによって直接供給される10μg/mLのジメチレンブルー塩化亜鉛二塩（DMB、Sigma、34108）と混合した。検出は波長530nmのVWD検出器を用いて行い、データはOpenLAB CDSクロマトグラフィーデータソフトウェア（1260 Infinity II、Agilent、香港、中国）で収集した。

亜硫酸塩の定量

150μLの培養上清または盲腸スラリー抽出物を350μLの蒸留水および10μLの10M NaOHと混合した。パラロサニリン法に基づくTotal Sulfite Assay Kit（JC-HX-04、HK、China）を用いて、製造者の指示に従って亜硫酸塩を定量した。反応は赤紫色の複合体パラロサニリンメチルスルホン酸を形成し、550nmに最大吸収を示した。吸光度はプレートリーダー（UV-2450、SHIMADZU、日本）を用いて10分間のインキュベーション後に測定した。

細胞培養と生存率アッセイ

NCM460ヒト結腸上皮細胞株（RRID：CVCL_0460）は、10％ウシ胎児血清（FBS；Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）、100μg/mLペニシリンG、100μg/mL硫酸ストレプトマイシン（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を添加したRPMI1640基本培地（Gibco, Thermo Fisher Scientific, MA, USA）で維持した。細胞は5%CO2加湿インキュベーター内で37℃で培養した。

細胞の生存率は、製造元の説明書に従い、生細胞/死細胞染色またはCell Counting Kit-8 (CCK8, GLPBIO, GK10001)により分析した。生細胞/死細胞染色では、96穴マイクロプレート中のNCM460細胞（4×103/ウェル）を100μLの1640培地で48時間培養した。PBSで洗浄後、細菌共培養用に細胞を調製した。大腸菌株をLB中37℃で一晩培養し、硫黄を含まないM9培地で洗浄後、L-システインまたはNa2S2O3を唯一の硫黄源とするM9培地に再懸濁した。細胞をこれらの細菌と2時間共培養した（1ウェルあたり150μLの細菌培養）。その後、細胞を30μLのカルセイン-AM/PI作業溶液（2μMのカルセイン-AMと4.5μMのヨウ化プロピジウム）で37℃、20分間染色し、続いて0.4%のポリホルムアルデヒドで固定した。実験は4重反復で行い、細胞の画像はオリンパスIX83蛍光顕微鏡（オリンパス、東京、日本）を用いて取得・解析した。実験はすべて四重反復で行った。陽性細胞の割合と平均蛍光強度は、Image-Pro Plus 6.0を用いて決定した。CCK8アッセイでは、NCM460細胞（5×103/ウェル）を96ウェルマイクロプレートで一晩培養し、唯一の硫黄源として2mM Na2SO4を添加したM9培地培養の細菌上清50μLで処理した。6時間培養後、細胞を洗浄し、100μLのRPMI1640培地と10μLのCCK-8試薬でインキュベートし、450nmの吸光度をモニターした。すべての実験は6反復で行い、細胞を含まないブランクウェルがコントロールとなった。

動物実験

雄のSPF C57BL/6マウス（6-8週）を標準的な齧歯類用飼料（Synergy Bio, AIN-93 M, Jiangsu, China）で飼育した。この研究で使用したマウスはすべて、孫中山大学第一付属病院の動物施設で繁殖・飼育した。マウス（n = 6）には抗生物質カクテル（Abx）[76]を5日間投与した後、2％DSSを6日間飲水に自由摂取させた。Abxを前処理しないマウス（n = 6）をビヒクル対照とした。3日目と5日目の糞便サンプルは、0.05gの新鮮な糞便を500μLのPBSと混合し、3分間ボルテックスした後、14,000×gで10分間遠心分離することにより処理した。上清は、黄砂定量の項に記載されているように、黄砂定量に使用した。大腸菌経口投与実験では、Abx-waterを投与したマウスに大腸菌野生株および変異株をそれぞれ1.0×109cfu/200μLずつ経口投与した。DSSは飲料水に3%(w/v)で6日間添加した。盲腸を採取し、「亜硫酸塩の定量」の項に記載された方法で亜硫酸塩を定量した。

マウスは体重、便の硬さ、便の出血について毎日モニターした。マウスはDSS投与5～6日後に頚椎脱臼により安楽死させた。大腸サンプルは、組織学的、ウェスタンブロットおよびqRT-PCR分析のために採取した。詳細はオンライン補足資料を参照。

λ-カラギーナンとDSSからの細菌のH2S産生

LB開始培養から細菌を回収、洗浄し、1% λ-カラギーナンを含む5 mLの無硫黄M9培地に接種し（接種サイズは1:200、v/v）、浮遊酢酸鉛ストリップでH2S生成をモニターしながら37℃で一晩培養した。菌液を含まない培地を陰性対照として設定した。

黄砂の分解を評価するため、マウスとヒトの糞便サンプル（CD被験者2名と健常人2名）を10 mLのLB培地（OD600 = 1.0）で培養した。細菌ペレットを、1％DSSを含む5mLの無硫黄M9培地に懸濁した。上清中のDSSレベルはSEC-HPLCで測定し、H2S産生は懸濁酢酸鉛ストリップでモニターした。

大腸菌WT株、変異株、およびP. mirabilisによる黄砂からのH2S産生を調べるため、培養液を10mLのLB培地で37℃、250rpmで一晩培養した。細胞を回収後、1mLの硫黄を含まないM9培地に懸濁した。前述したように、1% DSSを添加したM9培地の上清と2人のCD被験者の培養液を用いて、プレインキュベートDSS培地を調製した。その後、このプレインキュベートDSS培地200μLと1％DSS添加無硫黄M9培地に50μLの細菌培養液を接種した。インキュベーションは、硫化物定量用の酢酸鉛ストリップ（硫化物定量、酢酸鉛ストリップの項を参照）を備えた96ウェルプレートで37℃で行った。

統計分析

統計解析はPrism v.8.0（GraphPad）を用いて行った。2群間比較の場合、統計的有意性は、指示されたように、対応のないt検定またはノンパラメトリックMann-Whitney検定によって決定した。多 群間比較は、ほとんどの研究でANOVAにより行った。各データポイントは、個々のヒト被験者、動物、または生物学的複製を示す。

データおよび資料の入手可能性

すべての研究データは、論文および/またはSI Appendixに含まれている。データは公開のオープンアクセスリポジトリで入手できる。ハイスループット配列決定による遺伝子発現プロファイリングデータは、Gene Expression Omnibusのアクセッション番号（GSE83687およびGSE131032）およびBiostudiesのアクセッション番号（E-MTAB-54674）に寄託されている。PRISMのメタゲノム配列はBioProject番号PRJNA400072でSRA経由で入手可能。FAH-SYSUコホートの生のメタゲノミックデータはNCBI公開リポジトリに寄託された（Bioproject #PRJNA793776 ）。HMP IBDのメタゲノムおよびトランスクリプトームデータはhttps://ibdmdb.org/tunnel/public/summary.html。FAH-SYSUコホートの生のRNA-seqデータは、Genome Sequence Archive [77] in National Genomics Data Center [78], China National Center for Bioinformation/Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences (GSA-Human: HRA007763)に寄託され、https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human。本研究で作製されたすべてのプラスミド、細菌変異株、および試薬は、Material Transfer Agreement（材料譲渡契約）を締結した上で、リードコンタクトから入手可能である。本論文で報告されたデータの再解析に必要な追加情報は、要請があれば主担当者から入手可能である。

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参考文献のダウンロード

謝辞

孫文大学第一附属病院Research Computingの計算資源、メンテナンス、サポートに感謝する。また、中山大学第一附属病院質量分析コアラボ、特にYuanmei Yeの質量分析への協力に感謝する。

資金提供

本研究は、中国国家自然科学基金（82341217：M.C.、82100577：Y.Z.、82270579：R.F.、82370551：M.C.）、広西自然科学基金（2024GXNSFFA010009：R.F.）の支援を受けている。

著者情報

著者情報

  1. Wanrong LuoとMin Zhaoは本研究に等しく貢献した。

  2. Minhu Chen、Rui Feng、Yijun Zhuも同様に本研究に貢献した。

著者および所属

  1. 孫文大学第一附属病院消化器科、中山二路58号、1209室、広州市、510080、中国Wanrong Luo, Liyuan Xiang, Xueting Wu, Shu Xu, Xiaozhi Li, Minhu Chen & Rui Feng

  2. 中国広東省広州市中山大学第一附属病院精密医学研究所羅完栄、楊高、朱毅軍

  3. 中国広東省深圳市深圳第3人民病院消化器科Min Zhao

  4. クリーブランド・クリニック、ラーナー研究所、心臓血管・代謝科学部門、クリーブランド、オハイオ州、USAMohammed Dwidar

  5. クリーブランド・クリニック、マイクロバイオーム・ヒトヘルスセンター、クリーブランド、オハイオ州、USAAMohammed Dwidar

  6. ワーヘニンゲン大学バイオインフォマティクスグループ、オランダ、ワーヘニンゲンMarnix H. メデマ

  7. 英国、コベントリー、ウォーリック大学、生命科学部Hendrik Schäfer

  8. 中国、広東省広州市、教育省、中山大学ヒトマイクロバイオーム・慢性疾患重点研究室朱怡君

貢献

M.C.、M.D.、R.F.、Y.Z.が研究を計画し、W.L.、M.Z.、W.X.、R.F.、S.X.、X.L.、Y.G.が研究を実施し、W.L.、M.Z.、M.D.、X.L.がデータを解析し、M.D.、M.H.M、H.S.、Y.Z.が論文を執筆した。

連絡先

Minhu Chen、Rui FengまたはYijun Zhuまで。

倫理申告

倫理承認と参加同意

研究プロトコルは、孫中山大学第一附属病院の倫理委員会（2016[113]）により審査・承認された。すべての参加者から書面によるインフォームドコンセントを得た。すべての動物実験は、孫中山大学第一付属病院のInstitutional Animal Care and Use Committee（IACUC）（2021年[303]、2023年[183]）によって承認されたプロトコールのもとで実施された。

出版に関する同意

該当なし。

競合利益

著者らは競合する利益はないと宣言している。

追加情報

出版社ノート

シュプリンガー・ネイチャーは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っている。

補足情報

補足資料1

補足資料2

権利と許可

オープンアクセスこの記事は、クリエイティブ・コモンズ表示4.0国際ライセンスの下でライセンスされています。このライセンスは、原著者および出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられた場合にその旨を示す限り、いかなる媒体または形式においても、使用、共有、翻案、配布、複製を許可するものです。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、その素材へのクレジット表記に別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれています。この記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれていない素材で、あなたの意図する利用が法的規制によって許可されていない場合、あるいは許可された利用を超える場合は、著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを閲覧するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。クリエイティブ・コモンズ・パブリック・ドメインの権利放棄（http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/）は、データへのクレジット表記に別段の記載がない限り、この記事で利用可能となったデータに適用される。

転載と許可

この記事について

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Luo,W.、Zhao,M.、Dwidar,M.他、微生物同化硫酸還元を介したH2S：クローン病発症における見過ごされた役割。Microbiome 12, 152 (2024). https://doi.org/10.1186/s40168-024-01873-2

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  • 2024年3月27日受領

  • 受理2024年7月13日

  • 2024年8月16日発行

  • DOIhttps://doi.org/10.1186/s40168-024-01873-2

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