グルココルチコイドによる天然型IgEの誘導

論文|2022年9月13日号
グルココルチコイドによる天然型IgEの誘導

https://rupress.org/jem/article/219/10/e20220903/213459/Induction-of-natural-IgE-by-glucocorticoidsIgE?searchresult=1

特別収録：2022年 実験医学の年
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著者・論文情報
J Exp Med (2022) 219 (10): e20220903.
https://doi.org/10.1084/jem.20220903
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IgEは、肥満細胞や好塩基球の表面を覆い、特定のアレルゲンと結合すると脱顆粒を誘導することで、アレルギー反応を媒介する。しかし、このような「天然」IgEの起源、制御、機能については、いまだほとんど分かっていない。我々は、グルココルチコイドが、in vivoおよびex vivoにおいて、抗原提示なしにB細胞におけるIgEの産生を促進することを見出した。このようなIgE産生は、CD40シグナルを強化し、IL-4/STAT6経路と相乗的に作用するB細胞内在性のグルココルチコイド受容体シグナルによって促進されることが判明した。さらに、腸間膜リンパ節に存在する希少なB細胞がグルココルチコイド誘導性IgEの産生を担っていることを明らかにした。さらに、腸内で局所的に産生されたグルココルチコイドは、腸内環境の乱れ（dysbiosisなど）の際に、天然のIgEを誘導する可能性がある。特に、グルココルチコイドを先制投与したマウスは、その後の病原性アナフィラキシーから保護された。これらの結果から、グルココルチコイドは広範な免疫抑制作用を持つと考えられているが、B細胞においては選択的な免疫賦活作用を持つことが示唆された。

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はじめに
アレルギーは、世界中で何億人もの人々に影響を与える主要な慢性疾患であり、2型免疫応答を活性化することによって、花粉やピーナッツなどの多様で一見無害な環境刺激を標的とする（Lloyd and Snelgrove, 2018; Palm et al.） 細菌やウイルスなどの病原体を扱う1型免疫とは異なり、2型免疫はマクロ寄生虫、有害化学物質、毒素から身体を防御します（Iwasaki and Medzhitov, 2015; Palm et al.、2012）。タイプ2免疫は、IgEおよびIgG1抗体を分泌するB細胞と並んで、主にTヘルパー2細胞によって媒介されます（Lloyd and Snelgrove、2018；Palm et al.、2012）。アレルゲンおよびT細胞シグナルの最初の存在下で、アレルゲン特異的B細胞は、クラススイッチ組換えおよび体細胞超変異（SHM）を受けて、高親和性IgEを生成し、これは、マスト細胞および好塩基球などの自然免疫センチネルの表面上に発現する高親和性Fcイプシロン受容体I（FcεRI）を被覆します（He et al.2015; Oettgen, 2016; Stavnezer and Schrader, 2014）。IgEが介在する炎症性エフェクター反応（血管外遊出、粘液分泌、腸蠕動など）は、蠕虫や有害化学物質に対する防御と考えられているが、方向性を誤ったり過剰になったりすると病的にもなり得る（Anthony et al.、2007；Palm et al.、2012）。実際、典型的な非有害アレルゲンと結合すると、アレルゲン特異的IgEはFcεRI受容体を架橋し、肥満細胞および好塩基球にヒスタミンのような炎症メディエーターを放出させ、軽度のかゆみから生命を脅かす低血圧および気道閉鎖を伴うアナフィラキシーショックまで下流症状を誘発しうる（Galli and Tsai, 2012; Kelly and Grayson, 2016; Reber et al.、2017）。

不思議なことに、IgEはまた、特定の環境アレルゲンまたはマイクロバイオータもしくは食物駆動型抗原がない場合でも、抗原提示またはT細胞コスティミュレーションとは無関係に、自発的に誘導され得る（McCoyら、2006；PabstおよびSlack、2020年）。このようなIgE抗体は、同様の幅広い特異性を有する天然IgM抗体にちなんで「天然」IgEと呼ばれ（McCoyら、2006）、がん監視または皮膚バリア防御において恒常的な役割を果たすと考えられる（Crawfordら、2018; Hayesら、2020）。したがって、天然IgEの自発的な誘導および恒常性能力は、生理的または環境的なシグナルが、潜在的に保護的な役割を有する天然IgEの基礎レベルを誘導するのに十分である可能性を示唆するものである。例えば、無菌マウスは、基礎IgEレベル及び食物抗原依存性の腸Tヘルパー2細胞応答の増加（Hongら、2019；Kimら、2016）、並びにIgEの切り替えに必要なεGLTs（イプシロン生殖系列転写物）の腸間膜LN（mLN）における発現の増加を示す（Cahenzliら、2013；Hillら、2012）。さらに、広域抗生物質またはtoll様受容体シグナル伝達の遺伝的欠陥によって誘発される腸内細菌症は、IgEレベルの上昇と同様に炎症の増加と関連しており、炎症シグナルと結合した乱れた微生物シグナルがIgE誘導を促進する可能性を示唆している（Gavinら、2006； Hillら、2012；Schnareら、2001；Wesemann and Nagler、2016）。しかしながら、そのような広範な特異的または非特異的な天然IgEがどのように産生され、どのような機能を有するかは依然として不明である（Kelly and Grayson, 2016）。

グルココルチコイドは、一般的なストレス反応に関与する内因性ステロイドホルモンのシグナルであり、アレルギー治療のための免疫抑制薬として使用されている（Cain and Cidlowski, 2017）。しかし、最近の文献では、グルココルチコイドは免疫応答に対して細胞型特異的かつ用量依存的な効果を有し、これはその複数の作用様式と一致する（Franco et al., 2019; Sasse et al., 2019; Weikum et al., 2017）と仮定されている。B細胞において、グルココルチコイドは、B細胞の成熟および寿命を変えることが示されており、これは、下流の抗体産生または特定の抗原に対する親和性を規定し得る（Cainら、2020年；Gruver-Yatesら、2014年）。副腎皮質ホルモンはまた、ヒト及びマウスのT細胞における2型サイトカイン産生を変化させることによって（Blottaら、1997；Ohnishiら、2008）、及びCD40L-CD40を調節することによってヒト末梢血単核細胞（PBMC）におけるIgEレベルを増加又は低下させることによってアレルギー反応に関与してきた（Jabaraら、2001；Salviら、2000）。しかしながら、多面的な作用のために、アレルギーにおけるグルココルチコイドの詳細な分子機構や機能は議論されており、現在でも十分に理解されていない（Lane and Kemeny, 1994; Pullerits et al.）

本論文では、グルココルチコイドがB細胞に直接作用して、アレルギー防御機能を有する「天然」IgEの合成を促進することを明らかにする。我々は、「天然」IgEを、実験的に投与した抗原の非存在下で誘導されるIgEと定義している。我々は、マウスB細胞培養系を用い、グルココルチコイドが、CD40シグナルを強化・置換することにより、B細胞のIgEへのクラススイッチ組み換えを、B細胞内在性かつIL-4/STAT6依存性に誘導することを見出した。また、グルココルチコイドは、実験的に加えた抗原がないin vivoでの基礎的な天然IgEの上昇につながり、それはmLNにおけるプラズマブラスト様の特徴を持つまれなB細胞によって局所的に分泌された。注目すべきは、グルココルチコイドによって誘導された天然IgEが、その後のアナフィラキシー反応の大きさを鈍化させたことである。つまり、私たちの研究は、グルココルチコイドと天然型IgEの関係を確立し、アレルギーにおける天然型IgEとそのB細胞産生の潜在的特性を明らかにすることができる。

研究成果
グルココルチコイドは生体外B細胞におけるIgEスイッチングを増加させる
天然型IgEの存在は確認されているが(McCoy et al., 2006)、天然型IgEの産生を誘導する内因性シグナルは、特に抗原性のチャレンジがない場合には、まだ同定されていない。我々は、正常血清中に存在し、IgE産生に影響を与える内因性シグナル分子が存在するかどうかを検討した。この目的のために、我々は生体外培養を用いてIgEクラススイッチ組み換えの有効性をスクリーニングする実験を行った。これにより、成熟したナイーブ脾臓B細胞がIL-4とCD40Lによって刺激され、IgEスイッチングが起こる（図1 Aおよび図S1、AおよびB；Gehaら、2003年）。我々は、一過性の血清飢餓が、IL-4とCD40Lの刺激存在下でもIgEへのクラススイッチングを減少させることを発見した（図1 Aと図S1 C）。しかし、同じ条件下でIgG1クラススイッチにはほとんど影響がなかったことから、IgEの減少はクラススイッチの組換えにおける一般的な欠陥に起因するものではないことが示唆された。正常なFBSは多様な因子からなる未知の組成を有するため、IgEのクラススイッチ組み換えを促進する血清中の特定の因子を特定することは困難であった（van der Valk, 2022）。そこで、血清欠乏時にIgE+ B細胞の減少に関与する特定の因子を特定するために、まず、神経細胞や幹細胞を培養するための化学的に定義された血清の代替物であるB-27を利用して、FBSの未定義の組成を回避した（Brewer et al,1993）。興味深いことに、B-27の添加により、無血清（SF）培養条件でのIgEスイッチングの減少が完全に解消された。このことは、B-27がIgEスイッチングを引き起こす1つ以上の因子を含むことを示唆している（図S1 D）。候補を絞り込むために、抗酸化物質、ビタミンA、インスリンなどの成分のサブセットを欠くB-27変種をSF培養に補充したが、これらの定義された変種はいずれもIgEスイッチングの欠損を示さなかった（図S1 D）。さらに、煮沸したFBSはB細胞のIgEスイッチングを減少させなかったことから、血清中のタンパク質成分はIgEスイッチングに関与していないことが示唆された（図S1 E）。B-27の残りの非タンパク質成分を調べるために、化学的に定義された脂質、プロゲステロン、または甲状腺ホルモン（T3）もSF条件に加えたが、IgEスイッチングの有意な回復は観察できなかった（図S1、FとG；および表S1）。

興味深いことに、B-27やFBSにも含まれるステロイド系ストレスホルモンであるグルココルチコイドがIgEスイッチングに寄与することを見出した。コルチコステロン（Cort）およびグルココルチコイド受容体（GR）に対する親和性の高い合成グルココルチコイドであるデキサメタゾン（DEX）は、いずれもSF条件においてIgE+ B細胞の割合を著しく回復させた（図1 Bおよび図S1 H）。さらに、コントロールの完全培地中にCortまたはDEXを添加すると、IgEスイッチングがさらに増加した（図1 C）。この条件では、IgG1+ B細胞もDEXによってわずかに増加した（図S1 I）。しかし、IgEスイッチングに必要なεGLTは、このようなDEX処理によって選択的に増加することが確認され、少なくとも我々のex vivo環境ではIgMからIgEへの直接的なIgEスイッチングが示唆された（図1 D）。これらの観察と一致して、コントロールの完全培地で培養したB細胞をGR阻害剤であるRU-486とインキュベートすると、IgG1クラスのスイッチングではなく、IgEが著しく阻害された（図1 Eおよび図S1 J）。さらに、Nr3c1 GR遺伝子をB細胞特異的に欠失させたマウス（Cd19-CreまたはMb1-CreによるcKO）のB細胞の完全培地培養にDEXを添加しても、IgEクラススイッチングは増加しなかった（図1のFとG、および図S1のKとL）。このように、我々のデータは、グルココルチコイドが生体外においてB細胞内在性の方法でIgEへのクラススイッチングを誘導することを示唆している。

グルココルチコイドはCD40シグナルとプラズマブラスト様遺伝子の発現を強化する
次に、グルココルチコイドがどのようにしてIgEスイッチングを誘導するのかについて検討した。メカニズム的には、IL-4/IL-4Rシグナルを介したSTAT6転写因子の活性化がIgEスイッチングに重要であると文献に記載されている（Linehan et al.、1998）。DEXは、Stat6ノックアウトマウスの成熟ナイーブ脾臓B細胞のex vivo培養においてIgEスイッチングを誘導できなかったことから、グルココルチコイドによるIgEスイッチングの誘導は、STAT6に依存すると考えられる（図2 A）。これと同様に、IL-4を培養液から除去したWT B細胞では、DEXによってIgEスイッチングが誘導されなかった（図2 B）。しかし、興味深いことに、CD40L刺激を除去したB細胞では、DEXによるIgEスイッチングの有意な誘導が観察され、少なくともex vivoでは、グルココルチコイドがCD40Lの喪失を補償している可能性を示唆している（図2B）。根底にある分子メカニズムをよりよく理解するために、DEXの添加または無添加でex vivo培養したB細胞に対してRNA配列決定（RNA-seq）を行った（図2 C、図S2 A、および表S2）。先の概念を支持し、B細胞におけるCD40シグナルの重要な標的であるNF-κBは、RNA-seqデータにおいてDEXによって著しく活性化された（図2 D; Gehaら、2003；Luoら、2018； Mizuno及びRothstein、2005）。グルココルチコイドは、NF-κB標的転写を活性化するよりもむしろ阻害することが正統的に知られているので（Tan及びWahli、2016）、NF-κBの阻害剤であるIκBa、及びNF-κBの下流標的であるIRF4（Grumont及びGerondakis、2000）のタンパク質レベルを測定して、DEXにより実際にNF-κBを活性化できるかどうかを検証した。我々のシークエンスデータと一致して、培養B細胞におけるIκBaのレベルはDEXによって減少し、IRF4のレベルは増加した（図2 E）。さらに、選択的NF-κB阻害剤（TPCA-1、IκBキナーゼの可逆的阻害剤）を用いてDEX処理中のNF-κB活性化を抑制すると、DEXの効果が反転した（図S2 B）。しかし、注目すべきは、GRと免疫グロブリン遺伝子との結合やIgH遺伝子座のクロマチンアクセスの変化は検出されなかったことである（図S2 C）。したがって、我々のデータは、グルココルチコイドがB細胞においてCD40L/CD40のNF-κBへのシグナル伝達を促進し、下流のIgEクラススイッチングを誘導することを総合的に示唆している。

さらに、高分割IgE+ B細胞（>5分割）がDEX処理により特異的に増加することを見出した（図S2 D）。IgE+ B細胞の活性化は細胞増殖と密接に関連していることから（Wuら、2017）、DEXはB細胞の活性化をサポートし、IgE産生を促進する可能性がある。DEXがIgE+ B細胞に特異的に及ぼす影響を調べるため、培養後に選別したIgE+ B細胞の全RNAをFACSにより配列決定した（図2 Fおよび図S2 A）。対照のIgE+ B細胞と比較して、DEX処理IgE+ B細胞は、Prdm1、Cd93、およびXbp1を含む、より強いプラズマブラスト様シグネチャを示した（図2 Fおよび表S2；Brynjolfssonら、2018；Crooteら、2018；Glarosら、2021）。さらに、DEXは、分化するプラズマブラスト／プラズマ細胞または未成熟B細胞のいずれかであり得るCD93＋B細胞におけるIgEスイッチングを増強することができ、後者は、直接IgEスイッチングの増加を通じてIgG1よりもIgEに優先的にスイッチすることが以前に報告されている（図2 Gおよび図S2 E；Wesemann et al.、2011）。したがって、我々のデータは、グルココルチコイドが、B細胞の成熟および運命を変えることによって、IgE産生の方向に偏り、その舞台を設定する、B細胞における明確なトランスクリプトームを確立する可能性があることを示唆するものである。

グルココルチコイドは、in vivoでmLNに天然型IgEを誘導する。
次に、グルココルチコイドへの曝露がin vivoでの抗体産生に影響するかどうかを評価するために、WT C57BL/6J (B6; "野生型") マウスにDEXまたは対照薬を飲料水から全身投与した（図3 Aおよび図S3 A）。興味深いことに、WTマウスはDEX投与2週目および4週目に血漿中IgEの基底レベルを上昇させたが（図3 A）、他の抗体アイソタイプはほとんど影響を受けなかった（図3 B）。ナイーブなWTマウスでは基礎IgEは一般に低く、また、刺激のないマウスは病原体のない特定の環境で飼育されていたことから、DEXによって誘導されるIgEの特異性は「天然」IgEの幅広い特異性を反映していると推測される（McCoy et al.、2006）。一方、B細胞のみGRを欠損したcKOマウスでは、4週間のDEX処理後も血漿中IgEの上昇は認められず、DEX依存的IgE反応のB細胞内在性が強調された（図3C）。しかし、B細胞特異的なGRの欠失は、定常状態におけるIgEのベースライン・レベルに影響を与えなかった。このことは、グルココルチコイドを介したIgE産生が、ベースラインのIgEレベルに構成的に寄与するというよりむしろ誘導的に寄与することを示唆している（図3-C）。さらに、T細胞特異的GRノックアウトマウスにおいても、DEXはIgEレベルを上昇させることが確認された（図S3 B）。しかしながら、IL-4の主要な供給源と考えられるCD4+細胞の枯渇は、実際にin vivoでの天然IgE誘導を消失させることがわかり（図S3 C）、これは天然IgEに関する以前の研究（McCoyら、2006）と一致する。グルココルチコイド誘導性IgEの産生が、ex vivoでのCD40L/CD40シグナルに依存しないことを考えると（図2）、IL-4の要件にもかかわらず、同族T細胞の助けが天然IgEの合成に必要ではない可能性もある。しかし、これについてはさらに調査が必要であろう。以上の結果から、グルココルチコイドへの曝露は、in vivoでのIgEの誘導を増加させること、また、グルココルチコイドによるそのような天然IgEの誘導は、B細胞内在性でIL-4に依存することが示された。

さらに、我々は生体内で推定される天然のIgE分泌B細胞を同定することを試みた。IgE産生細胞は生体内で検出することが困難であるため、我々はまず、グルココルチコイド誘導性IgEがどこで産生されるかを間接的に理解する方法をとった。特定の組織における局所的なIgE濃度の代理として、濾胞（FO）B細胞上のIgEの低親和性受容体（CD23またはFcεRII）に結合した表面IgEのレベルを分析することにより、腸排液LNは皮膚排液LNまたは脾臓よりもIgEレベルが高いことを観察した（図3 Dおよび図S3 D；材料および方法）。このことは、B6マウスでは、低レベルではあるが、定常状態では、IgEは主に腸排液性LNで局所的に産生されていることを示唆している。この観察と一致して、DEX投与マウスは回腸および結腸LNのFO B細胞上の結合IgEレベルの増加を維持し、これは循環中の総IgEレベルとも相関していた（図S3 E）。

さらに、in vivoで天然のIgE分泌B細胞を直接同定するために、IgE発現細胞を蛍光金星タンパク質（黄色蛍光タンパク質誘導体）で標識するIgEレポーターマウスと並行してフローサイトメトリー染色を利用した（Yang et al. この方法により、非IgE+ B細胞上に発現するCD23に結合した表面IgEによる偽陽性シグナルの可能性を回避し、稀ではあるが真のIgE+ B細胞を検出することが可能となった。そこで、まずIgEレポーターマウスをDEXまたはビヒクル対照で2-4週間処理した後、フローサイトメトリーにより様々なリンパ組織でのIgE発現を解析した（図3 Eおよび図S3 F）。DEX投与マウスは、小腸および大腸からリンパを排出し、食物抗原および常在腸微生物に対する免疫寛容を促進するために重要であるmLNからのIgE発現B細胞の著しい増加を示した（図3のEおよびF；ならびに図S3 G）。一方、DEX投与マウスの脾臓、腹腔、骨髄では、有意なIgEシグナルは検出されなかった（図S3 H）。mLN由来のB細胞におけるIgEの発現を確認するために、FACSで選別したmLN B細胞に対してtotal RNA-seqを実施し、IgheのεGLTおよび成熟転写物がin vivo DEX処理により高度に誘導されることを見出した（図3 Gおよび図S3 I、J）。さらに、mLNにおけるこれらのDEX処理B細胞は、対照B細胞と比較して、プラズマブラスト様シグネチャーを示し（図3 Hおよび表S3）、これはex vivo作業からの観察結果と一致する（図2 F）。しかし興味深いことに、脾臓およびmLNのB細胞は、生体外でDEXと培養した場合、同程度のIgEスイッチングを示した。これは、DEXに対する反応性の違いではなく、mLNのマイルストーンに特異的な局所環境シグナルが、生体内でlgEスイッチングの引き金となるのに重要であることを示唆している（図3 I）。このように、我々の発見は、mLNのB細胞はグルココルチコイドにさらされると、天然IgEを優先的に産生することを示す。

次に、単一細胞のV(D)Jシークエンスにより、mLN B細胞のB細胞受容体レパートリーを検討した。天然抗体に関するこれまでの報告（Hayesら、2020；Kwonら、2022）と同様に、mLN B細胞は定常状態でポリクローナルであることがわかった（図S3 K）。また、クロノタイプの多様性に加え、SHMはほとんど検出されず、定常状態のmLN B細胞は生殖細胞中心反応を起こしにくいことが示唆された（Fig. S3 L）。興味深いことに、mLN B細胞のこれらの特性はDEXの影響を受けず、グルココルチコイドだけではレパートリーやSHMシグネチャーの変化にはつながらないことを示している（図S3、KおよびL）。我々のモデルでは抗原性のチャレンジがないことから、グルココルチコイドはレパートリーに影響を与えることなく、mLNにおけるポリクローナルIgE+ B細胞の頻度を増加させる可能性があることが示唆された。

グルココルチコイドは腸内環境の悪化時に天然型IgEの産生を促進する
次に、どのような生理的状況において、グルココルチコイドがmLNにおける局所的IgE産生を促進するのかについて検討した。腸管排出LNの免疫細胞が常に微生物シグナルと相互作用し、それに依存して腸管恒常性を維持していることを考えると、微生物誘導シグナルの欠如による腸管恒常性の崩壊がIgEの上昇を誘発する可能性がある（Wesemann and Nagler、2016）。以前報告したように、微生物シグナルに応答する能力を欠くMyd88/Trifダブルノックアウト（DKO）マウスは、血漿IgEの著しい上昇を示した（図4 A; Gavin et al.、2006）。このことは、DKOマウスにおける微生物由来のシグナル伝達の欠如に伴う腸の擾乱やディスバイオーシスが、実際にIgEの誘導に寄与していることを示唆している。したがって、我々は、ディスバイオーシス中のグルココルチコイド産生の増加が、食物アレルギーのような異常な免疫感知を可能にし得る過剰な炎症から保護するために、mLNにおける局所天然IgEレベルを誘導すると仮定した（Renz et al.、2018年）。実際、DKOマウスは、回腸Cortおよびグルココルチコイド合成に関与する酵素の発現レベルがより高いことが観察された（図4、BおよびC）。さらに、ディスバイオシス時のIgE誘導におけるグルココルチコイドの役割を検証するために、DKOマウスのグルココルチコイド合成を阻害した（図4 D）。定常状態では、DKOマウスは、成人期初期まで上昇し続けるIgEレベルを示し（図4 D）、この観察は、無菌マウスで報告されている循環IgEの自然誘導を彷彿とさせる（Cahenzliら、2013；Hongら、2019）。興味深いことに、生合成経路の最終的な11β-水酸化酵素（CYP11B1）酵素を競合的に阻害するメチラポンによるグルココルチコイド合成の抑制は、DKOマウスのIgEの上昇を著しく消失させた（図4 D）。同様に、DKOマウスでは、mLNにおけるIgEの局所レベルは、メチラポンによって低下した（図S4 A）。しかし、メチラポンはDKOマウスの全身レベルのCortを減少させなかった（図S4 B）。このことは、DKOマウスにおけるIgEの誘導には、腸内環境において局所的に産生されたグルココルチコイドが関与している可能性を示唆している。この全身性と局所性のグルココルチコイドの対比に関連して、我々は、生理的ストレス条件による全身性Cortの増加は、WTマウスの基礎IgEレベルの上昇には十分でないことを見出した（図S4 C）。我々は、それらのストレス条件における交感神経系の付随的な活性化が、IgE合成を含む2型応答の抑制につながると推測している（Florsheimら、2021年）。したがって、視床下部-下垂体-副腎軸の活性化によって産生される循環グルココルチコイドは、in vivoでの天然IgEの誘導に関与していない可能性があり、代わりに腸におけるグルココルチコイドの局所産生の重要性を示唆するものである。

天然型IgEはアレルギーを予防する役割を担っている可能性がある。
最後に、高親和性で抗原特異的なIgEが大量に存在するアレルギー時の天然型IgEの生理的な機能を調べた。DEXまたはビヒクル対照で4週間投与し、その後2週間漸減して免疫系と副腎機能を回復させた後、抗ジニトロフェニル（DNP）IgE（DNP-IgE）注射とDNPチャレンジによりIgE媒介性受動的全身アナフィラキシーモデルを誘導した（図4 Eおよび図S4 D）。DNP-ヒト血清アルブミン（HSA）チャレンジの際、先制的にDEX処置したマウスは低体温を示し、その結果、「アレルギー」対照マウスと比較して、より重症ではないアナフィラキシーを示唆するベースライン温度への早い回復を示した（図4 E）。同様に、コントロール血漿を投与したマウスと比較して、DEX処理およびテーパー処理したマウスの血漿を受動的に投与したナイーブB6マウスは、低体温が減少し、DNP-IgEによる受動的全身性アナフィラキシーから速く回復することを観察した（図4 F）。また、抗OVA IgE（OVA-IgE）注射とOVAチャレンジによる受動的皮膚アナフィラキシーモデルでも一貫した結果が観察され、DEX先制投与マウスはアナフィラキシー時の血管拡張と体液滲出の代理として耳へのエバンスブルー色素の集積が減少した（図4G）。また、DEX投与マウスとテーパードマウスをIgEとインキュベートした生体外骨髄由来肥満細胞のDNP-IgE誘発性脱顆粒が減少した（図S4 E）。IgG抗体からの寄与を完全に排除することはできないが、グルココルチコイドによって先制的に誘導される天然IgEは、おそらく高親和性アレルゲン特異的IgEとFcεRI結合を競合することによって、その後のアレルギー症状を弱める、またはそれから保護する生理的役割を果たし得る（Erb、2007；Oettgen、2016）。

考察
我々は、実験的に投与した抗原がない場合、グルココルチコイドがB細胞に直接作用して、ex vivoおよびin vivoの両方でIgEスイッチングを促進することにより、「天然」IgEを自発的に誘導することを報告した（図4 H）。グルココルチコイドのIgE促進作用がCD40L/CD40シグナルに依存しないことから（図2）、同族T細胞の助けはin vivoでの天然IgEの合成に必要ではない可能性がある。このことは、抗原非依存性およびMHCクラスII非依存性の天然IgE産生を示した以前の研究（McCoyら、2006年）と一致する。したがって、我々の発見は、天然型IgEの誘導には、抗原提示と直接的な細胞間相互作用ではなく、可溶性因子が重要であることを強調するものである。

さらに、グルココルチコイドによって誘導される天然IgE抗体は、最小限のSHMを持つポリクローナルレパートリーである可能性を提示するものであった。また、グルココルチコイド誘導性IgEは、他の天然型抗体と同様に、内因性抗原を広い特異性と低い親和性で認識する可能性がある。このことは、グルココルチコイドがIgMからIgEへの直接的なスイッチングを促進し、低親和性のIgEを生成することを示した我々の結果と一致している（図1 Dおよび図2 G）。天然のIgEが認識する抗原を同定することは興味深いことである。しかし、抗原提示は天然型IgEの誘導に必要ではなく (McCoy et al., 2006)、SHMによる親和性成熟も起こりにくいことから、天然型IgEが抗原とは無関係に、あるいは少なくとも特定のクラスの内因性抗原に限定して生じ、機能する可能性も十分に考えられる。

しかし、このようなポリクローナルIgEがどのようにしてアレルギー反応を抑制しているのかは、いまだ不明である。先行研究では、高親和性IgEと低親和性IgEの両方でマウスをアレルゲンに感作すると、その後のアナフィラキシーからマウスを守ることが示され（Xiongら、2012）、FcεRIと結合する過剰な組み換えFc断片を添加すると抗原特異的IgE反応が阻害される（Gehaら、1985）ことが分かっている。さらに、シアル酸糖鎖を除去すると、IgEのアナフィラキシー能が擾乱されることが示されている（Shade et al.、2020）。我々のDEX処理B細胞がSt3gal1のようなグリコシル化酵素のレベルの違いを示すことを考えると（図2 C）、天然のIgEは、FcεRIに対する親和性を変えるか、IgEが結合すると下流のFcεRIシグナルを弱める、異なる糖鎖修飾を持っているかもしれない（JenneweinおよびAlter、2017；Shadeら、2020）。おそらく、過剰量の低親和性天然IgEは、FcεRIに対する高い親和性を通じて、肥満細胞または好塩基球上のFcεRI部位についてアレルゲン特異的IgEと競合し、これを上回ることができる。あるいは、FcεRIに対する親和性が同じでも、天然型IgEは下流のFcεRIシグナル伝達経路に異なる影響を与え、それによってマスト細胞や好塩基球の脱顆粒や活性化状態を変化させる可能性がある。

私たちの研究は、ストレスと2型免疫の間の潜在的な関連も示している。ストレスホルモンは通常、2型免疫応答を含む免疫系を抑制すると考えられているが、我々のデータは、グルココルチコイドが実際にB細胞を陽性に制御して天然IgEを分泌させることができることを示唆している。では、どのような種類のストレスでもIgEの誘導を促進することができるのか、という疑問が残る。生体のストレス条件下で産生されるグルココルチコイドはIgEを誘導できないことが明らかになった（図S4 C）ので、副腎由来の全身性グルココルチコイドはin vivoでの天然IgE産生の主要な寄与者ではないかもしれない。代わりに、局所的なストレス条件によって回腸で産生される副腎外グルココルチコイドが、天然IgEの誘導に関与している可能性がある（Ahmed et al.、2019）。これらの局所的なストレス状態は、上皮障壁の破壊や腸管恒常性の乱れなど、2型免疫反応のトリガーと特異的に関連しているのではないかと推測しています。

将来的には、おそらく腸管免疫応答の変化と同時に、腸内のグルココルチコイドの局所レベルを増加させる生理的および病態生理学的条件を特定することが重要であろう。微生物叢の枯渇が回腸グルココルチコイドの誘導に関連することが以前に示されており（Mukherjiら、2013）、微生物シグナルが恒常性の間グルココルチコイドレベルを抑制することが示唆されている。さらに、炎症および上皮細胞損傷は、オーファン核受容体LRH-1（肝臓受容体ホモログ-1またはNR5A2；Ahmedら、2019；Muellerら、2006）を介して主に回腸でグルココルチコイドの副腎外合成を誘発することができる。同様に、2型免疫反応を誘発し得る毒素、有害化学物質、および外来生物は、粘膜免疫にさらに影響を与える腸管上皮におけるグルココルチコイド産生を誘発するのに十分な炎症性組織損傷を引き起こす可能性がある。したがって、腸の恒常性の乱れによって引き起こされる「局所ストレス」は、局所グルココルチコイドの誘導、ひいては天然IgEの誘導に帰着する可能性がある。したがって、そのような局所的ストレスによって誘発される天然IgEは、腸の恒常性を維持し、食物アレルギーのような異常な免疫感覚の発症を防ぐ上で極めて重要な役割を果たすと考えられる（Renz et al.、2018）。

局所グルココルチコイド産生の概念に即して、mLNの希少なB細胞が天然IgEの産生と分泌を担っていることも実証しています。研究により、定常状態では、非排泄性LNよりもmLNに免疫活性がある可能性が高いことが示されている（Casolaら、2004；Hoshiら、2001；Kuniedaら、2002）。しかし、どのような組織特異的特性が、mLNをIgEスイッチングにとって優先的で特に好都合な環境としているのかは、依然として不明である。例えば、IL-4やグルココルチコイドは、他のリンパ組織と比較して、mLNでより容易に利用可能である可能性がある。IL-4の主要産生細胞であるCD4発現細胞の枯渇が天然IgEを消失させる一方で、それらの細胞におけるGRの枯渇はそうではないことから（図S3、BおよびC）、IL-4の産生はグルココルチコイドに依存せず、一定である可能性が考えられた。腸管におけるIL-4の恒常的な産生は、微生物叢や食事との恒常的な相互作用から生じる可能性があり、mLNを天然IgEの産生のための特権的な組織として素因している可能性がある。同様に、mLN周辺のIL-4産生細胞の動態の違いは、グルココルチコイドに曝された場合と同様に、スイッチングを受けて天然IgEを産生する準備が容易に整ったmLN B細胞にとって、IL-4の利用可能性を高めることも可能であろう。これらのことは、IL-4存在下において、mLNと脾臓の精製B細胞が生体外でDEXに対して同様の応答性を示すという我々の観察結果と一致する（図3 I）。

さらに、DEXがmLNεGLTを増加させることは、IgEスイッチングの増加を示しているが、天然のIgE産生B細胞がクラススイッチングと分化の後にどのようにホームするかは、まだ十分に明らかにされていない。一方、B6マウスでは、IgEは定常状態では主にmLNで産生され、DEXによってさらに誘導されるという我々の知見から、DEXに応答してmLNを通過し、より頻繁にIgEスイッチングを受ける成熟したナイーブB細胞が、その後mLNに留まり、DEX処理マウスのmLNに天然のIgE分泌プラスマブラストをより多く蓄積する可能性が考えられる。一方、GRシグナルがCXCR4を介した血液-骨髄間のB細胞ホーミングを制御することが示されていることから（Cainら、2020）、DEXに応答してmLNを通過し、より頻繁にIgEスイッチングを受ける成熟ナイーブB細胞は、mLNに定着したIgE+ B細胞としては蓄積せず、mLNを好む形成細胞としてリンパ系組織間の移動を継続するかもしれない。したがって、グルココルチコイド曝露に伴うmLNにおけるIgE+ B細胞の移動動態および分化動態を調べることは興味深い。

我々の知見は、グルココルチコイドの古典的な免疫抑制効果に関する長年の見解に反対するように見えるが、最近の研究では、グルココルチコイドが特定の範囲で免疫増強することができるBおよびT細胞に対する用量依存的効果を有することが同様に見出されている（Cainら、2020；Hongら、2020；Shibaら、2018）。さらに、我々の知見と一致して、グルココルチコイドによるNF-κBシグナル伝達の誘導もまた、他の者によって確認されている。例えば、低用量のCortは、ミクログリア様免疫細胞においてNF-κBの転座および下流の炎症性遺伝子転写を増加させる（Liuら、2018年）。実際、我々は、CD40L/CD40シグナル伝達を強化するためにNF-κBを活性化することによってIgEスイッチングを促進することに加えて、グルココルチコイドは、ex vivo B細胞を、RNA-seqによって明らかになったPrdm1およびXbp1などの遺伝子に富む明確なトランスクリプトームを有するプラズマブラスト様細胞へ変化させることが確認された。このことから、グルココルチコイドは、NF-κBを活性化し、形質細胞様運命を促進し、下流のIgE産生を誘導することにより、B細胞における免疫強化の役割をさらに強化することが明らかとなった。

しかし、我々は、IgEの誘導にもかかわらず、それ以外の免疫系はDEX処理によって全身的に抑制されることも観察した。我々は、実験において超生理的用量を用いたためである（材料と方法）。B細胞におけるグルココルチコイドによるIgE合成誘導に関する我々の今回の知見に加えて、先行文献では、喘息のために高用量のコルチコステロイド治療を複数回受けた患者では、免疫抑制の指標となるIFN-γ産生T細胞およびナチュラルキラー細胞の減少にもかかわらず、IgEレベルが高いことが報告されている（Ziegら、1994年）。このように、グルココルチコイドによる免疫細胞の制御は、細胞の種類に依存し、用量に依存し、周囲の組織環境からの手がかりに敏感であることを考えると、生体全体では免疫抑制の状態にありながら、特定の免疫細胞集団に対してグルココルチコイドが免疫増強作用を示す可能性が高い。グルココルチコイドがどのような生理的背景で免疫反応を積極的に制御するのか、また、GRによる変化が特定の細胞の種類に応じたエピジェネティックな修飾を伴うのか、特に興味深く研究されているところである。

本研究は、グルココルチコイドが天然型IgEの産生促進因子として働くことを示唆し、グルココルチコイドによるIgEの誘導および保護生理学的機能に関する重要な機構的洞察を与えるものであると総括的に言える。さらに、我々の結果は、慢性的なグルココルチコイド治療がヒトにおけるIgEレベルを潜在的に上昇させる可能性を示唆しており、これは、実際に、長期間のプレドニゾン治療を受けた前述の患者について以前に報告されている（Ziegら、1994年）。我々の研究で同定された同じ経路が、ヒトにおけるIgE誘導に同様に関与しているかどうかを決定するために、さらなる研究が必要である。さらに、グルココルチコイドのB細胞に対する免疫増強作用を理解することは、アレルギーやその他のIgEを介した過敏症に対する新しい治療法の設計に、多くの新しい道を開くことになる。例えば、予防的な局所的グルココルチコイド治療により、食物アレルゲンに対する腸のアレルギー反応が緩和される可能性がある。また、遺伝子組換え天然IgE抗体の受動投与は、アレルギー患者の治療薬として使用できる可能性がある。このように、我々の研究は、グルココルチコイドと天然型IgEの上昇の間のメカニズム的なつながりを確立するだけでなく、今日我々の世界の多くを苦しめているアレルギーを治療するための新しいアプローチの舞台を提供するものである。

材料と方法
マウス
C57BL/6J WT (B6, 000664), Stat6 knockout (005977), Cd19-Cre (006785), Cd4-Cre (022071), Nr3c1fl/fl (GRfl/fl, 021021) マウスはJackson Laboratoryから購入し自社飼育をした。Mb1-CreマウスはYale (New Haven, CT)のDr. Joao Pereiraから親切に頂いた。Mb1-CreマウスまたはCd19-CreマウスをNr3c1fl/flマウスと交配し、Mb1-Cre+/-またはCd19-Cre+/-Nr3c1+/+, Nr3c1fl/+, Nr3c1fl/fl マウス（B細胞特異的Nr3c1 WT, Het, KO [cKO] ）となった。Stat6-/-マウスをB6マウスと交配してStat6+/-マウスを得、これを交配してStat6+/+、Stat6+/-、Stat6-/-マウスを得た。Cd4-CreマウスをNr3c1fl/flマウスと交配し、Cd4-Cre+/-Nr3c1fl/flマウス（T細胞特異的Nr3c1 KOマウス）を得た。Myd88/Trif KOマウス（DKO）の飼育者は、2wkおきにスルファメトキサゾール／トリメトプリム抗生物質食で維持した（Rakoff-Nahoumら、2015）。IgE KO B6マウスは、Boston Children's Hospital (Boston, MA)のHans Oettgen博士から寛大に提供されたIgE KO Balb/cJマウスから10回戻し交配して作製した。B6 Venus IgEレポーターマウス（Verigem）は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校（San Francisco, CA）のChristopher Allen博士から親切に提供されたものである。すべてのマウスは雌で、実験開始時に3-6.5週齢、特に断りのない限り同腹子であり、特定の病原体を含まない施設に維持されていた。マウスは、イェール大学のイェール動物資源センターで繁殖させ、特定の病原体を含まない条件で維持した。すべての動物プロトコルは、Yale大学のInstitutional Animal Care and Use Committeeの機関規制のもとで検討、承認、実施された。

脾臓B細胞およびリンパ組織の採取
CD19+脾臓B細胞の分離のために、WT B6、Stat6、またはcKOマウスの脾臓を採取し、70μmストレーナー（087712；Thermo Fisher Scientific）を通して、「完全培地」（2μM L-グルタミン［R8758を含むRPMI-1640培地］を含む6ウェル平底プレートにつぶした。Sigma-Aldrich; 21875034; Thermo Fisher Scientific]、さらに15% FBS [10438026; Gibco or 100-106; BenchMark or S11550; R&D Systems], 100 U/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin [P4333; Sigma-Aldrich], and 50 μM 2-ME [M6250; Sigma-Aldrich]) が添加された「完全培地」の入った6ウェルフラットボットのプレートに移した。赤血球を1×アンモニウム-塩化カリウム溶解バッファー（BP10-548E；Lonza）で溶解させた。ペレットを1×磁気活性化細胞選別（MACS）バッファ（0.5％BSA［BP1600-100；Thermo Fisher Scientific］及び2mM EDTA［AM9260G；Invitrogen］を含む1×PBS［14190144；Gibco］）により洗浄した。CD19+B細胞は、MACS MultiStand (130-042-303; Miltenyi Biotec) 上のマウスCD19 MicroBeads (130-121-301; Miltenyi Biotec) と LS columns (130-042-401; Miltenyi Biotec) を用いて、すべて製造者のプロトコルに従いながらMACSによって正選別した。十二指腸、空腸、回腸、結腸、鼠径、および腋窩LNを採取し、70μmのストレーナーを通して氷冷した2.5％FBS入り1×PBSに入れて潰し、1×塩化アンモニウム-カリウム溶解バッファとともにインキュベートしてから、フローサイトメトリ、FACSまたはRNA-seq調製に取り掛かった。具体的には、十二指腸、空腸、回腸、および大腸のLNを採取してmLNをプールした。腹膜洗浄および骨洗浄によって分離された腹膜細胞および骨髄は、フローサイトメトリー準備の前に洗浄された。

生体外B細胞培養
IgEおよびIgG1 B細胞クラススイッチ組換えについては、Vaidyanathanら（2017）のプロトコルを採用した。WT、cKO、Stat6ノックアウト、またはVerigem IgEレポーターマウスの精製脾臓CD19+ B細胞、および精製WT mLN CD19+ B細胞を、1μg/ml抗マウスCD40モノクローナル抗体（aCD40；553721；BD Biosciences）および10ng/ml IL-4（404-ML；R＆D Systems）を含む完全培地に8.75×105細胞/mlで6ウェル平底プレート内に播種した。48時間から72時間の6時間培養の間、細胞を、0.5 μg/ml aCD40と5 ng/ml IL-4を含む完全培地、またはFBSを欠くがそれ以外は0.5 μg/ml aCD40と5 ng/ml IL-4を含む完全培地成分をすべて含むSF培地に106 cells/mlで12ウェル平底プレート中に再懸濁させた。この6時間の間に、細胞はさらに、0. 1％DMSO（AB03091；AmericanBio）またはコントロールとしてのPBS；100ng／ml Cort（DMSOで希釈；C2505；Sigma-Aldrich）；100ng／ml DEX（DMSOで希釈；D1756；Sigma-Aldrich）；1mg／ml RU-486（DMSO で希釈したもの。M8046；Sigma-Aldrich）；2％50X B-27 SFサプリメントまたはその変種（17504044、10889038、12587010、またはA1895601；Thermo Fisher Scientific）；90℃で15分間インキュベートした15％「煮沸」FBS；0. 2％化学的に定義された脂質混合物（CDLまたはCDLipid；L0288；Sigma-Aldrich）；3.15ng／mlプロゲステロン（Prog；P8783；Sigma-Aldrich）；1ng／ml 3，3′，5-トリヨード-L-チロニン（T3；T2877；Sigma-Aldrich）；または20μg／ml TPCA-1（ab145522； Abcam）。72時間から78時間まで、同様の細胞密度を維持しながら、同一の6時間のインキュベーションを繰り返した。96時間までの2回の6時間インキュベーションの外では、洗浄した細胞を0.5μg/ml aCD40および5ng/ml IL-4を含む完全培地に再懸濁させた。IL-4またはCD40L（aCD40）の枯渇実験では、細胞を10ng/ml IL-4と1μg/ml aCD40を含む完全培地で0から48時間培養し、0.5μg/ml aCD40, 5ng/ml IL-4, または 0.5μg/ml aCD40 と5ng/ml IL-4 を含む完全培地で48から96時間培養し、適宜DEXインキュベーションを実施または実施せずに培養を行った。細胞増殖の標識のために、B細胞は、製造業者のプロトコルに従って、CellTrace Violet Cell Proliferation Kit (C34571; Thermo Fisher Scientific) で培養前に染色し、96時間後にフローサイトメトリーによって細胞分裂を評価した。mLN B細胞培養のために、mLNは上記のように抗CD19 MACSを受け、その後脾臓B細胞と同一の条件で生体外で培養した。すべての培養は、37℃、5% CO2のインキュベーターで維持した。

フローサイトメトリーおよび解析
フローサイトメトリー用のすべての抗体を表S4に示し、製造業者のプロトコルに基づき滴定した。0時間、48時間、72時間、または96時間の時点における生体外培養物の調製について、我々は、細胞内IgEタンパク質について染色する前に表面FcεRII-IgE複合体を最初に切断することによって真のIgE＋B細胞を検出し、表面CD23 (FcεRII) と結合したIgE-B細胞からの誤ったシグナルを回避する、Wesemannら (2011) のプロトコルを適応させた。簡単に説明すると、収穫したB細胞をまず0.1％トリプシン-EDTA（25200056；Gibco）で1分間インキュベートし、氷冷FBSと1×PBSで中和し、Zombie RedまたはZombie Yellow Fixable Viability Kit（423110 または423103；BioLegend）で生存性を評価した。次に、細胞をFoxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (00-5523-00; eBioscience)で固定および透過化し、次にStaining Bufferプロトコルに従って、蛍光色素標識抗体および抗CD16/32 Fcブロック (14-0161-86; eBioscience) で細胞内を染色した。特に、cKOマウスからの透過化PBMCは、モノクローナル非抱合ウサギ抗マウスGR抗体（12041；Cell Signaling）、次いでアレクサフルオロ488（A-11034；Invitrogen）に結合したポリクローナルヤギ抗ラビットIgG（H＋L）抗体を使用してGR欠失を確認した。収穫したin vivo組織の調製では、オプションでZombie RedまたはZombie Yellowを用いて細胞の生存率を評価し、続いて2.5% FBSおよびFcブロックを含む1×PBSで希釈した蛍光色素標識抗体で表面染色を行った。生存率および/または抗体染色後のすべてのサンプルについて、細胞を洗浄し、氷冷した2.5%FBS入り1×PBSに再懸濁し、80μmのナイロンメッシュで濾過した。FACSデータはLSR II Flow Cytometer (BD Biosciences)で収集し、FlowJo 9 (Tree Star)で解析した。B細胞集団は、シングレット、ライブ、およびB220+（CD45Rとしても知られている）にゲーティングすることによって同定された。具体的には、FO B細胞は、singlet、live、CD19+ FcεRI-、Fas-、CD38+ IgD+細胞に順次ゲーティングして同定し、IgEの中央値蛍光強度（MFI）を解析した。IgEレポーターマウスを用いた真のIgE+ B細胞同定のために、一重細胞、生細胞、CD45+、c-kit-、B220+、およびCD19+細胞のIgE表面発現とレポーターVenusシグナルを分析した。染色されたサンプルは、蛍光マイナス1（FMO）対照に対して検証された。この方法により、FcεRIにIgEが結合した肥満細胞や好塩基球、CD23にIgEが結合した非IgE産生B細胞は除外された。

RT-qPCR
RNeasy Micro Kit（74004；Qiagen）により、オンカラムDNase処理（79256；Qiagen）またはDirect-zol RNA Miniprep（R2052；Zymo）により、全RNAを抽出した。逆転写はランダムヘキサマープライマーとSMART MMLV Reverse Transcriptase (639524; Clontech)で行った．RNA量はPerfeCTa SYBR Green SuperMix, Low ROX (95056-02K; Quantabio), CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad) を用いて測定した。RT-qPCRプライマーのリストを表S5に示す。

RNA-seqおよび解析
上記のようにDEXまたはDMSOで処理したex vivo B細胞培養物からのIgE＋B細胞（Venus IgEレポーター陽性）、またはDEXまたはビヒクル処理マウスのmLNからのB細胞（singlet live CD45＋ c-Kit- B220＋でゲーティング）をYale Flow Cytometry Facilityを通じてFACSにより選別した。RNeasy Micro Kit (74004; Qiagen)によりTotal RNAを単離した。RNA-seqライブラリーは、SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2-Pico Input Mammalian (634413; Takara)によってプレップした。ライブラリーは、NextSeq 500（Illumina）でペアエンドラン（38×38または42×42bp）により配列決定された。リード2の5′末端から3塩基をFASTX-Toolkit (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/)でトリミングした。リードをマウスcDNA/ncRNAトランスクリプトーム（GRCm38 ensembl v89）にマッピングし、kallisto（v0.46.2、k-mer index 25、bootstrap 60; Bray et al., 2016）により100万あたりの転写物で定量化した。遺伝子発現の差分解析は、RStudio（v4.1.0）でbiomaRt、tximport、edgeR、Glimma、limmaパッケージにより、一般化線形モデル尤度比検定とロバート遺伝子単位の分散パラメータ推定を行った。パスウェイ解析は、ingenuity pathway analysis (Qiagen)で行った。また、STAR (v2.5.3) によりmm10ゲノムにリードをアラインメントし、同様の結果を観察した。εGLT、γ1GLT、μGLTの定量は、免疫グロブリン遺伝子の上流領域（Ighe.Global）から、100万マップリードあたりの転写産物のキロベースあたりのリード数（RPKM）を算出し、εGLTとγ1GLT、μGLTとμGLTを算出した。Ighg1: chr12:113,338,827-113,339,438 and chr12:113,334,226-113,337,296; and Ighm: chr12:113,422,854-113,424,477) の上流域の100万マップリードあたりの転写産物量を算出した。配列データは、National Center for Biotechnology Information Gene Expression Omnibusデータベース（アクセッション番号：GSE203542）に寄託されている。

ウェスタンブロッティング
細胞を1% radioimmunoprecipitation assay buffer (9806S; Cell Signaling Tech) で溶解し、15 µg の溶解液を4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels (4561084; Bio-Rad) にロードした。Trans-Blot Turbo Transfer System (Bio-Rad) を用いてメタノール活性化ポリフッ化ビニリデン膜 (1620175; Bio-Rad) に転写した後、膜を5% BSAを含む1×PBS中の0.1% Tween 20 (P9416; Sigma-Aldrich) でブロックし、下記に示す一次抗体でプローブし、3回洗浄した。次にメンブレンを抗マウス StarBright Blue 700 (12004158; Bio-Rad) または抗ラビット HRP 標識二次抗体 (18-8816-33; Rockland) でインキュベートしてからさらに3回洗浄した。検出は、West Pierce ECL Substrate (32106; Thermo Fisher Scientific) で行い、化学発光シグナルは、ChemiDoc Imaging System (Bio-Rad) で検出した。一次抗体として、抗IκBa（1：1，000、sc-371；SantaCruz）、抗IRF4（1：1，000、62834T；Cell Signaling Tech）、または抗β-Actin（1：2，000、3700S；Cell Signaling Tech）を使用した。

In vivo 薬物処理
DEX処理では、WT、cKO、またはIgEレポーターマウスを、2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン (2-HCD; H107; Sigma-Aldrich) で2週間または4週間、ビヒクルとして処理するか、0.02% DMSOで希釈した1.3μg/ml DEXで処理して、平衡させた。 オートクレーブした飲料水（200μlのDMSOまたはDEXを1,800μlの1% 2-HCDと最初に混合し、すべて1リットルの水に溶解）に0.02% DMSOと0.0018% 2-HCD vehicleとバランスよく混合した。ストレスを緩和するために注射ではなく経口飲水によりマウスを処理し、マウスは全身に送達される1日当たり0.36mg/kgのDEXを受け取ったと推定した（Hongら、2020；Yangら、2009）。メチラポン処理については、Myd88/Trif DKOマウスを、2-HCDビヒクル、または0.16% DMSOで希釈し、0.0034% 2-HCDでバランスを取った0.8mg/mlメチラポン（14994；Cayman）で3wk間投与した。処理物は水ボトルで提供し、7-10日ごとに補充し、自動給水弁は処理ケージについては取り外した。CD4+細胞の枯渇のために、B6マウスに1mgの抗CD4抗体（BE0003-1；Bio X Cell）またはアイソタイプコントロール（Bio X Cell、BE0090；Bio X Cell）をi.p.注射した。

血漿の分離
マウスから後眼窩出血により全血を採取した。血漿を単離するために、採取した血液サンプルを、リチウムヘパリン（365985；BD Biosciences）入りBD Microtainer PSTチューブで、製造業者のプロトコルに基づいて紡糸した。分離した血漿サンプルは、直ちに分析するか、評価まで-80℃で保存した。

ELISA法
血漿中の総IgEを測定するために、96ウェルNunc MaxiSorpプレート（44-2404-21；サーモフィッシャー）に、0.1M pH9.6炭酸-重炭酸緩衝液（C3041；Sigma-Aldrich）で希釈した2μg/mlラット抗マウスIgE (553413; BD Biosciences)を4℃で一晩コートした。プレートを0.05% Tween 20入り1×PBSで洗浄し、1% BSA入り1×PBSで1時間室温でブロックし、血漿または1% BSA入り1×PBSで希釈したマウスIgE κアイソタイプコントロール (557080; BD Pharmingen) とともに2時間室温でインキュベートした。検出のため、洗浄したプレートを 0.5 μg/ml ビオチン化ラット抗マウス IgE (553419; BD Biosciences) と共に室温で 1 時間インキュベートし、洗浄後、ストレプトアビジン-HRP (1:1,000, 554066; Thermo Fisher Scientific) を加え室温で 30 分インキュベート（いずれも 1%BSA含有 1×PBS にて希釈）した。洗浄したウェルを TMB 基質溶液 (555214; BD Biosciences) で展開し、3 M H2SO4 (258105; Sigma-Aldrich) でクエンチし、450 nm で分光光度計により光学濃度と逆算した濃度 (SpectraMax M5) により検出した。他の抗体のアイソタイプは、フローサイトメトリーによるLEGENDplex Mouse Immunoglobulin Isotyping Panel (740493; BioLegend)を用いてアッセイされた。ツァイトゲーバー時間4（ZT4）に採取した血漿または回腸上皮の細胞溶解物からのCortレベルを、DetectX Corticosterone Enzyme Immunoassay Kit（K014-H1; Arbor）によりアッセイした。

In vivo 受動的全身性アナフィラキシー
4 週間のビヒクルまたは DEX 投与の後、B6 マウスは 2 週間かけて飲料水に漸減させた。血漿移植実験のために、そのようなコントロールまたはDEX処理されテーパードされたマウスからの血漿をプールし、B6レシピエントマウスにi.p.注入した。次に、マウスに、100μlの1×PBSで希釈した2μgのモノクローナル抗DNP IgE（DNP-IgE、クローンSPE-7；D8406；Sigma-Aldrich）をi.v. 注入した。24時間後、マウスに100 μl 1×PBS で希釈した20 μg DNP-HSA (D-5059; Biosearch Technologies)をi.v.投与した。DNP-HSAチャレンジ後、マウスは直腸温度を経時的にプローブされた（TH-5およびRET-3；Physitemp）。

インビボ受動皮膚アナフィラキシー
上記のように4週間のビヒクルまたはDEX処理の後、B6マウスは、2週間かけて飲料水に漸減させた。次に、マウスに20ngのモノクローナル抗OVA IgE（clone E-C1; 7091; Chondrex）を皮内注射した。24時間後、マウスに、1％のEvans Blue色素（E2129；Sigma-Aldrich）と混合した20μgのグレードV OVA（A5503；Sigma-Aldrich） をi.v.チャレンジさせた。30分後、マウスを安楽死させ、アナフィラキシー時の血管透過性とヒスタミン駆動の血管外遊出を示す、耳のエバンスブルー色素の漏出を評価した。

定量化および統計解析
エラーバーはSEMを表し、各ドットは特に明記しない限り個々のマウスからのサンプルを表す。図の説明文に記載され、実験デザインによって適切とみなされるように、統計分析は、両側パラメトリック非対称スチューデントt検定またはウェルチt検定、比対スチューデントt検定、ポストホックテューキーの多重比較検定付き一方向ANOVA、またはポストホックシュダイクの多重比較検定付き二方向ANOVA（フルモデル混合効果分析）によって決定された。P < 0.05を統計的に有意とした。検定は、GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software, Inc)を用いて実施した。

ATACシーケンス（ATAC-seq）および解析
ATAC-seqライブラリーは、Omni-ATACプロトコル（FC-121-1031; Illumina; Corces et al.、2017）に従って各条件から5×104個の細胞で構築された。ライブラリーは、Yale Center for Genome Analysis（YCGA）によりIllumina HiSeq 2,000（paired-end run、100×100 bp）で配列決定された。配列決定したリードをアダプター配列でトリミングし（cutadapt v1.9.1; Martin, 2011）、Bowtie2 (v2.3.4.1; Langmead and Salzberg, 2012) によりマウスゲノム（GRCm38、sembl release 93）にマップした。ミトコンドリアリードと重複リードは、それぞれSAMtools (v1.9; Li et al., 2009) とPicard (v2.9.0, https://broadinstitute.github.io/picard/) で除去しました。ピークはMACS2 (v.2.1.1; Zhang et al., 2008)で見つけ、deepTools (v3.1.1; Ramirez et al., 2014)で可視化した。

単一細胞のV(D)J配列決定と解析
B6コントロールまたはDEX投与マウスからmLN B細胞（CD45+ FcεRI- B220+ CD23lo or CD45+ FcεRI- c-kit- B220+ CD19+）を選別し、10× Chromium Single Cell 5′ Reagent Kits v2. YCGAで遺伝子発現ライブラリーおよびV（D）Jライブラリーを構築した。ライブラリーはNovaSeq 6000でシーケンスした（ペアエンドラン、26×90bp）。生シーケンスデータは、mm10-2020-AとGRCm38-alts-ensembl-5.0.0を用いてCell Ranger (v6.1.2) で解析した。クロノタイプはLoupe VDJ Browser 4.0、SHMの頻度はChange-O (v1.0.0) のAssignGenesとMakeDB pythonパッケージによって解析された。

生物学的ストレス条件
寒冷負荷では、マウスを4℃で14日間飼育した。間欠的絶食負荷では、マウスを29日間にわたり1-2日ごとに一晩絶食させた。拘束ストレスでは、マウスを14日間にわたり1-2日ごとに50 mlコニカルチューブで4-6時間拘束した。

In vitro肥満細胞脱顆粒（β-ヘキソサミニダーゼ［β-hex］）アッセイ
肥満細胞の脱顆粒を評価するために、β-hex放出を定量化するための公表されたプロトコルを適応させた（Kuehnら、2010）。簡単に言うと、96ウェルのU底プレートに播種した骨髄由来のマスト細胞を、等量の培地のみ、ビヒクル処置およびテーパードマウスの培地および規格化血漿、またはDEX処置およびテーパードマウスの培地および規格化血漿のいずれかと共に37℃で30分間プレインキュベートした；必要に応じて、血漿濃度は添加前に最初に300ng／mlに規格化した。洗浄後、細胞を、培地中の2μg/mlのDNP-IgEとともに37℃で30分間インキュベートした。25μg/ml DNP-HSAで肥満細胞を刺激すると、肥満細胞顆粒から放出されたβ-hexは、消化されたp-ニトロフェニルN-アセチル-β-D-グルコサミニド基質の比色測定法を用いて定量化された。脱顆粒した細胞の割合は、上清中のβ-hex含有量を上清とライセートの両方を合わせた総β-hex含有量で割ったものとして計算された。

オンライン補足資料
Fig. S1は、IgG1スイッチングがグルココルチコイドにほとんど影響されないことを示している。図S2は、グルココルチコイドがIgE+ B細胞の活性化を支持し、クロマチンアクセシビリティにグローバルな変化を与えることなくIgE産生を促進することを示している。図S3は、グルココルチコイドによって誘導される天然IgEが、mLNにおいて局所的に産生される可能性があることを示している。図S4は、天然IgEが、生物学的ストレス条件ではなく、腸の局所的なグルココルチコイドによって産生されることを示している。表S1は、B-27サプリメントの定義されたビタミン、タンパク質、および他の成分のリストを示している。表S2は、生体外で培養されたB細胞からの加工された総RNA-seqデータを含む。表S3は、選別されたmLN B細胞からの処理された総RNA-seqデータを含む。表S4は、フローサイトメトリー用の抗体を列挙する。表S5は、RT-qPCRのためのプライマーをリストする。

謝辞
特にCuiling Zhang、Shuang Yu、Jaime Cullenには、マウスコロニーとin vivo実験において、洞察に満ちた議論と援助をいただいた。IgEレポーターマウスを提供してくれたChristopher Allen博士（University of California, San Francisco）に感謝する。IgE KO Balb/cJ マウスを提供してくださった Hans C. Oettgen博士（Boston Children's Hospital）に感謝する。Mb1-Creマウスを提供してくださったJoao Pereira博士（Yale）に感謝する。また、Yale Flow CytometryのFACSサービス、YCGAの10×Immune Profilingに感謝する。画像はBioRender.comで作成した。

本研究は、Howard Hughes Medical Institute、Blavatnik Family Foundation、Food Allergy Science Initiative、National Institutes of Healthからの助成金（AI144152 to R. Medzhitov）、Yonsei Research Fund (2021-22-0049), Yonsei Signature Research Cluster Program of 2022 (2022-22-0013) and the National Research Foundation of Korea, Ministry of Science, Information and Communication Technology (ICT) and Future Planning NRF-2022R1C1007283 によって支援されています。J. Limは、国際ヒューマンフロンティア科学プログラム機構（LT000037/2018-L）およびJane Coffin Childs Memorial Fundからの博士研究員の支援を受けています。R. Medzhitovは、ハワードヒューズ医学研究所の研究員である。

著者による寄稿。J. Lim、B. Vaidyanathan、R. Medzhitovは研究の構想を練った。J. Lim, E.V. Lin, J.Y. Hongは、B. Vaidyanathan, S.A. Erickson, C. Annicelliの協力を得て、実験の計画、実行、データ解析を行った。J. Lim, E.V. Lin, J.Y. Hong, R. Medzhitovは、他の共著者の意見を参考にしながら原稿を執筆した。

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著者ノート
*J. Lim, E.V. Lin, J.Y. Hongは、本論文に等しく貢献した。
開示事項 著者らは、競合する利害関係がないことを宣言している。
Bharat Vaidyanathan の現在の住所は EMD Serono Research & Development Institute, Billerica, MA です。