Selenomonas sputigenaは幼児う蝕の空間構造とバイオフィルムの病原性を媒介する病原体として機能する

発行：2023年5月22日
Selenomonas sputigenaは幼児う蝕の空間構造とバイオフィルムの病原性を媒介する病原体として機能する

https://www.nature.com/articles/s41467-023-38346-3

チョウ・フニョン
ジー・レン
...
ヒョン・クー
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ネイチャーコミュニケーションズ14巻、記事番号：2919（2023） この記事を引用する
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144 Altmetric
指標詳細
要旨
Streptococcus mutansは、小児う蝕（虫歯）の主要な病原体であるとされている。多種の微生物群集の役割は評価されているが、他の微生物が積極的に寄与しているか、あるいは病原体と相互作用しているかは依然として不明である。ここでは、未就学児416名（男性208名、女性208名）の歯肉縁上バイオフィルム（歯垢）のマルチオミクスを発見・検証パイプラインに統合し、疾患に関連する種間相互作用を同定しました。メタゲノム-メタトランスクリプトミクス解析により、小児う蝕と関連する16の分類群。マルチスケールイメージングとビルレンスアッセイを用いて、Selenomonas sputigena、Prevotella salivae、Leptotrichia wadeiのバイオフィルム形成ダイナミクス、空間配置、代謝活性を、単独またはS. mutansとの比較により検討した。我々は、これまで歯肉上バイオフィルムにおける役割が不明であった鞭毛嫌気性菌であるS. sputigenaが、連鎖球菌のエキソグルカンに捕捉されて運動性を失いながらも活発に増殖し、ハニカム状の多細胞超構造体を構築してS. mutansを包み、酸生成を促進することを明らかにした。齧歯類モデル実験により、S. sputigenaが歯肉上歯面をコロニー形成する能力が認識されていないことが明らかになった。S.sputigenaは単独ではう蝕を引き起こさないが、S.mutansと共感染すると、in vivoで広範囲の歯エナメル病変を引き起こし、病気の重症度を悪化させる。このように、我々は、既知の病原体と協力して独自の空間構造を構築し、バイオフィルムの病原性を高める病原体を発見し、ヒトの一般的な疾患において発見した。
はじめに
バイオフィルム形成性病原体は、多くのヒト感染症やバイオ医療機器・インプラントの汚染に関与している1、2、3。確立された病原体は、バイオフィルムの生活様式や病原性の発現を促進する創発的な特性を示すが、多くの場合、種間相互作用の証拠が増えつつある多細菌群集に存在する4,5. 様々なマイクロバイオームの中でも、ヒトのプラークバイオフィルムコミュニティは、口腔粘膜バリアとミネラル化した歯の表面に多様なマイクロバイオータを抱え、健康や病気を調節する上で重要な役割を担っていますが、まだ十分に評価されていません6. マイクロバイオーム・ワイド・アソシエーション研究により、口腔疾患に関与する新たな微生物種が発見されているが、そのほとんどは、診療所や歯科治療を受けている患者から採取した少量のサンプルから得られたものであり、特定された微生物種の原因的役割はほとんど未解明であった。口腔内バイオフィルムにおける微生物の相互作用の分類学的および機能的側面について、コミュニティベースのサンプルで包括的に調査することが必要である。このような研究は、集団に関連する新たな病原体を発見するだけでなく、新たな病原体メカニズムや種間相互作用に光を当てることができるかもしれません。
う蝕（虫歯）は、バイオフィルムを介する広範な疾患であり、食生活に影響されるため、世界中で約6億人の子供が罹患しており、依然として未解決の主要な公衆衛生問題である7. この病気は複雑な病因を持つが、一般的には、宿主と食事に依存した歯組織の脱灰プロセスであり、生物群集の異常と多細菌による酸生成に依存していると理解されている4、8。Streptococcus mutansはグラム陽性菌で、バイオフィルム形成性、酸性菌、酸欠菌であり、小児う蝕と臨床的に関連し9、動物モデルでう蝕を引き起こすことが示されており10、重要な口腔病原体として確立されている11。また、Scardovia wiggsiaeや、Streptococcus gordoniiやStreptococcus oralisなどのmitis群連鎖球菌などの他の細菌分類群は、S. mutansと連携したり拮抗したりすることが報告されている12,13。歯面上の他の微生物種もう蝕と関連しているが14,15,16,17、それらが積極的な貢献者なのか、不活性な同居人なのか、あるいは病原体18としてS. mutansと相互作用して疾患発症を促すのか、依然として明らかではない。
う蝕の微生物基盤に関するこれまでのエビデンスのほとんどは、標的培養法、培養ベース法、または16Sリボソーム遺伝子ベース法から得られたものであった。基礎的な情報を提供する一方で、この知識ベースは、DNAseqベースのメタゲノミクス（MTG）、およびRNAseqベースのメタトランスクリプトミクス（MTX）を用いて大幅に増強することができ、微生物の分類と機能活性に関するより深い洞察を得ることができます。次世代シーケンサーを採用した数少ない研究は、小規模な臨床サンプル19,20で行われ、メカニズム的な検証はほとんど行われていない。一方、イメージング技術の進歩により、多種類のバイオフィルムにおける空間的に構造化された群集が明らかになり、相互作用する微生物の空間的配置や位置関係（すなわち、生物地理学）についてのより良い理解が求められている21,22。これらの制約を克服し、基礎的な知識を得るために、私たちは、疾患関連微生物分類とその相互作用を研究するために、コミュニティベースの研究からの臨床データおよび情報学的発見とin vitroおよびin vivo実験モデルを統合したマルチモダリティ、発見-検証パイプラインを開発しました（図1）。
図1：本研究で採用した手法の概要。
本調査で採用した多方面からの発見・検証実験手法の設計の概要。
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本研究の結果、Selenomonas sputigena、Prevotella salivae、Leptotrichia wadeiは、歯肉縁上バイオフィルムにおいてこれまで認識されていなかった役割を持つ種であり、小児期に流行する細菌性疾患の病因に関連する機能レパートリーや相互作用を持っていることが明らかになりました。また、唾液中に存在し、歯周ニッチマイクロバイオーム23のメンバーとして一般的に報告されている鞭毛性グラム陰性嫌気性細菌S. sputigenaが、歯肉上バイオフィルム微生物群に重要な役割を持ち、小児う蝕と強く関連しているという意外な発見もあった。我々は、運動性のS. sputigenaがS. mutansが産生する細胞外グルカンマトリックスに捕捉されて運動性を失い、急速に増殖して多細胞のハニカム状の足場を形成し、溶連菌の細胞クラスターを包み込んで、う蝕の主要な病原因子である酸産生を促進することを明らかにする。また、S. sputigena単独ではう蝕を引き起こさないが、S. mutansと共感染した場合、齧歯類モデルで歯のエナメル質の広範囲な空洞化を引き起こし、疾患の重症度を著しく高めることを実験的に検証しています。この現象は、小児歯科疾患の病態解明を大きく前進させるとともに、他の多菌感染症における病原体と病原体の相互作用の確立にも示唆を与えるものと思われる。
研究成果
小児う蝕と関連する確立された分類群および新規分類群
MTG（＝全ゲノムシークエンスショットガン）およびMTX（＝RNAseq）データにおいて包括的な分類学的関連解析を実施し、臨床的に測定された小児う蝕経験に有意に関連する16の細菌種を同定しました。この16種の疾患関連菌の同定には、厳密な多重検定（すなわち、偽発見率、FDR）制御の、形質横断的基準を用いました。具体的には、局所的（歯垢を採取した歯面を考慮したう蝕経験歯面数）および人レベル（歯列全体を考慮したう蝕経験歯面数）の両方で測定した定量的疾患経験と、DNAおよびRNAデータにおいて、発見サンプルセット（n = 300 children）および同様の年齢の子どもの独立サンプル（n = 116、図2および補足表1）で再現できる証拠がある、統計的有意差を示す分類が必要であった。S. mutans (beta = 0.51 ± 0.21, p = 2.6 × 10-6)は、既知かつ期待される容疑者として、う蝕経験と強く関連することが明らかになった。その他の有意な関連分類群としては、P. salivae（β=0.31±0.14、p=8.5×10-6、DNAベースの種分類学的存在量と局所のう蝕経験の関連）、S. sputigena（β=0.53±0.22, p=3.1×10-6）L. wadei（β=0.41±0.15, p=2.2×10-7） Veillonella atypica（β=0. 41 ± 0.18, p = 1.1 × 10-5）、Lachnospiraceae bacterium oral taxon 082（β = 0.30 ± 0.15, p = 1.1 × 10-4）、Stomatobaculum longum（β = 0.36 ± 0. 22, p = 1.6 × 10-3）、Lachnoanaerobaculum saburreum（β = 0.43 ± 0.17, p = 9.6 × 10-7）、Centipeda periodontii（β = 0.31 ± 0.21, p = 3.8 × 10-3）。これらの関連はMTGとMTXのデータで一貫しており（補足図1）、予想通り、MTGとMTXでは分類学的に隣接する重要な分類群（Leptotrichia属やPrevotella属など）の存在量に高い相関性が見られた（図3）。S. mutansは、16種の有意な分類群の中で唯一のStreptococcusであり、他の15種の分類群との相関は最も小さかった。例えば、MTXにおけるS. mutansの平均相関は健康時と疾患時の両方で0.09であったのに対し、L. wadeiはそれぞれ0.50と0.49、S. sputigenaは0.45と0.38である。
図2：口腔内微生物種とう蝕の関連性
発見（n = 300人の子供）サンプルにおけるMTGおよびMTX分析でう蝕経験と有意に関連した23種の存在量とう蝕経験の間の関連性の推定値。関連の大きさは、対数正規モデル係数（2値う蝕状態間の各生物種の対数存在レベルの差）で測定し、両側Wald検定を実施した。これらの種のうち16種が再現サンプル（n = 116人の子供）で関連性の証拠を示し、図では名前で注釈している。括弧内は公称p値で、*, **, ***はそれぞれ再現標本における公称p値が0.1未満、0.05未満、0.01未満であることを示しています。効果量とその95％信頼区間は、補足情報のソースデータファイルで入手可能である。斜線はy = xを表す。同じ色の分類群は同じ属に属する。下線を引いた4つの分類群は、in vitroのビルレンスアッセイ、バイオフィルム研究で優先され、in vivo実験の候補となった「上位種」である。
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図3：口腔内微生物種間のペアワイズ相関関係。
歯の健康状態（すなわち、局所的なう蝕経験なし）と疾患（すなわち、あらゆる局所的なう蝕経験）において、MTGとMTXにおける有意な16種の存在量間の一対相関（すなわち、バッチ効果と年齢の項を含む定量的局所う蝕経験の対数正規モデルから生成した残差のピアソン相関）。括弧内の数値は、個々の生物種の他の15種との平均相関である。
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バイオフィルムのトランスクリプトームでは、新規の分類群が関与している場合、解糖がアップレギュレートされている。
MTXのう蝕経験と有意に関連する経路として、解糖IV、酢酸と乳酸へのピルビン酸発酵II、3-デヒドロキネートからコリスメート生合成、UDP-N-アセチル-D-グルコサミン生合成I、イノシン5'-リン酸生合成III、メナキノール8生合成IIスーパーパスウェイの6つが現れた（補論表2）。注目すべきは、これらの経路のうち最初の4つは、重要な16種のうち1つ以上が関与していることである。解糖IVは、発現量が最も多い経路の1つであり（全体では3位）、疾患に関与する酸生成の重要な経路で、S. sputigena、L. wadeiおよびさらに4種の重要な種が関与している。ピルビン酸の酢酸と乳酸への発酵にはL. saburreumが関与し、その著しいダウンレギュレーションは、酸性齲蝕を促進するバイオフィルムにおけるピルビン酸の利用可能性が低下し、S. mutansによって優先的に消費される可能性があることと一致する。さらに、L. wadei、C. periodontii、S. sputigena、V. atypicaが関与するUDP-N-アセチル-D-グルコサミン生合成Iは、ペプチドグリカンの合成と細胞増殖に重要であることが、アップレギュレートされている。また、L. wadeiとS. mutansという重要な生物種の比率が最も高い経路であるラクトース・ガラクトース分解Iも、統計的に有意ではないものの、疾患において発現量が増加した（Supplementary Fig. 2）。
病原性・バイオフィルム研究のために新たに候補となった3つの病原体
次に、マルチモーダル検証パイプライン（図1ステップ6-8）に進むことが現実的に可能な病原体のサブセットに優先順位をつけることにしました。本研究において、ビルレンス、バイオフィルム、in vivoの各実験で十分な特性評価が可能な候補のショートリストを選択するために、発見サンプルにおける関連性の統計的証拠（すなわちp値）、独立した複製証拠、異なる属の代表（すなわち1属1種）、および臨床分離株の入手を考慮しました。これらの基準に基づき、重要な16種のリストから、S. mutans（既知の確立された病原体）、S. sputigena、P. salivae、L. wadei（新しい候補）を優先した。これらの4つの分類群（以下、「上位種」）は、in vitroでの病原性評価とバイオフィルムの特性評価に引き継がれ、さらにin vivoでのコロニー形成と病原性試験の候補となった。
種間代謝の相互作用とアシドーシス
歯の表面の脱灰を引き起こす酸性の微小環境を形成するためには、バイオフィルム微生物叢内の細菌病原体が、酸性化した環境（酸性化）で生存しながら、スクロース（虫歯に関連する主な糖）などの食物糖を効率的に代謝し、酸（酸性化）を生成する必要があります24。我々はまず、上位の種が酸性生成性と酸性化性の両方を持つという病原性プロファイルに当てはまるかどうかを判断しようとした。
各菌種単独での解糖系pH-dropアッセイ（図4A1）、および新候補菌と既存のS. mutans菌との組み合わせ（図4A2）により、すべての菌種がスクロース存在下で活発に酸生成し、pHを強酸性値、すなわちエナメル脱灰25を引き起こすpH 4.3～5.5 に低下させ、疾患関連歯垢バイオフィルム転写体で糖分解の発現が上昇したことと一致した。S. mutansが最も酸性化し、L. wadei、P. salivae、S. sputigenaがそれに続いた（図4A1）。興味深いことに、S. mutansとS. sputigenaの組み合わせは、S. mutans単独よりも有意に高い平均酸生成率を示し（図4A2）、最も急速にpHを下げる結果となった。これらの結果は、S. mutansとS. sputigenaの共代謝関係の可能性を示唆するものである。
図4：上位種の代謝・酸生成プロファイル。
上位種は、S. mutans、S. sputigena、L. wadei、P. salivae。それぞれの種は単独またはS. mutansと組み合わせて培養した。A1 12時間の解糖系アッセイにおける単一種培養の平均プロトン産生率。A2 混合種培養（S. mutans＋新種）およびS. mutans単独培養の12時間の解糖系アッセイにおける平均プロトン生成率。B1 耐酸性は、各菌種が生存可能な最低開始pHと最終pH（48時間後）で示した。 B2 混合菌種が生存可能な最低開始pHと最終pH（48時間後）。C1 単一種培養の代謝活性（μW）の曲線。個々のピークの上にあるデータは、各生物種の代謝活性のピーク時間を示している。C2 混合種培養（S. mutans＋新種）とS. mutans単独培養の代謝活性（μW）曲線。SM, S. mutans; SS, S. sputigena; LW, L. wadei; PS, P. salivaeの6〜18時間における代謝曲線を挿入。A1およびA2については、データは3回の独立した実験による平均値±標準偏差でプロットし、有意なp値をバーの上に記した（p < 0.05 は、一元配置分散分析とポストホック Tukey HSD テストによる）。 nsは、統計的に有意ではない差（p > 0.05）を示す。
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4種とも酸性培地（pH5.5）で生育可能であり、う蝕病変の発生に必要な酸性条件への耐性があることが示された。単培養体の耐酸性を調べたところ、すべての種が初期pH5.5で増殖し、さらにpHを4.8〜4.6に下げることができた（図4B1）。特に、S. sputigena、L. wadei、P. salivaeをS. mutansと共培養した場合、酸耐性はより高く、開始pH5.2で増殖し、48時間後にはpHを3.9から4.2の範囲まで下げる能力を示した（図4B2）。特に、S. sputigenaとS. mutansの混合培養は、48時間後の最終pHが3.9と最も低くなった。
上位種の混合培養では、S. mutansが代謝活性を支配している
次に、リアルタイム等温マイクロカロリメトリーを用いて、上位種のスクロース代謝活動によって放出されるエネルギー（総熱量）を、単独で、および新規候補3種をS. mutansと共培養した場合の特性として調べた。単培養では、S. mutansが最も高い代謝活性のピークと速度を示し、活性とピークまでの時間が最も早かったが、代謝活性が急速に低下することを反映して、最も短い減衰時間を示した（図4C1）。一方、S. sputigenaの代謝活性は49時間後にピークを迎え、ゆっくりと減衰することから、嫌気性細菌であるL. wadeiは2番目に高いピークを示した。S. sputigena、L. wadei、P. salivaeとS. mutansの共培養では、代謝ピークがS. mutansの単独培養のピークに近かった（図4C2）ことから、共培養では病原体が代謝を支配していることがわかる。
以上のことから、S. sputigena、L. wadei、P. salivaeは、既知のS. mutansと並んで、酸性の性質と酸性生成の性質を示すことが判明した。すべての種は、主要な疾患関連食餌糖であるスクロースを代謝し、解糖系アッセイで酸を生成し、結果として生じる酸性pHで生存できる。代謝活性はS. mutansが牽引しているが、S. sputigenaを添加すると、S. mutans単独よりも酸の生成が速くなり、酸性度が著しく高くなることが予想外に判明した。このことは、S. mutansとS. sputigenaの間に、病原性バイオフィルムの形成に有利な協力関係がある可能性を示唆している。
S. mutansはS. sputigenaのコロニー形成とバイオフィルムの形成を促進する。
う蝕は、バイオフィルムを介した疾患の代表例であり、歯面への微生物のコロニー形成と構造化されたバイオフィルム群集の形成によって発症する27。我々は、唾液でコーティングしたハイドロキシアパタイトディスク（sHA、歯のエナメル質の代用品）と共焦点ライブセルイメージングを用いた実験モデルを開発し、上位4種のバイオフィルム形成能を調査した。S. mutansは、歯にバイオフィルムを形成する優れた能力で知られるよく知られた病原菌であるため28、L. wadei、P. salivae、S. sputigenaの単独およびS. mutansと組み合わせたバイオフィルム形成能力の調査に焦点を当てました。その結果、新種候補はsHA表面を共棲し、S. mutansは24時間後に構造的だが形態的に異なる混合種バイオフィルムを形成することがわかった（図5A上段）。一方、いずれの新種も単独で効率よく表面に定着し、バイオフィルムを形成することはできず、表面には単細胞（L. wadeiとP. salivae）または小さな細菌群（S. sputigena）しか見られなかった（図5B）。また、S. mutansとの混合バイオフィルムとして培養すると、それぞれの新種がより多く存在することが確認された（図5A下段）。これらの結果は、バイオフィルムに最適化された計算画像解析ツールボックス29を用いて、表面に結合した細胞量を定量化することでさらに裏付けられました（図5A下段および図5B）。実際、S. mutansと共培養した場合、24時間後にハイドロキシアパタイト表面にL. wadei、P. salivae、S. sputigenaの量が同じ種単独と比較して多く確認され（図5C）、S. mutansが存在すると表面のコロニーができやすいことが示されました。特に、S. mutansと共培養した場合、表面コロニー形成したS. sputigenaは、L. wadeiやP. salivaeよりも高い（10倍以上）増加を示したことから、種間相互作用はS. sputigenaのコロニー形成やバイオフィルム形成を著しく促進する可能性が示唆された。
図5：歯に似せた表面でのバイオフィルム形成と空間構造化
A S. mutansとともに各新種が形成した唾液コーティングハイドロキシアパタイト表面上の24時間混合種バイオフィルムの共焦点画像（上面図および側面図）。上段は、混合バイオフィルム内のS. mutans（緑色）と新種（赤色）の空間構造を示す統合画像である。下パネル、赤チャンネルのみ。CパネルAおよびBの計算画像解析に基づく、単一および混合バイオフィルム内の新種のバイオボリューム。 D上部は混合バイオフィルムの拡大共焦点画像、下部は新種が細胞外α-グルカンマトリクス（EPS、シアン色）と物理的に相互作用する様子。E 新種とS. mutans細胞またはEPSの計算による共焦点化解析。SM, S. mutans; SS, S. sputigena; LW, L. wadei; PS, P. salivae。スケールバー、20μm。CとEについては、データは3回の独立した実験からの平均値±標準偏差でプロットされ、有意なp値はバーの上に記されている（p < 0.05は、両側スチューデントt-テストによる）。nsは、統計的に有意ではない差（p > 0.05）を示す。
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単一および混合バイオフィルムの成長ダイナミクスをさらに理解するために、初期段階（すなわち、4時間）と中間段階（すなわち、10時間）での付着力を評価した。その結果、S. sputigena、L. wadei、P. salivaeは、単独でもS. mutansとの共培養でも、4時間後に同様に表面に結合した（補足図3、上）。興味深いことに、共培養した場合、S. sputigenaは10時間後に混合バイオフィルム中のS. mutansの凝集体の近くにクラスターを形成するように見える（補足図3、中、白矢印）。これはバイオフィルム形成時の2種間の初期の物理的相互作用が示唆された。これらのことから、S. mutansとの密接な相互作用や共代謝といった結合後の事象が、後の段階、すなわち24時間後のバイオフィルム空間構造やコミュニティ形成を媒介すると考えられる（補足図3、下）。
バイオフィルム内の種間空間構造化と共局在化
S. mutansは細胞外多糖類（EPS）を産生し、細菌細胞の共接着とバイオフィルムの蓄積を促進することから30、3つの新しい候補種、S. mutans、およびEPSの空間的局在を調査した。高解像度の拡大画像から、L. wadei、P. salivae、S. sputigenaの細胞の多くは、連鎖球菌のクラスター（マイクロコロニーと呼ばれる）の間に空間的に位置しており、むしろ中のS. mutans細胞と混在していた（図5D、上段）。興味深いことに、S. sputigenaが密集して集積しているのに対し、L. wadeiやP. salivaeはこれらの領域にまばらに生息していることがわかった。S. mutans由来のEPSα-グルカンを特異的に標識する蛍光マーカー28を用いると、L. wadei、P. salivae、S. sputigenaの細胞のほとんどが細胞外高分子マトリックスと共局在することがわかった（図5D、下段）。
空間的近接性の定量的尺度であるManderのオーバーラップ係数を用いて、2つの蛍光シグナルの互いに対する共局在を特徴付けるために、3次元解析を行った31。それぞれの混合種バイオフィルムについて、2つのマンダース係数を計算した： 1）各新種とS. mutansの間、2）各新種とEPSの間。その結果、L. wadeiとS. sputigenaはS. mutansよりもEPSに近接しており（図5E、左・右パネル）、これらの種はS. mutans細胞よりもEPSに主に関連している可能性が示唆された。一方、P. salivaeはS. mutans細胞およびEPSに対して同様の近接性を示した（図5E、中央パネル）。以上のことから、新規候補菌はS. mutansと混合バイオフィルムを形成し、この共存によって表面コロニー形成と構造化バイオフィルムの共発達を促進することがわかった。S. sputigenaは、S. mutansのクラスター間に散在する密なコミュニティを形成し、高度に凝集した共集バイオフィルムを導く。
運動性のある細菌S. sputigenaは、連鎖球菌のエクソグルカンに捕捉される。
S.mutansの存在下でS.sputigenaの表面コロニー形成が促進され、この種の組み合わせが酸性度を高めることを動機として、我々は混合種バイオフィルム内でのS.sputigenaの空間構造を明らかにすることを目指した。背景として、S. sputigenaはもともと、唾液を含む消化器系、歯周炎患者の歯肉下微生物叢32,33,34、および歯内感染35で発見されました。最近のう蝕の進行と阻止に関するin vivo実験研究36で得られたバイオフィルムでは、セレノモナス多種の群集が一般的であった（すなわち、上位10種の豊富な分類群の中にあった）。歯肉縁上バイオフィルムにおけるその役割や、他の微生物との相互作用については、依然として不明である。
多くの口腔内微生物とは異なり、S. sputigenaは鞭毛を持ち、これは液状環境での運動を可能にする表面に付着した付属物である。その結果、S. sputigenaの細胞は、sHA表面でコロニー形成した後も運動性を示し、ハイドロキシアパタイト表面に付着したまま、転がるような多方向の運動（補足動画1）をすることがわかりました。我々は、リアルタイムライブイメージングと計算機によるモーショントラッキングを用いて、S. mutansと共培養したときのS. sputigena細胞の表面運動性を調べた（図6A、Bおよび補足動画2）。個々のS. sputigena細胞の空間座標を各時間フレームで追跡し、時間分解した軌跡を作成した（図6Bに代表的なフレームを示す）。その結果、S. sputigena細胞は、S. mutansとの相対的な空間位置に応じて、特徴的な運動挙動を示すことがわかった。図6Cの上段（図6Aの「Box a」と同じ領域）では、S. mutans細胞の近くにいるS. sputigena細胞は運動性を示さない（図6C上）。一方、S. mutansから離れた場所にあるS. sputigena細胞は運動性を維持していた（図6C下段；図6Aの「Box b」と同じ領域）。また、個々のS. sputigena細胞の元の位置からの累積変位量（全経路長）を計算した。この変位曲線から、S. mutansに隣接するS. sputigena細胞の多くは動かないか短い距離しか動かない（図6D左）のに対し、S. mutansが近くにいないものは長い距離を活発に動くことがわかった（図6D右）。
図6：運動する細菌であるS. sputigenaが細胞外のα-グルカンに捕捉されるようになった。
A 表面に形成されたS. sputigena-S. mutans混合バイオフィルムの共焦点画像。赤がS. sputigena、緑がS. mutans。点線枠は、S. sputigenaがS. mutansクラスターと物理的に結合したバイオフィルム部分（a）または表面に付着したS. sputigena単独部分（b）である。B 表面付着した微生物は、蛍光染色とリアルタイム共焦点顕微鏡で可視化した。個々のS. sputigena細胞（パネルAの赤チャンネル）を経時的に計算で追跡し、時空間軌跡を作成した。C パネルAに示したエリア(a)と(b)の表面に付着したS. sputigena細胞の軌跡。色は個々の細胞から発生した軌跡を示す。D 初期位置からのS. sputigena細胞の累積変位量（全経路長）。左はエリア(a)におけるS. sputigena細胞の累積変位、右はエリア(b)におけるS. sputigena細胞の累積変位。E S. mutans由来のα-グルカンマトリックスに捕捉されたS. sputigenaの固定化された細胞。赤：S. sputigena、シアン：α-グルカンマトリックス。上段は、α-グルカンに捕捉されたS. sputigena細胞は移動性を示さない。下段は、グルカノハイドロラーゼ（デキストラナーゼとムタナーゼ）によるEPS分解により、S. sputigena細胞の表面移動性は回復する。F初期位置に対するS. sputigena細胞の累積変位量（全経路長）。左はコントロール群におけるS. sputigena細胞の累積変位、右はEPS酵素分解後の変位。SM, S. mutans; SS, S. sputigena. 3回の独立した実験からの代表画像を示す。スケールバー、10μm。
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S.スプティゲナ細胞の運動性が異なる空間的位置で対照的であることから、表面の運動性を失ったS.スプティゲナ細胞は、S.ミュータンス由来のEPSに物理的に捕捉されている可能性があると考えられた。まず、EPSのα-グルカンと共局在するS. sputigena細胞を追跡したところ、その細胞は運動性を失っていることがわかった（図6E、上段）。次に、抗菌活性37を持たないα-グルカンを特異的に加水分解するグルカノヒドラーゼ（ムタナーゼ、デキストラナーゼ）を用いてEPS分解を行い、S. sputigenaの運動挙動をリアルタイムで観察した。その結果、α-グルカンの分解後にS. sputigenaの表面運動性が回復することを発見した（図6E、下段に示す軌跡）。これらの観察結果は、グルカノヒドロラーゼ処理前後の運動性を計算機で追跡することで確認され（図6F）、EPS分解によって捕捉されたS. sputigena細胞が解放され、表面の運動性が回復することが示された。さらに、S. sputigenaの単一種バイオフィルムは、α-グルカンを生成するS. mutans由来の外酵素である精製グルコシルトランスフェラーゼB（GtfB）を外添した存在下で形成した30。GtfBを添加して培養したS. sputigena細胞（S. mutansを含まない）は、酵素が生成したα-グルカンに捕捉され、表面運動性を示さなかったが、Gtfなしで培養したS. sputigena細胞の多くは運動性を示した（補足図4Aの軌道、補足図4Bの置換曲線）ことから、EPSによる捕捉と運動性の低下がさらに確認された。
S.mutansと表面を共培養することで、S.sputigena細胞は運動性を失い、種間細胞-グルカンマトリックス相互作用によって固定化されるように見えるが、生存と活性は維持されている。これは、混合バイオフィルム群集の足場に影響を及ぼす可能性のあるこれらの運動性細菌の表面結合と蓄積を高める可能性がある。私たちのバイオフィルムMTXデータは、これらの観察結果を裏付けている。まず、S. mutansのgtfC遺伝子（グルカン合成に関与するグルコシルトランスフェラーゼGtfCをコード）とグルコース-1-リン酸アデニルトランスフェラーゼ遺伝子が、疾患において著しく発現が上昇することがわかった（補足表3）。gtfCは、本研究の運動性実験で使用したデキストラナーゼ（可溶性グルカンを分解）やムタナーゼ（不溶性グルカンを消化）による分解を受けやすい可溶性と不溶性のα-グルカン30を合成する酵素をコードしている。次に、S. mutansとS. sputigenaの遺伝子-遺伝子発現相互作用のうち、いくつかのネガティブなものを発見した。興味深いことに、13の遺伝子間相互作用のうち11が陰性であり、S. mutansのグルコース-1-リン酸アデニルトランスフェラーゼ遺伝子は、S. sputigenaの運動性に関わるフラジェリン遺伝子と強い陰性相互作用を示した（p = 3.7 × 10-6）（補足表4）。
インタクトなバイオフィルム構造におけるS. sputigenaとS. mutansの空間的配置
S.mutansはS.sputigenaの歯面へのコロニー形成を著しく促進し、その表面運動性を調節することができることを考慮し、この共コロニー形成コミュニティが多長さスケールでのバイオフィルム空間構造（バイオジオグラフィー）をいかに媒介するかを調査した。この目的のために、超解像共焦点顕微鏡と、混合バイオフィルム群集の計算機解析38を併用した。その結果、S. mutansのマイクロコロニーをS. sputigenaの細胞が高密度に包むという、ユニークな3D多細胞構造を発見しました（図7A）。レイヤーバイレイヤーイメージングによる断面観察では、生体構造の全高にわたってS. sputigena細胞が整然と配列していることがわかった（図7B）。この3次元生体構造の代表的な断面図（表面からz = 15μm）を見ると、主にS. mutansによって形成された内核と、S. sputigenaのリング状の外層が空間的に分離し、いずれもEPSα-グルカンと関連していた（図7C）。バイオ構造の質量中心（セントロイドと呼ぶ）に対する微生物とEPS成分の組成と空間的な構造化を調べた（図7Dの図参照）。その結果、セントロイド付近の中心部にはS. mutansが多く、周辺部にはS. sputigenaが多く生息していることが分かりました（図7E、左・中パネル）。特に、S. mutans由来のEPSα-グルカンは、S. mutans細胞の存在量が少ない周辺部を含む生体構造全体から検出された（図7E、右パネル）。このことは、分泌されたEPSが種間集合の足場となり、細胞間の直接接触なしに共接着を媒介できることを示している。
図7：S. sputigena-S. mutansバイオフィルムの生物地理学的特徴。
A S. sputigena（赤）がS. mutansの細胞群を包み込む蜂の巣状の構造で構成された混合バイオフィルム。両種ともEPSα-グルカンマトリックス（シアン色）で包まれている。 B 混合バイオフィルムの光学的切片から、バイオフィルム内でS. mutans（緑）とS. sputigena（赤）が物理的に分離していることがわかる。C S. sputigena、S. mutans、EPSの空間的配置を示す断面共焦点画像。S. mutans由来のEPS（シアン）はS. mutansのインナーコアクラスター（緑）の内側と外側の両方に存在し、S. sputigena細胞（赤）は主に外側でEPSに埋め込まれながらS. mutansクラスターを包む D 生物地理と空間解析に参照した質量セントロイドの図。E S. sputigena、S. mutans、EPSの空間分布（セントロイドまでの距離に対する相対値）。線は3つの独立した実験からの平均値、斜線部は標準偏差に対応する。3つの独立した実験から得られた代表的な画像を示す。SM, S. mutans; SS, S. sputigena. スケールバー：20μm。
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バイオフィルムの構造組織をさらに評価するために、共焦点画像の3D再構成と細菌細胞の空間分布の定量分析を行った。この解析により、S. sputigenaの細胞が多細胞の上部構造を形成するユニークなハニカム状の構造が明らかになった（図8Aおよび補足動画3）。細菌細胞の空間分布を明らかにするため、大規模な混合種生物構造をミクロン単位の小さな立方体に計算で分解し、各立方体内のS. sputigena細胞の相対存在量（すなわち、全細胞体積に占める割合）を、その3次元空間座標に対応させて算出した29。3次元空間分解能で局所的な分布を得ることができるこの方法を用いると、生体構造物の外表面全体（図8Bに示す水平面または垂直面のうち選択した面）付近でS. sputigenaの存在量が高いことが分かった。これらの結果は、S. sputigenaとS. mutansの細胞が密集しながらも空間的に分離したバイオジオグラフィーを持つ非ランダムなパターンを示しています。以上のことから、運動性細菌であるS. sputigenaが、共収穫種（S. mutans）が産生する外来EPSによって固定化され、局所的に増殖・蓄積を促進し、マトリックス足場に導かれた特徴的な多細胞ハニカム上部構造を形成する証拠を発見しました。
図8：バイオフィルム上部構造内のS. sputigenaの空間分布。
A S. sputigena-S. mutans混合バイオフィルム内でS. sputigenaが形成するハニカム構造の3次元レンダリング。B 異なる水平面（上）および垂直面（下）における、群集構造内のS. sputigenaの空間分布（相対的存在量、S. sputigenaが占める全細胞体積の割合として定義）。スケールバー、20μm。
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S. sputigenaが介在する種間空間構造化は、バイオフィルム病原性の強化に必要かつ特異的である。
バイオフィルムがう蝕の発生に重要な酸性微小環境を作り出すために、空間構造化が必要かどうかを調べるために、バイオフィルムとアパタイトの界面のpHをその場で測定しました。pH応答性蛍光プローブ39と高解像度共焦点ライブイメージングを用いて、リアルタイムでpHの変化を測定した。その結果、S. sputigenaとS. mutansが形成する上部構造のバイオフィルム-アパタイト界面が、グルコース暴露後に急速に酸性化し、強酸性（pH < 5.5）の領域が形成されていることがわかった（補足図5A、上）。S.mutans由来のEPSα-グルカンは、種間接着を媒介するバイオ構造全体から検出された（図7C、E）ことから、S. mutansのgtfBとgtfCのダブルノックアウト（すなわち、α-グルカンの生産不全30）により、S. sputigenaとのバイオフィルム空間構造化を破壊しました。その結果、S. sputigenaとS. mutansのΔgtfBC変異体は構造化されたバイオフィルムを形成できず、酸性pH領域には至らなかった（補足図5A、中）。この結果は、S. sputigenaと野生型S. mutansを、α-グルカンを特異的に分解するグルカノヒドラーゼ（デキストラナーゼとムタナーゼ）の存在下で共培養すると、細菌の生存率に影響を与えずにバイオフィルム構造を解体し、局所的に酸性pH領域を形成する能力を損ない、さらに裏づけられた（補足図5A, 下）。このデータは、S. sputigenaとS. mutansの間の種間空間構造化が、病原性酸性微小環境の形成に必要であることを示唆している。
さらに、生体外ヒト歯エナメル質バイオフィルムモデルを用いて、バイオフィルムの病原性を促進するS. sputigenaとS. mutansの相互作用の特異性を検討した。この方法では、バイオフィルムによって引き起こされたエナメル質表面の酸による損傷（すなわち脱灰）を直接評価することができます40。P.salivaeはS.mutansと共培養してもプロトン産生率が上昇しないことから（図4、A2）、P.salivae-S.mutans共培養をコントロールとして用い、S. sputigena-S. mutansバイオフィルム、およびS. mutans単独による酸によるエナメル質脱灰と比較しました。マクロ的には、S. mutans-S. sputigenaバイオフィルムに関連したエナメル質の脱灰が広範囲に認められ、立体視では臨床的に認められるう蝕病巣と同様に、カルキ状の不透明な表面で特徴付けられた（補足図6A、左下）。一方、P. salivae-S. mutans（補足図6A、左中）およびS. mutans単独（補足図6A；左上）のバイオフィルムからは、エナメル質表面に不透明な脱灰領域がわずかに認められただけだった。これらの違いは、共焦点トポグラフィーイメージングとトランスバースマイクロラジオグラフィー解析で確認された。
S. mutans-S. sputigenaバイオフィルム下のエナメル質表面は、S. mutansバイオフィルムおよびP. salivae-S. mutansバイオフィルムからのものと比較して高い粗さを示し（補足図6C、「エナメル質表面の粗さ」；p < 0.05）、表面損傷領域が広がっていた（補足図6A、下右側）。一方、P. salivae-S. mutansバイオフィルムからの表面粗さは、S. mutans単独からの表面粗さと同様であり（補足図6C；p＞0.05）、どちらも穏やかなエナメル質表面の脱灰を示した（補足図6A右）。横断マイクロラジオグラフィー解析により、脱灰したエナメル質病変の程度が検証され、P. salivae-S. mutansまたはS. mutansバイオフィルムに対して、S. mutans-S. sputigenaバイオフィルムによるミネラル損失が有意に高く、酸損傷が深い（p < 0.05 ）ことが示された（補足図6B、C）。以上のことから、S. sputigenaとS. mutansの相互作用の特異性とバイオフィルムの病原性を促進する空間構造化が示唆された。
S. sputigenaは、in vivoで歯面をコロニー化し、う蝕の発生を増加させることができる。
これまで紹介したin vitroおよびex vivoの実験データは、S. sputigenaがアパタイト表面でS. mutansと結合して高度な構造を持つ高密度のバイオフィルムを形成できること、そしてその組み合わせがどちらかの種単独よりも多くの酸やエナメル質の脱灰をもたらすことを示している。したがって、これらの菌が歯面を共棲し、生体内で強化されたバイオフィルム病原性を示すと予想するのは論理的である。この仮説を実験的に検証するために、私たちは、S. sputigena単独で、あるいはS. mutansと共感染した場合（図9A）に、歯面をコロニー化し、虫歯を引き起こすかどうかを、糖分の多い食事や虫歯の多発といった幼児期う蝕の特徴を模倣した確立したげっ歯類モデルに基づいて明らかにしようと試みた41（図9B）。その結果、S. mutans、S. sputigena、またはその両方に感染し、持続的に感染していることがわかった（図9C）。これは、種特異的なプローブを用いたリアルタイムPCRによって判定された。非感染（コントロール）動物は、S. mutansやS. sputigenaに感染しないままであった（図9C）。また、すべての動物が健康状態を維持し、群間で有意差はなく、安定した体重増加を示した（図9D）。これらのデータは、S. sputigenaがin vivoでS. mutansと歯のエナメル質表面を共培養する能力を持つことを確認するものである。
図9：う蝕におけるS. sputigenaとS. mutansの役割に関するin vivo研究。
A 実験デザインの図。B 動物の歯に、小児期の重度の虫歯で臨床的に見られるような、陥没した（重度の）う蝕病変が発生した。C qPCRによる感染の確認。21日目、24日目、30日目に口腔スワブを採取し、種特異的プローブを用いたqPCR解析に供した。D 実験期間中、細菌の感染が動物の健康に及ぼす系統的な影響をモニターするため、動物の体重を毎週測定した。グループ間で有意差は認められなかった。E 平滑面に発生した総う蝕（虫歯）のKeyesスコアリングを行った。F 平滑面に発生した空洞化（重度）病変のKeyesスコアリング。カリエススコアは、KeyesのスコアリングシステムをLarsonが修正したもので、カリエス病変の重症度の段階と程度を記録した。データは、平均値±標準偏差で示した。(n = 8匹）、有意なp値はバーの上に記載した（p < 0.05, one-way ANOVA with post hoc Tukey HSD testより）。nsは、統計的に有意ではない（p > 0.05）ことを示す。
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次に、う蝕の発生と重症度に対する影響を、各実験条件について評価した。このモデルでは、歯のエナメル質にう蝕病変（ヒトで観察されるものと同様）が進行し、初期の脱灰領域から中程度の病変、そしてエナメル質構造の損傷と空洞化を特徴とする広範囲の（すなわち重度の）病変へと進行する。先行研究42,43と同様に、S. mutansの感染によりう蝕が発症したのに対し、天然の口腔微生物群を保有する未感染動物では、重度の病変はなく、軽度の脱灰が認められた（図9E）。また、S. sputigenaを感染させた場合、菌の定着が確認されたにもかかわらず、未感染のコントロールと比較して、歯面にう蝕病変が発生しなかった（図9E）ことから、S. sputigena単独では、う蝕原性には限界があると考えられる。しかし、S. sputigenaとS. mutansを共感染させると、どちらかの菌種を単独で感染させた場合と比較して、総う蝕経験値とう蝕病変の重症度が有意に増加した（図9E）ことから、居住微生物群における病原性の増強が示唆された。特に、共感染では、エナメル質の破壊と率直な齲蝕（図9B）を特徴とする、より重度の病変（図9F）が生じることがわかった。以上のことから、S. sputigenaはS. mutansと相互作用して共棲を促進し、S. sputigenaの存在により、病原性を強化した独自の構造のバイオフィルムを形成し、in vivoで重篤な歯科疾患の発症を引き起こすことが示された。これは、疾患を引き起こす状態を促進する新しいパソビオントと種間バイオジオグラフィーが示唆された。
考察
本研究では、2つの地域密着型臨床コホートから得られたヒト歯垢サンプルのマルチオミクスを、情報科学、実験室、in vivo実験モデルを組み合わせた発見・検証パイプラインに統合し、病原体候補を特定するとともに、これらの未特性種がどのように相互作用して病原性口腔バイオフィルムを形成するかについての洞察を得ました（図10）。包括的な分類学的関連解析と多重試験制御による臨床特性横断的基準により、幼児う蝕と有意に関連する16種が同定され、その中にはいくつかの新規候補も含まれていた。その中でも、S. mutans（確立した病原体）、S. sputigena、P. salivae、L. wadei（新しい候補）は、疾患と強く関連していたため、包括的バイオフィルム研究に引き継がれた。その結果、鞭毛を持ち運動するS. sputigenaは、S. mutansと協調的な相互作用を行い、バイオフィルムの病原性を悪化させることを発見した。具体的には、S. sputigenaとS. mutansはアパタイト表面を共棲し、糖を代謝し、酸を産生し、耐性を持つことができる。この2つの種が一緒になると、酸産生と酸性度が著しく高まる。この相互作用は、S. sputigenaが連鎖球菌のエキソグルカンに取り込まれ、運動性を失い、蜂の巣状の多細胞構造を高密度に構築することによって裏打ちされる。S. mutansのグルコース-1-リン酸アデニルトランスフェラーゼ遺伝子とS. sputigenaのフラジェリン遺伝子44を含むいくつかの遺伝子とのMTXにおける負の相互作用は、実験研究で示された種間相互作用を裏づけるものであった。また、S. sputigenaは単独では病気を引き起こさないが、S. mutansと共感染すると、生体内のバイオフィルムの病原性を著しく高め、う蝕の重症度を増加させる。S. sputigenaは、これまで歯周病23,45、歯内感染35に関与しており、また、がん46,47の予後を左右する気道消化管マイクロバイオームのメンバーであることが知られている。今回の発見は、S. sputigenaが典型的な生息地以外の場所で病原体として働き、小児疾患の流行という背景から、歯肉縁上バイオフィルムの生物地理（すなわち空間構造）、代謝活性、病原性を調節していることを実証しています。
図10：本研究における多方面からの発見・検証パイプラインの適用例。
今後の口腔マイクロバイオーム探索・検証研究の指針となる、本研究の実験手法の概要。まず、地域密着型の2つの未就学児の臨床サンプルで得られたヒトプラークサンプルから得られたマルチオミクスデータの解析と統合を行いました。そして、最初の発見結果を、インフォマティクス、実験室、in vivoの実験モデルを組み合わせた検証パイプラインに進め、病原体の候補を特定し、これらの未特定の種がどのように相互作用して病原性の口腔バイオフィルムを形成するかについての洞察を得ることにした。
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私たちは、大規模なコミュニティベースの幼児サンプルで生成された堅牢な臨床データとマルチオミクスデータを活用し、保守的な選択基準を用いて、疾患経験に関連する細菌種を特定し、特性評価と実験的検証のための候補の優先順位を導き出しました。この種のマルチオミクス研究としてはサンプルサイズが大きく、厳格な発見・検証基準を適用した結果、既知および新規の分類群を含む、う蝕経験に関連する高信頼度の細菌種が得られました。この16種のうち4種を包括的に調べることができましたが、この高信頼性候補のセットは、近い将来、私たちや他の研究者によってさらに研究されることが予想されます。バイオフィルムのトランスクリプトーム解析では、代謝経路（解糖、ピルビン酸発酵、UDP-N-アセチルグルコサミンなど）や細菌遺伝子（グルコース-1-リン酸アデニルトランスフェラーゼなど）が疾患において著しく上昇することが確認されました。これらの知見は、う蝕に見られると予想される微生物叢と食物糖の代謝的相互作用と一致する24。糖質は、生態系の変化に適応できる種の増殖を促し、ミネラル化した歯組織の破壊の根底にあるバイオフィルム微小環境の酸性化を促進することで、ディスバイオシスの出現を助長する。この2つの生物種の間の酸性化の促進、UDP-N-アセチル-D-グルコサミン生合成Iのアップレギュレーション、MTXにおける遺伝子間相互作用は、S. sputigenaがう蝕に関連した歯垢バイオフィルムにおける重要種であるという根拠を強める36．
本報告では、S. sputigenaとS. mutansの協調的な相互作用は、通常歯肉縁下（歯肉の下の方）のニッチに生息すると報告されている運動性の細菌が、歯肉縁上（歯肉の上の方）に生息する別の種によって作られる外高分子マトリックスに取り込まれ、病原性を高める独自の空間バイオフィルム構造を形成するという予想外の現象にかかっている、ということが重要であった。アパタイト表面に固定化されたS. sputigena細胞とその周囲のS. mutans細胞クラスターが密集して成長することで、どちらの種だけでも達成できない凝集性の高いコミュニティ超構造を形成することを示す。さらに、S. sputigenaの固定化と混合群集の空間的構造化が、う蝕におけるバイオフィルムの病原性の特徴である強酸性pHの局所的領域の形成に関連していることを明らかにした。S. sputigenaが運動性を失い、高密度のハニカム構造を形成する正確なメカニズムは不明であるが、S. mutans由来のEPSα-グルカンが重要な役割を果たすと考えられている。S. sputigenaは、鞭毛の構成要素であるフラジェリンを高グリコシル化したものを発現している44。S. sputigenaの表面の糖鎖がグルカン結合性を示し、連鎖球菌のエキソグルカンと相互作用して、細胞を固定化させている可能性がある。さらに、フコースはS. sputigena flagellinのO-結合型糖鎖の主要な単糖成分であり44、同じ発見サンプルの最近のメタボロミクス研究では、幼児う蝕においてフコースの存在量が増加することが示されている48。S. mutansが分泌するグルコシルトランスフェラーゼ（Gtfs）は、他の微生物の表面にある異なる多糖の糖部分に結合し、その場でEPSα-グルカンを生成できる49。Gtfがフコース部位に結合することで、その場でグルカンを合成し、固定化に寄与している可能性が考えられる。今後、GtfとS. sputigenaの相互作用、グルカン-フコースの相互作用、およびこれらの相互作用が菌株依存的であるかどうかを調べる必要がある。
S. sputigenaは、これまで遺伝子操作に難渋しており、種間バイオフィルム相互作用におけるフラジェリンの機能など、その病原性役割をさらに深く理解するための分子生物学的研究を妨げてきた。しかし、制限修飾のないツール50を用いた新しい遺伝子工学の方法論は、この制限を回避できるかもしれない。S. sputigenaの他にも、いくつかの新種が追加研究の対象として浮上した。例えば、L. wadeiとP. salivaeは、我々の発見コホートと再現コホートにおいて、ともにう蝕経験と強く関連しており、必ずしもS. mutansと関連していない多菌バイオフィルムの文脈で病原性の役割を果たす可能性があり、将来的に調査する可能性がある。また、Lachnoanaerobaculum saburreumは、グルコース、ラクトース、スクロースなどの糖類から酸を生産することができ51、ピルビン酸発酵から酢酸と乳酸IIに関与し、疾患において有意に発現量が異なることが判明した4経路のうちの一つである。これらの候補を複数種組み合わせて検討することで、バイオフィルムの病原性メカニズムに関する新たな知見が得られる可能性がある。
現在のマルチオミクスパイプラインの限界は、菌界間相互作用（細菌以外のウイルスや真菌など）の研究に最適化されていないことです。例えば、核酸抽出プロトコルは、小児う蝕の文脈で重要な真菌の検出と分析に最適ではなかった52。これは、下流の真菌分析のための核酸抽出プロトコルを取り入れることで克服できる。同時に、MTGおよびMTXデータにおけるファージの検出は、近い将来、高い収量が得られると思われる急成長分野である53。ヒトのプラークサンプルにおける候補種の最初の発見で見つかった分類学的および機能的な変化の一部は、確立した疾患の下流（すなわち、結果）である可能性があります。パイプラインの実験的研究は、候補種の実際の病原性の可能性を明らかにするのに役立つ位置にある。しかし、う蝕の有無だけでなく、う蝕の発症や進行に関わる新種の発見と検証を強化するためには、地域社会に根ざしたヒトの縦断的研究が必要である。
以上のように、我々はマルチモーダルパイプラインを用いて、ヒト歯垢バイオフィルムの2つの大規模な発見および再現コミュニティベースのサンプルから、健康および疾患における小児口腔マイクロバイオームの分類学的および機能的特徴に関する新しい知識を得ることができました。その結果、運動性の鞭毛虫種が病気の原因菌が産生するEPSマトリックスに固定化され、増殖して酸産生が促進された3D多細胞超構造体を構築するという、マイクロスケールでの新しい種間相互作用と独自の生物地理を発見しました。我々は、S. sputigenaとS. mutansの相互作用が、in vivoの常在細菌叢の存在下でう蝕の重症度を高めることを示し、まだ解決されていない共通の疾患に対してバイオフィルム病原性を悪化させる新しい病態を示唆しました。バイオフィルムの空間的な構造化機能と病原体を介した病原性についての理解を深めることで、バイオフィルム形成の新しいメカニズムや治療標的が明らかになるかもしれない。このことは、他の生物種が既知の病原体と複雑なバイオフィルムで相互作用する他の多菌感染症に関連するかもしれない。
研究方法
ヒトマイクロバイオーム研究：背景とサンプリング
ヒトマイクロバイオーム研究は、ノースカロライナ州（NC）54の就学前児童のコミュニティベースのサンプルにおける幼児期の口腔衛生に関する遺伝疫学研究であるZOE 2.0の文脈で行われました。簡単に説明すると、2016年から2019年にかけて、NCの公立幼稚園に通う36～71カ月の子ども8059人が研究に登録され、そのうち6404人が訓練を受け、校正された歯科検診員による包括的臨床検査を受けた。小児期のう蝕経験に関するデータは、修正した国際う蝕検出分類システム（ICDAS）基準55を用いて収集された。歯科検診の直前の臨床面談で、2つの歯肉縁上（すなわち「歯垢」）バイオフィルム試料を採取し、これは間食または朝食の前か少なくとも30分後に行われた。マイクロバイオーム解析に使用する歯垢サンプルは、右上4分の1の乳歯の顔面/頬面から滅菌つまようじを使用して採取された（Universal tooth numbering system）： #A 、#B、#C、#D、#E；FDI歯番システム： #55 、#54、#53、#52、#51。採取した歯垢は、RNAlater TissueProtect 1.5 mLチューブに入れ、大学の生物試料処理施設に移送してさらに処理するか、-80 ℃で長期保存するまで、現場で-20 ℃で冷凍保存した。家族には、時間に対する報酬として20ドルのギフトカードが提供された。サンプルの収集、保管、処理、核酸抽出、および配列決定に関する詳細な情報は、最近のプロトコルの発表に報告されている56。
参加者とフェノタイピング
全ゲノムショットガンシーケンス（WGS、メタゲノミクス/MTG）およびRNAシーケンス（RNA-seq、メタトランスクリプトミクス/MTX）を実施し、ZOE 2.0参加者の最初の300人の歯肉上サンプル（「確立」う蝕病変検出閾値、ICDAS ≥ 3）48で定義される人レベルのう蝕経験あり50％となし50％。この病変閾値は、巨視的な歯質の喪失、すなわち「虫歯」に相当する。ZOE 2.0参加者（平均年齢52ヶ月）が「発見」試料となり、「再現」試料は、親研究のパイロット段階で、ほぼ同じ条件（すなわち、1人の臨床検査官）で検査を受けた同じ研究集団（すなわち、NCの公立幼稚園に在籍）の同齢児116人（平均年齢55ヶ月）で構成されていた。本研究では、男女の参加者の分布はバランスが取れており、各層に208人の子どもがいた（補足表5）。この情報は、両親または法的保護者が記入したアンケートから得られたもので、その後、ジェノタイピングによって得られる生物学的性別データとクロスチェックされた。本研究では、早期う蝕（ECC）の国際的なコンセンサス定義8に従って、早期う蝕病変（ICDAS≧1の閾値）の列挙を含む最も感度の高い臨床基準でう蝕経験を定量化した。これは、局所的（すなわち、プラークバイオフィルムを採取した5つの歯面内）および個人レベル（すなわち、88のすべての乳歯面からなる歯列全体）の両方で行われた。我々は、歯垢採取面をマイクロバイオーム分類学的に最も有益と考え、すべての分析において局所的な齲蝕経験を主要な臨床形質とした。しかし、これらの部位におけるマイクロバイオームバイオフィルムの分類学は、歯列全体の状態にも情報を与える可能性が高いと考え、第二の臨床的特性として「人レベル」のう蝕経験特性を考慮しました。発見サンプルと再現サンプルにおけるこれらの齲蝕経験形質の推定値、および参加者の人口統計学的情報は、補足表5に示すとおりである。
塩基配列の決定とアライメント
QuantIT® PicoGreen®を用いて全核酸を定量化した。5 ngのゲノムDNAをNextera XT DNA Sample Preparation Kit（Illumina）を用いて処理した。入力DNAを断片化し、フローセル内での結合とクラスタリングに必要なブリッジPCR（bPCR）対応アダプターを追加するNextera Enzyme Mix含有トランスポゾームを用いて、ターゲットDNAを同時に断片化しタグを付けた。次に、断片化されタグ付けされたDNAを、限定サイクルPCRプログラムを用いて増幅させた。このステップでは、下流のbPCRアダプターとコアシーケンスライブラリーアダプターの間にインデックス1（i7）とインデックス2（i5）を加え、さらにクラスター形成に必要なプライマー配列も加えた。増幅の熱プロファイルは、72℃で3分間の初期伸長ステップと95℃で30秒間の初期変性ステップに続き、95℃の変性10秒、55℃のアニーリング30秒、72℃の30秒間の伸長、72℃の5分間の最終伸長を15サイクル繰り返した。DNAライブラリープールをIlluminaプラットフォーム試薬カートリッジ（Illumina）およびIllumina装置上にロードした。Illumina HiSeq 4000 2×150からのシーケンス出力をfastqフォーマットに変換し、Illumina Bcl2Fastq 2.20.0 (Illumina, Inc. San Diego, CA, USA.) を用いてデマルチプレックスを行った。デマルチプレックスされたシーケンスリードの品質管理は、FastQC (Babraham Institute. Cambridge, UK)によって検証された。アダプターはTrim Galore (Babraham Institute. Cambridge, UK)を用いてトリミングした。得られたペアエンドリードは、ヒト、真菌、細菌、および拡張ヒト口腔マイクロバイオームデータベース（eHOMD）ゲノム59を含むカスタムデータベースを用いて、Kraken257およびBracken 2.558で分類し、最初の分類学的組成プロファイルを作成した。ホスト」と識別されたリードはすべて削除された。vsearch 1.10.260でペアエンドリードを結合しました。残ったアダプターリードはTrim Galoreを使用して再度トリミングした。遺伝子ファミリー、パスアバンダンス、パスカバレッジの推定は、MetaPhlAn362,63からの分類学的推定に基づいて、HUMAnN361を用いて残りのリードから作成した。
RNA単離はQiagen RNeasy Mini Kit (Cat.No. / ID: 74104)を用いて行い、RNAはNanoDrop1000 (ThermoFisher, Waltham, MA) を用いて定量した。RNA-seqによるMTXデータを生成するために、Illumina HiSeq 4000 2×150プラットフォームからのシーケンス出力をfastqフォーマットに変換し、Illumina Bcl2Fastq 2.20.0 (Illumina, Inc. San Diego, CA, USA) を用いてデマルチプレックスを行いました。デマルチプレックスされたシーケンスリードの品質管理は、FastQC (Babraham Institute. Cambridge, UK)によって検証された。Adapters は Trim Galore (Babraham Institute. Cambridge, UK) を用いてトリミングした。得られたペアエンドリードは、ヒト、真菌、細菌、および拡張ヒト口腔マイクロバイオームデータベース（eHOMD）ゲノム59を含むカスタムデータベースを用いて、Kraken257およびBracken 2.558で分類し、最初の分類学的組成プロファイルを作成した。宿主と同定されたリードはすべて削除された。vsearch 1.10.260でペアエンドリードを結合しました。得られたシングルエンドのリードは、Trim Galoreを用いて残存するアダプターを再度トリミングした。HUMAnN 3.061を使用して、MetaPhlAn 362,63メタゲノム解析による分類学的推定値に基づいて、遺伝子ファミリーおよびパスウェイレベルのデータを作成しました。さらに、実験的にテストした4つの「上位種」について、MTX遺伝子発現解析を実施した。Kraken2によって4つの上位種とその株に属すると分類されたリードは、種ごとに抽出され、STAR64 (v.2.7.10b) で各種の関連参照トランスクリプトームに個別にアラインされ、その後Salmon65 (v.1.10.1) で定量された。
品質管理手順
品質管理、スケーリング、分類群のフィルタリングの概要は、補足図7に示すとおりである。ウイルス配列を除去した後、残りのデータをまずreads-per-kilobase（RPK）形式で並べ、次にtranscripts-per-million（TPM）に再スケーリングし、最後に被験者平均のRPKレベルに近づけて再スケーリングした。発見サンプルのMTGの平均RPKは8,004,958であり、再スケーリングされたTPMは各被験者の8,000,000と設定されました。発見と推論を容易にするため、相対存在量が10-5未満、または有病率が10%未満の種は、すべての分類学的発見分析から除外した。6411種の非ウイルス種のうち、5990種の低存在と2935種の低有病率（2932種の低存在と低有病率の両方を含む）がフィルタリングされ、すべての下流のMTG分析用に418種の分類が保持されました。発見サンプルのMTXデータ、および再現サンプルのMTGとMTXデータは、すべて同様の方法で処理された。被験者ごとのRPK総数は平均11,014,832、5,077,759、2,739,606であり、被験者ごとの再スケーリングTPM総数はそれぞれ平均1100万、500万、300万である。アバンダンスフィルターとプリヴェランスフィルターを適用した後の保持タクサ数は、発見サンプルのMTXで385、複製サンプルのMTGとMTXのデータでそれぞれ422と397であった。これらの保持された分類群のセットを "コア" と呼ぶことにする。TPM正規化は、サンプルの多様性が限られているため、上位4種の標的MTXに対しては行わなかった。サンプルあたりの平均RPKは72,474でした。下流の差分発現および遺伝子間相互作用解析のために、平均20リードを超える遺伝子を保持しました。このフィルターを用いて、これら4つの上位種で利用可能な全9103遺伝子のうち、542遺伝子が保持されました： S. mutansが47個、S. sputigenaが39個、P. salivaeが8個、L. wadeiが448個でした。
う蝕体験と有意に関連する菌種の同定
対数正規線形モデルを用いて、MTGおよびMTXデータにおける生物種の存在量の差と、う蝕経験の定量的尺度との関連性を検証した。モデルには、対象となる表現型（すなわち、局所的または人レベルのう蝕の定量的経験のいずれか）、バッチ効果（すなわち、、 モデルには、表現型（局所的なう蝕の定量的経験の有無）、バッチ効果（最初のシーケンスバッチは52サンプル、2番目のバッチは残りの248サンプル）、登録時の年齢（月単位）、人種/民族（法的保護者が報告し、白人-非ヒスパニック、アフリカ人-非ヒスパニック、その他ヒスパニックに分類される）、ユニットが、基底2での対数変換前の再スケーリングTPM存在量データに対して追加されていた。MTGデータにおける各生物種の存在は、差分発現（すなわちMTXデータにおける存在量）を検討するモデルにおいて制御された。多重検定のための偽発見率（FDR）補正は、4つのモデル（齲蝕形質および存在量／発現）のそれぞれについてBenjamini-Hochberg手順66を用いて適用した。
う蝕経験に関連する細菌種の同定には厳格な基準を用い、発見サンプル（n = 300）において、MTGおよびMTXデータ（すなわち4モデル）において、局所的および人レベルの両方で定義された定量的疾患経験に対してFDR-有意に差がある分類群を要求した。すなわち、親研究と同じ集団（すなわち、NC州の公立幼稚園）から採取した116名の同じ年齢の参加者、同様の臨床データ、マイクロバイオームデータで、以前に同定された関連性の再現性を検討したのである。このように、MTGとMTXのデータで、局所的な疾患と人レベルの疾患について、さらに4つのモデルが作成されました。再現性の証拠として、重要度の高い順に、再現サンプルにおける関連推定値の方向性の一致、名目上の有意性、またはFDRレベルの有意性を考慮した。発見サンプルの4つのモデルすべてでFDR有意であり、MTGデータの局所的な疾患経験について少なくとも名目上有意であった種を「有意種」と呼んだ。複数の形質、MTG、およびMTXデータから、そして416人の研究参加者全員から、関連性の高信頼性証拠を有するこの種のセットは、報告のために優先され、実験検証パイプラインで検討するための候補となった。図2および3、補足図1および2、補足表1、2、3および4の作成に使用したマイクロバイオーム解析に由来する生データ、ならびにモデル係数の95％信頼区間（該当する場合は上限および下限）および変数の凡例は、補足データセットに含まれる。
う蝕経験に有意に関連する生物種間の相関とパスウェイ
有意な16種の相互関係についての初期洞察を得るために、健康時と疾患時の一対一の相関パターンを調べた。この目的のために、16の有意な生物種のそれぞれについて作成されたモデル残差間のピアソン相関係数を使用した。これらの対数正規モデルは、主解析で使用したモデル（バッチ効果と年齢で調整）と同じ仕様で、病気経験の調整を加えたものである。他の15種の有意な種との平均相関は、健康（すなわち、局所の疾病経験がない）と疾病（すなわち、局所の疾病経験がある）の間、およびMTGとMTXで調べた。
バイオフィルムのトランスクリプトームにおいて、う蝕経験に有意に関連するパスウェイを特定するために、上記のようにRPK形式で作成されたパスウェイおよびパスウェイ種MTXデータを調べた。サンプルあたりのRPK総数は平均383,119であり、RPKデータは、前述のように400,000のスケールでTPM形式に変換された。分類されていないものを含むすべての種にわたって合計された各経路は、主発見分析におけるのと同じ共変量のセットと、log2変換前の単一性の追加を伴う対数正規モデルを使用してテストされた。297のパスウェイをテストするためのFDR補正は、Benjamini-Hochberg手順を用いて適用された。この手順を用いて、MTXでの発現がう蝕経験と有意に関連するパスウェイを同定した。さらに、これらのパスウェイにおける16種の有意な発現を、各パスウェイに関与する全種に対する有意性の割合として調べた。
病原性アッセイと実験的試験のための生物種の絞り込み
我々は、う蝕経験との関連について強力かつ再現可能な証拠を示した16種のリストから出発した（補足表1）。本研究で、病原性、バイオフィルム、場合によってはin vivo試験で十分な特性評価を行うことができる候補のショートリストを選択するために、発見サンプルにおける関連性の統計的証拠（すなわち、p値）、独立サンプルにおける証拠の再現、異なる属の代表（すなわち、属ごとに1種選択）、および臨床分離株の入手を検討しました。これらの基準に基づき、重要な16種のリストから、Streptococcus mutans（既知の確立された病原体）、Selenomonas sputigena、Prevotella salivae、Leptotrichia wadei（新規候補3種）を優先的に選択しました。これらの4つの分類群は「トップ種」と呼ばれ、in vitroでの病原性評価とバイオフィルムの特性評価に引き継がれ、さらにin vivoでのコロニー形成とカリオン原性試験の候補となった。
実験室での検証で使用した微生物と増殖条件
Streptococcus mutans UA159（ATCC 700610）、Selenomonas sputigena（ATCC 35185）、Leptotrichia wadei（JCM 16777）、Prevotella salivae（JCM 12084）は、in vitroおよびin vivo試験で使用した。細菌は、Brain Heart Infusion Supplemented (BHIS) 培地（Brain Heart Infusion broth supplemented with 5 g/L yeast extract, 5 mg/L Hemin, 1 mg/L Vitamin K1, and 0.5 g/L L-cysteine） で37℃、嫌気槽（Anaerobe Systems）で指数期まで培養した。In vitroバイオフィルム研究では、唾液でコーティングしたハイドロキシアパタイトディスク（2.7 ± 0.2 cm2; Clarkson Chromatography Products）を、ヒト歯の歯-エナメル面を模して縦置きした。ECC患児に関連するカリオジェニックな条件をシミュレートするため、虫歯に関連する主要な食事糖であるスクロースを1%添加したBHIS培地（新種は107 CFU/mL, S. mutansは105 CFU/mL ）でアパタイト表面に単一または混合バイオフィルムを増殖した。バイオフィルムは、唾液でコーティングされたハイドロキシアパタイト表面で最大24時間増殖させ、単一種または混合種のコミュニティを確立させた。成長ダイナミクス実験では、バイオフィルムを4時間後（すなわち、初期付着段階）と10時間後（すなわち、中間段階）に調査した。リアルタイムライブイメージングには、緑色蛍光タンパク質（GFP）タグ付きS. mutans UA159株（S. mutans UA159 Ef-Tu-gfp）67が使用された。バイオフィルムEPSグルカンマトリックスは、バイオフィルム増殖中に1μM Alexa Fluor 647 dextran conjugate（Molecular Probes）を培養液に補充することで標識した。この標識法は、蛍光標識されたデキストランが連鎖球菌の糖転移酵素のプライマーとなり、バイオフィルムEPS合成時にグルカンに直接取り込まれるため、S. mutans由来のα-グルカンに極めて特異的であることがわかった。S. sputigenaの単一種バイオフィルムを、無細胞精製GtfB酵素（20U）を添加したBHIS（1%スクロース）中で24時間培養し、運動性追跡アッセイに使用しました。
上位種のビルレンスと代謝プロファイルの評価
耐酸性・酸原性
耐酸性試験は、あらかじめpHを調整したBrain Heart Infusion (BHI) broth (Anaerobe Systems)を用いて行った。乳酸（13.42M）を用いて培地のpHを調整した（2.9～6.5の間）。上位種のそれぞれを107 CFU/mLに連続希釈した。100マイクロリットル（100μL）の細菌懸濁液を900μLのpH調整済み培地に移し、酸性条件下での単一種の生育を調査した。並行して、新種（S. sputigena、L. wadei、またはP. salivae）のそれぞれをS. mutans（単一種の割合が同じ）と混合し、混合種の組み合わせの成長を検討した。培養は37℃の嫌気槽で48時間行い、細菌の増殖はマイクロプレートリーダー（SpectraMax M2e）を用いて610nmの光学密度値を測定して定量化し、一方pH値はpHメーター（FiveEasy Benchtop F20 pH/mV Meter, Mettler Toledo）を用いて測定しました。酸耐性を評価するために、各菌種が生存（検出可能な増殖）した最低pH値と培養の最終pH値（48時間後）の両方を記録した。酸原性（酸の産生）については、標準的な解糖系pH-dropアッセイを使用しました。細菌細胞（最終的に107CFU/mLの生存細胞数、単一種または混合種、同数、上述の通り）を、1％グルコースを含む塩溶液（50mM KCl、1mM MgCl2・6H2O）中でインキュベートし、経時的に酸を生成させた。pHの低下は、各生物種が活発に酸を生成する12時間の間、1時間ごとにpHメーターを用いて測定した。12時間の平均プロトン生成率を算出し、異なる菌種の単独またはS. mutansとの組み合わせによる酸生成性を比較した。
代謝プロファイリング
リアルタイム等温マイクロカロリメトリー68を用いて、上位種の代謝プロフィールを測定した。S. mutans，S. sputigena，L. wadei，P. salivae，P. oulorumをBHIブロスに移し，37℃の嫌気槽で48時間培養した．各菌株を107 CFU/mL に連続希釈し，60 μlずつ3連で還元前のBHI 540 μl入りチタンバイアル（カルウェル；SymCel）に移した．代謝活性を示すリアルタイムの熱産生は、48ウェルプレート（calPlate™）でcalScreener™マイクロカロリーメーター（SymCel Sverige AB, Stockholm, Sweden）を用いて、前述69と同様に48時間まで連続測定しました。サンプルの全処理とプレートの準備は、細菌の最適な増殖のために嫌気状態を維持するため、嫌気槽内で実施した。熱および対応するエネルギーデータは、calView™ソフトウェア（Version 1.0.33.0, © 2015 SymCel, Sverige AB）を用いて定量化しました。装置は37 °Cで設定・校正され、すべての取り扱いとセットアップは製造元の推奨に従って行われました。
バイオフィルムライブイメージング
バイオフィルムライブイメージングは、口腔内バイオフィルムに最適化された当社の確立した蛍光標識および共焦点イメージングプロトコルに基づき、いくつかの変更70を加えて実施した。バイオフィルムは、リン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH7.1）で3回浸漬洗浄し、表面から緩く結合した微生物を除去した。GFPタグ付きS. mutans細胞におけるGFP蛍光体の発達を促進するため、以前に報告されたプロトコルに従って、イメージング直前に好気的蛍光回復を行った71。バイオフィルムは、すべての細菌細胞を標識するSYTO82（Molecular Probes社）でカウンターステインした。超解像ライブイメージングは、Airyscanを備えたZeiss LSM800正立共焦点顕微鏡の40×（開口数＝1.2）水浸対物レンズを用いて37℃で実施した。細菌の運動性をリアルタイムでイメージングするために、マルチチャンネル共焦点画像を2.6秒間隔で30秒間撮影した。
計算機によるバイオフィルム画像解析
次に、先に詳述した38のように、蛍光減算法を用いてバイオフィルムの空間構造化（3Dバイオフィルム構造全体における異なる種とEPSの位置関係）を解析した。簡単に説明すると、ImageJ Fiji v.2.11.0 (https://imagej.net/Fiji)のImage Calculatorを使ってチャンネル減算を適用し、以下の式で混合種バイオフィルムの新種からの蛍光シグナルを算出した： ChNew species = ChAll bacteria- ChS. mutans、ここでChAll bacteriaは全菌のチャンネル（SYTO82）、ChS. mutansはS. mutansのチャンネル（GFP）である。計算機による画像処理と定量分析は、バイオフィルム29に最適化された画像解析ツールボックスであるBiofilmQ software v.0.2.2 (https://drescherlab.org/data/biofilmQ)を用いて実施した。大津アルゴリズムによる画像分割の後、バイオフィルム全体を小さな立方体（キューブサイズ＝2μm）に分割するBiofilmQのキューブベースのオブジェクトデクランピングを実施した。この機能により、各キューブが3次元的にユニークな空間座標を持つため、バイオフィルムのサブドメイン内の構造特性を空間分解能で解析することができます。キューブ内の各チャンネルについて、局所的な形状体積、相対的な存在量、強度などのパラメータを算出した。共局在解析には、BiofilmQのManderのオーバーラップ係数を用いて、2つの異なる蛍光シグナルの互いに対する空間的近接の度合いを定量化しました。2つのマンダース係数を算出した： 1）S.mutansを含む新種、2）EPSを含む新種。単細胞細菌の運動をリアルタイムで追跡するため、計算による単粒子追跡を行い、ImageJ Fiji72のTrackMateプラグインを使用して時間分解軌跡を作成した。バイオフィルムの可視化は、ImageJ Fijiの最大強度投影と3D表面レンダリングを用いて実施した。
バイオフィルムのpH測定と可視化（In situ biofilm pH measurement and visualization
pH応答性蛍光色素（C-SNARF-4）と共焦点ライブイメージングを併用し、既述のようにバイオフィルム-アパタイト界面のin situ pHを測定した39．C-SNARF-4はpHに依存した発光シフトを示すため、2つの発光波長における蛍光強度の比を用いて、バイオフィルムの局所的なpHを測定することができる。簡単に説明すると、24時間培養したバイオフィルムを浸漬洗浄し、HEPESバッファ（50μM；pH = 7.4）で60分間平衡化した。次に、バイオフィルムを30μMのC-SNARF-4で染色し、その後、2つの検出波長範囲（576-608nmおよび629-650nm）で連続レシオメトリックイメージングを行った。最初の画像（t = 0分）はグルコース曝露前に撮影し、画像取得はグルコース（最終濃度1%）添加後、37℃で5分ごとに、Zeiss LSM800共焦点顕微鏡の20x（数値開口数=1.0）水浸対物レンズを使用して行った。レシオメトリックプローブのキャリブレーションは、HEPESバッファ（50μM；pH＝4.5～7.5、0.5pH単位でステップ）を用いて実施した。計算機による画像解析と可視化は、ImageJ Fijiを使用して実施した。
生体外ヒト歯エナメル質バイオフィルムモデルとエナメル質表面解析
バイオフィルム下のエナメル質の腐敗の程度を分析できる生体外ヒト歯エナメル質モデルを採用した40。簡単に説明すると、非特定のヒト抜歯歯から調製した滅菌エナメル質標本（4×4mm）上に単一種または混合種のバイオフィルム（67時間）を形成した。バイオフィルムは、酵素処理（デキストラナーゼとムタナーゼ）の後に、人工的な表面損傷を与えることなくバイオフィルム除去に最適化された水浴超音波処理を用いて除去した40。実体顕微鏡（ZEISS Axio Zoom V16）を用いて、エナメル質表面の巨視的な脱灰領域（臨床的に見られる顕性幼児う蝕と同様のもの）を可視化した。次に、歯のエナメル質表面の表面形状および粗さを、Zeiss LSM800顕微鏡およびConfoMapソフトウェア（バージョン7.3.7984）の50x（数値開口＝0.95）対物レンズを用いた非破壊共焦点顕微鏡法により評価した。次に、ヒトエナメル質標本をアクリル棒に取り付け、横断マイクロラジオグラフィー用に硬組織ミクロトーム（Silverstone-Taylor Hard Tissue Microtome, Series 1000 Deluxe）を用いて切片（100±20μm厚）を作製した。切片をTMR-Dシステムに入れ、一定の距離で12秒間X線（45 kV; 45 mA）を照射した。アルミニウムのステップウェッジも同じ条件でX線照射を行った。デジタル画像はTMRソフトウェアv.3.0.0.18で解析され、健全なエナメル質はミネラル体積87％と定義された73。
標的細菌遺伝子発現および遺伝子-遺伝子相互作用解析
S. mutans、S. sputigena、L. wadei、P. salivaeの遺伝子発現を調べるために、ターゲットMTXアプローチを使用した。リードはSTAR-Salmon64,65を使用してこれらの種の参照ゲノムにアライメントされた。複数の菌株が利用可能な場合、結果は種レベルまで統合された。次に、バッチ効果、年齢、人種/民族を調整し、FDR多重検定補正を適用した対数正規モデルを用いて、遺伝子発現とう蝕経験との関連性を各遺伝子について検定した。さらに、S. mutansとS. sputigenaの遺伝子間相互作用についても検討した。この2種は、共培養すると酸産生が促進され、独自のバイオフィルム構造を持つことがわかった。この目的のために、遺伝子間相互作用を含む同じ対数正規モデルを、これら2つの種からフィルターされたすべての遺伝子のペアワイズ組合せを含めて使用し、FDR多重検定補正を適用した。
小児う蝕のin vivo齧歯類モデル
歯の細菌コロニー形成と疾患発症への影響は、他で詳述された確立された齧歯類う蝕モデルで評価し、いくつかの修正を加えた43,74. 簡単に説明すると、15日齢の雌のSprague-Dawleyラットの仔（特定病原体フリーグレード）は、Harlan Laboratories（米国インディアナポリス）からダム（ダムあたり8匹の仔）と共に購入した。到着後、動物は口腔スワブおよびリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）によりS. mutansおよびS. sputigenaの口腔内感染を事前にスクリーニングされ、いずれの生物にも感染していないと判断された。各動物から口腔スワブ（FLOQSwab, COPAN Diagnostics, Murrieta, CA, USA）を採取し、DNeasy PowerLyzer Microbial Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) を用いて細菌DNAを抽出した。微生物の検出には、以下のように種特異的なqPCRプライマーセットを使用した： S. mutans： S. mutans: Forward 5' ACCAGAAAGGGACGGCTAAC 3', Reverse 5' TAGCCTTACTCCAGACTTTCCTG 3'; S. sputigena： Forward 5' GGTCAGCCTTATCAGTTCCGTT 3'、Reverse 5' GGCGAGCTTTCAGCAATCTTAG 3'、すべての細菌： フォワード5' TCCTACGGGAGGCAGCAGT 3'、リバース5' GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT 3'。
子犬は、異なる細菌感染を受ける4つのグループにランダムに割り当てられ、別々に収容された：（1）S. mutans単独；（2）S. sputigena単独；（3）S. mutans plus S. sputigena；（4）S. mutansまたはS. sputigena感染をしない対照。19〜23日齢の動物に、S. mutansおよび/またはS. sputigenaの活発に増殖する培養物（BHISで〜108 CFU/mL）を毎日口腔スワブを用いて接種した（合計5回接種）。各感染群は、21日、24日、30日に口腔内スワブとqPCRにより指定された微生物感染を確認したが、対照群はS. mutansまたはS. sputigenaのいずれも感染していないままであった。実験期間中、交差汚染は検出されなかった。すべての動物に、小児う蝕に関連する虫歯促進食を模倣するために、国立衛生研究所う蝕原性食#2000と5%ショ糖水を自由摂取させた。実験は3週間続けられ、終了後、動物は炭酸ガスで安楽死させられた。顎は解剖され、KeyesのシステムをLarsonが修正した75に従って歯のう蝕スコアリングのために処理された。齲蝕スコアは、較正された試験官によって決定された。調査員は、感染、サンプリング、評価の各段階において、色分けされたサンプルを用いて実験グループ（すなわち感染）の割り当てをマスクされた。In vitroおよびIn vivoの実験データは、平均値±標準偏差で表示された。データは、Student's pairwise t-testまたは分散分析（ANOVA）に、多重比較を考慮したポストホックTukey HSD testを加えたものである。グループ間の差は、p < 0.05のとき、統計的に有意とみなされた。
報告書の要約
研究デザインに関する詳しい情報は、この記事にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryでご覧いただけます。
データの入手方法
ZOE 2.0のDNAおよびRNA配列データは寄託されており、dbGaPアクセッションphs002232.v1.p1 "TOPDECC-Trans-omics for Precision Dentistry and Early Childhood Caries" の一部として一般に公開されています： Genome-Wide Genotyping (CIDR) and Microbiome in the ZOE 2.0 Study "とBioProject 671299 (PRJNA671299; dbGaP: phs002232; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/671299) としてSequence Read Archive (SRA) に収録されています。ZOE pilot（複製サンプル）の生のDNAおよびRNA配列データは、BioProject 843091 "ZOE 2.0 pilot study" (PRJNA843091) の一部として寄託され、一般に公開されています。バイオフィルム微生物群集全体のマイクロバイオーム分類（MTGおよびMTX）およびパスウェイ情報、ならびに本研究で使用した4つの上位種の標的MTXデータは寄託され、メタデータ（すなわち、人口統計および臨床表現型情報）とともに、カロライナデジタルリポジトリおよびアクセッション番号5d86p890xを通じて一般に利用可能である。参照ゲノムは、拡張されたHuman Oral Microbiome Database (https://www.homd.org/)から入手しました。図と表の生成に使用したソースデータファイルは、補足情報に掲載されています。ソースデータは本論文に添付されています。
コードの利用可能性
本解析に使用したスクリプトは、https://doi.org/10.5281/zenodo.770729776 に掲載されています。
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謝辞
本研究は、米国国立衛生研究所からの研究助成金により行われました： National Center for Advancing Translational Sciences National UL1TR001111 (K.D.); National Institute for Dental and Craniofacial Research U01DE025046 (K.D.), R01DE025220 (H.K.) and R03DE028983 (D.W.); Z. R. はNIDCR Postdoctoral Training Program（賞番号 R90DE031532 ）の支援を受けました。Z.R.はColgate-Palmolive Fellowshipの受給者であった。UNC Microbiome Coreは、Center for Gastrointestinal Biology and Disease（CGIBD P30 DK034987）およびUNC Nutrition Obesity Research Center（NORC P30 DK056350）から一部資金提供を受けています。内容はあくまで著者の責任であり、必ずしも資金提供者の公式見解を示すものではない。著者らは、ZOE研究における歯肉縁上バイオフィルム微生物群の検体の採取、保管、払い出しについて、UNC-Chapel Hill Biospecimen Processing facilityのPatricia V. Basta博士とそのチームに感謝し、横断マイクロラジオグラフィーで技術支援を受けたIndiana UniversityのAnderson Hara博士、Dr. S. mutans UA159 Ef-Tu-gfp株の提供を受けたOregon Health & Science UniversityのJustin Merritt博士、S. sputigena ATCC 35185株の提供を受けたチューリッヒ大学のLamprini Karygianni博士およびThurnheer博士です。図中の一部の模式図は、BioRender.com（Publication License #RS251UWR8N ）を用いて作成した。
著者情報
著者ノート
これらの著者は等しく貢献した： Hunyong Cho, Zhi Ren.
著者と所属
ノースカロライナ大学チャペルヒル校（米国ノースカロライナ州チャペルヒル市）ギリングス国際公衆衛生学部生物統計学教室
Hunyong Cho、Bridget M. Lin、Chuwen Liu、Di Wu
ペンシルベニア大学歯学部イノベーション＆プレシジョンデンティストリーセンターバイオフィルム研究室（米国ペンシルベニア州フィラデルフィア市
Zhi Ren & Hyun Koo
ノースカロライナ大学チャペルヒル校アダムズ歯学部小児科・公衆衛生学教室（米国ノースカロライナ州チャペルヒル市
Kimon Divaris、Miguel A. Simancas-Pallares、Poojan Shrestha、Jeannie Ginnis
ノースカロライナ大学チャペルヒル校ギリングス公衆衛生学部疫学科、チャペルヒル、ノースカロライナ州、USA
Kimon Divaris、Poojan Shrestha、Kari E. North
UNC Information Technology Services and Research Computing, University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, NC, USA
ジェフリー・ローチ
ノースカロライナ大学チャペルヒル校医学部消化管生物学・疾患センターUNCマイクロバイオームコア（米国ノースカロライナ州、チャペルヒル市
ジェフリー・ローチ＆M.アンドレア・アスカラテ・ペリル
ノースカロライナ大学チャペルヒル校医学部医学科、消化器・肝臓学部門、米国ノースカロライナ州、チャペルヒル市
M. アンドレア・アズカラテ＝ペリル
シーダーズ・サイナイ・メディカルセンター 人工知能イノベーションラボ（米国カリフォルニア州ロサンゼルス市
アレナ・オルレンコ
米国マサチューセッツ州ボストン、タフツ大学歯学部包括ケア学科
アンドレア G．フェレイラ・ザンドナ
米国ノースカロライナ大学チャペルヒル校 アダムス歯学部 診断科学部門
アポエナ・アギア・リベイロ（Apoena Aguiar Ribeiro
ノースカロライナ大学チャペルヒル校（米国ノースカロライナ州チャペルヒル市）、アダムズ歯学部、口腔・頭蓋顔面健康科学部門
ディ・ウー
ペンシルベニア大学歯学部歯科矯正科（米国ペンシルベニア州フィラデルフィア市
ヒョン・クー
貢献度
K.D., K.E.N., A.A.R., D.W., and H.K. designed the study. K.D.、M.A.S.P、P.S.、J.G.、A.G.F.Gはデータ収集とサンプリングに参加した。J.R.とM.A.A.P.がサンプル処理とシークエンシングを行った。H.C.、J.R.、B.M.L、C.L.、A.O.、D.W.はバイオインフォマティクス解析を行った。Z.R.、A.A.R.、H.K.がin vitroの実験を行った。Z.R.とH.K.がin vivoの実験を行った。H.C.、Z.R.、K.D.、A.A.R.、D.W.、H.K.は、著者全員の貢献で論文を執筆した。
対応する著者
Kimon Divaris、Di Wu、Hyun Kooに対応する。
倫理的宣言
競合する利益
著者らは、競合する利益はないと宣言している。
倫理的承認
ヒトの観察データと分析は、2014年9月18日にノースカロライナ大学チャペルヒル校のOffice of Human Research Ethics Institutional Review Boardから承認（#14-1992）を受けた。すべての子どもの法的保護者は、研究への参加について書面によるインフォームドコンセントを提供した。in vivo実験研究は、ペンシルベニア大学のInstitutional Animal Care and Use Committee（IACUC#805735）の審査と承認を受けた。すべての研究は、ヘルシンキ宣言に従って行われました。
査読
査読情報
Nature Communicationsは、Rodrigo Alex Arthur、および他の、匿名の、この作品の査読に貢献した査読者に感謝します。査読者の報告書はこちらです。
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Cho, H., Ren, Z., Divaris, K. et al. Selenomonas sputigena acts as a pathobiont mediating spatial structure and biofilm virulence in early childhood caries. Nat Commun 14, 2919 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38346-3
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受理2022年6月11日
2023年4月21日受理
2023年5月22日発行
DOIhttps://doi.org/10.1038/s41467-023-38346-3
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