海洋生態系における新たな統合要素とゲノム可塑性

2023年1月11日 15:00

論文| 186巻1号, p47-62.e16, 2023年01月05日(月)
海洋生態系における新たな統合要素とゲノム可塑性
トーマス・ハックル 12, 13
ラファエル・ローレンソー 12
マーカス・J・アンケンブランド 12
エドワード・F・デロング
スティーブン・J・ビラー
サリー・W・チショルム
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脚注を表示するDOI:https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.12.006
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ハイライト

海洋細菌のゲノム適応を促進する新規DNAトランスポゾン「ティケポゾン」の発見

タイケポゾンはウイルスのサテライトになることも、栄養獲得遺伝子などのカーゴを運ぶこともできる

タイケポゾンは海水中のウイルスカプシドや細胞外ベシクルに豊富に存在する

タイケポゾンはゲノムアイランドの形成やリモデリングを促進する
まとめ
遺伝子の水平伝播は微生物の進化を加速させる。海洋ピコシアノバクテリアのプロクロロコッカスは、高いゲノム可塑性を示すが、その基礎となるメカニズムは不明であった。このDNAトランスポゾンは、ウイルスのサテライトであるものと、栄養獲得遺伝子などのカーゴを運ぶものがあり、この属の遺伝的多様性を形成していることが明らかになった。タイケポゾンは、深部分岐部位特異的チロシンリコンビナーゼを含む、移動ライフサイクルに連動した特徴的な遺伝子を共有している。この遺伝子はtRNA遺伝子に結合し、柔軟な遺伝子の貯蔵場所であるゲノムアイランドを再構築しているように見える。選択実験では、硝酸塩同化カセットを持つタイケポゾンが動的に獲得・喪失され、それによって染色体再配列と宿主適応が促進されることが明らかになった。海水から採取したベシクルやファージ粒子には、タイケポゾンが豊富に含まれており、自然界に拡散するための手段を提供している。また、プロクロロコッカスと共存する微生物にも同様の要素が見られ、広大な貧栄養海域における微生物の多様化に共通のメカニズムがあることが示唆された。
グラフィカルな要旨
図サムネイル fx1
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キーワード
遺伝子水平移動
移動性遺伝子要素
ウイルスサテライト
細胞外ベシクル
ゲノムアイランド
パンゲノム
適応
プロクロロコッカス
はじめに
プロクロロコッカス（Prochlorococcus）は、海洋で最も小さく、最も豊富な藍藻である。プロクロロコッカス属は大きなパンゲノムを持ち、ニッチ分化やファージ防御に関連する超可変ゲノムアイランドを含んでいます1, 2, 3, 4。光と温度への適応は同属のクレードを広く定義し、野生では共存する亜集団のモザイクに細分化されます5,6,7。プロクロロコッカスの生態系における可変ゲノムアイランドの重要性はよく知られているが、ほとんどの細胞には抱合システム11や天然コンピテンス遺伝子などの一般的な遺伝子水平移動手段がないため、それらがどのように形成され、新しい遺伝子を獲得するかは未解決のままである12。シアノファージとの遺伝子交換による島の多様化は、光合成、高照度適応、その他の代謝機能に関わる遺伝子で観察されているが、プロファージを介した伝達の証拠はほとんどない。いくつかのシアノファージはインテグラーゼ遺伝子と推定付着部位を持ち、プロクロロコッカスゲノム内の組換えホットスポットにリンクしているが16、17、数百のゲノムで1つの部分プロファージのみが観測されている18。さらに、プロクロロコッカス細胞には、プラスミド、トランスポゾン、挿入配列（IS）、統合・共役要素（ICE）を含む一般的な移動遺伝要素（MGE）が存在しないように見えるが、最も基層のプロクロロコッカスクレードLLIVで以前確認されたいくつかのトランスポゾンとISは例外である17。このように、一般的な水平方向の遺伝子伝達メカニズムが限られていることは、大規模で広く分布するパンゲノム7,22,23,24と矛盾しているように思われた。そこで我々は、培養細胞および野生細胞21のゲノムを調べ、このグループのゲノム島の多様性を促進するメカニズムについて証拠を得ることを目的とした。
研究成果
プロクロロコッカスゲノムアイランドに隠されたモビローム
ゲノムアイランド」という用語は、個々のMGEを指して使われることもあるが25、ここでは、系統間変動が大きく、柔軟性のある遺伝子（すなわち、すべてのゲノムで共有されていない遺伝子）が比較的高い密度を持つ大規模な染色体領域を特定するために使用する。このことは、プロクロロコッカスのゲノムアイランドの初期の記述と一致している1。
プロクロロコッカス属のゲノムアイランドは、培養単離株と野生単細胞から得られた623のゲノムに注釈をつけた21 (Table S1) 。これらのゲノムは10の異なる系統学的クレードに属し、この系における生態学的および進化的に適切な分化の単位となるグループ分けを行った5, 19, 27。我々は、カスタム隠れマルコフモデル（HMM）ベースのアプローチを用いて、柔軟な遺伝子の濃縮度の差に基づいて、明確に定義された島を特定した（図S1A）。すべてのゲノムにおいて、1クレードあたり平均8-10個の島が見つかり、その大きさは通常4-200kbpで、ゲノムあたりの全遺伝子の約4分の1を構成していた。この島には、プロクロロコッカス・パンゲノムの全柔軟性遺伝子の3分の2以上が含まれている（図S1B；表S2）。
サムネイル図1
図S1HMMに基づくオーソログ遺伝子の存在量を用いたゲノムアイランド予測、STAR Methods関連
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より限定的な研究1,28と同様に、我々が同定したプロクロロコッカス島のほとんどは、7つのtRNA遺伝子（prolinetgg, serinetga, alanineggc, threonineggt, argininetct, three methioninecatのうちの1つ、およびtmRNA遺伝子（停止したリボソームの解放に重要な二重機能の転送メセンジャーRNA））に直接隣接しています（図 S2）。tRNA遺伝子は様々なMGEの集積ホットスポットとして知られているため29、我々はプロクロロコッカスゲノムには一般的にMGEが存在しないという従来の考え方を再考し、利用可能なゲノムを慎重に再調査してそのような実体のサインを探した。
図サムネイル図2
図S2プロクロロコッカスにおけるゲノムアイランドと移動性遺伝要素の染色体構成、図7とSTAR Methods関連
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まず、プロファージ、統合プラスミド、トランスポゾン、カスポゾン、IS、ICE、病原性・ファージ誘導性染色体島（PICI）など、よく知られたタイプのMGEが存在するか、簡単なアプローチ（STAR Methods参照）でスクリーニングを行った。この領域は、異なるクレードの2つのゲノム（HLIとHLII；図S1C）でヌクレオチドレベルの高い同一性（99％）を示し、水平転移が起こったことを示していた。この領域は、MGEに共通するインテグラーゼ型タンパク質である大きなセリンリコンビナーゼと、さらに8つの仮説的遺伝子をコードしていた。さらに、リモートホモロジー検出法30を用いて仮説遺伝子を調べたところ、推定転写制御因子（MerR様）、推定主要キャプシド蛋白質（HK97-fold）、複製ヘリカーゼ（DnaB様）、ファージや他のMGEにしばしば見られる複製因子のリモート構造類似性蛋白質をコードする三つの小さな遺伝子が確認された。これらの特徴は、この島にMGEが存在することと一致した。その配列を利用して、さらに関連するMGEを繰り返し同定し、最終的にプロクロロコッカスのインテグラーゼ中心モビロームの特徴的なタンパク質の包括的セットをキュレートした（表S3）。これらのタンパク質を用いて、623のプロクロロコッカスゲノムから937のMGEを同定し、これらのMGEとプロクロロコッカスの進化と生態におけるその役割に関する以下の詳細な研究の基礎となった。
タイケポソン。ファージ干渉や栄養獲得に関与する新規DNAトランスポゾン
以下に詳述するように、同定されたプロクロロコッカスMGEの約半数（937個中501個）は、荷物を運ぶDNAトランスポゾンのまとまった新しいファミリーを構成している（図1、2）。これらのMGEの中には、海洋環境における既知のストレスに対して、適応的に有利な機能をコードしているものがある。これらの新規MGEは、幸運と繁栄の守護神であり、オセアヌスの娘であるギリシャ神話のティケにちなんで、タイケポゾンと名づけられた。タイケポゾンは、（1）他のMGEとは異なる、移動と複製を促進する特徴的な遺伝子の共通セットを持ち（図2）、（2）部位特異的統合酵素（多くの場合、タイケポゾンに固有の系統に属する部位特異的チロシン組み換え酵素）を含み、部分的にtRNA反復配列で囲まれた統合要素を残す（図1および図3）MGEの独立系統を形成することを以下に証拠とともに主張する。(3) 一方の端に内向きのインテグラーゼがあり、オプションとして、インテグラーゼの隣か反対側の端に小さな複製モジュールがあるという、保存された遺伝子構成をもつ（図1）；最後に (4) 地元の環境への適応という点で明確な意味をもつ荷物を運ぶ。 g., (4)栄養の獲得やファージによる干渉の促進など、局所的な環境への適応という点で明確な意味を持つカーゴを運ぶ（図1）。
図のサムネイル gr1
図1プロクロロコッカスにおけるタイケポゾンの構造と機能
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図1.サムネイルgr2
図2プロクロロコッカス属モビロームの2つの遺伝子共有ネットワーク（ティケポゾンとクリプティックMGEからなる
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図のサムネイル gr3
図3チケポソン型チロシンリコンビナーゼの系統的配置
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このタイケポゾンの定義に到達するために、我々はまず、遺伝子共有ネットワークアプローチを用いて、既知のMGEsの文脈ですべてのプロクロロコッカスMGEsを分類した39,40,41。プロクロロコッカスのモビローム（組み換え、DNA複製、パッケージングなど、移動生活に関する機能を持つタンパク質）の全ての特徴的なタンパク質、NCBIウイルスRefSeqの全てのタンパク質、mobileOGデータベース（MGEの全ての主要クラスの特徴的タンパク質1000万配列に基づく総合データベース）42の全てのタンパク質、さらに以下に詳しく述べる我々が特定したいくつかの要素と同様のゲノム構造を持つMGEのPICIsを表すタンパク質のセットを共クラスターに分類しました。次に、異なるプロクロロコッカスMGEが、既知のMGEタイプだけでなく、互いにどのように関連しているかを分析するために、MGEを共有タンパク質クラスターで結ぶ二部作ネットワークを計算した（図2）。
このネットワークに基づき、プロクロロコッカスMGEの約半分（501個）であるタイケポソンは、MGEの特徴的なタンパク質の大部分を包含する強固なクラスターを形成しており、これらの要素をMGEの新しい独立した系統として定義する根拠となるものである。タイケポゾンに関連するタンパク質クラスターのうち、3つだけがよく知られたMGEクラスの配列も含んでいた。ウイルス配列を含む主要カプシドタンパク質のクラスター、プラスミドやウイルスに見られる切断型チロシン組み換え酵素、プラスミド、ICE、ウイルスにも見られるまれな（タイケポゾンでは6タンパク質）だが明らかに乱用的な複製ヘリカーゼがそれであった。MGEの残りの半分は、インテグラーゼとエクスキジオナーゼ以外の識別可能な特徴的遺伝子を持たない暗号要素であり、特に明記しない限り、この2つの遺伝子以降の解析からは除外した。
原核生物のトランスポゾンは、IS型トランスポゾンとその自律型代表であるISや複合型トランスポゾンがあり、一般に部位選択性がなく、同一ゲノム内の異なる場所に組み込むことができるトランスポゾンをコードしています。一方、プロクロロコッカスのタイケポソンとクリプティックエレメントは、短い配列モチーフ、いわゆる付着部位を認識する部位特異的インテグラーゼ（937個中910個がファージインテグラーゼ様のチロシンリコンビナーゼ、残りが大きなセリンリコンビナーゼ）をコードする44 。このようなインテグラーゼは、2つの付着部位間の組換えを触媒し、切除されたMGEのレシピエントゲノムへの統合（MGE上の付着部位とゲノム内の付着部位間の組換え）または既に統合されたMGEの切除（統合後のMGEを挟んだ2つの付着部位間の組換え）を促進することが示されている。この可逆的なカットアンドペースト転座機構の方向性は、しばしば切除酵素によって制御されており、この酵素が発現すると再統合が阻害される44。
プロクロロコッカス属モビロームの様々なチロシンリコンビナーゼの中で、タイケポソンによってコードされるものは、その統合部位と系統性から、さらに際立っている。これらの酵素は、プロクロロコッカスの主要なゲノムアイランドに隣接する7つのtRNA遺伝子の、40ヌクレオチド長の結合部位を特異的に標的としている（表S4）。結合部位はtRNA遺伝子の始点/終点に位置し、全長遺伝子は流入する結合部位によって再構成されるため、標的のtRNA遺伝子は機能的に破壊されることがない。この統合プロセスは、おそらく部分的なtRNAでも起こり、統合されたタイケポゾンの両側には、少なくとも部分的なtRNAが存在する。
タイケポゾンのインテグラーゼと他のMGEs、ウイルス、バクテリア、古細菌45のインテグラーゼについて再構成した系統樹では、いくつかの例外を除き、前者は単系統クレードを形成し、他のシステムのインテグラーゼよりも互いに近縁であることが明らかになった（図3）。インテグラーゼは、ウイルス、MGEs、宿主の間を移動することが多く、進化の歴史が複雑であることから、これは予想外であった46。各島にはそれぞれ固有の近縁のtRNAがあり、各tRNAにはそれぞれ固有のインテグラーゼが存在する。さらに、系統樹に基づくと、タイケポゾンのインテグラーゼは、生命の様々なドメインに存在するインテグラーゼの多様性の10％以上を占めており（図3）（樹に基づく多様性の推定はSTAR Methods参照）、その古い起源を支持するとともに、それらを搭載するタイケポゾンが同様の時間スケールで独立して進化したことを示唆している。
インテグラーゼをコードするモジュール（約1kbp）に加え、多くのタイケポゾンは複製に関連する遺伝子（ポリメラーゼ、プライマーゼ、ヘリカーゼを含む2-4kbモジュール）を持っている（図1；表S4）；境界のはっきりした（すなわち。その中で最も一般的なのは、ヘリカーゼスーパーファミリー4（RecA-fold、cd01125；まれにDnaB-like、cd00984）およびスーパーファミリー3（Virus-like、PF05272）であった。）また、ヘリカーゼスーパーファミリー6（MCM-like, COG1241）のメンバーも一部観察された。さらに、15％のタイケポゾンは、ヘリカーゼに隣接するか融合した多機能プライマーゼポリマーゼドメイン（PrimPol, cd04859）も持っていた。これらの多機能プリマーゼ・ポリメラーゼドメインは、少なくともいくつかのタイケポゾンが自己合成を行う可能性を持っていることを示唆している。このことは、原核生物のトランスポゾンの中で、タンパク質を始原とするB型DNAポリメラーゼをコードするカスポゾンに次いで、このような能力を持つ2番目のグループとなる47, 48。
部位特異的インテグラーゼと自律的複製はMGEsでは珍しくないが、それらは通常、真核生物要素49か、独特のライフスタイルを持つ大型の原核生物要素に関連している：溶解性ファージはそれ自身のキャプシドをコードしている；プラスミドは通常、染色体外DNA分子として存在している；ICEは細胞間の移動を可能にする結合装置をコードしている、50,51。タイケポゾンはこれらの複雑な機能特性を持たず、その特徴的な機能と全体的なゲノム構成から、ウイルスのサテライト52-PICI36、53、54（最初にSaPIとして記述された）およびPICI様要素（PLE）などの複製/移動のためにヘルパーファージに依存する寄生MGEsに類似しています。最近、海洋性ウイルス粒子のかなりの割合にファージサテライトが存在することが報告されているが、今回報告されたプロクロロコッカスのタイケポゾンは、海洋性ウイルス粒子にコンカテマーとして存在するものとは異なるようである57。
その類似性は、PICIと認識できる相同性を持つ遺伝子を共有していないにもかかわらず、同じ機能タイプの明らかなファージハイジャック遺伝子を持つ「サテライトタイケポソン」のサブセット（501個中82個）で特に顕著になる。このサブユニットは、ファージカプシドの構成要素である主要キャプシド蛋白質の予測、または新しく形成されたファージカプシドにファージDNAを送り込むタンパク質複合体の部品である小さなターミナーゼサブユニットを持つ（図1B）。すなわち、ファージ感染時に宿主ゲノムから再活性化し、複製を行い、ファージの複製を阻害する可能性があり、新たに生成されたファージカプシドを乗っ取って他の細胞に拡散し、最終的にファージの捕食に対して集団レベルの抵抗性を提供するのである。しかし、興味深いことに、PICIでは一般的と思われる、追加のカーゴ遺伝子を持つサテライトティケポゾンは観察されなかった36。
私たちのデータセットに含まれる大多数のタイケポゾン（501個中419個）は、ウイルスのパッケージングや干渉のための遺伝子を持たず、代わりにしばしば最大10kbpのカーゴを運ぶ（境界が明確な213個のタイケポゾンのうち、。境界が明確な213のタイケポゾンのうち、80%が2 kbを超えるカーゴを、42%が10 kbを超えるカーゴを担っている。多くの場合、これらのタイケポゾンのカーゴは機能未知の遺伝子で構成されており、これは野生微生物のアノテーションにおける永遠の課題である58。しかし、我々がアノテーションできた遺伝子は、生態学的に関連したプロセス、特に栄養獲得に関連した幅広い機能を明らかにした。驚くべきことに、これらの機能には、世界の海洋の基礎生産性を制限する3つの主要な栄養素である窒素、リン、鉄が含まれている59 (図1A)。例えば、硝酸塩、リン酸塩、亜リン酸塩、シデロフォアを介した鉄の取り込みのための完全な複数遺伝子同化経路は、他の細菌や基部プロクロロコッカスクレードのコアゲノムのシンテニック領域にしばしばコードされている複雑な代謝形質31、60がタイケポソンに取り込まれ、特定の栄養素が強い選択的な要因となる環境においてこれらの形質を失った合理化プロクロロコッカスゲノールの適応力を高める可能性を持つモバイルユニットに変わっていたことが明らかにされた。この発見は、微生物の適応とゲノム進化を促進する上でタイケポゾンが果たす役割の可能性を裏付けるもので、特に、通常、獲得と喪失が稀であると考えられている主要な代謝形質に関して、重要な役割を担っていることが明らかになりました。
プロクロロコッカス固有のものなのか、それともゲノムが合理化された海洋微生物の特徴なのかを明らかにするために、他の海洋細菌ゲノム2,000個以上を対象に類似の要素を調べた。その結果、α-、γ-、Δ-プロテオバクテリアを含む様々な細菌群において、タイケポゾン特異的遺伝子共有ネットワークに該当する遺伝子を持つ関連要素が見つかり（図5C）、ゲノム可塑性と適応性の促進において同様の役割を果たす可能性があることがわかった。
活性と移動性の証拠
ゲノムデータに基づくと、タイケポゾンとクリプティックエレメントは、非常に一時的であるように見えた。MGEsの62%はユニークであり、したがって1つのゲノムにしか存在しなかった。MGEの62%はユニークで、単一のゲノムにしか存在しなかった。約26%は2〜5個（まれに25個）の近縁のゲノムに存在し、これは共通の祖先における単一の統合イベントとその後の垂直継承を表していると考えられる。この高い多様性と斑点状の分布は、島を一時的に訪れる大きな要素プールを持つダイナミックなシステムであり、それによって集団内の不均質性に大きく寄与していることを示唆している（図S3A）。(エレメントは、短い方のエレメントの50%以上が90%以上同一であれば同一と定義した。インテグラーゼの部位特異性により、独立した統合が同じtRNAで起こるので、位置は考慮しなかった)。
図サムネイル Figs3
図S3プロクロロコッカス623ゲノムにわたる移動性エレメントの分布とエレメントとアイランド間の機能的重複、STAR Methods関連
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タイケポゾンの活性をより詳細に知るために、プロクロロコッカスMIT0604株の培養に注目しました。この株は7つのMGE（4つのタイケポゾンと3つの暗号要素）を含んでおり、特に興味深いものでした。これらのタイケポゾンのうち2つは配列同一性が100%で、海洋生態系の基礎生産性をしばしば制限する栄養素である硝酸塩の同化のための完全な遺伝子群をコードしている31,60 (図S4C) 61。我々は、この株を、唯一の窒素源として NH4+ を用いた培地で増殖したものと、唯一の窒素源として NO3-を用いて同じ培地で培養し、連続移植により10年間維持したという事実から利用しました。後者の培養物は2011年に分離後すぐに配列決定され、その後、2019年に再び両方の独立した培養物の配列が決定された。3つのゲノムを比較した結果、重大なゲノム再配置が明らかになったが、そのすべてがタイケポゾンを中心としたものであった：タイケポゾンの獲得、喪失、重複、そしてそれらが担う硝酸塩同化クラスターの同一コピー2本間の関連染色体逆位が観察された（図4）。タイケポゾンの付着部位はゲノム上の島々に存在するため、修飾は島々に限られ、ゲノムの残りの部分は変化していなかった。最も顕著な変化は、NO3-を唯一の窒素源として培養した場合に、硝酸塩同化遺伝子群を含むタイケポゾンがもたらす選択的な優位性を示している。つまり、硝酸同化という代謝機能は、選択的圧力（この場合はNO3-）のもとで複製され、（NH4+が唯一の窒素源の場合）役に立たないときには失われ、野生ではコアゲノム形質よりも柔軟に細胞間を移動できる独立した「プラグイン」カセットになったのである。
図4サムネイル図
図S4.STAR Methodsに関連する、培養物におけるエレメントの統合と除去の検出。
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図1.サムネイルgr4
図4 プロクロロコッカスMIT0604のゲノムおよびゲノムアイランドリモデリング（統合型タイケポゾンによる
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我々はまた、円形および切除されたエレメント中間体のPCR増幅に基づいて、追加の4つのチケポゾンを含むプロクロロコッカス株におけるチケポゾンと暗号化エレメントの移動性の証拠を探した。我々は、すべての培養物が内部的に不均一であり、切除された、あるいはタンデムリピート接合部を有する要素を欠く細胞の亜集団があることを見出した（図S4AおよびS4B）確率的切除および統合事象が起こることを示している。
どのような条件でタイケポゾンの移動性が引き起こされるかをより理解するために、MIT0604のカーゴを運ぶタイケポゾンに関連するインテグラーゼの転写反応を、細胞が環境中で経験しそうなものや人工的なものなど様々なストレス要因で測定した（図S5A）。マイトマイシンCは、DNA損傷を引き起こすためによく使われるDNAアルキル化剤であり、プロファージの切除を誘発することがよく知られている。マイトマイシンC処理は、他の株でも他のインテグラーゼを誘導し（図S5B）、いくつかのタイケポゾンとクリプティックエレメントの検出可能な動員を引き起こし（図S4B）、その効果はMIT0604株に特異的ではないことが示された。
図サムネイル図5
図S5DNA損傷ストレスおよびショック処理下でのタイケポソンホールマーク遺伝子の転写応答、STAR Methods関連
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さらに、MIT0604のゲノム全体のトランスクリプトーム解析（図S5C）により、ほとんどのインテグラーゼ、推定切除酵素、および複製遺伝子はすべて、マイトマイシンCにさらされたときに転写が上昇することがわかり、普遍的な制御機構があることが示された。表層海域のDNA損傷源として知られているUVショックを含む他のDNA損傷処理（図S5A）では、インテグラーゼの相対転写量が有意に増加しなかったことに注目したい（図S5C）。このことは、マイトマイシンCの阻害メカニズムに何か特徴があることを示唆している。それは、複製分枝停止につながる致死的なDNAクロスリンク67,68を引き起こす能力にあると思われる。したがって、この緊密な制御機構により、移動性遺伝子は、一般にその活性に関連する毒性50,69を避け、栄養飢餓や高紫外線照射などのストレス時でさえ、ごく一部の集団70においてのみ誘導され、ほとんど沈黙を保つと推測している。
ウイルスカプシドと細胞外小胞におけるタイケポソン
次に、希薄な海洋において、タイケポゾンはどのように細胞から細胞へと移動するのだろうかと考えた。まず、プロクロロコッカスが豊富に存在する海洋サンプルから得たウイルス分画メタゲノムライブラリーをスクリーニングし、ベクターとなりうるウイルス粒子に注目した。さらに、ウイルス分画のロングナノポアリード71とショートリードコンティグ72,73の両方を調べたところ、サテライトティケポゾンが豊富に存在することが分かりました。これは、ファージ様パッケージング遺伝子によってファージのキャプシドが乗っ取られ、拡散が促進されて、海洋ウイルスメタゲノムで観察されるようになったという我々の仮説の根拠となっています（図5Aおよび5B）。この仮説は、光合成帯の海洋プランクトンからのウイルス粒子内に、タイケポソンを含むウイルスサテライトが豊富に存在することを示した最近の研究によって、さらに支持されている57。
図1.サムネイルgr5
図5 環境中のウイルス粒子と海洋細菌のゲノムに含まれるタイケポゾン
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しかし、ファージパッケージング遺伝子を持たないカーゴを運ぶタイケポゾンは、ウイルス画分サンプルからは確認できず、別の輸送経路を示唆し、別の場所を探す動機となった。そこで、プロクロロコッカスやその他の海洋微生物が放出することが知られている細胞外小胞が、ベクターとして機能しないかと考えた。海水から得た小胞と細胞分画のメタゲノム・データを比較したところ、予測されるほぼすべてのタイケポゾンの特徴的な遺伝子が、細胞と比較して小胞に特異的に濃縮されていることが確認された（図6）。同様に、タイケポゾンの付着部位として働くtRNAのほとんどのセグメントも、小胞において他のtRNAセグメントよりも有意に濃縮されていた。残念ながら、小胞に含まれるタイケポゾンがカーゴを運ぶ要素を含むかどうかは確認できなかった。小胞画分については、完全な要素を捉えることのできる長い読み取りデータがなく、短かい読み取りデータは多様で浅く、コンティグに組み立てることができなかったからである。しかし、これらのMGEsが小胞に特異的に濃縮されていることから、小胞がこれらのMGEsの共通の拡散手段として機能していることが強く示唆され、微生物群集における遺伝子水平伝播のベクターとしての小胞の重要性に新しい光を投げかけている。
図1.図2.図3.図4.図5.図6
図6海洋のベシクル分画メタゲノムにおけるタイケポソンシグネチャーの存在量の違い
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ゲノムアイランド形成の促進剤としてのタイケポソン
最後に、プロクロロコッカスのゲノム構成と進化におけるタイケポゾンの幅広い影響について調査した。タイケポゾンとゲノムアイランドは、同じ7つのtRNA遺伝子のすぐ隣にあることから、ゲノムアイランド形成の基本的なメカニズムとタイケポゾンの統合に関連する可能性について、さらに調査を進めることにした（図7）。
図のサムネイル gr7
図7プロクロロコッカスにおけるゲノムアイランドとそれに付随する移動性遺伝要素の染色体上の構成。
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このような付加的な島は、同じ統合部位に連続して統合するMGEが蓄積することで形成される75。実際、複数のタイケポゾンが、島tRNAの部分コピーによってのみ分離されて、すぐ隣に位置しているケースがいくつか見られた（例えば、図S6AのMIT9202とAG-355-A09）。さらに、断片化したインテグラーゼやより部分的なtRNAなど、退化したMGEの残骸が島全体に散在していることも確認され、さらに古い統合イベントがあったことが示唆された。
図1.図2.図3.図4.図5.図5.図6
図S6タイケポソン活性に関連したゲノムアイランド内容の変動とゲノムアイランドサイズの増加、STAR Methods関連
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しかし、1ゲノムあたり平均8-10個の島があるが、MGEは1-2個しかなく（タイケポゾンとクリプティックエレメント）、ほとんどの個々のゲノム島はMGEを含まず、含まれるMGEもかなり大きいことが多かった（図S2）。また、MGEが存在する島は、MGEが存在する島よりも大きいことが多い（図S2）。全体として、（境界が明確で明らかに退化した）推定上のMGEは、島全体の材料の3.6%を占めるだけであることが分かった。境界がはっきりせず、周囲の物質との区別がつきにくい部分的な要素や変性した要素も、島の要素部分と非要素部分の両方に存在する特徴的な遺伝子の数が同じであることから、同程度の割合を占めると思われる。したがって、アイランドの主要な部分は、タイケポソンやクリプティックエレメントではなく、むしろ追加的な移入物質で構成されているようである。
そこで私たちは、この追加的な物質がどのようにして持ち込まれたのか、特に、なぜタイケポゾンの組み込み部位の隣に蓄積しているように見えるのか、不思議に思った。ゲノム可塑性は、特にMGEsが存在しない場合、一般的に相同組換えによる物質の交換と関連している。相同組換えは、アイランドの存在/不在パターンを維持し、ゲノムから寄生MGEをパージするのに重要な役割を果たすことさえある76。また、特定の場所に可変ゲノムアイランドを出現させることもある77, 78。この場合、アイランドフランキングのコア遺伝子は組換え率が明らかに高くなるリコンビネーションアンカーとして作用している。しかし、プロクロロコッカスでは、このようなパターンを探しても、アイランドフランキング領域で組換え率が上昇することは見られなかった（図S7）。このように、相同組換えは島内の変動性を維持する役割を担っていると考えられるが、島が島のtRNA遺伝子の隣に特異的に形成されている理由についてはうまく説明できないようである。
図1.図2.図3.図4.図5.図6.図7
図S7アイランド・フランキングおよび非アイランド・フランキングゲノム領域における相同組換え、STAR Methods関連
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STARのゲノム領域は、島を囲むように配置されているため、島を囲むように配置されるのではなく、一過性に訪れるタイケポゾンの部位特異的な組換えによって、島が獲得されると推測された。具体的には、溶原性ファージにおける特殊な形質導入と同様に、ドナーゲノムからの不正確な切除によって、一時的にタイケポゾンに取り込まれたフランキング物質が持ち込まれると仮定する17, 79。受容体ゲノムに組み込まれた後、タイケポゾンが正確に切除されれば、移動したフランキング物質が新しい宿主に残されることになる。このようなプロセスは、時間とともに、タイケポゾンを標的とするtRNAの片側に物質が付加され、アイランドが形成されることになる（図7B）。
このアイランド形成のモデルを支持するのは、3つの明確な観察結果である。(1)ウイルスメタゲノムには、隣接する宿主材料と思われる配列を持つ完全長のタイケポゾンが存在した（図5A）。(3)島のサイズ（MGEを除く）とこれらの島におけるタイケポゾンの有病率の間には明確な相関があり、島がタイケポゾンで頻繁に利用されればされるほど、特殊な伝達によって周辺の物質がより頻繁に動員され、島のサイズの増加につながるという予想と一致している（図S6B）。
その結果、プロクロロコッカス菌のtRNA関連アイランドは、移動速度や回転速度が異なる2つの遺伝子プールで構成されているようだ：エレメント遺伝子（統合や複製のための主要遺伝子や貨物遺伝子を含む）と、機能エレメントの一部ではないアイランド遺伝子である。エレメント遺伝子は移動性が高く、選択圧に合わせてダイナミックに獲得・喪失することができる。アイランド遺伝子はコア遺伝子よりも高い移動率を示すが、エレメント-フランキング材料の共移動や活性エレメントとの組換えなど、より確率的なプロセスに依存しているように思われる。さらに、エレメントと隣接するアイランド領域との間で濃縮された機能の強い重複（図S3B）は、タイケポソン上に運ばれたカーゴが、例えばキャリアエレメントの分解によって、または組換えプロセスによってエレメント上に取り込まれることによって、アイランドの非エレメント部分の一部になるという考えを支持するものである。
さらに、インテグラーゼはタイケポゾンがどの島に統合されるかを決定するため、タイケポゾンのプールも、異なる島に影響を与える亜集団に分割される。この機構は、どのタイケポゾンとその近傍のゲノム領域がより再結合しやすいかを制御する可能性を持っている。以前、異なる系統間で、同様の生態的機能を持つ異なる遺伝子が同じ島に出現することが示された1,3。タイケポゾンの島特異性は、より広い生態的テーマに関して、この島の分化を促進する一つの重要な要因である可能性がある。
以上のことから、プロクロロコッカス島の物質の大部分は、タイケポソンに直接由来するものではなく、むしろタイケポソンが側面物質として持ち込んだと考えられ、この種の水平移動が島形成過程に重要であることを示唆していると結論づけた。ゲノムデータは、伝達を介したタイケポソン駆動型アイランド形成の直接的な証拠ではないが、観察されたアイランドの特徴-tRNA遺伝子における鋭いアイランドの境界線、アイランドの遠位端（アイランドtRNAから最も遠い端）における水平獲得物質の付加、MGE活性の上昇に伴うアイランドサイズの増大-は強力な支持となる。このモデルでは、tRNAが着地点として、過渡的なMGEがベクターとして機能し、転送された物質が徐々に蓄積され、その結果、大きく持続的な島の形成に寄与していると考えられる。
考察
貧栄養性海洋細菌のパンゲノム形成機構は、ゲノムの形状が簡素であるため、一般的に遺伝子の水平伝播の典型的な様式を持たず、これまで不明であった。我々は、ゲノムデータ、実験データ、フィールドデータを用いて、ユニークなMGEs（我々はタイケポソンと名付けた）がこの多様性の形成に関与していることを証明した。タイケポゾンは、地球上の海洋の基礎生産性を制限する3つの主要な栄養素である窒素、リン、鉄の吸収に関わる遺伝子など、細胞の部分集団間のニッチ分化に重要と思われる機能モジュールを運ぶことができ、この広大な生態系における自然選択の重要な要素となっている80。
タイケポゾンのサブセットは、PICI36,37に似たウイルス衛星であると思われ、シアノバクテリアで初めて報告されたこの種のものである。タイケポゾンとPICI遺伝子、特にそのインテグラーゼの進化の歴史が異なることから、その構造的類似性は収斂進化から生じた可能性がある。サテライト・タイケポゾンがプロクロロコッカスの祖先に最初に導入され、荷物を運ぶタイケポゾンの大きなファミリーに分岐したのか、あるいは荷物を運ぶタイケポゾンがファージ干渉遺伝子を獲得したのかどうかは不明である。いずれにせよ、すべてのタイケポゾンは、インテグラーゼと複製遺伝子の共有セットによって相互につながっている。このようにタイケポゾンは、成長制限からの解放と死亡率防御の2つの機能カテゴリーに大別されることは、生態学的に単純化されており、エレガントである。
タイケポゾンの役割は、単に荷物の機能を超えて、プロクロロコッカスの最大の可変性貯蔵庫であるゲノムアイランドの形成と再構築のためのシステムの中心に位置しているように思われる。ゲノムアイランドやその近傍に存在する遺伝子は、タイケポソンに含まれない水平方向の獲得領域が一緒に持ち込まれたことを示唆している。さらに、タイケポゾンはアイランド内の再配置を促進し、小さな遺伝子カセットによって異なる数百から数千の亜集団が共存する、野生プロクロロコッカス細胞の集団構造に特徴的なゲノム多様性を促進すると思われる5,6。プロクロロコッカスの姉妹分類群である海洋性シネコッカスでも同様の過程が報告されており、タイケポゾンは色素の種類の多様化に関与しているようである。81 宿主の分化と適応を促進する可能性があることから、タイケポゾンはプロクロロコッカス集団などの微生物集団の海洋的安定性に大きく寄与していると考えられる7。
さらに、野生個体群のメタゲノム解析から、タイケポゾンはファージのキャプシドと膜小胞の両方に含まれており、これらの構造が細胞間のタイケポゾンの移動に関与していることが明らかになった。ベシクルとファージは海水中を拡散することができる粒子であるため、微生物細胞間で遺伝情報を輸送・伝達するのに適している。ベシクルを介した遺伝子の水平伝播、すなわちベシダクション82は、様々な微生物システムで起こっており、ウイルス90よりも遠縁の分類群間の交流を仲介している可能性がある（ウイルスは宿主範囲が狭いことが多い）91。
タイケポゾンは、海洋微生物のゲノム上にその痕跡を残しており、微生物の多様化と適応の重要な担い手であることが示唆されている。タイケポゾンの動員、複製、転送についてはまだ多くのことが分かっていないが、海洋微生物集団の遺伝的構造を形成する可能性は、広大な貧栄養海洋やその先の進化を支配するプロセスに新たな光を当てる、刺激的な研究領域を開くものである。
研究の限界
本研究の成果の多くは、ビッグゲノミクスデータの解析に基づいている。これらのデータは、海洋微生物のゲノムに対する前例のない窓を提供し、広大なシステムにわたる大規模なパターンと相関を明らかにすることを可能にする。しかし、その背後にあるダイナミクスやメカニズムについての知見は得られていません。私たちは、ストレス実験とラボ実験から、タイケポゾンの活性と移動性について多くのことを学びましたが、他の側面はまだ解明されていません：サテライトタイケポゾンがファージ感染にどのように反応するかはまだわかっていません。現在、サテライトタイケポゾンを持つプロクロロコッカス培養液に感染する培養ファージは見つかっていない。同様に、小胞に含まれるチケポゾンが観察されているが、どのようにして小胞にパッケージされ、他の細胞に移されるのかについては、まだ分かっていない。また、栄養摂取遺伝子の存在は、適応や体力に重要であることを示唆しているが、その効果をケモスタット実験などの直接観察によって確認するには至っていない。
STAR★メソッド
主要リソース一覧
試薬またはリソースのソース IDENTIFIER
細菌・ウイルス株
プロクロロコッカスMIT0604株 Biller et al.74 N/A
プロクロロコッカス（Prochlorococcus）属 MIT9202 株 Thompson et al.92 N/A
プロクロロコッカス株 MIT9312 Coleman et al.1 N/A
プロクロロコッカス（Prochlorococcus）属 MIT9215 Kettler et al.26 N/A
プロクロロコッカスSB株島田ら.93 N/A
プロクロロコッカス（Prochlorococcus）属 PAC1 Pennoら.94 N/A
プロクロロコッカス（Prochlorococcus）属 MIT1013 株この研究 N/A
プロクロロコッカス（Prochlorococcus）MIT1306株 Cubillos-Ruizら 95 N/A
Alteromonas macleodii MIT1002 株 Biller et al.96 N/A
寄託データ
Global Ocean Reference Genomes EBI/NCBI https://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB33281
Station ALOHA ウイルスフラクションナノポアリード NCBI Sequence Read Archive SRX7079550
ベシクルフラクションメタゲノム NCBI Sequence Read Archive SRP272691
RNA-sequencing reads NCBI GEO PRJNA719560
オリゴヌクレオチド
RTqPCR反応用プライマーとEnd-point PCR用プライマーは表S5を参照。
ソフトウェアとアルゴリズム
checkm v1.0.7 Parks et al.97 N/A
Guppy v3.0.4 Oxford Nanopore Technologies, Ltd. N/A
PROKKA v1.12-ベータ版 Seemann98 N/A
panX sha-0a4dfce Ding et al.99 N/A
HMMER3 v3.2.1 Eddy100 N/A
seqkit v10.2 Shen et al.101 N/A
mafft v7.310 Nakamura et al.102 N/A
trimAl v1.4 Capella-Gutiérrez et al.103 N/A
msa-concatenate/msa-trim/msa-codon sha-2334c67 https://github.com/thackl/phylo-scripts/ N/A
FastTree v2.1.10 Price et al.104 N/A
Phytools Revell105 N/A
ggtree v2.5.0 Yu et al.106 N/A
Ori-Finder v1.0 Gao and Zhang107 N/A
ALLMAPS v0.7.7 Tang et al.108 N/A
R v3.5.1 Rコアチーム109 N/A
HMM v1.0 Himmelmann110 N/A
MMseq2 sha-45111b Steinegger and Söding111 N/A
VirSorter2 Guo et al.112 N/A
IslandViewer4 Bertelli et al.113 N/A
HHPred/HHSearch v3.1.0 Steinegger et al.30およびZimmermann et al.114のN/A
AliView Larsson115 N/A
FigTree Rambaut116 N/A
prodigal v2.6.3 Hyatt et al.117 N/A
ARAGORN v1.2.38 Laslett and Canback118 N/A
BLAST+ v2.8.1 Altschul et al.119 N/A
ggplot2 Wickham120 N/A
https://github.com/thackl/pro-tycheposons この研究（https://doi.org/10.5281/zenodo.4642441） N/A
ggraph v2.0.2 Pedersen121 N/A
iTOL Letunic と Bork122 N/A
wtdbg2 sha-8926622 Ruan and Li123 N/A
Geneious Kearse et al.124 N/A
Mauve Darling et al.125 N/A
minimap2 Li126 N/A
リボン Nattestad et al.127 N/A
SMRT Analysis 2.3.0 Chin et al.128 N/A
IMG Annotation Pipeline バージョン4 Chen et al.129およびMarkowitz et al.130 N/A
ProPortal CyCOGs 6.0 Berube et al.21 N/A
DIAMOND v0.9.4 Buchfink et al.131 N/A
orfm v0.7.1 Woodcroft et al.132 N/A
エッジR v3.20 Robinson et al.133 N/A
bbduk v38.16 Bushnell134 N/A
mcorr v20180102 Lin and Kussell135 N/A
topGO v2.34.0 Alexa and Rahnenfuhrer136 N/A
GOView Liao et al.137 N/A
Burrows-Wheeler Aligner v0.7.16a-r1181 Li and Durbin138 N/A
HTSeqパッケージv0.11.2 Anders et al.139 N/A
DESeq2 v1.24.0 Love et al.140 N/A
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リソースの有無
リード連絡先
リソースや試薬に関する詳細な情報やリクエストは、リードコンタクトであるThomas Hackl (t.hackl@rug.nl)までお願いします。
材料の入手可能性
この研究では、新たな試薬は生成されませんでした。
実験モデルおよび被験者の詳細
菌株の分離
プロクロロコッカスMIT1013株は、2010年晩春にR/V Melville（MV1015）にて行われたBiG-RAPA（Biogeochemical Gradients - Role in Arranging Planktonic Assemblages）探検で得られた海水（2010年11月18日から12月14日）から分離したものである。海水は、ステーション7（緯度：-26.25、経度：-104）において、ニスキン瓶ロゼットを用いて、表層クロロフィル最大値に相当する水深150mから採取した（キャスト68、2010年12月10日15時03分GMT）。海水17 mLを酸洗浄した28 mLスクリューキャップポリカーボネートチューブに分注し、20 μM塩化アンモニウム、1 μMリン酸ナトリウム、1 mM重炭酸ナトリウム、0.117 μMエチレンジアミンテトラ酢酸、0. 117μM塩化鉄（III）、0.009μM塩化マンガン（II）、0.0008μM硫酸亜鉛（II）、0.0005μM塩化コバルト（II）、0.0003μMモリブデン酸ナトリウム、0.001μM亜セレン酸ナトリウム、0.001μM塩化ニッケル（II）である。MIT1013株は、フローサイトメトリーによる単一のプロクロロコッカス集団の観察と、そのITS PCRアンプリコンの直接配列決定による単一の16S-23S rRNA内部転写スペーサー（ITS）配列の存在によって、単藻と判断されている。MIT1013の全ゲノム配列も追加で決定した。細胞は指数関数的に増殖し、遠心分離によってペレット化された。
培養条件
プロクロロコッカス細胞（MIT1013、PAC1、および指定された場合はMIT0604を除く）は、0.2μmろ過したサルガッソー海水を含む天然海水ベースのPro99培地にPro99栄養素（N、P、微量金属）を添加し、24℃で一定の光束（30～40μmol photons m-2 s-1）下で培養した141。
MIT0604の2つの独立した培養：「硝酸塩培養」は、上記の通常のPro99培地培養に相当し、「アンモニア培養」は、800μM塩化アンモニウム（NH4Cl）を省き、800μM硝酸ナトリウム（NaNO3）に置き換え、アンモニウムを唯一の窒素源として残してPro99培地で培養したものであった。
本研究で使用したプロクロロコッカス単離株。HOTS: Hawaii Ocean Time Series station, Pacific oligotrophic gyre.
株クレード分離場所、深さ参考文献
MIT0604 HLII HOTS, 175m Biller et al.20
MIT9202 HLII 熱帯太平洋、79m Thompson et al.92
MIT9312 HLII 湾流、135m Coleman et al.1
MIT9215 HLII 赤道太平洋、表面 Kettler et al.26
SB HLII 西太平洋、40m 島田ほか.93
PAC1 LLI HOTS、100m Penno et al.94
MIT1013 LLI 東部南太平洋亜熱帯ジャイロ、150m この研究
MIT1306 LLIV HOTS, 150m Cubillos-Ruiz et al.95
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メソッドの詳細
ゲノムデータセット
プロクロロコッカスゲノム
プロクロロコッカスゲノムアセンブリは、培養分離株から得られた73種、単細胞シーケンスから得られた540種、メタゲノムアセンブリから抽出された10種の計623種が公開されています（Table S1）。分離株と単細胞ゲノムのコンタミネーションは4%以下、メタゲノムから抽出したゲノムは8%以下であることが確認されました。生アセンブリはNCBI Genbankなどの公共データベースで公開されており、我々がアノテーションを解除したリファレンススカフォールドアセンブリはGitHub (https://github.com/thackl/pro-tycheposons) およびZenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.4642441) から入手可能である。
グローバルオーシャンリファレンスゲノム（GORG）熱帯地域
GORG-Tropics は、熱帯・亜熱帯の表層海水28 サンプルから無作為に抽出した細菌と古細菌の12,715個の単一増幅ゲノム（SAGs）からなるデータセットです24。GORG-Tropicsは、熱帯・亜熱帯の表層性メタゲノムから平均40%のリードを収集し、95%以上の塩基同一性を有する参照データベースとして使用されています。このデータセットは、https://osf.io/pcwj9 および https://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB33281 からアクセスできる。
ベシクル分画メタゲノム
4つの貧栄養水サンプルの細胞画分とベシクル/小粒子画分からペアメタゲノムを作成しました。すべてのサンプルは、HOT263（2014年6月；水深5m）およびHOT283（2016年4月；水深5m、25m、137m）クルーズで北太平洋亜熱帯ジャイアのALOHAステーション（22.75°N、158°W）で収集されたものである。各サンプルセットは、ニスキンボトルから回収した合計約100～200 Lの水に由来するものである。細胞性メタゲノムについては、3-6 L の水を 0.2 μm Sterivex フィルター（Millipore）に濾過し、保存した。Biller らによる既報の通り、142 フェノール/クロロホルムベースの抽出を使用して DNA を抽出した。Lysing Matrix E ビーズ（MP Biomedicals）、400 ul フェノール：クロロホルム：IAA（25：24：1）、400 ul 2x TENS buffer（100 mM Tris-HCL pH 8.0, 40 mM EDTA, 200 mM NaCl, 2% SDS、2x buffer）をフィルターを含むマイクロチューブに加え、ビーズビーターで40秒間激しく撹拌させた。19,000 xgで5分間スピンした後、水相をPhase Lock Gel tube (5 Prime)に移し、等量のクロロホルムと混合し、約27,000 xgで5分間スピンさせた。上清を除去し、等容量のAMPure XPビーズ（Beckman Coulter）と混合し、室温で10分間インキュベートした。ビーズを75%エタノールで2回洗浄し、乾燥させ、20 uLの超高純度ガラス蒸留水（Teknova）に再懸濁した。PicoGreen assay (ThermoFisher)を用いて全DNA収量を定量し、収量は約10-2600 ng total DNAの範囲であった。
残った水の<0.2μm画分を100kDaタンジェンシャルフローフィルターで濃縮し、Optiprepグラジエントを用いてさらに分画した。小胞に富む画分を同定し、TURBO DNAseを用いて小胞外のDNAを取り除き、残りのDNA（おそらく小胞内）を既出の方法で抽出した74．小胞はGESバッファ（50 mM グアニジニウムチオシアネート、1 mM EDTA、0.005% (w/v) サルコシル；最終濃度）中で37℃、30分間溶解された。DNAは、DNA Clean & Concentrator-5カラム（Zymo Research社）を用いて、製造元の指示に従い、DNA結合バッファーを5：1の割合で使用して精製し、超純水で溶出させた。精製した細胞および小胞/粒子関連DNAのシーケンスライブラリーは、NextEra XTキット（Illumina）を用いて約1 ngのDNAから調製し、MIT BioMicro CenterでIllumina NextSeq 500により150+150ntペアエンドシーケンスを生成した。すべてのデータは、NCBI Sequence Read Archive (SRP272691)から入手可能。
Tara Oceansのウイルスフラクションメタゲノムコンティグ
Tara OceansおよびTara Oceans Polar Circle探検で収集した131サンプルの短鎖ウイルスデータは、表層（水深5m）から中深層（水深1000mまで）の水層にわたって取得されたものである。GOV2.0のMalaspina遠征による深海サンプル(n=14)は本研究に含まれていない。GOV2.0データセットを構築するためにGregoryら72が行ったバイオインフォーマティックなウイルス選択の前に、131のTaraサンプルから組み立てられたすべてのコンティグは、タイケポゾンのスクリーニングが行われた。これらのアセンブルされたコンティグは、iVirusのData CommonsポータルでGOV2.0の下でアクセスすることができる（ファイル名：Tara_assemblies.tar.gz）。
ステーションALOHAのウイルスフラクションナノポアリード
深さ25mのサンプルは、2019年8月5日のHOT-314クルーズで、ステーションALOHA（22°45' N, 158° W; http://hahana.soest.hawaii.edu/hot/ ）で採取されました。サンプル収集、ろ過、ウイルス濃縮、抽出、および配列決定はすべて以前に記載されている71。簡単に言えば、海水は、0.22 umフィルター（Sterivex GV）を通して蠕動ポンプで予備ろ過した後、30 kDaフィルター（Biomax 30 kDa）膜、カタログ＃：P3B030D01、ミリポア）上で接線流ろ過（TFF）により濃縮させた。複数回の遠心濃縮の後、溶解とDNA精製は、Qiagen Genomic-tip 20/Gプロトコルを用いて、製造者の推奨に従って、1本のチューブで行った。110Lの0.22umプレフィルター海水からウイルス濃縮サンプルを採取し、合計3.2μgの精製高分子量DNAを得た。配列決定は、FLO-MIN106 (R 9.4.1) フローセル (Oxford Nanopore Technologies, Ltd.) を搭載したGridION X5で実施した。701,515リードをGuppy v3.0.4でベースコールし、10.38Gbのシーケンスデータ（リードN50長29.70Kb）を生成しました。すべてのデータはNCBI Sequence Read Archive (SRX7079550)から入手可能です。
計算機解析
遺伝子予測およびオルソログの検出
遺伝子アノテーションの一貫性を確保するため、623のプロクロロコッカスゲノム（詳細はゲノムデータセット参照）をPROKKA v1.12-beta.98 を用いて再アノテーションした。注釈付き遺伝子は、panX sha-0a4dfce99を用い、コレクションの単細胞ゲノムの不完全性を考慮し、カスタマイズした設定でオーソログのグループにクラスタ化した。コア遺伝子は、すべてのゲノムの少なくとも70％、完全性98％以上のすべてのゲノムに存在することで定義した（-cg 0.70 -csf strains_complete_98plus.txt)．
系統樹の再構成
解析したプロクロロコッカス全623ゲノムの系統樹を、連結した109個のシングルコピー・コアタンパク質から最尤法を用いて構築しました。マーカーは、ubiquitous bacterial single-copy core genes ("bac120") として以前に記述された120個のTIGRFAM143プロファイルに基づいてHMMER3 v3.2.1100で同定した。144 この特定のデータセットでシングルコピーでないことがわかった11個のタンパク質は除外された。配列ファイルはseqkit v10.2101で操作し、個々のタンパク質アラインメントはmafft v7.310で生成し、102 trimAl v1.4103 (-gappyout) でトリミングし、msa-concatenate (https://github.com/thackl/phylo-scripts/, sha-2334c67) で連結した。最尤系統樹は FastTree v2.1.10 で推定し、LLIV クレードに根を張り、R パッケージ phytools105 と ggtree v2.5.0.106 を用いて可視化した。
リファレンスベースゲノムスキャフォールディング
シングルコンティグからなる全34ゲノムをリファレンスとした。また、比較のために、すべての参照ゲノムは、プラス鎖のdnaN遺伝子付近を複製起点とするように、円形染色体の向きを変え、回転させました。これは、多くのプロクロロコッカスゲノムで使用されている方法と一致しています。OriC予測は、Ori-Finder v1.0107のコマンドライン版で行い、dnaA boxの配列はシアノバクテリアで提案されている "TTTTCCACA "に設定しました145。11 種類のゲノムの開始位置を調整し、3 種類のゲノムを逆相補した。その他のゲノムは、前述の参照系統樹の中で最もコフェン距離が小さい参照ゲノムを使用した。ドラフトゲノムと最近接参照ゲノムの各ペアについて、同じクラスターのオーソログ遺伝子に属する遺伝子をマッチングして1x1アンカーマップを作成しました（上記参照）。これらのアンカーマップは、ALLMAPS v0.7.7を用いて、コンティグの方向付けと順序付けを行い、共線性が最大となるようにした。108 必要に応じて、参照配列の最初と最後にわたるコンティグは、dnaN遺伝子の位置で2つに分割された。コンティグ間のギャップは、1x1マップから対応する遺伝子間の絶対距離の総和を最小化することで推定した。コンティグはその長さの対数で重み付けされ、最小ギャップサイズは100bpに設定された。この最適化は、R v3.5.1 の "L-BFGS-B" メソッドを用いて実施した。データへのアクセスは、「プロクロロコッカスゲノム」のセクションを参照。
ゲノムアイランド予測
データセット全体のゲノムアイランドのアノテーションを自動化するために、オーソログ遺伝子の頻度を入力とするHMMベースのアプローチを考案しました。ある遺伝子とそのオルソログループの頻度を、その遺伝子が存在する菌株の数と定義する。同一ゲノム内の重複は無視される。島は非中核遺伝子に富み、その遺伝子頻度の構成は島以外の地域とは異なるという観察に基づいている1。プロクロロコッカスHLI 2株（MED4、MIT9515）、プロクロロコッカスHLII 2株（MIT9312、MIT9215）、プロクロロコッカスLLII 1株（SS120）、プロクロロコッカスLLIV 1株（MIT9313）1，3，146の既知のゲノムアイランドを用いて、アイランドと非アイランド遺伝子周波数のプロファイルを4種類作成しました。これらのプロファイルの比較に基づいて、島内外の有病率に応じて、HMMの異なる状態：core、flex、inconclusiveを定義しました。R-package HMM v1.0110を使用して、2つの隠れ状態（島、非島）を持つ4つのHMMを構築しました。開始確率、遷移確率、放出確率は文献のアノテーションから推定しました。全ゲノムについて、各遺伝子に上述の遺伝子頻度に応じたカテゴリ（core, flex, inconclusive）を割り当てました。これらのラベルを足場配列（上記参照）上に現れる順序で観測値として用い、ビタビアルゴリズムを適用して各遺伝子の隠れた状態（島、非島）を予測した。このゲノムアイランドの遺伝子レベルの解像度は、さらなる解析に用いられた。
まず、すべてのアセンブリをリファレンススキャフォールドして再編成し、始点と方向が一致した単一染色体スキャフォールドを得た。既知のゲノムアイランドの座標1,3,146とオルソログ遺伝子クラスターの存在量99を用いて、Hidden-Markov-Modelをトレーニングし、全ゲノムにわたってアイランドを予測した（図S1A）。
既知の移動性遺伝要素の検索
まず、MGEタンパク質およびプロファイルデータベースの包括的コレクション（NCBI viral RefSeq, NCBI Plasmid RefSeq, ACLAME, ICEBerg, COMPASS, immedb, and ISfinder, pVOG42）に対して類似性検索（HMMER3，100 MMseq2111）を行い、共通のMGEの存在についてスクリーニングを行いました。さらに、自動アノテーションツール(VirSorter2,112 IslandViewer4113)も走らせた。しかし、LLIV Prochlorococcusのトランスポゾンと挿入配列が既に知られている以外は、いずれの検索も明確なヒットを得ることはできなかった。そこで、ゲノムアイランドのアノテーションをもとに水平転移配列と思われるものを同定した後、HHPred/HHSearch v3.1.030,114でリモートホモロジー検出を行い、アノテーションされていない遺伝子に対して機能予測を行った。
インモビロームの特徴的な遺伝子の同定
プロクロロコッカス属に特化した統合的なMGEsの検索を可能にするため、我々は反復的、探索的アプローチでMGEs候補に見られる遺伝子のタンパク質HMMプロファイルをコンパイル、キュレーションした。高信頼性MGE候補の一握りの手動アノテーションから始め、以下の2つの基準のいずれかに基づいて関連するオルソグループ（「遺伝子予測とオルソログ検出」セクション参照）を同定した。
a)
a) MGEに典型的な切除-複製-パッケージングのライフサイクルに関連するいくつかの注釈を持つオルソグループ（インテグラーゼ、プライマーゼ、ヘリカーゼ、キャプシド遺伝子、ターミナーゼ）、及び、b)MGEに典型的な切除-複製-パッケージングのライフサイクルに関連するいくつかの注釈を持つオルソグループ
b)
b) 複数の候補に出現し、かつ統合的に保存されたパターンを持つオルソグループ。
これらのオルソグループから、mafft v7.310,102 msa-trim (https://github.com/thackl/phylo-scripts/, sha-2334c67), AliView,115 FastTree v2.1.10,104 FigTree,116 and HMMER3 v3.2.1 を組み合わせて、冗長度を減らしたアラインメントとHMMプロファイルを作成、キュレーションした。100 all-vers-all 比較で良い相互ヒットと全体的に一貫した複数配列アラインメントのオルソグループは、全てを一緒に並べてから統合された。このプロファイルと、次のセクションで詳しく説明する R スクリプトの初歩的なバージョンを使用して、623 のプロクロロコッカスゲノムコレクションのすべての注釈付きタンパク質をスキャンしました。その結果、異なる特徴的な遺伝子が近接して複数ヒットするゲノム領域（10-20kbのウィンドウ内に複数ヒット）を同定し、ランク付けし、可視化した。こうして得られた最高ランクのクラスタから、新たに高信頼性の候補を選び、それらを以前に選んだ候補とともに用いて、ホールマーク遺伝子の同定を繰り返し、遺伝子セットの全体サイズを広げ、既存のプロファイルを改良しました。
プロクロロコッカスの推定MGEでよく見られるタンパク質のプロファイルをキュレートすることに加え、他の特徴的なプロファイルのいくつかと強く重複する一般的なPfamプロファイル147を追加し、4セットの公開PICIからタンパク質を収集しました38、37、36、56 それぞれの出版物で提供された注釈に基づいてこれらの遺伝子をクラスターにグループ化し、アラインメントを手動でキュレーションし、それらが全対全の比較で良い相互ヒットと一緒にアラインメントしたときに一貫した多重配列アラインメントを持っていれば単一のプロファイルにクラスターを統合した。
モビロームの自動検出とアノテーション
最終的に、ゲノムデータセットにおけるMGEの検出を自動化するための小さなパイプラインを考案した。スクリプトは GitHub (https://github.com/thackl/pro-tycheposons) と Zendodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.4642441) から入手可能であり、以下のステップを実行する。

アノテーションがない場合は prodigal v2.6.3117 で遺伝子予測。

外部 tRNA データベースがない場合は、ARAGORN v1.2.38118 で全長 tRNA のアノテーションを行う。

HMMER3を用いたMGEホールマーク遺伝子とウイルスホールマーク遺伝子（VirSorterプロファイル148）の検出

完全長tRNAとBLAST+ v2.8.1119を用いた部分的なtRNAアノテーション

BLAST+によるインテグラーゼ・フランキング領域におけるアタッチメントサイトの検出

MGE候補を様々な特徴遺伝子、アタッチメントサイト、tRNAの存在に基づきスコア化

ggplot2120 および https://github.com/thackl/gggenomes を用いた MGEs の可視化
本研究では、このパイプラインを用いて、3つのデータセットを解析した。
1)
623 個のプロクロロコッカスゲノム
2)
Global Ocean Reference Genomes (GORG)の2344個のシングルセルアセンブリ
3)
タラ海洋の262種類のウイルスフラクションサンプルから無作為に選んだ5-20kbp長のコンティグ1000個まで（合計128,566コンティグ）
データセットの詳細については、「ゲノムデータセット」の項を参照。解析結果は、GitHub (https://github.com/thackl/pro-tycheposons) および Zendodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.4642441) で公開されています。
モビローム・ホールマーク遺伝子のクラスタリング
プロクロロコッカス属のMGEを既知のMGEとの関連で解析するために、遺伝子共有ネットワーク法を用いた。39,40,41 プロクロロコッカス属モビーロームの全てのホールマークタンパク質（移動生活様式に関する機能：組み替え、DNA複製、パッケージング）を感度良くクラスタリングし、その中から

NCBI ウイルス RefSeq (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/release/viral/, 2021-02-05 アクセス) にあるすべてのタンパク質。

MGEsの主要なクラスの1,000万個の特徴的なタンパク質配列に基づく総合データベース（ICEBerg, ACLAME, NCBI Plasmid RefSeq, COMPASS, immedb, ISfinder and pVOGを含む）42の全てのタンパク質を含む。

およびファージ誘導性染色体アイランドを代表するタンパク質の包括的なセット36,37,38,56。
クラスタリングはMMseq2 sha-45111b (`easy-cluster --evalue 1e-4 --coverage .7`) を用いて実施した。
さらに、手動で作成したプロファイルと照合することで、これらのクラスターに機能を割り当てた。全体として、自動クラスタリングプロセスは、手動で作成したタンパク質クラスタと良い一致を示したが、普遍的に適用されるカットオフの単純化アプローチでは、大きな保存タンパク質（インテグラーゼなど）の崩壊したクラスタと、特に進化の速い短い共因子（切除酵素など）の分裂したクラスタの両方が示すように、多様なタンパク質セットの異なる特性を最適に捉えることはできないことに注意してください。配列とクラスタリング結果はGitHub (https://github.com/thackl/pro-tycheposons)とZenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.4642441)で公開されています。
遺伝子共有ネットワークの構築
移動性遺伝子プール内の構造と、それらの遺伝子を持つMGEsの関連性を評価するために、2つの遺伝子共有ネットワークを構築した。まず、プロクロロコッカス・モビロームの特徴的なタンパク質プロファイルを手動でキュレーションし、単純な遺伝子共有ネットワークを作成しました。このネットワークでは、タンパク質プロファイルをノードとし、同じMGE上に共起するプロファイルのすべてのペアを、その共起を観察する頻度によって重み付けして接続しました。まれな接続（カウント3未満）は無視される。このネットワークは、モビロームの内部構造に関する情報、すなわち、データ中にいくつの異なるタイプのMGE（未接続のサブグラフ）が存在するかという情報を提供します。
次に、プロクロロコッカスのモビロームから自動的に計算されたタンパク質クラスタと、ウイルスとMGEタンパク質セットの包括的なセットに基づいて、二部構成のネットワークを作成しました。このネットワークでは、タンパク質クラスタとMGE/ウイルスゲノムの2種類のノードが存在します。MGE/ウイルスゲノムとそれらが含むタンパク質の間に接続が描かれている。この2つ目のネットワークは、既知のMGEの領域と比較して、タイケポゾンの境界を明示的に強調しています。ネットワークは、ggraph v2.0.2.121 を用いて R で作成された。
チロシンリコンビナーゼの系統樹
新規チチェポゾンとクリプティックエレメントのほとんどで同定されたチロシンリコンビナーゼを、既知のインテグラーゼとの関連に置くために、まず既知のリコンビナーゼタンパク質の代表的なセットをコンパイルした。著者らの好意により提供された、最近報告された Xer-like tyrosine-recombinases の HMM データベース35 を用いて、UniRef50 (https://www.uniprot.org/help/uniref) からタンパク質配列を収集した。次に、これらの配列を、我々の要素で見つかったインテグラーゼ配列の非冗長サブセット（最大ペアワイズ同一性が40％）と結合した。mafft v7.310102 (--genafpair) で配列を整列し、FastTree v2.1.10104 で系統樹を計算し、iTOL122 で可視化し、手動でキュレーションを行った。新しいインテグラーゼが寄与する系統的多様性を比較するために、新しいインテグラーゼクレードの枝長の合計を、全木の枝長の合計で割ることにした。また、新しいインテグラーゼを分類する前に、それぞれのサブタイプのアラインメントで触媒部位に特徴的な残基があるかどうかを確認し、機能予測に自信を持てるようにした。
オックスフォード・ナノポアゲノムアセンブリ
MIT0604の2つの独立した培養液のアセンブリは、硝酸塩培養液では50,000 bp以上、アンモニア培養液では30,000 bp以上のナノポアリードからwtdbg2 sha-8926622123を用いて作成されました。いずれの場合も、MIT0604の完全な染色体に一致する1本のコンティグが得られ、アセンブリからさらに解析するために抽出された。コンティグはそれぞれ、2011年に作成された参照用Illuminaアセンブリの開始位置と向きに一致するように再編成された。アセンブリとリードデータセットは、Geneious,124 Mauve,125 minimap2126 and Ribbonを用いて再配置を解析した。127 処理済みのアセンブリは、https://github.com/https://github.com/thackl/pro-tycheposons でダウンロードできる。
実験手順
オックスフォード・ナノポアシーケンス
プロクロロコッカスMIT0604の2つの独立した培養物を、Oxford Nanoporeテクノロジーを用いて配列決定しました。サンプルは超長鎖シーケンスプロトコルに従って調製し149、全ゲノムを製造元の指示に従ってMinIONシーケンサーでRapidシーケンスキット（SQK-RAD004）を使用してシーケンスしました（Oxford Nanopore）。
プロクロロコッカスMIT1013のゲノムシークエンス
150 PacBioライブラリーの調製とシーケンシングは、MIT BioMicro CenterとUMass Worcester Medical School's Deep Sequencing Core Facilityが実施した。PacBio リードのアセンブリは、SMRT Analysis 2.3.0128 に実装されている階層的ゲノムアセンブリ処理 (Protocol = RS_HGAP_Assembly.2) を用いて、以下のパラメータを調整した上で実施しました。Minimum Polymerase Read Quality = 0.85 and Genome Size = 2000000 bp (他のパラメータはすべてデフォルト設定)。プロクロロコッカスのコンティグ1本と、プロクロロコッカスの異種培養によく見られる従属栄養細菌であるマリノバクター属に最も近い6513 bpのコンティグが同定された。プロクロロコッカスコンティグの重なり合った末端をBLASTで同定し、組み立てたコンティグを手作業で円形化した。SMRT Analysis 2.3.0のRS_Resequencing.1プロトコルを用いて、以下のパラメータで円形アセンブリを修正した。SMRT Analysis 2.3.0にて、Minimum Polymerase Read Quality = 0.85 and Consensus Algorithm = Quiverを設定し、円形アセンブリを修正した。このゲノムは IMG (accession number 2681812904) に寄託され、IMG Annotation Pipeline version 4,129,130 でアノテーションされ、ProPortal CyCOGs 6.0.21 に収録されています。
インテグラーゼ遺伝子のRTqPCR
インテグラーゼ遺伝子の逆転写qPCR解析は、処理にさらされた生物学的3連符について、未処理のコントロールと比較して実施した。RNA調製のために、細胞を遠心分離（12,000g、12分間、20℃）によって集め、直ちに500μLのTRI試薬（Zymo Research）に再懸濁させた。RNAは、Direct-zol RNA MicroPrep kit（Zymo Research）を用いて、製造元の説明書に従って単離した。TURBO DNA-free Kit (ThermoFisher)を用いて溶出後、DNA除去工程を追加した。RNA サンプルは、RNA the Clean & Concentrator kit (Zymo Research) を用いて濃縮し、SuperScript™ III First-Strand Synthesis System (ThermoFisher) を用いて逆転写を行った。最後に、QuantiTect Probe PCR Kit（Qiagen）を用いて、表S5に詳述するプライマーセットを用いて3回qPCRを行い、遺伝子rnpBの発現を内因性基準として、比較CT（2-DDCT）法151に従って遺伝子発現差分を計算した。
図S5Aに示す処理の説明。Alteromonas」＝ヘルパー株Alteromonas MIT100296を5x106細胞mL-1で1時間添加；「Pyruvate」＝5mMのピルビン酸を2時間添加；「Glucose」＝5mMのグルコースを2時間追加。硝酸塩」＝窒素源としてアンモニウムに代えて硝酸塩を用いたPro99培地で培養；「N飢餓」＝細胞を2回洗浄し、窒素源のないPro99培地に再懸濁し、48時間インキュベートし、対照培養物は洗浄するが補充したPro99に再懸濁させる。P飢餓」＝リン酸塩のないPro99培地を用いた同じプロセス；「定常期」＝培養物を定常期になるまで放置し、対照培養物は指数期で収穫する。金属毒性」＝Pro99に存在する微量金属をその濃度（毒性レベル）の5倍で1時間添加；「銅」＝CuCl2を100pMで培養物中に1時間添加；「ヒ酸塩」＝Na3AsO4を10μMで16時間添加；「H2O2」＝過酸化水素を0. 5μMで1時間添加；「DCMU」＝DCMU（ジウロン除草剤）を4μMで1時間添加；「Chloramphenicol」＝クロラムフェニコールを1μM（致死量）で1時間添加。Ciprofloxacin」＝1μMのシプロフロキサシン（致死量）を1時間添加152；「Mitomycin C」＝20μMのマイトマイシンC（致死量）を2時間添加；「Cold shock」＝培養物を14℃に1時間冷却；「pH9. 3' = 0.1 M NaOH溶液を1.4 mMで添加し、pH 9. 4 mMでpH9.3とし、1時間; 'pH 6.5' = 0.1M HCl溶液を2.1 mMでpH6.5となるよう添加。 5、1時間；「Dark」＝培養管を暗所に1時間置く；「High Light」＝培養管を光強度150μEで1時間置く；「UV shock」＝25mLの培養物を入れた蓋なしの滅菌ガラスシャーレ（直径150mm）中で細胞を254nmで30秒間照射（紫外線100μW cm-2）した。細胞はインキュベーター内の25mL培養チューブに戻して30分間培養し、対照培養はUV照射を省略して同じ条件で行った153；「UV順化」＝培養は、302〜316nmのUVBを照射するレイマインダー15W UVランプから毎日正午に2時間の追加UVを受けて、50μEの光レベルに順化した（ランプからの距離16インチ）。コントロールは、25μEの光量でUVなしで、昼行性で培養した。RNAは、指数関数的に成長する培養物において、正午に採取した65；「外来性DNA」＝1μgのpUC19プラスミドDNAを濃縮細胞サンプルに電気穿孔し、152、これをRNA抽出前に24時間放置して回復させた。対照の培養物もプラスミド DNA 非存在下でエレクトロポレーションした。
RNA シーケンス実験
プロクロロコッカスMIT0604株の30mL培養物9個を指数関数期まで増殖させた。3つの培養物を、最終濃度15μg mL-1のマイトマイシンC（Sigma-Aldrich）で2時間処理した；3つの培養物を、蓋のない滅菌ガラスシャーレ（直径150mm）中で254nmで30秒間室温で細胞を照射（UV 100μW cm-2）し、1時間153間その最初の培養状態に戻してUVショックを与えた；残り3つの培養物を処理なしのコントロールとして保持した。細胞を12,000 g、12分間、20℃での遠心分離により採取し、mirVana microRNA (miRNA) extraction kit (Ambion, Carlsbad, CA, USA)を用いてRNAを抽出した。全鎖特異的トランスクリプトームシーケンス（RNA-seq）ライブラリーは、KAPA RNA HyperPrep kit（Illumina）を用いて構築し、リボソームRNA枯渇のためにRiboZero kit（Illumina）を使用した。配列決定は、ハーバード・メディカル・スクールのBPF Next-Gen Sequencing Core FacilityのIllumina NextSeq 500装置で行い、High-Output 75-cycle kitでSingle-Read 75bpリードを取得した。
ラボ分離株におけるタイコポゾンの移動度
ラボ分離株におけるエレメントの切除は、染色体空位部位（'切除'）、またはエレメントの円形/タンデムリピート状態に特異的なエンドポイントPCRを用いてプローブされた（図S4）。プライマーを表S5に示す。25 mLの二重培養物を指数関数期まで成長させ、t0（マイトマイシンCの添加前）およびt2h（最終濃度10μg mL-1のマイトマイシンCの添加後2時間）にサンプリングした。サンプリングは、10mLの細胞を遠心分離（7,000g、30分、20°c）により採取し、DNeasy Blood & Tissue kit（Qiagen）を用いてDNA抽出を行った。PCR反応はQuick Load Taq 2X master mix (New England Biolabs)を用いて、伸長時間2分、アニーリング温度52℃で行った。PCR産物を1%アガロースゲルに直接ロードし、可視化した。図に表示された各バンドはサンガーシークエンスで確認され、予想されるアンプリコンに対応するものであった。
定量と統計解析
ウイルス画分中のチケポソン含有リードの解析
オープンリーディングフレームを予測するにはエラーレートが高すぎる生のナノポアリードから、タイケポソンとクリプティックエレメントの特徴的な遺伝子をアノテーションするために、我々は別の戦略を用いました。HMM-profileの作成に使用したアラインメントをタンパク質参照データベースに変換し、DIAMOND v0.9.4131をロングリードモードで使用してナノポアリードをこのデータベースに整列させた。また、DIAMOND v0.9.4131をロングリードモードで使用し、ナノポアリードとデータベースのアラインメントを行いました。
ベシクルおよび細胞内フラクションのTycheposonシグネチャー
細胞質・小胞質メタゲノムに含まれるタイケポゾンとクリプティックエレメントのホールマーク遺伝子の相対量を評価するため、アミノ酸空間に翻訳したリードをorfm v0.7.1132 とHMMER3 (--evalue 1e-20) を用いて、すべてのエレメントホールマーク遺伝子プロファイルとプロクロロコッカルド遺伝子プロファイルの109箇所にリクルートしました。シングルコピーのコアマーカー遺伝子セットの生成の詳細については、プロクロロコッカスの系統樹の再構築の項を参照。このプロファイルは、少なくとも2つの細胞分画サンプルと2つのウイルス分画サンプルにおいて、最低カウントが5であるもののみを考慮しました。複製がない場合は、全サンプルにわたるすべてのコア遺伝子から分散を推定し、これが妥当ではあるがかなり保守的な推定値を提供すると仮定した。ライブラリサイズで正規化し（method="TMM"）、正確検定とコア遺伝子から推定した分散を使用して、2つのフラクション間の差について検定した。
付着部位の存在量の違い
小胞および細胞画分サンプルにおける付着部位となりうるtRNA配列の存在量を評価するために、2段階のプロセスを適用した。まず、GORG単細胞ゲノムを用いて作成した海洋tRNA遺伝子の非冗長参照データベースに対して、bbduk v38.16134 (k=39 edist=2) を用いて、39bpにほぼ完全に一致するリードを少なくとも1つスクリーニングした（「Global Ocean Reference Genomes」セクション参照）。次に、これらのリードを、短い完全一致に最適化した設定（-task blastn -reward 1 -penalty -4 -gapopen 5 -gapextend 2 -perc_identity 94 -evalue 10e-5）で、全参照tRNAの5'と3'の半分に対してブラストを行いました。また、5'側と3'側の領域が異なる頻度で存在するtRNAをフィッシャーの正確検定とボンフェローニ補正により多重検定のp値を調整し、結果をRでさらに解析した。得られたカウント分布は、ggplot2.120を用いて可視化した。
島のサイズとMGE統合の頻度
島の大きさがタイケポゾンの統合頻度と相関しているかどうかを調べるために、各プロクロロコッカスクレードについて、統合されたMGEを除く7つのタイケポゾンを標的とするtRNA遺伝子に隣接する島の中央値を計算した。次に、これらの島の大きさを各クレードで観測された統合型タイケポゾンの数と比較し、線形フィットによりP値およびR2値を求めた。
相同組換え率の推定
ゲノムアイランドの形成は、しばしば近傍のコア遺伝子間の相同組換えによって促進される。まず、5つの大きな単系統クレードHLI、HLII/VI、LLI、LLII/III、LLIVについて個別にバックボーンコア遺伝子（島にはないオーソグループ）を同定した。次に、各クラスタと最も近い島との平均距離の代理値を、クレード全体で推定した。その際、個々のゲノムから得られたすべての遺伝子から最も近い島までの距離の25%分位を採用した。次に、mafft v7.310 を用いて、これらのクラスタのタンパク質アラインメントを作成し、102 アミノ酸アラインメントに塩基コドンをマップバックし (msa-codon https://github.com/thackl/phylo-scripts/) 、trimAl v1.4103 (-gt .3) で 70% 以上の隙間を持つ位置をトリミングしています。次に、すべてのアラインメントを、最も近い島までの推定距離の順に連結し、島を挟む遺伝子を先頭に、島から最も遠い遺伝子を末尾に配置した。最後に、これらのクレードごとに連結したアラインメントを99999塩基の長さのブロックに分割した。それらのブロックそれぞれについて、mcorr v20180102,135を用いて組換え率および関連変数を推定し、含まれる遺伝子のゲノムアイランドへの近接度に関してそれらのブロック単位の結果を比較した。
機能的エンリッチメント解析
機能エンリッチメント解析のために、すべての遺伝子をバックボーン、アイランド、エレメントの3つのセットに分割した。検出された特徴的な遺伝子と201bpより小さい遺伝子は除外された。また、各セットは互いに排他的であるため、アイランド内のエレメント内の遺伝子はエレメントカテゴリにのみ割り当てられた。R-package topGO v2.34.0 を用いて、backbone-element 間および backbone-island 間のペアワイズ機能濃縮解析を行った。136 2つの解析で有意に濃縮されたGO用語（p<1e-10、少なくとも100回出現するGO用語のみを考慮）を、GOカテゴリ（分子機能、細胞成分、生物学的プロセス）のそれぞれについてGOView137を用いて比較した。
RNA配列解析
イルミナの生データから、bbduk v38.16,154 を用いて、ktrim=r, k=23, mink=11, hdist=1 の設定でアダプターをトリミングした。bbduk v38.16,154でqtrim=rl, trimq=6を指定して、アダプタートリミングした配列から低品質領域を除去しました。トリミングしたRNA-seqリードを、BWA-backtrackアルゴリズムを用いてBurrows-Wheeler Aligner v0.7.16a-r1181,138でMIT0604ゲノムを含む参照ファイル（ https://github.com/https://github.com/thackl/pro-tycheposons/ から入手可能）にアライメントした。各注釈付きORFに「センス」「アンチセンス」方向でアラインしたリードの数を調べるため、HTSeqパッケージv0.11.2139を用い、デフォルトパラメータと「nonunique all」オプションでマッピングをパースした。各ORF（ライブラリ調製時にリボソーム欠失を含むため、rRNAとtRNAを除く）にアラインしたリードのカウントを複製間で集計した。DESeq2 Rパッケージv1.24.0.140を用い、標準的なDESeq2関数とワークフローを用いて、ライブラリーのシーケンス深度でサンプルを正規化し、各遺伝子の分散を推定して、差次的に発現する遺伝子を同定しました。マイトマイシンC対コントロール、UVショック対コントロールの比較では、負の二項一般化線形モデルを用いて、Wald検定で発現差検定を行った。P値はBenjamini-Hochberg手順で多重検定用に補正した。DESeq2著者によって示唆されたように、<0.1の調整されたp値を持つ140の遺伝子は、与えられた処置のペアの間で有意に異なる発現を有するとみなされた。差分発現の結果は、ggplot2.120を用いて可視化した。
データおよびコードの利用可能性
本論文では、既存の一般に公開されているデータを解析しています。これらのデータセットのアクセッション番号は、主要なリソースの表に記載されています。生のプロクロロコッカス単離株および単細胞アセンブリは、NCBI Genbankなどの公共データベースから入手できます。私たちが解除したアノテーションを含む参照用スキャフォールドアセンブリは、GitHub (https://github.com/thackl/pro-tycheposons) および Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.4642441) から入手可能です。Global Ocean Reference Genomesは、https://osf.io/pcwj9、EBI/NCBI bioprojectとしてアクセスできる。PRJEB33281 プロクロロコッカスMIT0604株のRNA-Seqデータは、NCBI GEOから入手可能である。PRJNA719560。Tara Oceansのウイルスフラクションショートリードメタゲノムコンティグは、iVirusのData Commons portalからGOV2.0の下でアクセスできる（ファイル名：Tara_assemblies.tar.gz）。Station ALOHA virus-fraction nanopore readsは、NCBI Sequence Read Archiveから入手可能である。SRX7079550 Vesicle-fraction metagenomesはNCBI Sequence Read Archiveから入手可能。SRP272691 すべてのオリジナルコードはGitHub (https://github.com/thackl/pro-tycheposons) およびZenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.4642441) に寄託されています。本論文で報告されたデータの再解析に必要な追加情報は、リクエストに応じてリードコンタクトから入手可能です。
謝辞
この研究は、Simons Foundation（生命科学プロジェクト賞ID 337262, 647135, 736564 to S.W.C., SCOPE賞ID 329108 and 721246 to E.F.D. and S.W.C., SCOPE ALOHA賞ID 721223 to E.F.D. ）の一部助成を受けて行われたものである。Life Sciences Project Award ID 827839 and 510023 to R.S.）、Gordon and Betty Moore Foundation（award ID 3777 to E.F.D. and 3790 to M.B.S.), Department of Energy (248445 to M.B.S.), and National Science Foundation (DBI 0424599, OCE-1153588, OCE-1356460 and IOS-1645061 to S.W.C., and the DBI 06160, IOCA 06160, IOCA 06130) が含まれている。OCE-1829831 to M.B.S., and OIA-1826734 to R.S.)。Wei DingにはpanX pangenomeソフトウェアのサポートを、Gera Smyshlyaevには既知のチロシンレコンビナーゼの分類に用いたHMMへのアクセスを、Kathryn Kauffmanにはウイルスサテライトの分析に関するフィードバックを、Kristina Haslinger, Daniel S. Fisher, Jed Fuhrmanには原稿に対するコメントをいただきました。また、Jamie Becker、Jessie Berta-Thompson、Elena Kazamiaには、小胞メタゲノム・サンプリングに協力してもらった。
執筆者
T.H.、R.L.、M.J.A.は本研究の構想を練った。T.H.はバイオインフォマティクス解析を主導した。T.H.、M.J.A.、E.T.は、S.L.H.、P.B.、G.E.Lの貢献により計算機解析を行った。 R.Lはタイケポソンの移動度と活性に関する実験作業をリードした。R.L.、C.B.、Z.C.はこれらの実験を実施した。S.J.B.はベシクル関連の実験を主導し、K.D.D.、A.A.A.と共同で行った。E.L.、J.B.、J.M.E、E.F.Dはウイルス様粒子1分子ナノポアシーケンスのための新しい方法を開発、ステーションALOHA時系列のショートリードピコプラントンとビリオプラントンマトリゲンコンチグの収集・シーケンス・組み立てを実施した。A.A.Z.とM.B.S.は、Tara Oceansのウイルス分画メタゲノムコンティグを作成し、提供しました。R.S.は、Global Ocean Reference Genomesデータベースを提供した。T.H.、R.L.、M.J.A.、S.W.C.は、共著者全員の貢献により、原稿を執筆した。T.H.とS.W.C.はプロジェクトの監督を行った。
利害関係者の宣言
J.B.は、オックスフォード・ナノポア・テクノロジーズの社員であり、株主および/または新株予約権者です。
補足情報
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表S1. 本研究で使用したすべてのプロクロロコッカスゲノムのSTAR Methodsに関連するメタデータ

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表S2. 図7、S1、S2、S7に関連する、すべてのプロクロロコッカスゲノムの予測されるゲノムアイランド

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表S3. 図1、2、3、5、6、S1、S4に関連する、ホールマーク遺伝子プロファイルのアノテーション

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表S4. タイケポゾンタイプとクリプティックエレメントのまとめ（図2関連

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表S5. 図S4と図S5に関連する、タイケポソン誘導の研究に使用したRT-qPCRプライマー配列

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発行日 2023年1月5日
受理されました。2022年12月5日
改訂版受理 2022年9月16日
受理：2022年9月16日 2021年3月29日
身分証明書
DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.12.006

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図
図のサムネイルfx1
グラフィカルアブストラクト
図サムネイル figs1
図S1HMMによるオーソログ遺伝子の存在比を用いたゲノムアイランド予測、STAR Methods関連
図1HMMによるゲノムアイランド予測
図S2プロクロロコッカスにおけるゲノムアイランドと移動性遺伝要素の染色体構成、図7とSTAR Methodsに関連する図
図サムネイル gr1
図1プロクロロコッカスにおけるタイケポゾンの構造と機能
図2.
図2プロクロロコッカス属モビロームのチケポソンとクリプティックMGEからなる2分割遺伝子共有ネットワーク
図1GR3
図3チケポソン型チロシンリコンビナーゼの系統的配置
図サムネイル figs3
図3プロクロロコッカス623ゲノムの移動性エレメントの分布とエレメントとアイランドの機能的重複、STAR Methodsとの関連
図1.図2.図3.図4.図
図S4STAR Methodsに関連する培養液中のエレメントの統合と除去の検出
図のサムネイル gr4
図4 プロクロロコッカスMIT0604のゲノムおよびゲノムアイランドのリモデリング（統合型タイケポゾンの影響
図1.図2.図3.図4.図5.図5
図S5 STAR Methodsに関連するDNA損傷ストレスおよびショック処理下でのタイケポソン特徴遺伝子の転写応答
図サムネイルgr5
図5環境中のウイルス粒子と様々な海洋細菌のゲノムに存在するタイケポゾン
図サムネイルgr6
図6海洋のベシクル分画メタゲノムに含まれるタイケポゾンのシグネチャーの存在比の違い
図サムネイルgr7
図7プロクロロコッカスにおけるゲノムアイランドとそれに付随する移動性遺伝要素の染色体構成
図1図2図3図4図5図6
図S6STAR Methodsに関連した、タイケポソン活性に関連したゲノムアイランド含有量の変動とゲノムアイランドサイズの増加
図1.図2.図3.図4.図5.図6
図S7アイランドフランキングおよび非アイランドフランキングゲノム領域における相同組換え、STAR Methods関連
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