プロバイオティクス細菌由来のD-トリプトファンは腸内細菌叢とアレルギー性気道疾患に影響を及ぼす

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アレルギー・臨床免疫学雑誌
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喘息と下気道疾患|139巻5号1525-1535頁2017年5月

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プロバイオティクス細菌由来のD-トリプトファンは腸内細菌叢とアレルギー性気道疾患に影響を及ぼす

https://www.jacionline.org/article/S0091-6749(16)31020-X/fulltext

インゲ・ケパート博士
ジュリアーノ・フォンセカ博士
コンスタンツェ・ミュラー博士
アントン・ハルトマン博士
フィリップ・シュミット・コップリン博士
スザンネ・クラウス＝エッチマン医学博士
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脚注を表示掲載:2016年9月23日DOI:https://doi.org/10.1016/j.jaci.2016.09.003
プラムXメトリクス

背景
喘息のような慢性免疫疾患は、非常に蔓延している。現在利用可能な医薬品は症状を改善するが、病気を治すことはできない。このため、アレルギー性疾患の予防のために、プロバイオティクスのような医薬品に代わるものが求められている。しかし、臨床試験の結果は一貫していない。この理由の少なくとも一部は、プロバイオティクス細菌、宿主の微生物叢、免疫細胞間の非常に複雑なクロストークにある。プロバイオティクス細菌から生理活性物質を同定することで、この困難を回避できる可能性がある。
目的
アレルギー性気道疾患を予防する可能性のある生理活性プロバイオティック代謝物を同定し、その特性を明らかにすることを目的とした。
方法
プロバイオティクス上清を、ヒトホジキンリンパ腫細胞株の構成的CCL17分泌を減少させ、LPS刺激ヒト樹状細胞のコスティミュレイトリー分子のアップレギュレーションを抑制する能力についてスクリーニングした。
結果
試験したプロバイオティクス37株中13株の上清が免疫活性を示した。2株の上清を極性に従ってバイオアッセイ誘導クロマトグラフィー分画し、全イオンクロマトグラフィーと質量分析を行った結果、生理活性物質の分子式としてC11H12N2O2が得られた。プロトン核磁気共鳴とエナンチオマー分離により、D-トリプトファンが同定された。一方、L-トリプトファンと他の11種類のD-アミノ酸は不活性であった。実験的喘息誘発前にD-トリプトファンをマウスに与えると、肺と腸の制御性T細胞数が増加し、肺のTH2反応が減少し、アレルギー性気道炎症と過反応が改善した。アレルギー性気道炎症は腸内微生物の多様性を減少させたが、これはD-トリプトファンによって増加した。
結論
D-トリプトファンは、プロバイオティック細菌から新たに同定された産物である。我々の知見は、定義された細菌産物が慢性免疫疾患の新規予防戦略に利用できるという概念を支持するものである。
キーワード
D-トリプトファン
プロバイオティック細菌
細菌物質
スクリーニング
免疫調節
アレルギー性気道疾患
腸内細菌叢
使用した略語
AAI（アレルギー性気道疾患）、CDM（Chemically defined medium）、DC（樹状細胞）、Foxp3（Forkhead box p3）、IDO（インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ）、LGG（ラクトバチルス・ラムノサスGG）、OTU（Operational taxonomic unit）、SLC6A14（Solute carrier family 6 amino acid transporter member 14）、Treg（Regulatory T）
アレルギー、炎症性腸疾患、糖尿病などの慢性免疫疾患は、先進工業国で非常に流行しており、今後数十年間は非感染性疾患による負担のさらなる増加が予想されている。従って、医療従事者と消費者の両方から、医薬品に代わる証明された代替品に対する需要が高まっている2。
プロバイオティクス細菌は、試験管内3, 4, 5や動物6, 7で免疫反応を修正することが示されており、「適切な量を投与すると宿主に健康上の利益をもたらす生きた微生物」と定義されている。しかし、急性感染性下痢症9を除けば、アレルギー性疾患の一次予防10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22や慢性炎症性腸疾患の治療23など、さまざまな適応症を対象とした臨床試験には一貫性がない。したがって、コンセンサスペーパー24や欧州食品安全機関25は、アレルギー症状の予防に対するプロバイオティクス微生物の役割は確立されていないと述べている。
相反する結果の重要な理由の一つは、プロバイオティクス細菌と宿主の微生物叢および免疫細胞との相互クロストークが複雑であることであろう。健康な被験者であっても、腸内細菌叢は個々の患者によって著しく異なる26, 27。さらに、疾患状態では細菌叢と免疫の両方が大きく変化する可能性がある28。したがって、個々の患者におけるプロバイオティクス菌株の正確な機能性を予測することは難しい。さらに、主張されている健康効果について生物学的妥当性を立証するために重要なメカニズム解明が不足している。
プロバイオティック微生物に由来する特定物質の使用は、これらの問題を克服するための魅力的な選択肢となりうる。宿主における複雑な運命と反応パターンを持つ生きた細菌以外に、証明可能な作用機序を持つ明確な特性を持つべきである。これまでのところ、生理活性物質として実証された候補構造や物質はごくわずかであり、治療効果を示す前臨床試験のエビデンスを持つものはさらに少ない29。
そこで本研究の目的は、(1)プロバイオティクス上清中のTH2減少免疫活性を検出するためのスクリーニングツールを確立すること、(2)この活性を媒介する可溶性細菌分子を同定すること、(3)アレルギー性気道疾患（AAI）モデルマウスで推定物質を試験すること、(4)潜在的な基礎メカニズムに関する知見を得ることであった。
方法
試薬、細菌およびヒト細胞の培養条件、ヒト単球由来樹状細胞（DC）の作製、D-トリプトファンの構造解明（Sigma-Aldrich, St Louis, Mo）、サイトカイン/ケモカインの定量、マウスT細胞の分化、フローサイトメトリー、定量的RT フローサイトメトリー、定量的RT-PCR、微生物叢解析、腸管固有層細胞の単離、および動物実験（実験的喘息の誘発と肺機能解析）については、本論文のオンラインレポジトリ（www. jacionline.org.
細菌株
ビフィズス菌、乳酸菌、乳酸球菌、大腸菌（Escherichia coli Nissle 1917）、腸球菌（Enterococcus faecium）、および好熱性連鎖球菌（Streptococcus thermophilus）は、異なる提供者から入手した（本論文のオンラインレポジトリ（www.jacionline.org）の表E1を参照）。すべての菌株を定常期になるまで増殖させ、最小細胞数108コロニー形成単位/mLにした。無細胞上清は、遠心分離（6000rpm、20℃で5分間）後、孔径0.22μmの表面修飾ポリエーテルスルホン膜（Millipore, Darmstadt, Germany）でろ過して得た。上清のアリコートを細菌増殖培地で培養しても、細菌の増殖は観察されなかった。そうでない場合は、上清を採取後すぐに-80℃で保存した。
プロバイオティクス上清中の免疫調節活性をスクリーニングするためのバイオアッセイ
ヒトDC上のコスティミュレイトリー分子のダウンモジュレーション、およびヒトホジキンリンパ腫T細胞株（KM-H2）によるCCL17分泌のダウンモジュレーションに基づく2つの生物学的アッセイを設定した。ヒト未熟DCを、200μLの細菌を含まない上清の存在下または非存在下で、大腸菌（Sigma-Aldrich）由来の0.1μg/mL LPSで24時間成熟させた後、コスティミュレイトリー分子のフローサイトメトリー解析を行った。
同様に、200μLの上清を3～5×106個のKM-H2細胞に24時間添加した。上清は遠心分離によりKM-H2細胞から回収し、CCL17の定量まで-80℃で保存した。KM-H2培養液の希釈をコントロールするために、対応する量のブランクMRS培地を異なる容量の細菌上清で添加した。プロバイオティクス活性を有しないLactobacillus rhamnosus DSM 20021のブランク菌増殖培地および上清を、両スクリーニングアッセイにおいて陰性対照として用いた。
動物およびD-トリプトファンの経口投与
すべての動物実験は、Federal Guidelines for the Use and Care of Laboratory Animals（Az 55.2-1-54-2532-137-13）のもとで実施され、Upper Bavaria and Schleswig-Holstein地区政府の承認を得た（V244-13313/2016［7-1/10］）。6～8週齢の雌性BALB/cマウスをCharles River社（Sulzfeld、ドイツ）から入手し、個別に換気したケージに2匹ずつ収容し、特定の病原体を含まない条件に維持した。標準的な押し出しペレット飼料と滅菌ろ過した飲料水を自由摂取させた。マウス血清中のD-トリプトファンを定量するため、D-トリプトファンを1.8または18 mg/dL（マウス1匹あたり約0.09および0.9 mg/d）の濃度で飲料水に溶解した。対照動物には純水を与えた（各群n = 8）。行動や体重に変化は認められなかった。動物は14日後に殺され、血清は分析まで直ちに-80℃で保存された。
AAI予防のため、マウスは最初の感作の少なくとも3日前から25日目に死亡するまで、50mmol/LのD-トリプトファンを投与された。マイクロバイオーム解析のため、盲腸を切り取り、直ちに-80℃で保存した。
統計解析
バイオアッセイと動物実験
バイオアッセイと動物実験の結果は、平均値とSDで示した。必要に応じて、Student t検定とDunn多重比較検定、または2-way ANOVAとBonferroni posttestを用いた。適用された検定は、それぞれの図の凡例に示されている。0.05未満のP値は有意とみなした（バージョン5.0; GraphPad Prism Software, La Jolla, Calif）。
微生物の多様性
細菌多様性は、各群6匹の盲腸サンプルにおける16S rRNA遺伝子の分子バーコードによって評価した。この目的のために、キットを用いたプロトコール（PowerSoil DNA Isolation Kit; MO BIO Laboratories, Carlsbad, Calif）を用いて、盲腸からDNAを直接抽出した。S-D-Bact-0785-a-S-18（5′-GGMTTAGATACCCBDGTA-3′）およびS--Univ-1100-a-A-15（5′-GGGTYKCGCTCGTTR-3′）をプライマーとして用いて、16S rRNA遺伝子の可変領域V5およびV6内で315 bpの断片を増幅した30。アンプリコンの塩基配列決定は、ペアエンドテクノロジーを用いてIllumina MiSeqプラットフォーム（Illumina, San Diego, Calif）で行った（詳細は本論文のOnline RepositoryのMethodsセクションを参照）。配列はNational Center for Biotechnology Information accession no. PRJNA304109に寄託した。
リードはソフトウェアパッケージQIIME (http://qiime.org)を用いて解析した。運用分類単位（OTU）は、Greengenes参照データベースの13_8バージョン31の中から、配列同一性95%の類似度で選んだ。配列は1サンプルあたり15,000リードにサブサンプリングされ、これは品質管理後に最もリード数が少なかったサンプルで得られたリード数を反映している。この数は、OTU95に基づいてコレクターズカーブを計算したときに、プラトーに達するにはまだ十分であった。主座標分析は、Rソフトウェア環境(http://www.r-project.org)内のapeパッケージを使用して、重み付けされていないUniFrac距離行列上で生成され、統計的有意性はスチューデントt検定で決定された。各サンプルのα-多様性は、Chao1指標33を用いて測定し、ノンパラメトリック2標本t検定（すなわち、有意性検定にモンテカルロ順列を使用）を用いて処理間で比較した。ノンパラメトリック類似度分析は、β-多様性距離行列のサンプルグループ間の有意差を調べるために行った。
結果
生理活性プロバイオティック物質の同定と特性解析
CCL17のダウンレギュレーションに関する粗プロバイオティック上清のスクリーニング
プロバイオティクス細菌の上清中のTH2制御活性を検出するためのハイスループットスクリーニングシステムを開発するために、ヒトホジキンリンパ腫T細胞株KM-H2によるTH2関連CCL17の高い構成性分泌を利用した。
KM-H2細胞を、ラクトバチルス・ラムノサスGG（LGG）、ビフィズス菌BB-420、およびラクトバチルス・カゼイW56の上清の量を増やしながらインキュベートし、CCL17のダウンレギュレーションの閾値を同定した。3種類のプロバイオティクス株から得た上清は、非プロバイオティクス株であるLactobacillus rhamnosus DSM-20021から得た上清と比較して、CCL17濃度を用量および時間に依存して約30%まで有意に低下させた（図1、A）。この減少をもたらす最小量（200μL）を、以降のすべての実験に用いた。
図サムネイルgr1
図1異なるプロバイオティクス株の上清を用いたヒト細胞に対する免疫活性のスクリーニング。A,ヒトホジキンリンパ腫KM-H2細胞のCCL17分泌を低下させるLGG（fx1）、Bifidobacterium BB-420（fx2）、Lactobacillus casei W56（fx3）の細菌上清の用量依存的能力。陰性対照は非プロバイオティクス乳酸菌Lactobacillus rhamnosus DSM-20021（fx4）であった。3回の独立した実験を二重に示す（未処理のKM-H2細胞のCCL17分泌量に対する平均±SDパーセンテージ）。LGG：P＜0.005およびP＜0.0005、L casei W56： ##P < .005、##P < .0005、BB-420： §§P＜0.005、§§P＜0.0005、スチューデントt検定。B、LGG、ビフィズス菌BB-420、Lactobacillus casei W56、または非プロバイオティクスLactobacillus rhamnosus DSM-20021からの上清の、LPS刺激ヒト単球由来DCにおけるコスティミュレイトリー分子およびHLA-DRの完全なアップレギュレーションを阻止する能力。+/-菌体上清の有無。5回の独立した実験を示す（LPS単独に対する平均±SDパーセント）。P < .01および*P < .001、Dunn多重比較検定。
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細菌培養培地の多くの成分が質量分析における特異的シグナルの検出を妨害したため、細菌はより複雑でない化学的に定義された培地（CDM1）で培養した。CDM1で培養したプロバイオティクス株の上清と標準培地の上清のCCL17濃度低下作用は同等であった（本論文のOnline Repository（www.jacionline.org）のFig E1を参照）。その後、37株のプロバイオティクス株の上清を試験した結果、21株中7株のラクトバチルス属株、10株中5株のビフィドバクテリウム属株、3株中1株のラクトコッカス属株が、細胞生存率に影響を与えることなくCCL17分泌を減少させた（本論文のOnline Repository（www.jacionline.org）のFig E2を参照）。一方、Streptococcus thermophilus株、Enterococcus faecium株、E coli Nissle 1917株は、いずれもCCL17レベルに影響を与えなかった（図2および表E1参照）。
図サムネイルgr2
図2KM-H2細胞のCCL17分泌を減少させる全37株の細菌上清の能力に関する概要。網掛け棒は、非プロバイオティクス乳酸菌Lactobacillus rhamnosus DSM-20021（陰性対照）；LGGは、乳酸菌以外の菌株を用いたすべての実験において陽性対照として含まれた。開棒は、未処理のKM-H2細胞および培地対照細胞。3回の独立した二重実験を示す（未処理のKM-H2細胞のCCL17分泌量に対する平均＋SDパーセンテージ）。**P < .005 および ***P < .0005、Student t test。
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CCL17ベースのスクリーニングアッセイの結果の検証
観察された免疫調節活性を確認するため、ヒト単球由来DC上のコスティミュレイトリー分子の発現を減少させるプロバイオティクス上清の有効性を評価した。抗原を認識すると、ナイーブDCは複雑な成熟過程を経る。35 完全に活性化されたDCは適応免疫応答を誘導するが、不完全な活性化は寛容をもたらす。CCL17を用いたスクリーニングで「免疫調節性」と判定された13種類の上清はすべて、LPSによって誘導されたCD83、CD80、CD86、CD40を発現する成熟型DCの割合を有意に減少させたが、残りの上清はDCに対して不活性であった（図1、B）。いずれの上清もDCの生存率には影響を与えなかった（図E2参照）。このように、両方のバイオアッセイで100％一致した結果が得られた。全菌株の生物活性の完全な概要については、表E1を参照のこと。
厳選されたプロバイオティクス上清の分画により、極性の異なる3種類の生物活性画分が得られた。
LGGは臨床研究で最も頻繁に使用されている。37 したがって、我々はLGGの上清を選択し、さらにL casei W56の上清を選択して、さらなる濃縮と推定代謝産物の段階的化学的特性解析を行った。この過程で、KM-H2およびDCバイオアッセイの両方で、各サブフラクションの生物活性を再試験した。
細菌上清は半分離クロマトグラフィーにかけられ、11種類のMeOH/H2O抽出物が得られた。最も免疫調節活性が高かったのは20％画分であり、40％および50％MeOH画分ではわずかに活性が低かった（図3）。したがって、この画分をさらなる精製に選んだ。
図サムネイルgr3
図3KM-H2細胞のCCL17分泌を減少させるプロバイオティクス上清のサブフラクションの能力。LGG（上）またはLactobacillus casei W56（中）の上清から、異なる極性（MeOH/H2Oグラジエントクロマトグラフィー）を有するサブ分画。陰性対照は、非プロバイオティクスDSM-20021およびブランクCDM1培地（下）であった。3つの独立した実験を二重に示す（未処理のKM-H2細胞の構成的CCL17分泌に対する平均±SDパーセンテージ）。**P < .005 および ***P < .0005、Student t test。
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20% MeOH/H2O抽出物中の生理活性物質の単離と同定
20% MeOH/H2O画分をクロマトグラフィーでサブ分画したところ、10個のサブ分画が得られた（本論文のOnline Repository（www.jacionline.org）のFig E3を参照）。そのうち3個がバイオアッセイで活性を示した。これらのサブフラクションと最も近傍のサブフラクションを、逆相高速液体クロマトグラフィー、高分解能飛行時間型質量分析計を用いて再評価し、トータルイオンクロマトグラムを作成した。クロマトグラムの類似性を確認することにより、ピークの保持時間と分子質量情報によると、生理活性サブフラクションにのみ存在し、L casei W56のサブフラクション7とLGGのサブフラクション6で最も高い物質を同定した（本論文のオンラインレポジトリ（www.jacionline.org）の図E4、Aを参照）。抽出されたマススペクトルから、この物質はトリプトファンイオン(2M+H)+と(M+H)+、およびそのフラグメントである(M+H-NH3)+から構成されていることが強く示唆された（図E4、B参照）。
クロマトグラフィーを繰り返して生理活性物質を注意深く濃縮した結果、両菌株から単離された候補物質は、いずれのスクリーニングアッセイにおいても生理活性を示した。フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計を用いた高分解能質量分析により、これらのイオンの分子式が C11H12N2O2 であることが確認された（図 E4, C および D 参照）。プロトン核磁気共鳴を用いたさらなる分析により、官能基の分布と分子構造に関する詳細な情報が得られた。二重鎖と三重鎖（δ7.8-7.0）はインドール環の発生を示した。また、δ3.9-3.8とδ3.2-3.1の領域での共鳴シグナルは、それぞれβ-CHとα-CHプロトンに割り当てられた（この論文のオンラインレポジトリ（www.jacionline.org）の図E5を参照）。このように、標準的なトリプトファンと我々の生理活性サブフラクションの間には密接な一致があった。
L-トリプトファンは細菌増殖培地の標準成分であることから、我々は生理活性がこのアミノ酸のD-形態に関係していると仮定した。実際、精製サブフラクションのエナンチオマー分離により、D-トリプトファンとL-トリプトファンの存在が確認された（図E6, A、本論文のオンラインレポジトリ（www.jacionline.org）参照）。一方、ブランク培地の対応するサブフラクションにはL-トリプトファンのみが含まれていた（図E6, B参照）。
プロバイオティクス上清中の免疫調節活性はトリプトファンのD-型に限定される
生物活性が本当にトリプトファンのD-異性体に限定されているかどうかを確認するため、CCL17バイオアッセイで異なる濃度の合成L-トリプトファンとD-トリプトファンを試験した。D-トリプトファンのみが用量依存的な免疫活性を示した（図4）。さらに、試験した他の12種類の極性および非極性の中性D-アミノ酸は、いずれも生理活性を示さなかった（表I）。
図サムネイルgr4
図4KM-H2細胞によるCCL17分泌に対するトリプトファンL-およびD-異性体の効果。KM-H2細胞を異なる濃度の合成トリプトファンL-およびD-異性体で刺激し、24時間後にKM-H2培養液中のCCL17を定量した。丸はD-トリプトファン、菱形はL-トリプトファン。3つの独立した実験を二重に示す（未処理のKM-H2細胞の構成的CCL17分泌に対する平均±SDパーセンテージ）。*P < .05、**P < .005、***P < .0005、Student t test。
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表 合成D-アミノ酸∗で処理した表面マーカー発現成熟DCの割合
D-アラニン D-ヒスチジン D-イソロイシン D-ロイシン D-メチオニン D-フェニルアラニン
CD83 97.7 ± 2.3 103.1 ± 0.3 100.5 ± 1.1 97.1 ± 2.4 102.4 ± 2.2 99.6 ± 2.0
CD86 99.2 ± 2.1 102.5 ± 0.4 99.8 ± 1.2 101.9 ± 1.3 102.2 ± 2.5 99.2 ± 3.3
cd80 98.3 ± 2.6 102.0 ± 0.9 98.2 ± 1.5 100.3 ± 1.6 100.4 ± 0.2 92.4 ± 3.5
CD40 102.3 ± 3.4 101.4 ± 3.2 100.4 ± 2.4 100.4 ± 1.7 102.7 ± 0.6 100.4 ± 2.7
HA-DR 98.1 ± 1.1 99.9 ± 0.9 100.1 ± 0.3 98.0 ± 10.0 98.9 ± 2.0 98.0 ± 3.2
D-プロリン D-セリン D-スレオニン D-トリプトファン D-チロシン D-バリン
CD83 100.9 ± 0.4 100.8 ± 0.3 102.6 ± 0.5 7.6 ± 3.3 101.6 ± 0.6 102.1 ± 1.2
CD86 101.2 ± 1.9 101.1 ± 2.8 102.1 ± 0.7 24.1 ± 2.7 102.2 ± 0.9 101.8 ± 0.9
cd80 100.3 ± 0.1 100.1 ± 2.8 100.8 ± 0.4 12.1 ± 1.7 101.6 ± 0.4 99.6 ± 2.0
CD40 99.2 ± 1.3 100.8 ± 1.1 100.6 ± 1.5 15.2 ± 6.5 100.4 ± 1.3 101.4 ± 2.4
hla-dr 98.4 ± 2.6 98.6 ± 0.6 97.1 ± 3.9 88.9 ± 3.0 98.4 ± 2.4 100.0 ± 1.0
3回の独立した実験を示す（LPS誘導発現に対する平均±SDパーセンテージ）。
∗ LPS（0.1μg/mL）、D-アミノ酸（10μmol/L）でDCを刺激した。CD83、CD86、CD80、またはCD40を発現するDCの割合を評価した。
新しいタブで表を開く
細菌上清とD-トリプトファンは濃縮ヒトDCのサイトカインプロフィールを調節する
この生理活性の根底にある機序を初めて知るために、細菌上清または合成D-トリプトファンで処理した後、高度に濃縮されたDC（図E2、D参照）から分泌されるサイトカインを定量した。すべてのプロバイオティクス上清とD-トリプトファンは、これらの培養においてIL-10を強く誘導し、LPS誘導性のIFN-g、IL-12、IL-5を減少させた。対照的に、サイトカインパターンはコントロール上清とアミノ酸の影響を受けなかった（表II）。全体として、IL-10/IL-12比は増加し、BB-46を除いてIL-5/IFN-g比は減少した。
表I ヒトLPS処理DCにおけるプロバイオティクス上清またはD/L-トリプトファンによるサイトカイン調節作用∗。
IL-10 (pg/mL) IL-5 (pg/mL) IFN-g (pg/mL) IL-12 (pg/mL) 比率
IL-10/IL-12 IL-5/IFN-g

• 肺胞 - 肺胞 - 肺胞 - 肺胞 - 肺胞 - 肺胞 - 肺胞
  培地 3.20 2.90 14.70 68.30 112.50 2238.80 102.10 2092.80 0.031 0.001 0.131 0.031
  DSM-20021 6.80 4.80 33.60 55.90 330.00 2520.50 447.80 2217.30 0.015 0.002 0.102 0.022
  432.90 787.90 9.10 5.40 372.70 105.70 79.20 106.90 5.466 7.370 0.024 0.051
  LA-2 107.30 591.70 8.00 10.30 111.60 437.70 89.30 238.00 1.202 2.486 0.072 0.024
  LA-5 81.30 305.70 7.60 8.00 113.30 531.80 87.50 331.10 0.929 0.923 0.067 0.015
  LC-01 452.40 924.50 7.90 2.40 109.30 211.30 76.90 67.80 5.883 13.636 0.072 0.011
  BB-12 234.90 735.70 11.00 10.90 75.40 437.00 91.50 228.20 2.567 3.224 0.146 0.025
  BB-46 813.50 1230.70 14.00 13.60 13.50 637.90 95.10 202.30 8.554 6.084 1.037 0.021
  BB-420 450.40 915.40 8.80 8.40 81.50 783.70 102.50 356.90 4.394 2.565 0.108 0.011
  L-Tryptophan 5.70 4.90 12.00 61.40 45.00 2031.50 88.30 1993.00 0.065 0.002 0.267 0.030
  D-Tryptophan 56.90 202.50 10.30 20.60 21.90 1129.50 82.50 871.90 0.690 0.232 0.470 0.018
  L-Proline † 6.00 14.80 57.70 88.90 2133.90 99.80 1938.00 † 0.003 0.166 0.027
  D-Proline 5.90 4.00 15.80 69.10 92.60 2295.40 90.60 1911.90 0.065 0.002 0.171 0.030
  ∗ LPS（0.1μg/mL）の存在下または非存在下で、200μLの細菌無細胞上清またはトリプトファンエナンチオマー（10μmol/L）を用いて14時間DCを刺激した。ネガティブコントロールとして、非プロバイオティクスDSM-20021およびブランク培地（CDM1）を用いた。D/L-プロリンおよびL-トリプトファンは、D-トリプトファンのコントロールとして用いた。
  検出限界未満。
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  D-トリプトファン経口補給の前臨床効果
  D-トリプトファンは、アレルギー性気道炎症およびTH2免疫応答に影響を及ぼす。
  D-トリプトファンをアレルギー疾患の患者に経口投与する場合、腸から吸収される必要がある。マウスに0.9mg/日のD-トリプトファンを経口投与すると、D-トリプトファンの血清レベルが有意に上昇した（図5、A）。D-トリプトファンを3日間マウスに前投与したところ、実験的「喘息」誘発期間中、気管支肺胞洗浄液の総細胞数が減少したが、これは主に好酸球数の減少によるものであった（図5、BおよびC）。さらに、この補充はメタコリンに対する気道過敏性を改善した（図5、D）。TH2反応の関与が示唆されたので、肺T細胞を分析した： D-トリプトファンは、気管支肺胞洗浄液中のIl-4産生T細胞およびIl-4レベルを減少させたが（傾向、図5、EおよびF、脾臓細胞については本論文のオンラインレポジトリ（www.jacionline.org）の図E7を参照）、Ifn-g産生TH1細胞は減少させなかった。さらに、D-トリプトファン投与は、ヘリオス陽性制御性T（Treg）細胞数を有意に増加させたが、フォークヘッドボックスp3（Foxp3）＋細胞数は変化しなかった（図5、G）。
  図のサムネイルgr5
  図5D-トリプトファン経口投与によるアレルギー性気道炎症の抑制。A,D-トリプトファン（50 mmol/L）を飲料水または水のみに投与したマウスの血清D-トリプトファン（超高速液体クロマトグラフィー質量分析ピーク面積）。D-トリプトファン（実線バー）とL-トリプトファン（斜線バー）のスケールが異なることに注意。P=0.006および*P=0.004、Welch検定、平均±SD。B、気管支肺胞洗浄液（BAL）中の細胞の総数。C, 微分細胞数。D,メタコリンの増量に対する気道抵抗の測定（Bonferroni posttestを用いた2元配置分散分析）。E、肺由来のCD3+CD4+リンパ球におけるIfn-gとIl-4の幾何平均（fold change）。F、Cytometric Bead Arrayを用いて評価したマウスの気管支肺胞洗浄液中のIl-4レベル。G、肺由来CD3+CD4+Foxp3+リンパ球のHelios陽性Treg細胞。スチューデントt検定： *P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001。図5、B、C、EおよびF、各群n = 8マウス、Mann-Whitney U検定、中央値±SD、*P < .05、***P < .001、および図5、DおよびG、各群n = 6～12マウス。
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  これらのin vivoでの所見をさらに立証するために、in vitroでT細胞分化アッセイを行った。in vivoでの観察結果と一致して、D-トリプトファンはTH2細胞の分化を低下させたが、TH1細胞の分化は影響を受けなかった（図6、AおよびB、ならびに本論文のオンラインレポジトリ（www.jacionline.org）の図E8、Aを参照）。その結果、Il4とGata3の発現とIl-13の分泌は減少したが、Ifngの発現は影響を受けなかった。しかしながら、Treg細胞はmRNAおよびタンパク質レベルでFoxp3発現の増加を示した（図6、C、および図E8、B参照）。
  図6-トリプトファン
  図6D-トリプトファン（DTrp）がin vitro初代T細胞分化に及ぼす影響。マウス初代脾臓細胞を、0、10、50μmol/LのD-トリプトファン（水に溶解）存在下で、それぞれのサイトカインミックスを用いてTH1（A）、TH2（B）、Treg（C）細胞へと分化させた。分化は、フローサイトメトリー、定量的RT-PCR、および培養上清からのIl-13およびIl-5タンパク質レベルのサイトメトリービーズアレイによって評価した。グラフは、D-トリプトファンで処理しなかった分化細胞に対する倍数変化を示す。*P＜0.05、n＝3～4独立実験、Mann-Whitney U検定。
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  D-トリプトファンは、アレルギー性気道炎症において腸内Treg細胞を誘導し、腸内微生物の多様性を増加させる。
  観察された肺免疫反応に加えて、Foxp3+ T細胞の頻度は、AAIを補充したマウスの大腸において、AAIを補充していないマウスと比較して局所的に増加していた（図7、A）。腸管免疫の変化は、D-トリプトファンによって直接的に、あるいは腸内細菌叢の変化を通して間接的に引き起こされるのかもしれない。
  図のサムネイルgr7
  図7D-トリプトファン（DTrp）の経口投与により、AAIを発症したマウスの腸管Treg細胞数と腸内細菌叢が増加した。A, 結腸固有層におけるCD3+CD4+T細胞中のFoxp3+細胞の割合。****P < 0.0001、n = 6から12匹/群、Student t test。B, α-細菌群集の多様性。シャノン多様性指数を用いて、各処置における細菌の多様性を推定した（ウィルコクソン順位和検定）。
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  16S rRNAベースのバーコーディングによる細菌の多様性解析から、AAIを投与したマウスではOTU95のレベルで群集の豊かさと多様性が強く減少していることが示された（図7、B）。D-トリプトファンを補充すると、AAIマウスの細菌多様性は増加し、その結果、健常動物に匹敵するα-多様性パターンが得られた。D-トリプトファンの投与後、元の多様性が完全に回復したわけではないが、微生物群集組成に対するその効果は有意であった（図E9、A、本論文のOnline Repository（www.jacionline.org）参照）。
  動物のD-トリプトファン補給の健康状態に関係なく、すべてのサンプルはバクテロイデーテス門とファーミキューテス門で占められていた（全塩基配列の19.4%から27.7%、65.9%から78.4%）。予想通り、ファーミキューテス門は主にClostridiales目のメンバーで構成されていた。放線菌やプロテオバクテリアを含む他の門も存在したが、その量はかなり少なかった。科レベルでは、Lachnospiraceae、Odoribacteraceae、Rikenellaceae、Ruminococcaceae、S24-7、およびClostridialesに属する未分類の細菌科（図E9、B参照）が優勢であった。後者は主にAAIマウスに存在し、全コミュニティの58.6％を占めた。しかし、Lachnospiraceaeは、コントロールマウス（13.7％）、D-トリプトファン投与マウス（20.6％）、D-トリプトファン非投与マウス（27.5％）と比較して、AAIマウス（5.5％）では少なかった。嗅覚性細菌科はD-トリプトファンの影響を強く受け、その相対量は両群とも3倍に増加した（3.9％ vs 約1.1％）。対照的に、リケネラ科は対照群（4.6％から7.7％）と比較してD-トリプトファン群（1.1％から2.0％）で存在量の減少を示した。興味深いことに、ルミノコッカス科は、AAIに罹患した対照マウス（3.7％）では強く減少していたが、D-トリプトファンの投与により回復した（8.9％）。S24-7ファミリーのメンバーは、AAIでもD-トリプトファン投与でも影響を受けなかった。全体として、D-トリプトファンの補充は、AAIを発症したD-トリプトファン投与マウスの腸内細菌の多様性を増加させ、細菌の多様性パターンは健常対照マウス（PBS/PBS；図7, B）と同等になった。この結果から、D-トリプトファン投与により、AAIマウスにおいて健全な微生物群集の遺伝子型が再確立されることが示唆された。
  考察
  本研究において、我々は初めてD-トリプトファンをプロバイオティクス菌株LGGおよびL casei W56が産生する細菌物質として同定した。我々は、D-トリプトファンがヒト末梢およびマウス免疫細胞におけるTH2サイトカインおよびケモカインの産生を減少させ、さらに重要なこととして、マウスに与えた場合にAAIの完全な発症を防ぐことを実証した。免疫調節の他に、これは実験的喘息動物で失われていた多様な腸内細菌叢の維持によっても起こりうる。
  プロバイオティック細菌はin vitro3,4や動物実験5,6で免疫反応を修飾することが示されているが、慢性炎症性疾患の治療における臨床的有効性に関する明確な証拠はほとんどない。プロバイオティック細菌と宿主の微生物叢や免疫系との相互作用は非常に複雑であるため、予測可能な作用機序を持つ小分子の利用は、リスクのある被験者のアレルギー性疾患の予防に興味深い選択肢を提供するかもしれない。
  D-アミノ酸はL-アミノ酸の非蛋白原性エナンチオマーである。1980年代後半に哺乳類の脳で神経伝達物質として遊離のD-アスパラギン酸とD-セリンが発見されるまでは、D-アミノ酸は高等生物では役割を果たさないと考えられていた。したがって、ヒトにおけるD-トリプトファンの取り込み40と代謝41についてはほとんど知られておらず、高等生物はD-トリプトファンをあまり利用しないと考えられてきた42。高感度アッセイ法を開発することにより、マウスにおける経口摂取後のD-トリプトファンの全身分布を明らかにした。
  高等生物とは対照的に、プロバイオティクス細菌を含む多くの細菌は、D-グルタミン酸やD-アラニンなどのD-アミノ酸を生産し、主にペプチドグリカン壁の糖鎖架橋に利用している43, 44。
  細菌のL-トリプトファンの生合成と分解の制御はよく知られている45 。細菌のコミュニケーションにおけるD-トリプトファンの役割は、枯草菌のバイオフィルムの分解に必要であることを証明したことにより、最近になって発見されたばかりである46 。プロバイオティクス細菌が産生するその他の可溶性物質については、今のところあまり研究されていない4, 47。
  グラム陰性菌由来のアシルホモセリンラクトンについてすでに示されていることと同様に、D-トリプトファンを含む細菌のD-アミノ酸を認識し、相互作用する手段が進化した可能性がある。
  この仮説は、いくつかの観察結果から支持される。第一に、我々のバイオアッセイに用いたヒト細胞は、D-トリプトファンには反応したが、L-トリプトファンや他のD-アミノ酸には反応しなかった。
  Gタンパク質共役型受容体GPR109B54はマクロファージ、単球、脂肪組織、肺に発現しており55、D-トリプトファンまたはその代謝物であるD-キヌレニンの結合によって好中球を引き寄せる。GPR109Bは、喘息患者の気道上皮細胞やT細胞では対照群と比べて有意に減少しており、アレルギー性疾患におけるこの受容体の役割の可能性を示している（本論文のオンラインレポジトリ（www.jacionline.org）の表E2を参照）。
  2番目の受容体であるsolute carrier family 6 amino acid transporter member 14（SLC6A14、別名ATB0,+）は、D-トリプトファンおよび他の4種類のD-アミノ酸を上皮細胞を横切って輸送する。SLC6A14はさらに、胎児の肺でも非常に高いレベルで発現している（我々のデータ［本論文のオンラインレポジトリ（www.jacionline.org）の図E10を参照］とSuら58のデータに基づく）。胎児期におけるSLC6A14の生理学的役割は、今のところ不明である。しかし、プロバイオティクス細菌を用いた出生前介入試験との関連性を推測することは魅力的である。
  トリプトファン2,3-ジオキシゲナーゼ（TDO）、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ（IDO）1、そして最近発見されたIDO2の3つの酵素がトリプトファンを代謝することができる。トリプトファン2,3-ジオキシゲナーゼはL-トリプトファンに特異的であるが、IDO1はD-とL-トリプトファンの両方をキヌレニン経路に流す。IDOの活性化はトリプトファンの枯渇を引き起こし、それによって末梢耐性を促進する59。しかし、IDO1は気道における免疫寛容の誘導には重要ではなく、肺DCへの作用を通してTH2反応を促進する60ようである。さらに、DC61にも発現し、基質特異性がわずかに異なるIDO2が、D-トリプトファン代謝をさらに調節する可能性がある62。
  これまでのところ、推定物質の同定のために20％MeOH画分に焦点を絞ってきたのは、この画分が免疫調節活性と極性が最も高かったからである。さらに、40％および50％のMeOH画分でも生理活性が検出されたことから、さらなる低分子免疫活性物質の発見が期待される。我々のバイオアッセイは、DCに寛容性プロファイルを誘導し、アレルギー関連ケモカインCCL17のレベルを低下させる物質を検出するように設計された。したがって、アレルギー疾患とは関係のない、さらなる免疫調節物質が見落とされている可能性がある。
  D-トリプトファンは、我々のスクリーニングアッセイで示されたように直接的に、あるいは宿主のマイクロバイオームの構造を変化させることによって間接的に、免疫恒常性に影響を及ぼす可能性がある。観察されたD-トリプトファンの免疫調節特性を別にすれば、腸内細菌叢の変化やAAIからの保護を説明する直接的なメカニズム的関連性はわかっていない。しかし、われわれの知見と同様に、Trompetteら63は、発酵性食物繊維による腸内細菌叢の変化が、AAIからの保護に関与する代謝産物の産生を誘導することを示した。これらの代謝産物はさらに、Foxp3+ Treg細胞の頻度増加と関連している64。肺微生物叢とFoxp3+ Treg細胞の集団はさらに、ハウスダストマウス誘発AAIマウスモデルにおいて、新生児マウスを2型免疫反応の過度な上昇から保護することが示されている65。
  まとめると、我々は初めて、D-トリプトファンがプロバイオティクス株によって産生される免疫調節物質として作用することを明らかにした。この結果は、トリプトファンが免疫応答と腸内細菌叢の構成成分の両方に影響を及ぼす可能性があり、AAIの活動亢進の重症度を軽減できる可能性があることを示唆している。免疫調節に加えて、これはAAIを発症した動物では失われていた多様な腸内細菌叢の維持によっても起こりうる。
  我々は、細菌由来のD-トリプトファンがヒトの健康において、これまで考えられていたよりも幅広い役割を果たす可能性があると結論づけた。全体として、我々の知見は、定義された細菌産物が、慢性炎症性疾患の予防戦略開発の基盤となりうるという概念を支持するものである。
  新生児マウス肺のmRNAアレイを実施してくれたMartin Irmler（Institute of Experimental Genetics, Helmholtz Zentrum Muenchen, Neuherberg, Germany）に感謝する。Rabea Imker、Juliane Artelt、Sebastian Reuter、Gregor Jatzlaukには優れた技術協力をいただいた。Katrin Milger、Stefan Dehmel、Petra Nathan、Sabine Bartel、Oliver Eickelberg、Susanne Krauss-EtschmannはEuropean Cooperation in Science and Technology (COST) BM1201 "Developmental Origins of Chronic Lung Disease"（www.cost-early-origin-cld.eu）の一員である。
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  図E10
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筑波大学
PubMed
クロス
グーグル奨学生
バンクローJ.
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樹状細胞と免疫の制御。
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スコープス (12473)
PubMed
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グーグル奨学生
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定常状態のDCの寛容促進機能の制御。
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スコープス (41)
PubMed
クロス
グーグル
検索 乳酸菌。地図上の結果-ClinicalTrials.gov. https://clinicaltrials.gov/ct2/results/map?term=Lactobacillus。2015年2月2日アクセス。

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グーグル・スカラー
橋本 敦.
熊代 聡
西川貴史
岡 徹
高橋和彦
水戸崇史
ほか
ヒト前頭前野における遊離D-アスパラギン酸およびD-セリンの胎生期発生と生後の変化。
J Neurochem. 1993; 61: 348-351
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スコパス (255)
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クロス
グーグル奨学生
ヴィッサー W.F.
フェルホーヴェン-デュイフN.M.
オフォフR.
バッカー S.
クロンプ L.W.
ベルガーR.
他
体液中のD-アミノ酸を定量するための高感度かつ簡便な超高速液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析法。
J Chromatogr A. 2011; 1218: 7130-7136
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スコープス (126)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ロペス-ブリージョS.
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ヒト赤血球、エールリッヒ細胞、ラット腸管における輸送系Tを介したトリプトファン輸送。
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スコパス (26)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ラングナー R.R.
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正常ヒトにおけるD-トリプトファンの代謝。
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PubMed
要旨
全文PDF
グーグル奨学生
トリエブワッサー K.C.
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ヘンダーソン L.M.
バドニーJ.A.
イヌにおけるD-およびL-トリプトファンの代謝。
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スコパス (14)
PubMed
概要
全文PDF
グーグル奨学生
カヴァ F．
デ・ペドロM.A.
ラム H.
デイビス B.M.
ウォルドー M.K.
非カノニカルD-アミノ酸による細菌細胞壁の修飾のための異なる経路。
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スコープス (211)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ラム・エイチ
オー D.C.
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タカックス C.N.
クラディ J.
デ・ペドロ M.A.
ら
D-アミノ酸は細菌の定常期細胞壁リモデリングを支配する。
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麹菌
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ヤノフスキー C.
細菌におけるトリプトファン合成・分解遺伝子のRNAによる制御。
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スコープス(105)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
コロドキン-ガルI.
ロメロ D.
カオ S.
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コルターR.
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D-アミノ酸がバイオフィルム解体の引き金となる。
Science. 2010; 328: 627-629
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スコープス (701)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
トーマス C.M.
ホン T.
ファン・パイケレンJ.P.
ヘマラジャータ P.
トリン D.V.
フー・W．
他
プロバイオティクス乳酸菌由来のヒスタミンは、PKAおよびERKシグナルの調節を介してTNFを抑制する。
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スコープス(347)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
フリードマンM.
D-アミノ酸の起源、微生物学、栄養学、薬理学。
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スコープス (154)
パブコメ
クロス
グーグル奨学生
ヒトマイクロバイオームプロジェクトコンソーシアム
健康なヒトのマイクロバイオームの構造、機能、多様性。
Nature. 2012; 486: 207-214
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日本学術振興会特別研究員
PubMed
クロス
グーグル奨学生
フイ D.S.W.
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チャブラ S.R.
ウィリアムズ P.
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緑膿菌クオラムセンシングシグナル分子の免疫調節活性の違い。
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(160件)
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クロス
グーグル奨学生
スミス R.S.
ケリー R.
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フィップス R.P.
シュードモナスの自己誘導物質N-(3-オキソドデカノイル)ホモセリンラクトンは、ヒト肺線維芽細胞においてシクロオキシゲナーゼ-2とプロスタグランジンE2の産生を誘導する。
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スコープス (133)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
リッチー A.J.
ヤム A.O.W.
タナベK.M.
ライス S.A.
クーリー M.A.
緑膿菌のクオラムセンシング分子N-(3-オキソドデカノイル)-L-ホモセリンラクトンによるin vivoおよびin vitroでのT細胞およびB細胞を介した免疫応答の修飾。
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(88件)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
チャブラ S.R.
ハーティC.
フーイ D.S.
デイキン M.
ウィリアムズ P.
テルフォードG.
他
免疫調節剤としての細菌シグナル（クオラムセンシング）分子N-(3-オキソドデカノイル)-L-ホモセリンラクトンの合成類似体。
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(226件)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
イルカヤマ-トモベ
田中裕之
横溝貴史
橋立-吉田敏明
柳澤正
櫻井智子
芳香族D-アミノ酸はGタンパク質共役型受容体GPR109Bを介してヒト白血球の化学誘引因子として働く。
Proc Natl Acad Sci U S A. 2009; 106: 3930-3934
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(59件)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ワイズ A.
フォード S.M.
フレイザーN.J.
バーンズ A.A.
エルシュアバギー N.
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他。
ニコチン酸に対する高親和性受容体と低親和性受容体の分子生物学的同定。
J Biol Chem. 2003; 278: 9869-9874
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筑波大学
PubMed
クロス
グーグル奨学生
キシック A．
ハルストランドT.S.
スタントE.N.
スティーブンス P.T.
コボー M.S.
タプリンC.
他。
フィブロネクチン産生低下は、喘息上皮の修復障害に有意に寄与する。
Am J Respir Crit Care Med. 2010; 181: 889-898
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スコパス(119)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
畑中敏明
黄 W.
中西 崇
ブリッジズ C.C.
スミス S.B.
プラサド P.D.
他。
大腸に発現するアミノ酸トランスポーターATB(0,+)を介したD-セリンの輸送。
Biochem Biophys Res Commun. 2002; 291: 291-295
論文で見る
スコープス (84)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
スー A.I.
ウィルトシャーT.
バタロフ S.
ラップ H.
チン K.A.
ブロック D．
他。
マウスとヒトのタンパク質コードトランスクリプトームの遺伝子アトラス。
Proc Natl Acad Sci U S A. 2004; 101: 6062-6067
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遺伝子発現
PubMed
クロスリファレンス
グーグル奨学生
マン D.H.
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インドールアミン2,3ジオキシゲナーゼと免疫応答の代謝制御。
Trends Immunol. 2013; 34: 137-143
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筑波大学
PubMed
要旨
全文
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グーグル奨学生
シュー・エイチ
オリス T.B.
フェイ M.
ヘンリー A.C.
メルガート B.N.
チェン・L.
ら
肺樹状細胞におけるインドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼは、Th2応答とアレルギー性炎症を促進する。
Proc Natl Acad Sci U S A. 2008; 105: 6690-6695
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スコープス (123)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ロブS.
コニグストレーナーA.
シェーファーR.
ランメンゼーH.G.
オペルツG.
テルネスP.
レボトリプトファンはヒト樹状細胞のIDO活性を阻害するが、デキストロ-1-メチルトリプトファンは阻害しない。
Blood. 2008; 111: 2152-2154
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スコープス (159)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
パントゥリスG.
セリスM.
湯浅秀樹
ボール H.J.
モワット C.G.
ヒトインドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ-2は、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ-1とは異なる基質特異性と阻害特性を有する。
Amino Acids. 2014; 46: 2155-2163
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スコープス (96)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
トロンペットA.
ゴルウィッツァー E.S.
ヤダヴァ K.
シチェルシュティールA.K.
スプレンガー N.
Ngom-Bru C.
他
食物繊維の腸内細菌叢代謝はアレルギー性気道疾患と造血に影響する。
Nat Med. 2014; 20: 159-166
論文で見る
スコープス (1890)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
スミス P.M.
ハウィット M.R.
パニコフN.
ミショー M.
ガリーニ C.A.
Bohlooly-Y M.
他
微生物の代謝産物である短鎖脂肪酸は、大腸Treg細胞の恒常性を制御する。
Science. 2013; 341: 569-573
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スコパス(3503)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
ゴルウィッツァー E.S.
サグラニ S.
トロンペットA.
ヤダヴァ K.
シャーバーン R.
マッコイ K.D.
ほか
肺微生物叢はPD-L1を介して新生児のアレルゲンに対する耐性を促進する。
Nat Med. 2014; 20: 642-647
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スコープス (427)
PubMed
クロス
グーグル奨学生
論文情報
出版履歴
オンライン公開 2016年9月23日
受理済み 2016年9月16日
改訂版を受領 2016年5月13日
受理：2016年5月13日 2015年9月17日
脚注
ヘルムホルツ・センター・ミュンヘン、ドイツ環境衛生研究センター、ライプニッツ医学・バイオサイエンスセンターResearch Center Borstelによる学内助成金の支援を受けた。プロバイオティクス菌はオランダのWinclove Bioindustry BV社、デンマークのHorsholmにあるChr.Hansen社、ドイツのDaniscom Niebüll社、ドイツのHerdeckeにあるArdeypharm GMbH社から提供された。いずれの提供者も本試験のデザイン、分析、解釈に影響を与えなかった。

潜在的利益相反の開示： O. EickelbergはGerman Center for Lung ResearchおよびApcethから助成金を受けており、Roche、Bayer、Novartis、GalapagosおよびMorphosysとコンサルタント契約を結んでいる。その他の著者は、関連する利益相反はないと宣言している。

身分証明書
DOI: https://doi.org/10.1016/j.jaci.2016.09.003

著作権
© 2016 米国アレルギー喘息免疫学会を代表してエルゼビア社発行
サイエンスダイレクト
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図
図サムネイルgr1
図1異なるプロバイオティクス株の上清のヒト細胞に対する免疫活性のスクリーニング。A、LGG（fx1）、ビフィズス菌BB-420（fx2）、ラクトバチルス・カゼイW56（fx3）の上清の用量依存的なヒトホジキンリンパ腫KM-H2細胞のCCL17分泌低下能。陰性対照は非プロバイオティクス乳酸菌Lactobacillus rhamnosus DSM-20021（fx4）であった。3回の独立した実験を二重に示す（未処理のKM-H2細胞のCCL17分泌量に対する平均±SDパーセンテージ）。LGG：P＜0.005およびP＜0.0005、L casei W56： ##P < .005、##P < .0005、BB-420： §§P＜0.005、§§P＜0.0005、スチューデントt検定。B、LGG、ビフィズス菌BB-420、Lactobacillus casei W56、または非プロバイオティクスLactobacillus rhamnosus DSM-20021からの上清の、LPS刺激ヒト単球由来DCにおけるコスティミュレイトリー分子およびHLA-DRの完全なアップレギュレーションを阻止する能力。+/-菌体上清の有無。5回の独立した実験を示す（LPS単独に対する平均±SDパーセント）。P < .01およびP < .001、Dunn多重比較検定。
図サムネイルgr2
図2KM-H2細胞のCCL17分泌を減少させる37株すべての細菌上清の能力に関する概要。網掛け棒は、非プロバイオティクス乳酸菌Lactobacillus rhamnosus DSM-20021（陰性対照）；LGGは、乳酸菌以外の菌株を用いたすべての実験において陽性対照として含まれた。開棒は、未処理のKM-H2細胞と培地対照細胞。3回の独立した二重実験を示す（未処理のKM-H2細胞のCCL17分泌に対する平均＋SDパーセンテージ）。**P < .005 および **P < .0005、Student t検定。
図サムネイルgr3
図3KM-H2細胞におけるCCL17分泌を減少させるプロバイオティクス上清のサブフラクションの能力。LGG（上）またはLactobacillus casei W56（中）の上清から、異なる極性（MeOH/H2Oグラジエントクロマトグラフィー）を有するサブ分画を得た。陰性対照は、非プロバイオティクスDSM-20021およびブランクCDM1培地（下）であった。3つの独立した実験を二重に示す（未処理のKM-H2細胞の構成的CCL17分泌に対する平均±SDパーセンテージ）。P < 0.005およびP < 0.0005、スチューデントt検定。
図サムネイルgr4
図4KM-H2細胞によるCCL17分泌に対するトリプトファンL-およびD-異性体の影響。KM-H2細胞を異なる濃度の合成トリプトファンL-およびD-異性体で刺激し、24時間後にKM-H2培養液中のCCL17を定量した。丸はD-トリプトファン、菱形はL-トリプトファン。3つの独立した実験を二重に示す（未処理のKM-H2細胞の構成的CCL17分泌に対する平均±SDパーセンテージ）。*P < .05、**P < .005、**P < .0005、Student t test。
図のサムネイルgr5
図5D-トリプトファン経口投与によるアレルギー性気道炎症の軽減。A,D-トリプトファン（50mmol/L）を飲料水または水のみに投与したマウスの血清D-トリプトファン（超高速液体クロマトグラフィー質量分析ピーク面積）。D-トリプトファン（実線バー）とL-トリプトファン（斜線バー）のスケールが異なることに注意。P=0.006およびP=0.004、Welch検定、平均±SD。B、気管支肺胞洗浄液（BAL）中の細胞の総数。C, 微分細胞数。D,メタコリンの増量に対する気道抵抗の測定（Bonferroni posttestを用いた2元配置分散分析）。E、肺由来のCD3+CD4+リンパ球におけるIfn-gとIl-4の幾何平均（fold change）。F、Cytometric Bead Arrayを用いて評価したマウスの気管支肺胞洗浄液中のIl-4レベル。G、肺由来CD3+CD4+Foxp3+リンパ球のHelios陽性Treg細胞。スチューデントt検定： *P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001。図5、B、C、EおよびF、各群n=8マウス、Mann-Whitney U検定、中央値±SD、*P < .05、***P < .001、および図5、DおよびG、各群n=6～12マウス。
図のサムネイルgr6
図6D-トリプトファン（DTrp）はin vitro初代T細胞分化に影響を及ぼす。マウス初代脾臓細胞を、0、10、50μmol/LのD-トリプトファン（水に溶解）存在下で、それぞれのサイトカインミックスを用いてTH1（A）、TH2（B）、Treg（C）細胞へと分化させた。分化は、フローサイトメトリー、定量的RT-PCR、および培養上清からのIl-13およびIl-5タンパク質レベルのサイトメトリービーズアレイによって評価した。グラフは、D-トリプトファンで処理しなかった分化細胞に対する倍数変化を示す。*P < 0.05、n = 3から4の独立実験、Mann-Whitney U検定。
図のサムネイルgr7
図7D-トリプトファン（DTrp）の経口投与は、AAIマウスにおいて腸内Treg細胞数と腸内細菌群集を増加させた。A, 結腸固有層におけるCD3+CD4+T細胞中のFoxp3+細胞の割合。****P < 0.0001、n = 6から12匹/群、Student t test。B, α-細菌群集の多様性。シャノン多様性指数を用いて、各処置における細菌の多様性を推定した（ウィルコクソン順位和検定）。
サムネイル図1
図E1
サムネイル図2
図E2
図E3
図E3
サムネイル図4
図E4
サムネイル図5
図E5
サムネイル図6
図E6
サムネイル図7
図E7
サムネイル図8
図E8
サムネイル図9
図E9
表
表I 合成D-アミノ酸で処理した成熟DCの表面マーカー発現率
表I ヒトLPS処理DCにおけるプロバイオティクス上清またはD/L-トリプトファンによるサイトカイン調節作用
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