母親の微生物叢は、微生物叢由来の細胞外小胞を介して胎児とコミュニケーションする

2023年11月14日 10:18

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公開日：2023年11月13日
母親の微生物叢は、微生物叢由来の細胞外小胞を介して胎児とコミュニケーションする
https://microbiomejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40168-023-01694-9?utm_source=dlvr.it&utm_medium=twitter

Anna Kaisanlahti, Jenni Turunen, ...Justus Reunanen 著者一覧を見る
マイクロバイオーム第11巻、論文番号：249（2023）この記事を引用する

1 Altmetric

指標詳細

要旨
背景
胎児環境における細菌の存在に関する報告はまだ限られており、議論の余地がある。近年、ヒト腸内細菌叢から分泌される細胞外小胞が、宿主-微生物叢相互作用の新たなメカニズムとして浮上している。我々は、健康な妊娠中の胎児環境における細菌細胞外小胞の存在を調査し、腸内細菌叢由来の細胞外小胞が生物学的障壁を越えて胎児に到達するかどうかを明らかにすることを目的とした。

研究結果
健康な妊婦の羊水中に細菌性細胞外小胞が検出され、母体の腸内細菌叢に見られる細胞外小胞と類似性を示した。妊娠マウスでは、ヒト母体腸内細菌叢由来の細胞外小胞が羊膜腔内に到達することが確認された。

結論
我々の知見は、母体微生物叢由来の細胞外小胞が、母体微生物叢と胎児との相互作用メカニズムであることを明らかにし、出生後の腸内コロニー形成のための出生前免疫系のプライミングにおいて極めて重要な役割を果たす可能性がある。

ビデオ要約

背景
ヒトの腸内細菌叢は、それぞれが多様な機能活性を持つ何千もの微生物からなる多様な生態系を構成している。ヒトの健康におけるその重要性は、生物医学研究において拡大しつつある分野である。近年、宿主と微生物叢のコミュニケーション分野において、腸内細菌叢から分泌される細胞外小胞（EVs）が注目されている[1,2,3,4,5,6,7,8]。EVは、ほとんどすべての細胞タイプによって分泌される膜に包まれた粒子であり、生物学的障壁を越えて様々な生体分子を輸送することができる[9]。

胎児マイクロバイオームの概念については、依然として議論の的となっている。これまでの研究では、胎盤や羊水に細菌DNAが存在することが報告されているが [10,11,12]、全細胞細菌からなる明確な胎児マイクロバイオータという考え方は懐疑的である [13,14,15,16,17,18,19]。実験室で培養された単一の病原体に由来するEVが胎児と母体の界面に及ぼす影響 [20, 21]や、妊娠中の尿中の細菌EV分泌の調節は、すでにヒトで示されている [22] 。しかし、健常妊娠中の微生物EVに関するデータは乏しく［23,24,25］、微生物叢由来のEVは胎児環境では調べられていない。

われわれは、母親の微生物叢由来のEVが生物学的障壁を越えて胎児に到達するという仮説を立てた。我々は、健康な妊婦の腸および羊水中の細菌EVの特徴を明らかにすることを目的とした。さらに、マウスモデルを用いて、母親の腸内細菌叢由来のEVが胎児と相互作用するかどうかを検討した。

方法
妊婦からの羊水および糞便サンプルの採取
フィンランド、オウル市のオウル大学病院で、正期産後に選択的帝王切開分娩を受けた28人の妊婦から羊水サンプル（n = 26）と糞便サンプル（n = 25）を採取した。妊婦の臨床的特徴は、Additional file 1: Table S1に示した。サンプリング手順については、以前に詳述されている[13]。簡単に説明すると、羊水サンプルは帝王切開中に産科医によって無菌状態で採取され、一方、糞便サンプルは帝王切開前に看護師によって母親から採取された。羊水および糞便サンプルは、採取後直ちに-20℃で保存された。これらの処置について文書によるインフォームド・コンセントを行った女性のみが登録された。研究プロトコルは、フィンランド、オウル大学病院の北部オストロボスニア病院地区倫理委員会の承認を得た（決定番号EETTMK: 3/2016）。本研究のすべての臨床的側面は、関連するガイドラインおよび規則に従って実施された。

羊水サンプルからのEVの単離
EVは、以前に記載されたように[4, 26]、超遠心分離とその後の密度勾配超遠心分離によって羊水サンプルから単離した。簡単に説明すると、各サンプル10mLを10,000×g、30分間、4℃で遠心分離し、固形物から精製した。その後、サンプルを0.8μmのシリンジフィルター（Minisart®）でろ過した。SW 41 Ti スイングロータ（12 mL）を装備した Optima L-100/L90 超遠心機（ベックマン）を用いて、100,000 × g で 18.5 時間超遠心することにより、EV を単離した。得られたEVを含むペレットをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に溶解し、OptiPrep™勾配密度超遠心法により細菌EVをさらに濃縮し、フラクション6と7をPBSで洗浄し、下流の分析に使用した[4, 26, 27]。単離されたEVは、分析まで-20℃で保存された。PBSでオーバーレイしたグラジエントから得られたフラクション6と7は、プロテオミクス解析のネガティブコントロールとして使用した。

母体糞便サンプルからのEVの単離
EVは、以前に記載されたように[4, 26, 27]、一連の濾過、サイズ排除クロマトグラフィー、および密度勾配超遠心ステップを通して、母親の糞便サンプルから単離された。簡単に説明すると、各母体サンプルの糞便4gをPBSに懸濁し、14,000×gで30分間、4℃で遠心分離を繰り返し、固形物を除去した。その後、サンプルを40μmのナイロンフィルター（Falcon）と0.45μmのPESフィルター（Biofil）でろ過し、Centricon® Plus 70フィルター装置（Millipore）を用いて濃縮した。リポタンパク質やカイロミクロンなどの糞便特有の汚染物質をサイズベースで除去するため、Exo-Spin™ミニカラム（Cell Guidance Systems社製）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより、濃縮サンプルからEVを分離した。この調製物は、あらかじめPBSで洗浄したフラクション6と7について、OptiPrep™勾配密度超遠心法を用いて細菌EVをさらに濃縮し、これらのフラクションを下流の分析に使用した[4, 26, 27]。分離された糞便EVは、分析まで-20℃で保存された。PBSでオーバーレイしたグラジエントから得られたフラクション6と7は、プロテオーム解析のネガティブコントロールとして使用した。

単離したEVの透過型電子顕微鏡（TEM）分析
透過型電子顕微鏡（TEM）イメージングは、以前に記載されたように実施した[27]。羊水および糞便サンプルから単離したEVを、Formvarカーボンコートおよびグロー放電した銅グリッド上に堆積させた。サンプルは1％グルタルアルデヒドでグリッドに固定し、2％メチルセルロース-0.4％酢酸ウラニル溶液でネガティブ染色した。その後、Tecnai G2 Spirit 120 kV TEMとVeletaおよびQuemesa CCDカメラ（Tissue Imaging Center, Biocenter Oulu, Oulu, Finland）で試料グリッドを観察し、画像を撮影した。

EVのナノ粒子追跡分析（NTA）
単離されたEVの濃度とサイズ分布は、NanoSight NM300装置（Malvern Panalytical）を用いてナノ粒子追跡分析（NTA）により特徴づけられた。装置には405nmレーザー、シリンジポンプ、NTAソフトウェアバージョン3.4.4（Malvern Panalytical）が装備されていた。最適な測定のために、サンプルはあらかじめPBSで希釈した。得られたEVのサイズは、平均値（SD）および最頻値（SD）とともにグラフ表示され、EVのサイズ分布は、D10、D50、D90値の平均値（SD）として表された。羊水EVと母体糞便EVのサイズとサイズ分布は、一対の両側t検定を用いて比較した。グラフはGraphPad Prism（バージョン9.3.1）を用いて作成し、統計的に分析した。

羊水と糞便からのDNA抽出
DNeasy PowerSoil Proキット（Qiagen）を用いて、糞便および羊水サンプルから全DNAを抽出した。糞便サンプルはステンレスビーズを用いてTissuelyzerでホモジナイズした。約200mgの糞便サンプルを1mLのPBSに溶解し、2mLの遠心チューブに入れた。サンプルを25Hzで2分間振とうし、氷上で2分間インキュベートした後、もう一度25Hzで1分間振とうした。ホモジネートは、製造業者のプロトコールに従ってさらに処理した。羊水については、2.5mLのクライオチューブを8609×gで20分間遠心し、上清を捨てた。得られたペレットを製造元のプロトコールに従って水平にホモジナイズし、DNA抽出の残りの工程も同じプロトコールを続けた。糞便サンプルは100μLの溶出試薬で溶出し、羊水サンプルは50μLで溶出した。合計5種類の陰性コントロール（滅菌水、HyClone™ HyPure、Thermo Scientific）をこれらのサンプルと同時に処理した。

EVからの全RNA抽出とcDNA合成
我々は、RNA分析、特に16Sリボソームリボ核酸（rRNA）遺伝子配列決定を用いて、微生物叢由来のEVの特徴を明らかにすることにした。この選択は、EV中のゲノムDNAの存在に関するデータが限られており、一貫性がないことに由来する[28, 29]。全RNA抽出は、exoRNeasy Serum Plasma Midi Kit（Qiagen）を使用して、羊水と糞便のEVサンプルの両方について、製造元の説明書に従って行った。その後、20 ngのRNAを用いて、iSCRIPT™ cDNA合成キット（Bio-Rad）を用いて、メーカーのプロトコールに従ってcDNA合成を行った。さらに、ユニバーサル16S rRNA遺伝子に特異的なS-D-Bact-0341-b-S-17プライマー（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）を反応ミックスに含めた[30]。

ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）と16S rRNA遺伝子の塩基配列決定
RNA分析後、母親の羊水と糞便サンプルから分離したEVについてPCRと16S rRNA遺伝子の塩基配列を決定した。標的領域は16S rRNA遺伝子のV4-V5超可変セグメントで、プライマーペア519F（5′-CAGCMGCCCGCGGTAATWC-3′）と926R（5′-CCGTCAATTCCTTTRAGTTT-3′）を用いた［31、32］。519Fプライマーは、配列決定時のプールを容易にするため、サンプルごとに個別にバーコード化した。PCR反応には、Phusion Flash High-Fidelity PCRマスターミックス（Thermo Scientific社製）を用い、50μL反応では製造元のプロトコールに従った。さらに、PCRと配列決定には2つのネガティブコントロール（滅菌水、HyClone™ HyPure, Thermo Scientific）とHM-782DとMicrobial Mock Community B (BEI resources, USA)からなる2つのモックコミュニティコントロールを加えた。

PCR反応はApplied Biosystems™ Veriti 96-Well Thermal Cycler（Thermo Scientific）を用いて実施した。サイクルは98 °Cで3分間の初期化ステップから始まり、アニーリング温度56 °Cで30サイクルの反応、72 °Cで5分間の最終伸長ステップを行った。PCR産物はアガロースゲル電気泳動とBio-Rad社のVersaDocイメージングマシンを用いたイメージングにより確認された。その後、PCR産物をプールし、AMPure XP (Beckman Coulter, CA, USA)を用いて精製を行った。プールは1%アガロースゲルで電気泳動され、そこから産物が切り出され、MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen)を用いて精製された。Phusion Flash High-Fidelity PCRマスターミックスと1μMのプライマーAおよびtrP1を用いて、プールに2回目のPCRを行った。この2回目のPCRはアニーリング温度63℃で7サイクル行い、最後の伸長ステップは5分間であった。PCR産物を再びAMPure XPを用いて精製し、Bioanalyzerを用いて分析し、Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit（Thermo Fisher Scientific）を用いてプールの濃度を測定した。配列決定は、IonTorrent PGM（Thermo Fisher Scientific）を用いて行った。

16S rRNA遺伝子配列解析
シーケンス結果はQIIME2（バージョン2021.2）を用いて解析した[33]。データの質を保証するために、200 bpより短いリードは除外した。残りのリードは、DADA2を用いて、15でトリミングし、250で切断することで、ノイズ除去および多重化を解除した。キメラリードは厳密にフィルター除去した[34]。汚染リードは、R decontamパッケージ（バージョン1.8.0）を用いて、DNA抽出とPCR中に生成されたネガティブコントロールを参照しながら除去した。この目的のために、閾値0.5のprevalence-based法を使用した[35]。シアノバクテリア、ミトコンドリア、真核生物、古細菌と同定された分類群は分析から除外した。さらに、既知の皮膚汚染物質であるコリネバクテリウム（Corynebacterium）とクチバクテリウム（Cutibacterium）も除外した。リード頻度の平均は9108、中央値は3914であった。読み取り回数が不十分なサンプルを除外した後、最低読み取り回数に基づいてサンプリング深度を1609に設定し、読み取りデータを希釈した。

α多様性と呼ばれるサンプル内の多様性は、シャノン指数と観察された特徴の数を用いて評価した。グループ間のアルファ多様性の差の統計的有意性は、p < 0.05を有意閾値として、Kruskal-Wallis H検定を用いて評価した。グループ間の一対差異は、RStudio（バージョン2022.07.1 [36]、Rバージョン4.2.1 [37]）内でボンフェローニ補正を適用した一対ウィルコクソン順位和検定によって決定した。さらに、Bray-Curtis非類似度に基づく主座標分析によって、β多様性として知られる群集の類似性を視覚的に表現した。β多様性のグループ間差の有意性はPERMANOVAを用いて評価した。SILVAデータベース（バージョン138）を用いて、門レベルおよび属レベルの分類群の相対存在量を計算した。差次的に豊富な分類群は、ANCOM（Analysis of composition of microbiomes）法 [39]を用いて同定した。図は、RStudio（バージョン2022.07.1 [36]、Rバージョン4.2.1 [37]）とRパッケージggplot2（バージョン3.3.6）およびGridExtra（バージョン2.3）を使用して作成した。

EVからのタンパク質の単離
EVからのタンパク質は、以前に記載されたプロトコールに従って、メタノール沈殿で単離した [40]。簡単に説明すると、サンプル量の4倍のメタノール、サンプル量の1倍のクロロホルム、サンプル量の3倍のdH2Oを含む溶液中でEVタンパク質を沈殿させ、14,000×gで1分間遠心分離した。水とメタノールの混合物を除去した後、沈殿物をメタノールで洗浄し、20,000×gで5分間遠心した。タンパク質ペレットを室温で水平に10-20分間風乾し、その後1×Laemmli緩衝液に再懸濁した。再懸濁したタンパク質を＋95℃で5分間煮沸し、12% SDS-PAGEゲルにロードした。電気泳動は110Vで10-15分間行い、その後50％エタノールと10％酢酸を含む溶液で30分間ゲルを固定した。固定したゲルを1×Sypro Rubyタンパク質溶液で一晩染色し、光から保護した後、翌日5％酢酸で5分間脱染した。最後に、ゲルをdH2Oに15分間浸し、UV光下でタンパク質バンドを切り出し、エッペンドルフチューブで20μLのdH2O中に保存した。

EVタンパク質の質量分析
質量分析によるEVタンパク質の分析は、フィンランド、トゥルクのTurku Proteomics Facilityで行った。トリプシンで消化したペプチドを15μLのギ酸に再懸濁し、この溶液5μLを分析に供した。ナノエレクトロスプレーイオン源を備えたQ Exactive HF質量分析計（Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany）と組み合わせたナノフローHPLCシステム（Easy-nLC1200, Thermo Fisher Scientific）を用いて、液体クロマトグラフィー-エレクトロスプレーイオン化-タンデム質量分析を行った。ペプチドを最初にトラップカラムにロードし、その後15cm C18カラム（75μm×15cm、ReproSil-Pur 5 μm 200Å C18-AQ、Dr. Maisch HPLC GmbH、Ammerbuch-Entringen、ドイツ）で分離した。移動相は、0.1%ギ酸を含む水（溶媒A）と0.1%ギ酸を含むアセトニトリル/水（80:20, v/v）（溶媒B）であった。ペプチドは溶媒Bの8～43%の直線的な20分間のグラジエントで溶出した。質量分析データは、Thermo Xcalibur 4.1 software (Thermo Fisher Scientific)を用いて自動的に取得した。情報に依存した取得方法は、300-2000 m/zの質量範囲をカバーするOrbitrap質量分析サーベイスキャンと、それに続く最も高強度の10個のペプチドイオンの高エネルギー衝突解離フラグメンテーションから構成された。

プロテオームデータ解析はPeaks Studioソフトウェア（バージョン10.6）を用いて行った。検索はUniProt SwissprotおよびUniProt trEMBLデータベース（UniProtリリース2021_04）に対して行い、親質量の許容誤差は10.0 ppm、フラグメント質量の許容誤差は0.02 Daに設定した[41]。ペプチドとタンパク質の同定におけるFalse discovery rateは1.0%に設定し、各グループの上位のタンパク質のみを考慮しました。タンパク質は、少なくとも1つのユニークなペプチドで表され、支持ペプチドからの総タンパク質カバレッジが1%以上の場合に同定されたとみなされた。ネガティブコントロールはEV由来のタンパク質と並行して分析し、コントロールサンプルで同定されたタンパク質はEVタンパク質の同定結果から除外した。解析結果の分類学は、UniProtリリース2021_04の名前に従って参照した。同定結果のデータは、Additional file 2に示したスクリプトを使用してRで処理し、Additional file 3にメタデータ、Additional file 4にスクリプトの説明を添付した。図はRStudio（バージョン2022.02.3 [36]、Rバージョン4.2.0 [37]）とggplot2パッケージ（バージョン3.3.6）を用いて描いた。

妊娠マウスにおけるヒト糞便EVの生体内分布解析
4人の妊婦の糞便サンプルから得たEVを、以前に確立されたプロトコール[44]に従って、Bodipy Texas red-ceramide (Invitrogen, Germany) [42, 43]で標識した。簡単に説明すると、1 mMの色素（ジメチルスルホキシド中）をEVと結合させ（EV100 μLあたり色素5 μL）、37℃で30分間インキュベートした。27,000×gで20分間遠心分離することにより、過剰の未組み込み色素を標識EVから除去し、染色した小胞をPBSで再構成した。

12週齢の雌性FVB/NRjマウス（出典：Janvier Labs）を、温度と湿度を管理し、12時間の明暗サイクルで飼育し、餌と水に自由にアクセスできるようにした。本実験は、地元の動物実験倫理委員会（MELUR）からライセンス番号（V 242-68909/2015 (87-6/15)）の承認を受け、ドイツのキール大学が推奨する動物飼育ガイドラインを遵守した。

本研究では、妊娠第1期末のマウス4匹を使用した。テキサスレッドで標識した糞便由来EVを妊婦から単離し（マウス1匹あたり100μL、約108EVに相当）、尾静脈注射でマウスに投与した。24時間の循環後、動物を腹腔内注射で人道的に安楽死させた［4.0％NaCl中0.6％ケタミン（AVECO Pharmaceuticals, Boston, MA, USA）と0.4％メデトミジン（Pfizer Deutschland, Berlin, Germany）からなるカクテルを125μL］。その後、マウスを犠牲にし、Berthold Technologies社（ドイツ、Bad Wildbad）のNightOWL 983システムを用いて生体外イメージングを行うために臓器と胎児を採取した。イメージングプロセスでは、テキサスレッド用に740/790 nmの励起/発光フィルターを使用し、画像を作成した。臓器の周囲に関心領域を設定し、最大相対蛍光強度ボクセルを測定し、Indigoソフトウェアで解析した。筋肉組織は、非特異的ターゲティングのコントロールとした。

蛍光強度の統計解析は、GraphPad Prism（バージョン9.3.1）を用いて、Kruskal-Wallisノンパラメトリック検定により行った。様々な臓器および胎児の蛍光強度は、GraphPad Prism（バージョン9.3.1）で作成した平均値と標準偏差で視覚的に表した。

統計解析
羊水と糞便のEVサイズとサイズ分布パラメータに関するNanosightの結果を比較するために、GraphPad Prism（バージョン9.3.1）を用いて、一対の両側t検定を適用した。 16S rRNA遺伝子配列の解析では、QIIME2（バージョン2021.2）内のKruskal-Wallis検定を用いて多群比較を行った[33]。一対検定は、RStudio（バージョン2022.07.1 [36]、Rバージョン4.2.1 [37]）に実装されている多重比較のためのボンフェローニ補正を用いたウィルコクソン順位和検定を採用した。β多様性の群間差の有意性はPERMANOVAで評価し、有意に豊富な分類群はANCOM（Analysis of the composition of microbiomes）法 [39]を用いて同定し、いずれもQIIME2（バージョン2021.2）に実装した [33]。

生体内分布アッセイでは、GraphPad Prism（バージョン9.3.1）を用いて、胎児と母体臓器の蛍光強度を解析するための多群比較にクラスカル・ワリス検定を用いた。

結果
母体糞便由来EVは羊水由来EVよりも広いサイズ分布を示した
妊婦の羊水と糞便中に存在するEVを特徴付けるために、ナノ粒子追跡分析を行った。分析の結果、糞便抽出物中の濃度は108-9ナノ粒子/mL、羊水中の濃度は108-10ナノ粒子/mLであった。両サンプルタイプとも、200 nmより小さい粒子がかなり存在し、以前に報告された小型EVのサイズ範囲と一致していた。糞便EVサンプルの平均粒子径は、羊水EVサンプルの粒子径よりも有意に大きかった。さらに、糞便EVサンプルの粒子径分布は羊水EVサンプルよりも広く、平均粒子径は羊水EVが142～216 nm、糞便EVが152～343 nmであった（図1A～C）。個々のサンプル内のEVサイズ分布は、Additional file 1：図S2、S3）。透過型電子顕微鏡では、糞便サンプルのEVに典型的な二層膜ナノ構造が明らかになり、羊水EVは「膨らんだ風船」の表現型を示した（図1D）[45, 46]。

図1
図1
母親の糞便サンプルの細胞外小胞（FE EVs）は、羊水由来の細胞外小胞（AM EVs）と比較して、より広いサイズ分布を示す。ナノ粒子追跡分析（NTA）における羊水および糞便由来のEVの代表的なサイズ分布（A）。平均値および最頻値で表されるEVサイズの解析、エラーバーは標準偏差を示す、n = 26羊水サンプルおよびn = 25糞便サンプル、各ドットは1サンプルを表す、p < 0.05および**p < 0.001の一対両側t検定（B）。直径10パーセンタイル（D10）、直径50パーセンタイル（D50）、直径90パーセンタイル（D90）の平均値で表されるEVのサイズ分布、エラーバーは標準偏差を示す。羊水と糞便のEVの代表的な透過型電子顕微鏡写真 (D)

フルサイズ画像
羊水と母親の糞便中の細菌EVのタンパク質カーゴは、起源と機能的特徴において類似性を示した。
合計で、11,280の異なるペプチドがUniProtKB swissProtデータベースから、14,406がUniProtKB trEMBLから同定された。その結果、羊水サンプルでは3526個のタンパク質が同定され、糞便EVサンプルでは8417個のタンパク質が同定された。タンパク質の同定結果は、UniProtKB SwissProtとUniProtKB TrEMBLについて、それぞれAdditional files 5と6にあります。具体的には、羊水EVサンプルでは細菌性タンパク質が340個、ヒトタンパク質が3186個同定されたのに対し、糞便サンプルでは細菌性タンパク質が7558個、ヒトタンパク質が859個同定された。平均すると、羊水サンプルには1サンプルあたり細菌性タンパク質が30個、ヒトタンパク質が3186個同定されたのに対し、糞便サンプルには細菌性タンパク質が平均1333個、ヒトタンパク質が平均60個同定された。両サンプル群のタンパク質同定に関する統計は、Additional file 1: Table S2に示した。

羊水および糞便由来EVの両方で最も同定された細菌門は、バクテロイデーテス（Bacteroidetes）、ファーミキューテス（Firmicutes）、プロテオバクテリア（Proteobacteria）、およびアクチノバクテリア（Actinobacteria）であった。遺伝子オントロジー（GO）アノテーションは、羊水EVで同定された細菌タンパク質の58％（生物学的プロセス）と76％（分子機能）で利用可能であり、糞便由来の細菌EVタンパク質では9％（生物学的プロセス）と12％（分子機能）であった。羊水および糞便由来EV中の細菌タンパク質が共有する生物学的プロセスに関する最も優勢なGOsは、細胞プロセス[GO:0009987]、代謝プロセス[GO:0008152]、局在化[GO:0051179]、刺激に対する応答[GO:0050896]、および生物学的制御[GO:0065007]のGOsであった（Fig. 分子機能については、羊水および糞便由来のEV中の細菌タンパク質が共有する最も優勢なGOsは、結合[GO:0005488]、触媒活性[GO:0003824]、構造分子活性[GO:0005198]、およびトランスポーター活性[GO:0005215]であった（図2C）。さらに、翻訳レギュレーター活性[GO:0045182]は、羊水EV細菌タンパク質において最も一般的なGOクラスの1つであったが、糞便由来のEV細菌タンパク質には存在しなかった（図2C）。

図2
図2
羊水細胞外小胞（AM EV）と母親の糞便細胞外小胞（FE EV）に含まれる細菌タンパク質は、分類学的および機能的特徴を共有している。羊水由来EV（n = 26）および糞便由来EV（n = 25）において同定された細菌タンパク質の門レベルでの分類学的特徴。各門に割り当てられたタンパク質のヒット数はlog10スコアで表され、サンプルは列に、10以上のタンパク質ヒットを持つ門名は行に示されている。サンプルコホートには双子の妊娠が含まれ、羊水サンプルではAとBとした（A）。AM EVおよびFE EVで同定された細菌タンパク質のGO生物学的プロセスクラスは、log10スコアで示されている（B）。AM EVおよびFE EVで同定された細菌タンパク質のGO分子機能クラスは、log10スコアで示されている（C）。

フルサイズ画像
羊水と母親の糞便中のEVは細菌タンパク質のサブ集団を共有している
羊水由来EVと糞便由来EVのタンパク質同定を比較すると、79の細菌タンパク質の亜集団（図3A）と809のヒトタンパク質（図3B）が、両方のタイプのEVサンプルに存在することが同定された。生物学的プロセスのGOアノテーションは、オーバーラップタンパク質セットの細菌タンパク質同定の63%で利用可能であり、分子機能については68%であった。重複する細菌タンパク質集団の生物学的プロセスに関する優勢なGOsは、代謝プロセス[GO:0008152]と細胞プロセス[GO:0009987]であった（図3C）一方、分子機能については、結合[GO:0005488]と触媒活性[GO:0003824]であった（図3D）。これらのGOカテゴリは、羊水EVと糞便EVの両方で細菌タンパク質同定で観察された全体的な傾向と一致している。重複する細菌タンパク質は、主にバクテロイデーテス（Bacteroidetes）、ファーミキューテス（Firmicutes）、プロテオバクテリア（Proteobacteria）、および放線菌（Actinobacteria）に由来し、羊水由来EVと糞便由来EVの両方で、細菌タンパク質のヒットにおいて支配的な系統であった（図3E）。重複した細菌タンパク質の詳細については、Additional file 1: Table S3を参照。

図3
図3
羊水由来細胞外小胞（AM EVs）と母体糞便由来細胞外小胞（FE EVs）は、細菌タンパク質のサブ集団を共有している。AM EVsとFE EVsにおける細菌タンパク質同定のベン図表示（A）。AM EVsとFE EVsにおけるヒトタンパク質同定のベン図表示（B）。AM EVsとFE EVsの両方で同定された細菌タンパク質の分類学（門レベル）（C）。AM EVとFE EVの両方で同定された細菌タンパク質のGO生物学的プロセスクラス（D）。AM EVsとFE EVsの両方で同定された細菌タンパク質のGO分子機能クラス(E)

フルサイズ画像
羊水由来のEVで同定された細菌タンパク質のうち、2つのタンパク質がバクテロイデーテス（Bacteroidetes）およびプロテオバクテリア（Proteobacteria）門由来のサンプルの80％以上に存在し、2つのタンパク質がプロテオバクテリア（Proteobacteria）門由来のサンプルの50％以上に存在した。これらのタンパク質の詳細は、Additional file 1: Table S4に示した。母親の糞便EVサンプルで同定された細菌性タンパク質のうち、主にバクテロイデーテス門に由来する10個のタンパク質がサンプルの70％以上に存在し、バクテロイデーテス門に由来する6個のタンパク質はすべてサンプルの60％以上に存在した。さらに、主にバクテロイデーテス門に由来する24種類の細菌タンパク質が、サンプルの30～60%で検出された。これらのタンパク質の詳細は、Additional file 1: Table S5に示した。

細菌16S rRNA遺伝子解析は、羊水と母親の糞便中の細菌性EVの起源が共有されていることを示唆している。
糞便23検体、糞便由来EV23検体、羊水24検体、羊水由来EV24検体からなる合計94検体を研究に組み入れた。品質管理後、糞便由来22検体、糞便由来EV22検体、羊水10検体、羊水由来EV24検体をαおよびβ多様性解析のために保持した。アルファ多様性（サンプル内の多様性）は、シャノン指数と観察された特徴の数を計算すると、サンプルグループ間で有意な差が見られた（p < 0.05）（図4）。糞便サンプルは他のサンプルよりも高い多様性を示し、グループ内で最大の変動を示した。Bonferroni補正を加えたWilcoxon順位和検定を用いた一対検定では、羊水由来EVと糞便由来EV、羊水由来EVと羊水由来EV、羊水由来EVと糞便のグループ間で有意差が認められた（Additional file 1: Table S6）。羊水および羊水由来EV群と、糞便および糞便由来EV群との間の比較を除き、これらの特徴の一対比較はすべて有意差をもたらした。すべてのサンプル群で、β多様性（サンプル間多様性）に有意差が認められた。Bray-Curtis非類似度を用いた主座標分析による可視化では、あらかじめ定義されたグループ分けに従ってサンプルがクラスタリングされ、羊水EVと母親の糞便EVのクラスタリングが示唆された（図4）。PERMANOVAによるグループ別および一対比較では、サンプルグループ間の組成の違いが有意であることが確認された（p = 0.001）（図4、Additional file 1: Table S6）。

図4
図4
主座標分析（PCoA）による可視化は、羊水細胞外小胞（AM EVs）と母親の糞便細胞外小胞（FE EVs）のクラスタリングを示す。各サンプル群（AM＝羊水、AM EVs＝羊水由来細胞外小胞、FE＝母体糞便、FE EVs＝母体糞便由来細胞外小胞）において、アルファ多様性はシャノン指数と観察された特徴数で、ベータ多様性はPCoAでBray-Curtis非類似度を用いて定量化した。サンプル群間の差の統計的有意性は、QIIME2に実装されているように、Kruskal-Wallis Hを用いてα多様性を推定した。PERMANOVAは、Bray-Curtis非類似度によって定量化されたグループ間の差の統計的検定として使用された。P < 0.05を統計的に有意とみなした

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サンプル群の分類学的分析では、細菌の存在量にばらつきが見られた。ほぼすべてのサンプルで、ファーミキューテス門とバクテロイデーテス門（過去の16S rRNA遺伝子配列解析データベースではバクテロイデス門）を示す細菌の16S rRNA遺伝子所見が認められたが（図5）、糞便サンプルでは属レベルでバクテロイデス属（30％）とアリスティペス属（13％）がほとんどであったのに対し、羊水サンプルで最も一般的な属はペプトニフィルス属（33％）で、その他の属は細菌組成の10％未満であった（Additional file 1: Table S7）。逆に、EVサンプルの細菌組成は類似しており、ブドウ球菌と連鎖球菌の割合がわずかに異なっていた（Additional file 1: Table S7）。

図5
図5
羊水細胞外小胞（AM EVs）と母親の糞便細胞外小胞（FE EVs）は、その細菌組成において類似性を示した。サンプルの種類（AM＝羊水、AM EVs＝羊水由来細胞外小胞、FE＝母親の糞便、FE EVs＝母親の糞便由来細胞外小胞）に基づく門レベルと属レベルの分類群バープロット。門レベルでは、最も頻度の高い10の門を色分けし、残りを折りたたんで「その他」のカテゴリーとし、属レベルでは、最も頻度の高い20の属を色分けし、残りを折りたたんで「その他」のカテゴリーとした（A）。各サンプルにおける全属の相対的存在量 (B)

フルサイズ画像
FE対FE EVサンプルでは36種、AM対AM EVサンプルでは22種、FE対AMサンプルでは6種、FE EV対AM EVサンプルでは4種であった（追加ファイル1：補足図S1、補足表S8）。

ヒト母体糞便EVは妊娠マウスの胎児に到達する
母体腸内細菌叢EVの胎児へのトランスロケーションを、妊婦の糞便サンプル由来のEVを通して、我々のマウスモデルで試験した。蛍光標識したEVを妊娠マウスの尾静脈に注入したところ、注入24時間後にマウス胎児に特異的に集積した。さらに、これらの標識EVは、母体の肺、心臓、肝臓、脳などの遠位臓器にも集積することがわかった（図6）。

図6
図6
妊婦の糞便細胞外小胞（EV）は、妊娠マウスの胎児への蓄積を示した。妊婦の糞便から分離した標識EVを、妊娠第1期末のマウスに静脈注射した。動物は注射の24時間後に犠牲にし、様々な臓器と胎児の画像を得た。母体の様々な臓器と胎児の蛍光強度を評価した。データは平均値で示し、標準偏差はエラーバーで示した。n＝4マウス、Kruskal-Wallisノンパラメトリック検定では臓器／胎児間で有意差なし（ns）（A）。(B)には、臓器と胎児の代表的な蛍光画像と、同程度の大きさの関心領域(ROI)が描かれている。

フルサイズ画像
考察
本研究の結果から、微生物叢由来のEVが妊婦の羊水に存在することが示された。注目すべきは、羊水と母親の糞便で見つかったEVは、そのタンパク質カーゴと細菌組成の点で類似性を示していることである。マウスモデルにおいて、我々はヒト母親の糞便サンプルからEVを単離することに成功し、それが羊膜腔内に到達することを示した。我々は、母親の腸内細菌叢に由来するEVが胎児環境に到達することを発見した。これは、母親の腸内細菌叢と発育中の胎児との間の、これまで報告されていなかった相互作用メカニズムである。羊水中に母親の腸内細菌叢由来のEVが存在することは、出生後の新生児の腸内コロニー形成に重要な、胎児の免疫系をプライミングするためのもっともらしいメカニズムを示唆している。

胎児環境における細菌EVに関するこれまでの研究は、妊娠合併症を調査する動物モデルにおいて、単一の細菌病原株から単離されたEVの影響を研究することに焦点が当てられていることが多かった [20, 21]。さらに、胎児環境における細菌の存在に関する研究は、主に16S rRNA遺伝子の塩基配列決定に依存しており、細菌由来の他の生体分子に重点を置いた研究は限られていた [47] 。Nunziら（2023）による最近の研究では、羊水由来のEVの単球活性化能を探索し、16S rRNA遺伝子配列決定によってヒト羊水中の細菌性EVの存在を報告している［24］。同様に、Menonら（2023）は、胎盤由来の細菌EVの16S rRNA遺伝子配列決定を通じて胎盤マイクロバイオームを調べた［25］。これらの先行論文とは対照的に、本研究では、16S rRNA遺伝子解析に加えてプロテオミクスによって羊水由来の細菌EVを特徴付けることで、より包括的なアプローチをとっており、母親の腸内細菌叢EVとの直接的な比較を容易にしている。

本研究では、細菌タンパク質とRNAによって証明されるように、ヒト羊水中に細菌EVが存在することを示した。本研究のプロテオーム解析により、羊水由来EVと母親の糞便由来EVの両方に存在する細菌タンパク質のサブグループが明らかになった。両EVグループのタンパク質カーゴは、ほとんどが同じ細菌門に由来し、同様の機能的特徴を示すことが観察された。16S rRNA遺伝子解析では、羊水と母親の糞便サンプルの細菌DNAに違いが観察されたにもかかわらず、これらの供給源から分離されたEVは、細菌組成と多様性において類似性を示し、共通の供給源があることが示唆された。これらの結果は、妊娠中の母親の微生物叢は、微生物叢由来のEVを介して発育中の胎児とコミュニケーションしているという仮説を支持するものである。

われわれのマウスモデル実験は、母体の微生物叢由来のEVが妊娠中に胎児に到達できるというさらなる証拠を提供している。これまでの研究で、細菌EVは腸管上皮バリアを通過して血流に入り、その後遠位臓器に移動する能力があることが示されている。この現象は、血液[48]や母乳[49]などのヒト体液中の腸管関連細菌EVの出現に関連して、あるいは妊娠の範囲外で、培養常在菌株由来の細菌を用いて実施された動物モデルにおける標識細菌EVを用いた生体内分布アッセイを通じて、以前に報告されている[50, 51]。本研究では、胎児への生物学的分布を評価するために、細菌EVを糞便サンプルから分離し、母体の腸内細菌叢からのEV分泌物全体を代表させた。

子宮内で形成された乳児の初回通過糞便は、すでに特徴的な微生物叢を保有している[13,52,53,54]。しかし、羊水と胎盤の胎児マイクロバイオームの概念は、全細胞細菌からなる特徴的な胎児マイクロバイオータはありそうにないため、批判を引き起こした[13,14,15,16,17,18,19]。しかしながら、Jimenezら（2008）による研究では、妊娠マウスに経口接種した場合、羊水と胎便からエンテロコッカス・フェシウムのDNAが検出可能であったと報告している［54］。母体の微生物叢由来のEVの移動は、これらの相反する知見を調和させるのに役立ち、生きた細菌を必要とせずに胎児環境に細菌物質が存在することの潜在的な説明を提供するかもしれない。したがって、胎児マイクロバイオームの概念に関する今後の研究では、母親の微生物叢由来のEVの役割を考慮すべきである。

ヒト胎児の免疫系の発達は妊娠初期に始まる [55] 。Mishraら（2021年）は、複数の胎児組織で細菌の存在を検出し、微生物曝露に応答する胎児の記憶T細胞の活性化を調べたことから、妊娠中の微生物曝露が胎児の免疫細胞をプライミングすることを示唆した［56］。常在菌に加えて、微生物の代謝産物も、制御性T細胞の調節を含む腸管適応免疫応答を制御することが示されている [57]。細菌EVは、病原体関連分子パターンとそれに続くtoll様受容体2およびtoll様受容体4の活性化を通じて、様々な宿主免疫応答を活性化することができる [58,59,60,61,62] 。胎児が子宮内で羊水を摂取すると、羊水からの細菌EVが腸上皮に到達する可能性が高く、これらの非複製細菌ユニットを介した早期細菌曝露の安全な経路が提供される。本研究の結果から、羊水中に存在し、胎児が摂取した可能性の高い母体の腸内細菌叢由来のEVが、出生時の早期腸内コロニー形成に必要な免疫寛容へと胎児の免疫系を導くという仮説を立てた。我々の発見は、母体の腸内細菌叢由来の細菌EVは、健康な妊娠中の胎児環境の自然な一部であるという考えを支持するものである。

本研究の主な強みは、母体の腸内細菌叢と羊水のEVを包括的に調べたことにある。さらに、羊水中の細菌EVをタンパク質とRNAの両面で評価した。2つの異なる生体分子群を分析することで、EVの分泌とその積荷をより深く理解することができる。しかし、本研究の限界も考慮しなければならない。宿主と微生物由来のEVを分離することは依然として困難であり、細菌EV濃縮を含む分離プロトコールにもかかわらず、マウスの生体内分布アッセイでは宿主と微生物由来のEVが混在していた可能性がある。さらに、16S rRNA遺伝子アンプリコン分析におけるサンプルのバイオマスの低さは、コンタミネーションのリスクをもたらすが、これはde Goffauら（2018）[63]によって記載された適正実施とコントロールのためのガイドラインを実施することによって対処した。最後に、我々の焦点は胎児環境における腸内細菌叢由来のEVの探索であったが、口腔または膣内細菌叢などの他のソースからの細菌EVの潜在的な寄与については、さらなる調査が必要である。

結論
我々の発見は、母体の腸内細菌叢によって分泌された細菌EVが、胎児発育中に子宮内腔に到達することを示している。この発見は、母体の微生物叢と胎児との相互作用のメカニズムを示唆しており、出生時の早期腸内コロニー形成のために胎児の免疫系を準備する上で重要な役割を果たしている可能性がある。

データおよび資料の入手可能性
本研究で作成・解析した16S rRNA遺伝子シーケンスデータセットは、Genbankのバイオプロジェクトリポジトリで利用可能である： PRJNA878641。

質量分析プロテオミクスデータは、PRIDE [64]パートナーリポジトリを経由してProteomeXchange Consortiumにデータセット識別子PXD045755で寄託されている。

略号
EVs：
細胞外小胞

PBS：
リン酸緩衝生理食塩水

PCR: ポリメラーゼ連鎖反応
ポリメラーゼ連鎖反応

ANCOM：
マイクロバイオーム組成解析

GO：
遺伝子オントロジー

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参考文献のダウンロード

謝辞
Biocenter Oulu Electron Microscopy Core Facility、Biocenter Oulu Sequencing CenterおよびUniversity of Ouluの科学的専門知識および研究インフラストラクチャーサービスに対して謝意を表する。

および研究インフラサービスに対して謝意を表する。

資金提供
オウル大学（オウル大学病院を含む）よりオープンアクセスの資金提供。Academy of Finland grant 328768, 299749, 243032491 (JR)、National Institutes of Health grant R01AB123456 (TT)、Pediatric Research Foundation (TT)、State Funding for University Hospitals, VTR grant (TT)。フィンランド文化財団助成金00220426（AK）、Yrjö Jahnsson財団助成金20217413（AK）。

著者情報
著者情報
Terhi TapiainenとJustus Reunanenは本研究に等しく貢献した。

著者および所属
オウル大学バイオセンター、90220、オウル、フィンランド

Anna Kaisanlahti、Jenni Turunen、Nadiya Byts、Nikke Virtanen、Mysore V. Tejesvi、Sonia Sarfraz、Sohvi Kumpula、Jenni Hekkala、Sonja Salmi、Johanna Korvala、Marko Suokas、Terhi Tapiainen & Justus Reunanen

オウル大学トランスレーショナル医学研究ユニット、90220、オウル、フィンランド

Anna Kaisanlahti、Nadiya Byts、Nikke Virtanen、Sonia Sarfraz、Sohvi Kumpula、Jenni Hekkala、Sonja Salmi、Johanna Korvala & Justus Reunanen

オウル大学臨床医学研究ユニット、90220、オウル、フィンランド

ジェンニ・トゥルネン、ニコ・パアランネ、テルヒ・タピアイネン

発生生物学研究室、疾患ネットワーク研究ユニット、オウル大学生化学・分子医学部、90220、オウル、フィンランド

アナトリー・サモイレンコ、ジュヌヴィエーヴ・バート、アルテム・ジヴォロジニ、セッポ・ヴァイニオ

オウル大学理学部生態学・遺伝学、90570、オウル、フィンランド

マイソール V. テジェスヴィ

ドイツ・キール大学シュレスヴィヒ・ホルシュタイン・キャンパス・キール大学病院放射線・神経放射線科医用画像部門、24105、キール

オルガ・ウィル、トゥーラ・ペニャテ・メディナ、オウラ・ペニャテ・メディナ

フィンランド、オウル、オウル大学病院、小児科・思春期医学科、90220

ニコ・パアランネ & テルヒ・タピアイネン

フィンランド、トゥルク、20014、トゥルク大学、コンピュータ学科

パンデ・プトゥ・エラウィジャンタリ & レオ・ラハティ

キール大学がん実験研究所、24105、キール、ドイツ

トゥーラ・ペニャテ・メディナ & オウラ・ペニャテ・メディナ

クヴァントゥム研究所、オウル大学、90570、オウル、フィンランド

セッポ・ヴァイニオ

ロンザ・ネザーランドB.V., 6167 RB, Geleen, Netherlands

オウラ・ペニャテ・メディナ

貢献
概念化： TT、JR. 方法論： AK, JT, AS, GB, MVT, AZ, JK, MS, TPM, SV, OPM, TT, JR. 実験作業： ak、jt、nv、ss、jh、ss、ow、np、ms、tpm、opm、tt。データ解析： ak、jt、nb、mvt、ppe、opm、ll。結果の解釈： ak、jt、nb、mvt、np、ppe、opm、ll、tt、jr。原稿執筆： ak、jt、nb、mvt、sk、ppe、tpm、opm、ll、tt、jr。プロジェクトの資金提供： LL、TT、JR。

責任著者
Anna Kaisanlahtiまで。

倫理申告
倫理承認と参加同意
研究プロトコルは、フィンランド、オウル大学病院の北部オストロボスニア病院地区の倫理委員会により承認された（決定番号EETTMK:3/2016）。本研究の臨床的側面は、関連するすべてのガイドラインおよび規制に従って実施され、登録された参加者全員から書面によるインフォームドコンセントを得た。動物実験は、ドイツ・キール大学の地元動物実験倫理委員会の承認を受け、施設ガイドライン（MELUR、ライセンス番号（V 242-68909/2015 [87-6/15]））に従って実施した。

論文発表の同意
該当なし。

競合利益
著者らは競合する利益はないと宣言している。

追加情報
出版社ノート
シュプリンガー・ネイチャーは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っている。

補足情報
追加ファイル1.
補足表および図。

追加ファイル2.
カイザンラハティ_AMBI_プロテオミクス。

追加ファイル3.
プロテオミクスのメタデータ。

追加ファイル4.
README_プロテオミクス。

追加ファイル5.
Proteins_swissprot。

追加ファイル6.
Proteins_trEMBL。

権利と許可
オープンアクセスこの記事は、クリエイティブ・コモンズ表示4.0国際ライセンスの下でライセンスされています。このライセンスは、原著者および出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示す限り、いかなる媒体または形式においても、使用、共有、翻案、配布、複製を許可するものです。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、その素材へのクレジット表記に別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれています。この記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれていない素材で、あなたの意図する利用が法的規制によって許可されていない場合、あるいは許可された利用を超える場合は、著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを閲覧するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。クリエイティブ・コモンズ・パブリック・ドメインの権利放棄（http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/）は、データへのクレジット表記に別段の記載がない限り、この記事で利用可能となったデータに適用されます。

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この記事の引用
Kaisanlahti, A., Turunen, J., Byts, N. et al. 母親の微生物叢は、微生物叢由来の細胞外小胞を介して胎児とコミュニケーションする。Microbiome 11, 249 (2023). https://doi.org/10.1186/s40168-023-01694-9

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受領
2022年12月19日

受理
2023年10月09日

発行
2023年11月13日

DOI
https://doi.org/10.1186/s40168-023-01694-9

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キーワード
腸内細菌叢
細胞外小胞
胎児環境
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胎児微生物叢
腸
マイクロバイオーム
ISSN: 2049-2618

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投稿に関するお問い合わせ：lyndie.manicani@springernature.com
一般的なお問い合わせ：info@biomedcentral.com
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