消化管バイオフィルム： 内視鏡的検出、疾患との関連性、治療戦略
基礎および臨床消化器病学および肝臓病学のレビュー167巻6号p1098-1112.e52024年11月オープンアクセス
消化管バイオフィルム： 内視鏡的検出、疾患との関連性、治療戦略
Bernhard Jandl∙Satish Dighe∙Maximillian Baumgartner∙Athanasios Makristathis∙Christoph Gasche∙Markus Muttenthaler markus.muttenthaler@univie.ac.at
要旨
astrointestinalバイオフィルムは、マトリックスに包まれ、高度に不均一で空間的に組織化された多細菌群集であり、消化管内の広い範囲を覆うことができる。過敏性腸症候群、炎症性腸疾患、胃がん、大腸がんなどの消化管疾患との関連が指摘されている病原性バイオフィルムには、腸内細菌叢の異常、粘液障害、上皮浸潤が関連している。腸管バイオフィルムは潰瘍性大腸炎や過敏性腸症候群の患者に非常に多くみられ、ほとんどの内視鏡医は大腸内視鏡検査中にそのようなバイオフィルムを観察したことがあるだろうが、おそらくその生物学的および臨床的重要性を認識していないであろう。消化管バイオフィルムには保護的な細胞外マトリックスが存在するため、治療が困難であり、有効な治療法はまだ開発されていない。本総説では、消化管バイオフィルムの形成、増殖、外観と検出、バイオフィルムの構造とシグナル伝達、ヒトの宿主防御機構、バイオフィルムの疾患と臨床的関連性、治療的アプローチ、および将来の展望について述べる。バイオフィルムの正確な病態生理学的関連性、および治療の進歩を臨床に還元するための主要なハードルに関する、重要な知識のギャップと未解決の研究課題についても論じている。この総説は、腸内バイオフィルム研究の現状を要約し、将来の研究と治療戦略への展望と指針を提供するものである。
キーワード
本稿で使用した用語
astrointestinalバイオフィルム
消化管内のバイオフィルム
ヒトの消化管（GI）は口から肛門まで伸びる消化管であり、腸内細菌叢と呼ばれる様々な生活様式を持つ微生物が豊富に生息し、ヒトマイクロバイオームの約30％を占める、人体で最も高密度に生息する環境である。消化管に至るまで、細菌密度は増加し、結腸で最も高い密度（109～1011個/mL）を示す（図1）。細菌と環境および宿主との相互作用は、マイクロバイオータの表現型の出現と構成に影響を与える。腸内微生物は、管腔内で自由浮遊細胞として生息するものもあれば、バイオフィルムと呼ばれる高次構造を適応するものもある1-3。
図1 ヒトの消化管。A ）バイオフィルムの発生は、IBS、IBD、消化性潰瘍疾患、胃体部優位性胃炎、無胃酸症、消化器癌などの消化器疾患と関連している（左列）。疾患に関連するバイオフィルム形成が可能な細菌株には、B fragilis、C difficile、病原性・腸管付着性大腸菌、R gnavus、H pyloriなどがある（右列）。B）近位部から遠位部にかけての抗菌薬、酸素（O2）、pHの濃度勾配を含む、消化管に沿った総細菌密度とバイオフィルムの存在量。C ）腸粘膜は、筋層、固有層、上皮、内側および外側の粘液層からなる。上皮は特に陰窩のパネス細胞と杯細胞からなり、どちらも細菌の侵入に対する宿主の防御システムの一部である。パネス細胞は抗菌性化合物を分泌し、杯細胞は厚い粘液層を作り、上皮と内腔の間に物理的バリアを形成する。陰窩の底で絶えず分裂している幹細胞は、常に組織の補充に貢献している。大腸固有層には、マクロファージ、T細胞、樹状細胞（DC）、免疫グロブリンA陽性B細胞（IgA+B細胞）などの免疫細胞が存在し、細菌の侵入に対する自然免疫反応および適応免疫反応の一翼を担っている。大腸内粘液層は健康な状態では基本的に無菌であり、バイオフィルムによるコロニー形成や粘液浸潤は、宿主の免疫応答や抗菌応答が抑制された結果起こりうる。
バイオフィルムは、マトリックスに包まれた微生物群集であり、表面に付着しているか、あるいは表面に付着していない凝集体である。このユニークな構造は、宿主の防御やせん断力、抗生物質などの環境因子から身を守ることで生存率を高めている1,6,7。高い細胞密度とバイオフィルムの多種多様な特性は、種間のコミュニケーションと相互作用を促進し、他の微生物の代謝活動に依存する一部の微生物に利益をもたらす。
消化管粘膜は、粘膜筋層（陰窩収縮に関与する薄い平滑筋層）、固有層（間葉系細胞および免疫細胞）、上皮（単細胞層）、および内側と外側の粘液層から構成されている（図1）。 1腸管粘膜には、(1)腸細胞、(2)杯細胞、(3)パネス細胞、(4)腸内分泌細胞、(5)ミクロフォールド細胞など、病原体に対する宿主の防御に不可欠な役割を持ついくつかの異なるタイプの細胞が存在する（補足表1）。
粘液層は主に、上皮表面を覆う動的なムチン糖タンパク質シートからなり、腸管上皮と管腔内容物の間の主要なバリアを形成している。外側の粘液層にバイオフィルムが形成されると、粘膜侵襲を引き起こし、細菌を上皮に接近させる可能性がある。
例えば、活性型粘膜トロンビンは腸管上皮で産生され、常在菌によって制御されるプロテアーゼであり、バイオフィルムマトリックスの切断を通じてバイオフィルムを拘束することができる18。腸内タンパク質分解活性の不均衡は、過敏性腸症候群（IBS）やセリアック病に関連しており、常在細菌は、腸内微生物のβ-グルクロニダーゼを介した非共役ビリルビンの産生を介してプロテアーゼを阻害することができるため、このような宿主と微生物の相互作用を通じて、健康的な腸内プロテアーゼの恒常性維持に寄与する20。
すべての腸内バイオフィルムが病原性であるわけではなく、常在性粘膜バイオフィルムの例もいくつかある2 、3 、15。常在性バイオフィルムは、腸管内腔で空間と栄養分を奪い合い、酢酸や酪酸などの抑制性代謝産物を放出することで、病原性細菌のコロニー形成や侵入を制限することができる21。ヒトの腸内に最も多く存在する属のひとつであるバクテロイデスについて概説したように、腸内バイオフィルムの常在性と病原性の境界線は薄いことがある。バイオフィルム形成が自然な微生物のライフスタイルの一部であることを考慮すると、病原性はバイオフィルムに直接関係するというよりも、宿主の免疫反応の異常や微生物の異常な特徴と関連している可能性がある。抗生物質の（過剰）使用もまた、腸内細菌叢のディスバイオシスを引き起こし、自然な微生物防御機構としてのバイオフィルム形成に関与している可能性がある。しかし、IBS、炎症性腸疾患（IBD）、消化性潰瘍疾患、無胃酸症、体表優位性胃炎、および消化器がん（図1）に関連する巨視的に見えるバイオフィルムは、臨床的に最も重要である2,3,15,16,26-31。
消化管バイオフィルムのライフサイクルと構造
消化管バイオフィルムは、(1)ムチンが豊富なマトリックスを持つ粘膜バイオフィルム、(2)ムチン凝集体の周りのバイオフィルムクラスター、(3)食物粒子に付着したバイオフィルム、または(4)これらの形態が混在したものとして形成される（図2,図3）。
図2 バイオフィルムのライフサイクル。バイオフィルムのライフサイクルには、以下の3つの段階がある。1）初期化：細菌は粘膜表面に付着するか、表面に発現する接着タンパク質、鞭毛、繊毛を用いて（細菌同士、あるいは未消化の食物粒子や宿主ムチンなどの管腔内容物に）凝集し、マイクロコロニーを形成する。2) 発達：粘液に付着したマイクロコロニーが細胞分裂を開始し、細菌の共存と効率的なコミュニケーションを支える不均質な化学的・物理的微小環境を持つEPSからなるEPSマトリックスを形成する。バイオフィルムの成長と発達はダイナミックなプロセスであり、内腔の浮遊性細菌は確立されたバイオフィルム構造に移動し、内腔細菌のバイオフィルム凝集体は凝集によって拡大し、非表面付着凝集体は粘膜バイオフィルムに付着する。ersister細胞は栄養不足の領域、典型的には成熟バイオフィルムの中核に形成され、環境ストレスや抗菌剤曝露に対して高い耐性を示す。3) 拡散： PSマトリックスのリモデリングにより、バイオフィルムに分散した凝集体の放出が促進され、感染していない粘液にコロニー形成することができる。腸内での分散方向は、腸の蠕動運動によって近位部から遠位部へと変化する。ispersedバイオフィルムは、腸に沿ったバイオフィルムの拡大に寄与する明確な表現型である。生活環のほとんどの発達的側面は、無菌条件下で、宿主の防御反応の影響を受けずに、緑膿菌と 黄色ブドウ球菌の単一種バイオフィルム増殖を用いた試験管内セットアップに基づいている。しかし、この研究が臨床応用にどのような意味を持つかは不明であり、ほとんど知られていない。ここに示すバイオフィルムのライフサイクルは、最近拡張された概念モデル32に従って おり、GI環境のために視覚化され、文脈化されている。
図3 GIバイオフィルムの外観とマトリックス構成。A ）腸内細菌とバイオフィルムの外観。腸内細菌群集は消化管全体に分布し、異なる表現型（浮遊性、バイオフィルム、バイオフィルム分散型）に適応する。これらの群集の大部分は自由浮遊性（プランクトン状態）であるが、粘膜バイオフィルムとして、あるいは食物粒子やムチンに凝集したバイオフィルムとしても存在する。粘膜バイオフィルムからの放線菌は宿主の粘液層に侵入し、上皮と密接に接触する。B ）バイオフィルムマトリックスの組成 バイオフィルムマトリックスは主に水と、多糖類、タンパク質、脂質、細胞外DNAなどの生体高分子からなり、ハイドロゲル状の構造を形成している。活性細胞はこのマトリックスに埋め込まれ、共にバイオフィルムを形成する。バイオフィルムは、QS、ストリンジェント・レスポンス、セカンド・メッセンジャーといった非常に効果的な細菌制御経路を用いて、バイオフィルムの組織、構造、行動を制御している。C ）バイオフィルム陽性患者の大腸内視鏡画像。ヒト上行結腸に存在する腸管バイオフィルム。D ）in vitroにおける緑膿菌バイオフィルムの走査型電子顕微鏡像。細菌を取り囲む分泌されたバイオフィルムマトリックスを可視化している。
典型的なバイオフィルムのライフサイクルは、浮遊性細菌の凝集か粘膜表面への付着から始まる。いずれの場合でも、細菌は鞭毛、繊毛、毛繕いなどの細胞表面付属物を利用する。凝集または付着すると、細菌はEPS産生を開始し、コミュニケーションネットワークを構築する。このような初期段階の集団は、クオラムセンシング（QS）を用いてライフサイクルに影響を与える細胞制御プロセスを制御する、マイクロコロニーと呼ばれるより高密度な集団へと進化する33。アシルホモセリンラクトン（AHL）などのQSシグナル分子は自己誘導物質と呼ばれ、通常細菌に由来し、宿主の腸管免疫に影響を与える可能性がある34。また、宿主由来の分子（ホルモンなど）が微生物のQSを活性化する可能性があることを示す証拠もある35。成熟したバイオフィルムの形成は、細菌の高い不均一性と、強固な細胞接着と保護を備えた多層バイオフィルムマトリックスを促進する。バイオフィルムの成長と発達はダイナミックであり、（1）浮遊性細菌がバイオフィルム構造体へと移動すること、（2）管腔バイオフィルム凝集体が粘膜バイオフィルムに付着すること、（3）非表面付着バイオフィルムが腸管管腔内で凝集することを可能にする（図2）32。バイオフィルムの成熟期には、一般的にバイオフィルムの中核部（栄養供給が低下し、そこに存在する細菌細胞にストレスを与える領域）に、代謝が低下したパーシスター／休眠細胞の亜集団（1％未満）が存在する36。成熟したバイオフィルムは遺伝子の水平伝播を促進し、特に変異率の加速の原因となって、より強化された耐性メカニズムの開発と分布につながる可能性がある37。最終的に、転写機構の変化を介したバイオフィルムの再構築の開始は、バイオフィルムの分散（バイオフィルムまたは浮遊細胞の放出）をもたらし、ライフサイクルを終了させ、バイオフィルムが拡大して他の表面をコロニー化することを可能にする38。小腸の連続的な蠕動運動は、バイオフィルムに分散した物質を近位部から遠位部へと移動させるが、盲腸は行き止まりのような状態である。
イオフィルムの産生は、ダイナミックでエネルギーを必要とするプロセスであり、細菌の卓越した空間的組織化をもたらす4,5。最もエネルギーを必要とするステップは、多糖類、タンパク質、脂質、細胞外DNAを含むEPSの合成と分泌である。EPSはまた、バイオポリマーとともにハイドロゲル状のバイオフィルムマトリックスを形成する、かなりの量の水分を含んでいる（図3）。EPSはバイオフィルム細胞の間を満たし、周囲の環境を形成し、消化管内腔に浮遊する食物粒子や宿主ムチンへの表面接着、細菌のクラスター化、凝集を促進する。マトリックスはバイオフィルムのバイオマスの約90％を占め、その構成成分は分子間および分子内相互作用を介して自己組織化し、機械的および化学的安定性をもたらす3次元ネットワークを形成する。バイオフィルムのマトリックスは、宿主の防御機構、腸の蠕動運動による機械的な力、および薬剤の浸透が遅いか不完全であることによる抗菌剤から保護する。
アミロイドやレクチンなどのタンパク質は、細菌細胞を周囲のマトリックスに結合させることで、バイオフィルム構造を安定化させる。嚢胞性線維症患者の肺組織を用いた最近の生体外分析によると、宿主由来の細胞外DNAはバイオフィルムのEPSマトリックスの外層に蓄積されるが、内層の細胞外DNAは細菌由来であることが示唆されている39。これが消化管バイオフィルムにも当てはまるのか、また他のEPS（例えばムチン）が主に細菌由来なのか宿主由来なのかは、まだ未解決の研究課題である。栄養素の利用可能性、環境ストレス、およびQS、ストリンジェント・レスポンス、セカンドメッセンジャーなどの制御機構もまた、マトリックス組成に影響を与える可能性があり、個々のバイオポリマーの化学的性質やその含有比率は細菌種によって異なる可能性がある。
これらを総合すると、バイオフィルムのライフサイクルは、環境の脅威に対して防御的な優位性をもたらす特殊な細菌構造の形成と確立を包含している。このようなバイオフィルム内には、バイオフィルムの増殖と拡大のための拡散を調節する、非常に効率的な情報伝達と制御のネットワークが存在する。薬剤の浸透性の低下や遺伝子の水平移動といった耐性機能は、抗生物質耐性の向上に寄与しており、その結果、バイオフィルム細胞はプランクトン細胞よりも最大で1000倍も保護されている。
バイオフィルムの有病率と疾患との関連性
複雑で多様な腸内細菌叢は、ヒトの生理、健康、疾病に影響を及ぼす。IBSとIBDは最も頻度の高い2つの消化器疾患であり、合わせて欧米の人口の10％以上が罹患している。最近の臨床研究では、IBS患者の57％、潰瘍性大腸炎（UC）患者の34％、クローン病（CD）患者の22％（健常者6％、オーストリアのコホートでは976人、ドイツのコホートでは450人）で、内視鏡的に粘膜バイオフィルムが確認された16。バイオフィルム陽性のUC患者とIBS患者は、バイオフィルム陰性の患者と比較してマイクロバイオームが変化しており、この所見は疾患の状態とは無関係であった16。バイオフィルム陽性患者では、細菌の多様性が増加し、総胆汁酸および一次胆汁酸の濃度が上昇していることが観察された。iofilm陽性患者では、Faecalibacterium属、Coprococcus属、Subdoligranulum属、Blautia属などの短鎖脂肪酸産生細菌属の存在量も減少していた16。腸内バイオフィルムの存在量が最も多かったのは、盲腸、回腸末端、上行結腸であった16。
IBS患者および健常対照者に比べ、BD患者では粘膜細菌密度が100倍以上増加しており、これもバイオフィルムを形成している可能性が高い45。IBS患者および非IBS患者のメタゲノム菌種解析による糞便マイクロバイオームプロファイリングでは、IBS患者の糞便マイクロバイオームシグネチャーが対照者と異なることが明らかになったが、IBS-便秘優位型（IBS-C）、IBS-下痢優位型（IBS-D）、IBS-混合型（IBS-M）のマイクロバイオームには有意差は認められなかった46。さらに、エタボローム・プロファイル解析により、胆汁酸吸収不良を伴うIBS-DおよびIBS-M患者のサブセットでは、糞便メタボロームが変化していることが明らかになり、同定された胆汁酸、アミノ酸、ペプチド、p-クレゾール硫酸の代謝物変化は、IBS症状の一因と考えられた46。
新たに発症した小児CD患者の複数の消化器官から採取した検体では、腸内細菌科、パスツレラカエア科、ヴェイヨネラ科、フソバクテリウム科などの細菌が過剰増殖し、エリシペロトリキア目、バクテロイデス目、クロストリジウム目などの細菌が減少しており、病型と相関していた47。患者の生検検体を分析した結果、IBD患者ではバクテロイデス・フラギリス（Bacteroides fragilis）グループがバイオフィルムの質量の60％以上を占めていたのに対し、IBS患者では15％未満であった45。IBD患者では健常対照群と比較して、上皮付着細菌の出現が増加しており48 、49、IBD患者の微生物叢から生体外で生成されたバイオフィルムは、健常者のものよりもサイズと細胞数が顕著である50。
バイオフィルムは、胃がんや大腸がんなどの他の消化器疾患にも関連している。興味深いことに、バイオフィルムは右側大腸腫瘍の89%で検出されたが、左側大腸腫瘍では12%でしか検出されなかった52。CRC患者の粘膜関連微生物叢には、Fusobacterium nucleatum、53EnterotoxigenicB fragilis、28genotoxin-producingE coli、54 Streptococcus gallolyticusなど、発癌に寄与することが知られている様々な菌株が含まれている。別の研究では、健常人とがん患者から採取したバイオフィルム陽性の生検検体をCRCマウスモデルに導入したところ、発がん性転帰が見られたが、バイオフィルム陰性の患者から採取した生検検体では観察されなかった29。
lostridioides difficileはグラム陽性の嫌気性芽胞形成菌で、健康なヒトの腸内に無症候性に定着する。抗生物質の大量使用や免疫機能の低下は、C difficileの過剰増殖の引き金となり、TcdAおよびTcdB毒素の濃度が上昇し、C difficile感染症（CDI）を引き起こす可能性がある。別の研究では、バイオフィルム陽性患者とバイオフィルム陰性患者の大腸から採取された毒素原性C difficile腫瘍スラリーは、いずれも腫瘍形成と関連していた24。
エリコバクター・ピロリはウレアーゼ産生菌であり、胃粘膜に容易に定着する。ピロリ菌は、消化性潰瘍、無胃酸症、胃体部優位型胃炎、胃がんなどの胃疾患の病因と関連している。消化性潰瘍患者のウレアーゼ陽性生検標本の表面の97％がバイオフィルムで覆われていたのに対し、ウレアーゼ陰性の対照群ではわずか1.6％であった研究で示されたように、ピロリ菌はバイオフィルムも形成しており、ピロリ菌のバイオフィルムの病原的役割を裏付けている59。
消化器疾患患者においてバイオフィルムの発生が増加しているという証拠が蓄積されているにもかかわらず、バイオフィルムの正確な疾患関連性については、さらなる調査が必要である。組織学的検査に使用されるカルネ固定などの一部の分析技術は、生物学的プローブに影響を与え、アーチファクトを引き起こす可能性があり、結果を解釈する際に考慮する必要がある潜在的なバイアスである。重要な知識の欠如には、バイオフィルムがどのように疾患の引き金となるのか、最も問題となる菌株／遺伝子はどれなのか、バイオフィルムが細菌の胆汁酸代謝をどのように変化させるのか、などに関する徹底的な理解が含まれる。これらの知識ギャップを解消することは、バイオフィルム関連病態の診断を強化し、バイオフィルムに特異的な治療戦略の開発を促進し、消化器疾患と抗菌薬耐性による社会経済的負担を軽減することにつながる。
バイオフィルム検出と臨床的意義
UC 患者の 3 人に 1 人、IBS 患者の 3 人に 2 人の頻度で見られることから16、ほとんどの経験豊富な内視鏡医は、大腸内視鏡検査中にバイオフィルムを見たことがあるであろう（図 3 、図 4 ）。糞便残渣からバイオフィルムを識別することは、診断および治療の指針として極めて重要であるが、バイオフィルムはしばしば見落とされたり、不完全な腸管前処置とみなされたりする。IBSおよびIBD患者では、内視鏡的に見えるバイオフィルムの有病率が高いにもかかわらず16、腸内バイオフィルムは、医学界ではまだかなり新しい概念であり、異なる腸管前処置がバイオフィルムの持続性および外観にどのように影響するかについてのデータは限られている。前述の研究では、大容量（＞2 L）のポリエチレングリコール製腸剤が使用され、Boston Bowel Prep Scoreが＞6であった患者のみが対象とされた。残念ながら、バイオフィルムマトリックスに特異的な染色法はまだ存在しない。
図4 ジェット洗浄前後の大腸および回腸バイオフィルムの大腸内視鏡画像。
60。染料噴霧の前提条件として、大腸壁には糞便の残渣がないことが必要である。しかし、大腸壁に強固に付着したバイオフィルムが存在する場合には、ジェット洗浄を行ったとしても、これを達成することは容易ではない。UCにおける内視鏡的サーベイランスに関する米国消化器病学会の勧告によれば、異形成発見のための条件と実践には、炎症のコントロール、高精細内視鏡の使用、腸の準備、および大腸バイオフィルムの除去を含むすべての大腸粘膜の入念な洗浄と検査が含まれる61。腸管粘膜の大部分を覆うバイオフィルムは、不完全な腸管洗浄と間違われることがあり（ビデオ1）、バイオフィルムの下に隠れている無柄のポリープの診断を遅らせる可能性がある。
糞便残渣と付着性バイオフィルムの違いは、以下の点から評価できる： 1）余分な層がジェットウォッシャーで簡単に除去できる場合は、糞便の可能性が高い；（2）洗浄が困難で、層が膜のように回腸結腸壁に付着している場合は、バイオフィルムの可能性が高い（ビデオ1 ）；（3）糞便は通常、重力により液体とともに底部に蓄積するが、バイオフィルムは多くの場合、完全な腸壁の周囲に360°の付着層を形成する（補足図1）16。
バイオフィルムの形成は細菌の胆汁酸代謝に影響を及ぼすため、回腸での胆汁酸脱共役作用が低下し、胆汁酸の吸収に影響を及ぼす可能性がある。回腸のバイオフィルムが厚いと回腸胆汁酸の再吸収が阻害される可能性があり、大腸の一次胆汁酸レベルが上昇すると、下痢や痛みなどの一般的な「機能性」GI症状が説明できる66。胆汁酸の変化の役割とバイオフィルムのライフサイクルおよびGI病態との関連については、さらなる研究が必要である。
大腸内視鏡検査を繰り返し行い、内視鏡的バイオフィルムの表現型（腸内の位置とバイオフィルムの巨視的外観、バイオフィルムのスコアリングシステムの補足表3を参照）をモニタリングした長期的な予備データから、このようなバイオフィルムは何年にもわたって持続する可能性があることが示唆された。ヒトにおける腸内バイオフィルムの縦断的な生理学的影響については、現在、知識のギャップが存在しており、バイオフィルム、消化管疾患、マイクロバイオーム組成、薬物、および栄養の相互影響を正確に明らかにするためには、より質の高い長期的研究が必要である。また、内視鏡による除去技術を用いたインターベンション研究も重要であり、GIバイオフィルムの動物モデルを確立することは、in vivoにおける基礎的な病態メカニズムの理解を深める上で極めて重要である。
内視鏡検査中のバイオフィルム除去に効果的な溶液を特定するため、in vitroおよびin vivoで数種類の創傷洗浄液が試験された。67,68回腸末端、盲腸、および上行結腸にエンドワッシャーを介してアクティマリス センシティブ（海塩濃度1.2 wt%、NaOCl 0.04 wt%、HOCl 0.004 wt%、pH 8.5）を1リットル塗布すれば、ほとんどのバイオフィルムを除去するのに通常十分である（図4 、ビデオ1 ）。IBS-MおよびIBS-D患者の腹部症状を治療するために、バイオフィルムを内視鏡的に除去するための対照臨床試験が進行中である。
バイオフィルムの形成は、微生物ストレスや微生物多様性の低下に対する反応であるようだ。抗生物質や食品添加物は、微生物の多様性の低下とバイオフィルム形成に寄与している可能性があり、食品の工業化がバイオフィルム形成頻度と関連していることは、欧米人の集団で観察されるIBSやIBDの有病率の高さと一致しており、もっともらしい。粘液分解や病原性／付着因子など、細菌の代謝や経路におけるバイオフィルム特異的なシフトを同定するために、縦断的メタトランスクリプトーム研究を実施すべきである。
ndoscopicallyに可視化されたバイオフィルムは、「特発性」胆汁酸吸収不良患者のバイオマーカーとして機能する可能性があり、因果関係をよりよく理解するために介入研究（すなわち、バイオフィルムの除去）を実施すべきである。バイオフィルムがIBSにおける消化器症状、IBDにおける炎症、または消化器腫瘍形成と相関するかどうか、そしてバイオフィルムの除去がこれらの疾患および症状の一部を軽減できるかどうかを研究するために、強力な縦断的研究が必要である。
治療介入戦略と機会
現在のバイオフィルム治療と抗生物質耐性の課題
現在までのところ、バイオフィルムに特異的な薬剤はなく、大腸内視鏡検査中のジェット洗浄がバイオフィルムを除去する唯一の選択肢となっている。抗生物質は細菌感染症に対して一般的に処方されるが、バイオフィルムではその有効性が低下する。さらに、投与量の増加や治療の長期化は、副作用やCDIの発症リスクを増大させるだけでなく、バイオフィルムですでに顕著になっている抗生物質耐性の世界的な問題の一因にもなっている6,72。最近、内視鏡検査中に局所的に適用された抗生物質が、大腸がんおよび腺腫患者の腫瘍の特徴や大腸バイオフィルムに及ぼす影響を検討する臨床試験が完了した（ClinicalTrials.govID: NCT04312360）。この研究の結果はまだ発表されていないが、このような治療法の有効性や患者の病勢進行への影響について新たな知見が得られるかもしれない。
標的治療によるバイオフィルムの選択的除去は、比較的新しく有望な戦略であるが、医療界や製薬業界ではまだ普及していない。バイオフィルムの研究と抗バイオフィルム薬の開発における重要なハードルは、治療の手がかりを評価し、in vivoでのバイオフィルムの構造と薬物標的の関与に関する知識を深めるためのGIバイオフィルム動物モデルがないことである。
バイオフィルム薬剤ターゲットと抗バイオフィルム戦略
73-75。本セクションでは、最新の抗バイオフィルム治療アプローチと薬剤開発の進歩を概説し、その可能性を胃腸での適用性に照らして評価する。現在の治療戦略は、(1) 細菌の接着を抑制する、(2) バイオフィルムの形成を阻害する、または (3) 成熟したバイオフィルムを根絶する介入に分類することができる（図5）。
図5 GIバイオフィルムに対する治療介入のための分子標的およびアプローチ。A ）バイオフィルム標的。ラグターゲットには、バイオフィルムマトリックス、制御ネットワーク、バイオフィルム形成細胞の分子標的およびメカニズムが含まれる。B ）バイオフィルム内常在細菌の標的。作用的標的には、排出ポンプ、タンパク質、DNA、転写・翻訳プロセス、細胞表面に発現するcurli、pili、アドヘシンなどの細胞間標的、抗生物質の取り込み促進が含まれる。C) バイオフィルムを標的とした戦略。治療的アプローチは、細菌表面の接着の阻害、バイオフィルム形成の阻害、成熟バイオフィルムの駆除など、バイオフィルムのライフサイクルのさまざまな段階に焦点を当てている。D ）腸内細菌叢の調節。ecalマイクロバイオーム移植とプロバイオティクスは、個人の腸内細菌叢を積極的に調整し、腸の恒常性を取り戻すための戦略である。
抗バイオフィルム評価 参考文献
細菌付着抑制
バイオフィルム形成 阻害
ndolicidina ウシ好中球由来抗菌 ペプチド In vitro116
L-37a抗菌 ペプチド Cathelicidin In vitro117
ヘニルアラニン-アルギニン β-ナフチルアミド、チオリダジン、N-メチル-2-ピロリドンb低分子 エフラックスポンプ阻害剤 In vitro108
ウラノフィンb低分子 抗リウマチ薬 In vitro73,109
erumboneおよびα-humulenea天然 物 天然物 In vitro113
成熟バイオフィルムの放射化
am-3a抗菌 ペプチド Defensin-1 アナログ In vitro119
-ロイシン、d-メチオニン
-トリプトファン、d-チロシン低分子 d-アミノ酸 In vitro81,82,86
低分子の 第4級アンモニウム化合物 In vivo74,87
イプロフロキサシン-ジニトロキシド結合体a低分子 ニトロキシド機能化抗生物質 In vitro88
バイオフィルムの抑制および駆除
金属ベースのナノ粒子（例：Ag、Fe、Cu、Zn、Mg、希土類金属）a ナノ粒子 金属ベースのナノ粒子 In vivo124,126,127
腸内細菌叢の調節
coliNissle 1917bプロバイオティクス - In vivo75,133
可能性のある治療戦略の要約（治療効果による分類
開発初期。
改善された。
イオフィルムによる予防戦略は、主に細菌の接着と再発を阻害することに重点を置いている。シャペロン-アッシャー経路は、ピリ生合成を制御する保存された分泌系であり、接着阻害の有望な標的である。ピリ生合成のためのモール分子阻害剤は、この経路をうまく破壊し、細菌の表面接着を阻害する。例えば、フラバノールであるミリセチンは、絨毛を介したバイオフィルム形成を阻害する代表的な化合物である77。他のアプローチでは、マンノシドなどの抗接着剤を用いて接着剤産生を阻害し、消化管コロニー形成を抑制する78。しかしながら、この接着阻害戦略に関するin vivoデータのほとんどは、肺感染症または創傷感染症の動物モデルで得られている76。
EPSマトリックスの産生を阻害することも治療戦略のひとつである。例えば、l-システイン、d-ロイシン、d-メチオニン、d-トリプトファン、およびd-チロシンは、個々にバイオフィルムの増殖を抑制し、成熟バイオフィルムの分散を誘発することができる。さらに、アスパラギン酸およびd-グルタミン酸のl-型およびd-型は、シプロフロキサシンと共投与すると、バイオフィルムの形成を阻害し、成熟したバイオフィルムを分散させることができる。d-アミノ酸のin vivo実験では、マウスにおける敗血症や肺炎感染を軽減するものがあることが明らかになったが、バイオフィルム動物モデルにおける抗バイオフィルム効果については、まだ検討されていない85,86。
第四級アンモニウム両親媒性化合物もまた、抗バイオフィルム効果を持つ興味深い化学物質群である。これらの化合物は、親油性のアルキル鎖に結合した親水性の第4級アンモニウム部分からなり、強力なバイオフィルム駆除特性を示す87。
例えば、シプロフロキサシン-ジニトロキシド結合体は、12.5μMで大腸菌のバイオフィルムを効果的に駆除した88。また、種特異的なバイオフィルム標的化を可能にする可能性のある別の戦略として、コリシン系抗生物質を用いて、CD患者の細菌性腸内細菌異常症に関連する付着性侵入性大腸菌と効率的に闘うことができる89。多種の細菌からなるバイオフィルムの複雑で不均一な集合体の中で、個々の細菌種を選択的に標的とするバイオフィルム戦略は、常在菌に影響を与えないという点で特に魅力的である。
バイオフィルム内のエルシスター細胞は休眠状態に入ることがあり、抗生物質の標的が減少または減少するために高い抗生物質耐性を示す。このような細胞は根絶が難しく、バイオフィルムの再発を助長するため、難題となっている90。有望な抗パーシスター薬候補は、代謝的に独立した細菌二重層を標的とするか、休眠状態から活性状態への移行を誘導し、抗生物質感受性を回復させるかのいずれかである91 、92。例えば、ペルシスター細胞を糖レベルの上昇にさらすことで、代謝と抗菌標的活性を回復させることができる93。ペルシスター細胞を目覚めさせることで、細胞増殖速度も上昇し、薬剤の取り込みと効果を高めることができる94,95。
S、ストリンジェント・レスポンス、セカンダリー・メッセンジャーは、バイオフィルムの行動、機能、構造を制御する多様な制御ネットワークである。QS中に自己誘導物質が発現・検出されることで、細菌は細胞密度を監視・制御し、群れの運動性、遺伝子発現、バイオフィルム形成を制御することができる96。QSの細菌コミュニケーションシステムを阻害する薬剤は、クオラムクエンチャーと呼ばれる。大腸菌はAHL合成酵素を持たず、AHLを合成しないが、大腸菌の細胞分裂とバイオフィルム形成に関与するsdiA遺伝子を制御する細胞分裂抑制因子であるAHL応答性転写制御因子SdiAを介してAHLに応答する100。QSは、バイオフィルムに特徴的な高密度の細菌集合体において特に顕著であるため、細菌のQSを標的とすることは、バイオフィルム特異的薬剤を開発するための有望な戦略である。
脂肪酸メッセンジャーであるシス-2-デカン酸は、緑膿菌、大腸菌、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）を含む多くの菌種でバイオフィルムを分散させ、バイオフィルム形成を阻害したり、バイオフィルム分散の引き金になったりする。101-103。このようなマトリックス分散性分子は、バイオフィルムの再増殖を防ぐために抗菌薬と併用できる可能性がある。
よく知られた例として、大腸菌のAcrAB-TolC排出ポンプシステムがあり、アミノグリコシド、フルオロキノロン、テトラサイクリン、リファンピシン、カルバペネムなどの抗生物質を効果的に排出する。106、107バイオフィルムでは、排出ポンプはQSシグナル分子やEPSの分泌に重要な役割を果たしている。特に、フェニルアラニン-アルギニンβ-ナフチルアミド、チオリダジン、N-メチル-2-ピロリドンの3種類の排出ポンプ阻害剤は、大腸菌のバイオフィルム形成を有意に減少させた108。さらに、抗リウマチ薬であるオーラノフィンは、耐性-結節-分裂型排出ポンプの発現に関与するbmB3遺伝子の発現を低下させることにより、B fragilisのバイオフィルム形成に影響を及ぼす109。オーラノフィンや多様な排出ポンプ阻害剤のような認可された薬剤の、消化管バイオフィルムを標的とした有効性はまだ明らかにされていないが、従来の薬剤の再利用は、臨床研究への迅速なアクセスを可能にする大きな可能性を秘めている。
天然物の化学的・構造的多様性は、抗バイオフィルムのリード化合物を含む創薬の重要な資源である。例えば、ニンニク、シナモン、ショウガ、イチョウ、クランベリー、柑橘類から抽出された有数のエキスは、抗バイオフィルム特性を示す。例えばハムノリピッドは、アルカン脂肪酸鎖に結合したラムノース糖部分から成り、S mutansや Streptococcus sanguinisを含むいくつかの病原菌のバイオフィルム形成を阻害することができる。
例えば、インドリシジンはウシ好中球の細胞質顆粒に由来する13残基のAMPで、細胞壁を破壊することなく浸透し、細菌のDNA合成を阻害する。他の例としては、カテリシジン由来のヒト宿主防御ペプチドLL-37があり、これは細菌の接着を阻止し、QSを担う遺伝子をダウンレギュレートする。β-ディフェンシン1のディフェンシン断片修飾による最適化により、常在菌に害を与えることなく消化管病原性バイオフィルムに有効な抗菌ペプチド（AMP）Pam-3が開発された119。しかしながら、経口腸管安定性ペプチドの開発における有望な新たな進歩により、この戦略は最も有望で革新的な戦略のひとつとなるかもしれない120 、121。特に、治療リードから薬剤候補開発までの時間が早いこと、また、ペプチドのサイズが大きいため腸血液関門の通過が制限され、腸に制限された非全身の作用が期待できる122。
一般的に1～100nmの大きさのナノ粒子は、治療への応用、特に腸特異的な作用に有望である。例えば、銀、鉄、銅、亜鉛、マグネシウム、希土類金属をベースとした金属系ナノ粒子などである124,126,127。
GIバイオフィルムと闘うためのもうひとつの治療法として、プロバイオティクスまたは糞便微生物叢移植（FMT）を用いて腸内細菌叢を変化または刺激する方法がある。プロバイオティクスは腸内細菌叢を変化させ、病原性細菌の（再）コロニー形成、バイオフィルム形成、粘膜バリアへの浸潤を予防する可能性がある。感染性下痢、抗生物質関連下痢、肝性脳症、UC、IBSなどの消化器疾患において、多くのプロバイオティクスが有益な効果を示している。
プロバイオティクス菌株の望ましい特性には、腸管表面への良好な接着性や消化管内での滞留時間の延長などがあり、これらは健康な腸内細菌叢を回復し、腸の恒常性を促進するために必要である。例えば、プロバイオティクス大腸菌ニッスル1917による治療は、腸管病原性大腸菌または腸管毒素原性大腸菌感染によって引き起こされる消化管障害に対する有望な戦略であるが、これは非病原性大腸菌ニッスル1917が病原性菌株のバイオフィルム形成能に勝るためである。大腸菌Nissle 1917は「一般的に安全とみなされる（Generally Regarded As Safe）」ステータスを保持しているが、この細菌はコリバクチンという遺伝毒素を産生し、マウス腸管コロニー形成モデルにおいてin vivo毒性とDNA損傷作用が認められた135。
さらに、プロバイオティクスの特性を持つ特定の乳酸菌種は、抗菌、抗付着、抗バイオフィルム分子を分泌するため、病原性バイオフィルムのコロニー形成に対抗するのに適している。アクチカセイバシラス・パラカゼイATCC334はペクチン酸カルシウムビーズ上にバイオフィルムを形成することができ、マウスに経口投与すると、このビーズが大腸内のバイオフィルムコロニーを放出し、炎症と大腸粘膜の損傷を軽減することで大腸炎の重症度を緩和する139。胆汁酸変換酵素を持つプロバイオティクス株も、細菌の胆汁酸代謝の改変とバイオフィルム形成の相関関係が解明されれば、新たな治療の道を開く可能性がある。こうした有望な結果にもかかわらず、プロバイオティクスの使用は、免疫系の過剰刺激、全身感染、有害な代謝活性、遺伝子導入の促進などの副作用の可能性があるため、依然として議論の的となっている140。
MTでは、健康なドナーから疾患のあるレシピエントへの糞便の移植が行われ、細菌の多様性を増加させ、病原性細菌の過剰増殖を減少させることによって健康な腸内細菌叢を回復させることにより、健康に有益で理想的には疾患解決の結果を得ることを目的としている（図5）141。MTの長期的な効果はまだ十分に理解されておらず、食品医薬品局は追跡感染に関する警告を発表した142-144。
もう1つの有望な生物療法は、RebyotaやVowstのような糞便微生物製剤である。レビオタは直腸に投与され、再発性CDI患者の抗生物質投与後の治療薬として承認された市場で最初の糞便微生物製剤である145。もう一つの糞便微生物製剤であるバウストは、再発性CDIの予防を目的としたファースト・イン・クラスの経口投与製剤として承認を受けた。
様々なクラスの化合物についてin vitroで観察された有望な抗バイオフィルム効果にもかかわらず、ベンチからベッドサイドへの移行における現在の主要な制限は、適切なGIバイオフィルム動物モデルがないことである。このようなモデルを開発することは、薬剤の有効性、効力、および安全性に関する知識のギャップを埋めるために極めて重要であり、前臨床in vivoデータを用いた薬剤開発の取り組みを強化することになる。
結論と展望
Iバイオフィルムは、回盲部腸管領域で内視鏡的に可視化されることがあり、IBD、IBS、胃がん、大腸がんと関連する患者もいる。IBDやIBS、胃がん、大腸がんなどの一部の患者との関連が指摘されており、臨床医や研究者の間で注目度が高まっている。ヒトの生理機能との関連性を完全に把握するためには、健康な腸からバイオフィルムが蔓延する疾患状態への移行に関与する因子に関するさらなる研究が必要である。不健康なバイオフィルム」状態を定義する目のマーカーはほとんど不明であり、粘膜細菌密度の増加、上皮接着性の変化、宿主微小環境の正確な役割と影響は、依然として未解決の研究課題である。このような疑問の解決には、微生物-微生物間および宿主-微生物間の相互作用、宿主免疫系の正確な寄与、バイオフィルムが宿主の防御反応を回避する方法など、ヒトにおける消化管バイオフィルム形成の基礎となるメカニズムの詳細な理解が必要である。このような研究は、バイオフィルムの病態生理学的役割を評価するために不可欠であり、早期の診断と介入を可能にするバイオマーカーの同定に役立つ可能性がある。ヒトバイオフィルムフラッシュのx vivo検査は、プロテオミクス、トランスクリプトミクス、メタボロミクスによる貴重な解析を可能にし、主要な病原株や遺伝子を同定するための分類学的シフトに関する貴重な洞察を提供する。内視鏡的に可視化されたバイオフィルムと疾患表現型とをより適切に関連付けるためには、患者におけるバイオフィルムの縦断的役割を調査する大規模コホート研究が必要である。さらに、例えばジェット洗浄による消化器疾患患者におけるバイオフィルム除去の効果に関する臨床研究は、そのような治療の長期的効果を評価し、バイオフィルムと消化器疾患および症状との因果関係／相関関係についての重要な洞察を明らかにするために重要である。最終的には、臨床的表現型との関連付けを行いながら、より大規模な患者コホートにおいてバイオフィルムを除去し、再発を予防するために、非侵襲的で安全かつ効率的で、理想的には病原性バイオフィルムに特異的な治療法が必要となる。そのため、EPSマトリックスの正確な組成、宿主の生体高分子の関与、その化学的・物理的特性を明らかにし、効果的な薬剤の浸透と治療標的を可能にすることが極めて重要である。疾患におけるバイオフィルムの関連性を効果的に研究し、腸に特異的な抗バイオフィルム薬や治療アプローチを臨床に応用するためには、代表的な多種バイオフィルム動物モデルが最も重要である。このような動物モデルの欠如は、前臨床治療研究の大きなボトルネックとなっており、腸内バイオフィルムの病因を研究する我々の能力を制限している。このような研究を通じて腸内バイオフィルムの理解を深めることは、消化器疾患における腸内バイオフィルムの役割についてのより有意義な洞察をもたらし、腸内バイオフィルムを制御する新たな治療戦略への道を開くことになるであろう。
補足資料 (1)
ビデオ1
内視鏡検査中の患者におけるiofilmの検出と除去。
補足図1 内視鏡によるバイオフィルムの連続性（A ）と付着性（B ）によるスコアリング。
1) 腸管細胞 腸管細胞は腸内で最も豊富な細胞であり、物理的バリアとして機能し、細菌の侵入を積極的に阻止する。腸管細胞はまた、サイトカインを産生し、宿主の免疫応答を調整する。そのほか、病原体の中和、免疫排除、微生物叢の調節、アレルゲンの中和、腸内の免疫寛容を担う免疫グロブリンA抗体を誘導することで、微生物叢と腸の間の恒常性を支えているe2。
2) ゴブレット細胞 ゴブレット細胞は大量のムチンタンパク質を産生・分泌し、腸管上皮表面を覆って細菌の侵入を防いでいる。小球細胞はまた、トレフォイル因子ファミリーe3やAMPを含む様々な防御ペプチドを分泌し、腸をダメージから守り、健全な微生物叢を維持するのを助けている。
3) パネス細胞 パネス細胞は小腸の「リーベルキューンの陰窩」の底部に存在し、小腸内の微生物集団を制御し、近傍の幹細胞を保護することによって、自然発生的な腸管防御の重要な部分を形成している。アネス細胞は、ヒトの腸内に最も多く存在するAMPである抗菌性α-ディフェンシンペプチドを大量に産生するe4。これらのペプチドはグラム陰性菌とグラム陽性菌を標的としており、その結果、上皮の近くはほとんど細菌がいない環境になるe4, e5
4）腸内分泌細胞 腸内分泌細胞は小腸の上皮細胞集団の約1％を占め、上皮のバリア機能と免疫細胞に影響を与える。それに応答して、増殖性抗アポトーシス作用や抗炎症作用を持つグルカゴン様ペプチドや、バリア機能に直接影響を与えるサイトカインを発現するe7。
5）マイクロフォールド細胞 マイクロフォールド細胞は、小腸のパイエル板を含むリンパ組織に存在する特殊な腸管上皮細胞で、粘膜および全身の免疫応答に貢献している。これらの細胞は、管腔抗原や大腸菌を含む微生物全体を活発に経上皮的に輸送し、免疫応答としてこれらの内容物を貪食することができるe8。
補足表1ヒトの細胞防御機能
増加 減少 参考文献
過敏性腸症候群B fragilis/ovatus +e9, e10
オリデクストリバクター種＋e9
インビスカス ＋e9
レンタ +e9
ハセウェイ +e9
フィリフォルミス +e9
ペクチノシチザ +e9
スパンクニクス +e9
アティピカ +e9
ローレン病バクテロイデス目 ＋e11
ロストリジアル属 ＋11
リシペロトリキア目 +e11
prausnitzii +e12, e13
菌毒素原性B fragilis +e14～e17
腸内細菌科 +e11
腸内細菌科 +e11
asteurellacaea属 +e11
緑膿菌 +e14-e17
エリロネラ科 ＋e11
潰瘍性大腸炎F peridonticum +e9
無毒化B菌 +e14-e17
ラウティア属 +e9
大腸菌 ＋e9
プラウスナイシチー ＋e9
インフルエンザ菌 +e9
レブシエラ属 +e9
ガーナバス +e9
緑膿菌 ＋e14～e17
肛門がん 腸管毒素原性B型フラジリス ＋e18、e19
エノトキシン産生性大腸菌 +e19～e22
ヌクレアタム ＋e18、e19
ガロリティカス +e23
ロストリジウム・ディフィシル感染症C difficile +e24 e25, e26
胃潰瘍ピロリ菌 ＋e27
胃がんピロリ 菌＋e28～e30
健康な人バクテロイデーテス ＋e31
ビフィダム ＋e9
ラモサム +e9
腸内細菌科 ＋31
アクノスピラ科 ＋31
gnavus属 ＋e9
補足表2細菌バイオフィルムと関連する腸疾患と対応する細菌シグネチャー
大量PEG腸管前処置後の内視鏡所見、BBPS≧6
腸管残渣 バイオフィルム
盲腸と直腸の間の任意の場所 腸腰筋±上行結腸
形態 斑状 緑黄色の連続層、時に斑状
下側で高濃度a全面に 同様のパターン
洗浄膜として剥がれる。
オストウォッシュ残渣 NBIを使用しても残渣なし NBIを使用しても赤斑あり
補足 表3内視鏡的バイオフィルムの定義
BPS、Boston Bowel Prep Score；NBI、narrow-band imaging；PEG、ポリエチレングリコール。
重力による
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