糞便叢の自己接種により微生物叢の密度と組成が変化し、マウス小腸の胆汁酸プロファイルが変化すること

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発行：2020年2月12日
糞便叢の自己接種により微生物叢の密度と組成が変化し、マウス小腸の胆汁酸プロファイルが変化すること

https://microbiomejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40168-020-0785-4

Self-reinoculation with fecal flora changes microbiota density and composition leading to an altered bile-acid profile in the mouse small intestine - Microbiome

サイード・R・ボガティレフ、
ジャスティン・C・ロランド &
ルステム・F・イスマギロフ
Microbiome 8巻 記事番号：19（2020） この記事を引用する
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メートル法詳細
アブストラクト
背景
上部消化管は、酵素による消化と栄養吸収、免疫サンプリング、薬物の取り込みの主要な場所として、ヒトの生理学において重要な役割を担っています。小腸のマイクロバイオームの変化は、非アルコール性脂肪肝炎や炎症性腸疾患など、さまざまなヒトの疾患に関与していることが示唆されています。しかし、ヒトの小腸内細菌叢の生理的・機能的役割は、そのサンプリングに伴う複雑さのため、まだ十分に解明されていません。齧歯類モデルはマイクロバイオーム研究に広く用いられており、消化管微生物叢の空間的、時間的、組成的、機能的な調査や、宿主の生理学や疾患表現型に対するその影響を調べることができます。古典的な培養ベースの研究では、（共食いによる）糞便微生物の自己再接種が、マウスの近位胃腸管の微生物の組成と存在量に影響を与えることが記録されています。この広範な自己再接種行動は、小腸の微生物相を調査する際に特に関連する研究因子となり得る。現代のマイクロバイオーム研究では、自己接種を考慮しないか、あるいはマウスの単体飼育や金網床での飼育などのアプローチで自己接種を排除していると仮定している。これらの仮定は、最新のツールで厳密に検証されていません。ここでは、定量的16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンス、定量的微生物機能遺伝子含有量推論、および胆汁酸のメタボローム解析を用いて、マウス上部消化管の微生物負荷、組成、および機能に対する自己接種の影響を評価しました。
結果
コプロファジックマウスにおいて、糞便叢への継続的な自己暴露は、上部消化管マイクロバイオームに実質的な量的および質的影響を及ぼした。微生物の存在量と群集組成におけるこれらの違いは、小腸の胆汁酸プールのプロファイルの変化と関連しており、重要なことに、大腸や便のサンプルを分析しても推測することができなかった。全体として、非吸収性マウスの小腸で観察されたパターン（総微生物量の減少、嫌気性微生物群の低存在、胆汁酸は主に共役型）は、ヒト小腸で通常見られるものと類似していることがわかりました。
結論
今後、マウスモデルを用いて、消化管微生物のコロニー形成と機能を、異種物質の変換や薬物動態に関連して、あるいは小腸マイクロバイオームや小腸ディスバイオシスと関連する生理状態や疾患の文脈で評価する際には、自己再接種を考慮に入れる必要がある。
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背景
小腸は、ヒトの消化器系において、酵素による消化と栄養の取り込み、免疫のサンプリング、薬物の吸収が行われる主要な部位です。小腸の表面積は大腸のそれを大きく上回るため[1]、宿主と微生物の相互作用のための広いインターフェイスとして機能する可能性があります。
ヒトの正常な生理機能や食事介入に対する反応において、小腸マイクロバイオームが重要であることを示す科学的根拠が増えつつあります [2, 3]。小腸マイクロバイオームの変化は、栄養不良 [4,5]、肥満、代謝性疾患 [6]、炎症性腸疾患（IBD）および過敏性腸症候群（IBS） [7,8,9] 、薬剤副作用 [10] など、多くのヒト疾患に関与していることが分かっています。ヒトの健康における小腸マイクロバイオームの重要性は明らかであるにもかかわらず、小腸マイクロバイオームの研究はまだ不十分であり、その特性もよく分かっていません。その主な理由は、ヒトでのサンプリングに伴う手続きや物流の複雑さ（方法があまりにも侵襲的で、専門の医療施設が必要）です。さらに、微生物の組成は、同じ動物やヒトの小腸、大腸、便の間で大きく異なる傾向があり [11, 12]、分析のために小腸をターゲットとしてサンプリングすることの重要性が強調されています。
マウスは、マイクロバイオーム研究の分野において、モデル生物として主流となっている動物種です。他の哺乳類モデルと比較して、マウスは維持費が安く、環境や食餌を容易に制御でき、遺伝子操作に従順で、すでに多数の遺伝子マウスモデルが存在し、近交系コロニーを用いた増殖により個体間変動が少ない[13]。さらに、マウスの無菌（GF）および異種混合（Gnotobiotic）技術は十分に確立されています。マウスモデルを使用することで、消化管（GIT）全体を調査し、実験条件（例：食事の変更、異種物質の投与）や微生物のコロニー形成（例：モノコロニー形成、定義された微生物コンソーシアムのコロニー形成、ヒト微生物関連マウス）に応じて起こるマイクロバイオームとホスト生理学の変化を調査することができます。
齧歯類モデルには、ヒトとの遺伝的、解剖学的、生理学的な違いに関連するいくつかのよく認識された限界もある[13, 14]。これらの限界の中には、実験室環境において、齧歯類が大腸微生物群の消化管自動接種および同種再接種（糞便の摂取、またはcoprophagyによる）を行うという持続的な傾向がある［15、16、17］。この広範な行動は、従来のマウスとGFマウスの両方[18]、標準食と強化食で維持された従来のマウス[19]、食物へのアクセスがある動物とない動物[20]、および異なるマウス系統[16, 21]で観察技術を用いた古典研究で証明されています。
複数の古典的な研究が、伝統的な微生物学的手法を用いて、自己接種がネズミの小腸[22,23,24]、大腸および便[20,23,25,26]の微生物叢の構造に及ぼす影響を評価しようと試みたが、相反する結果を報告している[23, 25, 26]. このようなコンセンサスの欠如は、共食いを防止するための異なる方法（中には効果がないものもある）の使用、標準化されていない飼料、動物モデル間の株間または種間の違い、あるいはその他の説明できない実験パラメータに起因すると考えられる。また、マウスで共食いによる自己暴露を繰り返すと、シュードモナス属などの「外因性」微生物種によるGITのコロニー化が促進されることが示唆されている[27]。これらの観察結果はすべて、マウスモデルにおける消化管微生物生態の研究において、自己再接種を考慮することの重要性を強調しています。しかし、この分野では現在、自己再接種が腸内細菌叢の空間的、構造的、機能的状態やマウス宿主生理に及ぼす影響について、正確かつ包括的に評価することができないでいる。げっ歯類を対象とした現在のマイクロバイオーム研究では、自己再接種を考慮に入れていないか、動物を単独飼育するか金網床（「ワイヤースクリーン」または「ワイヤーグリッド」とも呼ばれる）に収容することで排除できるとしている [14]. これらの仮定が誤りであることを示唆する古典的な文献[16, 21, 28, 29, 30, 31, 32]があるにもかかわらず、最新の定量的ツールを用いて、最新の施設に収容したマウスで検証されたことはない。
ここでは、消化管マイクロバイオーム研究に関連する以下の3つの疑問に答えるため、マウスの自己接種に関するこれらの仮定を明示的に検証する：（1）定量的な16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンスツールは、共食いであることがわかっているマウスと共食いでないマウスとの間の小腸微生物負荷の差を検出するか？(2)共食性は小腸の微生物組成に影響を与えるか？(3)マウスの自己接種に伴う微生物叢の密度や組成の違いは、小腸の微生物機能（例：微生物代謝産物産生や修飾の変化）に影響を与えるか？
これらの疑問に答えるため、共食いを防ぐことが知られている条件下（「尻尾」または「糞便採取」カップによる装着[16, 23, 26, 30, 33]）およびマウスが共食いをすることが知られている典型的な実験条件（標準ケージに収容）においてマウスの胃腸サンプルを分析した。また、標準ケージおよびワイヤーフロアケージに収容された単体飼育のマウスからのサンプルも対象とした。自己接種に伴うマウスGITの全長に沿ったマイクロバイオームの量的および組成的変化を解析し、微生物機能の変化を計算で推測し、腸の対応するセグメントにおける微生物機能関連代謝物プロファイルを評価しました。
研究成果
まず、マウスの共食いを防止することで、小腸における生菌数の減少や微生物相組成の変化が起こることを確認するために、パイロット試験を実施しました。嫌気性BHI-Sブロス培地を用いた最確数（MPN）アッセイを用い、共食いであることが分かっているマウス（標準ケージで飼育、N = 5）と共食いでないことが分かっているマウス（尾錠を装着して標準ケージで飼育、N = 5）のGIT全体における生菌（培養可能）微生物負荷を評価しました。公表されている古典的文献[20, 24]と一致して、コプロファジックマウスは、非コプロファジックであるマウスよりも上部GITにおける培養可能な微生物の負荷が著しく高いことがわかりました（追加ファイル1：図S4A）。さらに、16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンス（各群からN = 1匹を解析）および得られた相対存在量データの主成分分析（PCA）によって明らかになったように、コプロファジックマウスのGIT近傍、特に胃の微生物群集組成は大腸の微生物組成により近い（追加ファイル 1: 図S4B）。
このパイロットスタディにより、テールカップはマウスの上部消化管における生存糞便叢の自己再接種を防ぐのに有効であることが確認されました。この結果を受けて、私たちは、定量的な16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンス（微生物総量の変化と培養不可能な分類群の変化の両方を考慮する）、定量的な機能遺伝子含有量の推定、標的胆汁酸メタボロミクス分析という最先端の手法を用いて、上記の3つの問いに答えるための厳格かつ詳細な研究（図1）を計画しました。
図1
a 2つの年齢コホート（4ヶ月齢と8ヶ月齢）のマウスを2-6ヶ月間同居させて飼育した（1ケージに4匹のマウス）。各ケージから1匹ずつ、4つの実験条件（機能的テールカップ（TC-F）、模擬テールカップ（TC-M）、ワイヤーフロアでの飼育（WF）、標準条件での飼育（CTRL）のいずれかに割り当てられた。すべてのマウスを単独で飼育し、各処理で12～20日間維持した（N = 24、1群6匹）。 b 試料は消化管内の6箇所から採取した。各サンプルは、内腔内容物（CNT）および粘膜（MUC）の定量的16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンシングおよび/またはCNTの定量的胆汁酸分析によって分析された。パネルbは[13, 34]から引用した)
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研究デザイン（図1）は、4匹ずつ6つのケージで2～6ヶ月間共同飼育した後、4つの実験群に分け、12～20日間単独飼育するものであった。実験条件は、機能性テールカップを装着し標準ケージに単独収容した動物（TC-F）、模擬テールカップを装着し標準ケージに単独収容した動物（TC-M）、ワイヤーフロアに単独収容した動物（WF）、標準状態に単独収容した対照動物（CTRL）の4つである。試験終了後、各動物のGITの全セグメントから胃腸内容物および粘膜サンプルを採取し、総微生物負荷（GIT全体）およびマイクロバイオーム組成（胃（STM）、空腸（SI2）、盲腸（CEC））を評価しました。
定量的な16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンスに大腸の盲腸区間を選んだのは、この区間の内容物を分析することで、環境要因に応じた大腸と糞便の微生物多様性の完全なスナップショットが得られるからです［35,36,37］。また、セカール内容物は、すべての実験条件において、すべての動物からより一貫した量のサンプルを収集することを可能にしました（一方、排便は、終末サンプリング時に動物間で一貫性がない場合があります）。
自己再接種は上部腸の微生物負荷を増加させる
最初の疑問（定量的シーケンスツールは、共食いであることが知られているマウスと共食いでないマウスの上部GITにおける16S rRNA遺伝子DNAコピー負荷の違いを検出できるか）に答えるため、16S rRNA遺伝子DNA定量PCR（qPCR）およびデジタルPCR（dPCR）を用いてGIT全体の定量化できる微生物負荷量を分析しました。機能的なテールカップを装着したマウスで自己接種を防ぐと、上部GITの内腔の微生物負荷は劇的に減少したが、下部GITでは減少しなかった（図2a）。上部GITの定量可能な微生物負荷の総量は、機能的なテールカップを装着したマウスでのみ減少した。糞便へのアクセスを維持し、自己接種を実践した単独飼育の他のすべての実験グループ（模擬テールカップを装備したもの、ワイヤーフロアに収容したもの、標準ウッドチップ敷料に収容したもの）は、発表された文献から予想されるように、上部GITの微生物負荷が同様に高かった［16、21、28、29、30、31、32］。
図2
機能的テールカップ（TC-F）、模擬テールカップ（TC-M）、ワイヤーフロア（WF）、標準条件（CTRL）の4つの実験条件におけるマウスの胃腸管（GIT）の内腔内容物と粘膜の微生物負荷量を定量化した。a 総微生物負荷の代理である総16S rRNA遺伝子DNAコピー量を、全グループのマウスのGITに沿って測定した（STM＝胃、SI1＝小腸（SI）の上3分の1、SI2＝SIの中3分の1、SI3＝SIの下3分の1はそれぞれ十二指腸、空腸、回腸にほぼ対応、CEC＝盲腸、COL＝結腸）。多重比較はKruskal-Wallis検定で行い、次にWilcoxon-Mann-Whitney検定で偽発見率（FDR）補正を行い、一対比較を行った。個々のデータ点を箱ひげ図に重ね合わせ、ひげは四分位数（Q2およびQ3）から1.5×四分位範囲（IQR）内の最後のデータ点まで伸びる。 b SI中部の内腔内容物の微生物負荷（総内容物1gあたり）と粘膜の微生物負荷（粘膜DNA100ngあたり）の相関関係。N＝6マウス／実験群
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すべての試験群において、小腸中部の粘膜微生物負荷は、内腔内容物の微生物負荷と高い相関（PearsonのR = 0.84, P = 2.8 × 10- 7）を示した（図2b）。
TC-Fマウスの1匹（6匹中）の胃（STM）および小腸（SI1、SI2、SI3）サンプルは、他のTC-Fマウスと比較して高い微生物負荷量を示していた。このTC-Fマウスの上部消化管における総微生物負荷量は、他のすべてのグループ（TC-M、WF、CTRL）のマウスと同程度であり、微生物負荷量と組成（後述）の両方を同じサンプルで分析することの重要性が強調されました。
自己再接種は上部腸の微生物叢組成を大きく変化させるが、大腸ではあまり顕著な効果はない
第二の疑問（糞便微生物群の自己接種が上部消化管微生物組成に影響を与えるか）に答えるため、胃（STM）、空腸（SI2）、盲腸（CEC）サンプルについて定量16S rRNA遺伝子アンプリコン配列決定［38、39］（Barlow JT, Bogatyrev SR, Ismagilov RF: A quantitative sequencing framework for absolute abundance measurements of mucosal and lumenal microcommunities, submitted）を実施しました。定性的な配列決定により、自己再接種による上部GIT微生物相の劇的な全体的変化が明らかになりました（図3）。多次元的な微生物の絶対量プロファイルに対して行われた探索的PCAにより、非吸収性マウスの上部GITマイクロバイオームのユニークで明確な構成が明らかになりました（図3a）。すべてのコプロファジックマウスの胃（STM）と小腸（SI2）のマイクロバイオームが大腸のマイクロバイオームに近い位置に集まっていることは注目に値するが、この類似性は大腸のマイクロバイオームを持続的に自己接種しているためであることを示唆している（図3a）。
図3
胃、中小腸、盲腸の16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンスによる腸内細菌叢の組成および定量的解析 a 胃、中小腸、盲腸の微生物の絶対量プロファイルを対数10変換および標準化（平均＝0、SD＝1）した主成分分析（PCA）。各主成分について、寄与度の高い分類群の負荷量を示す。 b すべての実験条件について、中腸の微生物群の平均相対量および絶対量プロファイル（オーダーレベル）を示す。機能的テールカップ（TC-F）、模擬テールカップ（TC-M）、ワイヤーフロアに収容（WF）、標準条件に収容したコントロール（CTRL）。N = 6マウス/実験グループ、うち4匹をシーケンスに使用。 c マウスGITに沿って、共食いマウスと非共食いマウスで比較した微生物分類群の絶対量（オーダーレベル）。葉緑体およびリケッチア（ミトコンドリア）は、植物由来の食品成分からの16S rRNA遺伝子DNAアンプリコンを表す。多重比較は、Kruskal-Wallis検定を用いて行った
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自己再接種は、微生物分類ごとに異なる効果をもたらし（図3c）、その変化パターンにより、以下の3つに大別されることがわかった：
1.
1.哺乳類以外のマウスの上部消化管において、定量的配列決定法［38］（Barlow JT, Bogatyrev SR, Ismagilov RF: A quantitative sequencing framework for absolute abundance measurements of mucosal and lumenal microbial communities, submitted）の検出下限［LLOD］以下に低下または消滅（Clostridiales、Bacteroidales、Erysipelotrichalesなど）した「糞便分類群」（以下、「糞便類」という）；
2.
非吸収性マウスの上部GITで比較的安定した状態を保っていた「真の小腸分類群」（例：Lactobacillales）；
3.
3.非好食性マウス（好食性マウスと比較）の盲腸で絶対量が少なかった分類群（Bacteroidales、Erysipelotrichales、Betaproteobacterialesなど）。
全体として、共食いマウスの小腸微生物叢の組成は、文献で以前に報告されたものと一致していた[35]。非コプロファジックマウスの上部GIT微生物相は、ヒトの小腸微生物相で顕著な微生物分類群として知られる乳酸菌（図3c）で占められていた［3、40、41］。重要なことは、胃と小腸に高い微生物負荷があった単一のTC-Fマウスは、GITのこれらのセグメントの微生物組成が、他のすべてのTC-Fマウスと同様（すなわち、Lactobacillalesが優勢）であり、すべてのコプロファジー・マウスとは非常に異なることが、組成分析によって示された（図3B、C）。PCAでは、このマウスの胃と中小腸は、他のすべてのTC-Fマウスの胃と中小腸とクラスターを形成していた（図3a）。
小腸の微生物相の変化は、推定される微生物機能遺伝子量の違いにつながる
自己再接種によって誘発される小腸の微生物叢の量的・質的変化は、微生物叢の機能的変化の結果として間接的に、あるいは糞便代謝物の再摂取を介して直接的に、微生物機能の変化 [42, 43] と代謝物プロファイルの変化をもたらすと仮定した。このような微生物叢の変化が小腸の微生物機能にどのような影響を与えるかを理解するために、次に機能的な微生物遺伝子の絶対量がどのような影響を受けるかを予測することを目的としました。私たちは、16S rRNAマーカー遺伝子配列に基づく微生物機能推論パイプライン（PICRUSt2）[44, 45]と私たちの定量的16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンス手法[38]（Barlow JT, Bogatyrev SR, Ismagilov RF: A quantitative sequencing framework for absolute abundance measurements of mucosal and lumenal microbial communities、投稿）を結合させました。我々は、小腸の生理機能に大きく関連すると思われる微生物機能、すなわち宿主由来の胆汁酸の微生物変換とゼノバイオティクスの微生物修飾に焦点を当てて解析を行いました。
その結果、共役胆汁酸の酵素的加水分解（胆汁酸ヒドロラーゼ、BSH [46,47,48] ）や有害物質の共役体（例、 β-グルクロニダーゼ、アリルスルファターゼ [49, 50]）は、コプロファージマウスの胃と小腸で、非コプロファージマウスに比べて劇的に高く（場合によっては数桁高く）なった（図4）。盲腸ではこの差は見られなかった。
図4
コプロファジックマウスと非コプロファジックマウスのGITに沿った胆汁酸およびゼノバイオティクス結合体の修飾に関与する微生物遺伝子の推論を行った。GIT（STM胃、SI2小腸の中1/3が空腸にほぼ対応、CEC盲腸）全体の（a）胆汁酸ハイドロラーゼ（cholylglycine hydrolase）、（b）β-グルクロニダーゼ、（c）アリルスルファターゼをコードする微生物遺伝子の絶対量の推論値。各酵素の括弧内にはKEGGオーソロジー番号を記載した。すべてのプロットにおいて、個々のデータポイントは箱ひげ図に重ね合わされ、ひげは四分位数（Q2およびQ3）から1.5×四分位範囲（IQR）内の最後のデータポイントまで伸びる。多重比較はKruskal-Wallis検定で行い、一対の比較はWilcoxon-Mann-Whitney検定とFDR補正で行った。N = 4マウス/グループ
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自己再接種による小腸内細菌叢の変化で胆汁酸プロファイルが変化する
胆汁酸は、宿主とその腸内細菌叢に対して複数の重要な生理的機能と効果を持つ宿主由来の化合物の顕著なクラスである [51, 52]。これらの宿主由来分子は、小腸および大腸の両方において、微生物による修飾に非常に従順である[53]。GITにおける主な微生物による胆汁酸修飾には、脱共役化、脱水素化、脱水素化、エピマー化などがある[52]。そこで次に、自己接種が胆汁酸組成に及ぼす影響を評価するために、GIT全体に沿った定量的な胆汁酸プロファイリングを実施した。
小腸は、胆汁酸が最も多く含まれ（最大10mM）、脂質の乳化と吸収に機能するGITのセグメントである[54,55,56]。このような高濃度の胆汁酸基質を考慮し、我々は特に、小腸の微生物相（図2および図3）において、共食いマウスと非共食いマウスで観察された違いが、微生物による胆汁酸の脱共役に顕著な効果をもたらすかどうかを分析したいと考えた。また、胆汁酸の脱共役化における違いが、微生物の絶対量（図3c）から推測されるBSH遺伝子量の絶対量の違い（図4a）と一致するかどうかを検証したいと考えた。
まず、4つの実験グループすべてにおいて、GITのすべてのセクションにおける総胆汁酸レベル（共役および非共役、第一および第二）が、小腸で最も高いことを確認した（図5a）。次に、共役および非共役（図5b）、ならびに一次（宿主合成）および二次（微生物修飾）胆汁酸のレベルを、共食性マウスと非共食性マウスで比較しました（Additional file 1: Figure S5）。
図5
GIT全体における胆嚢胆汁および内腔内容物中の胆汁酸プロファイル。a 胆嚢胆汁中および消化管全体（STM胃；SI1小腸（SI）上3分の1、SI2SI中3分の1、SI3下3分の1はそれぞれ十二指腸、空腸、回腸にほぼ対応；CEC盲腸；COL結腸）における総胆汁酸量（共役および非共役；一次および二次）およびb 非共役胆汁酸の割合。すべてのプロットにおいて、個々のデータポイントは箱ひげ図に重ねられ、ひげは四分位数（Q2およびQ3）から1.5×四分位範囲（IQR）内の最後のデータポイントまで伸びる。多重比較はKruskal-Wallis検定で行い、一対比較はWilcoxon-Mann-Whitney検定（FDR補正付き）を用いて行った。N = 6マウス/グループ
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小腸の全セクションおよび胆汁中で、非コプロファージックマウス（TC-F）はコプロファージックマウスと比較して、非抱合胆汁酸のレベルが有意に低い（図5b）。図4aの計算による推論（mid-SIサンプルでのみ実施）と一致して、非コプロファージックマウス（TC-F）の小腸の3つのセクションすべてで、非抱合胆汁酸のレベルはコプロファージックマウスに比べて大幅に低かった。非コプロファージックマウスの小腸では、全胆汁酸プールのほぼ100％が抱合型として残存していた。
共食いマウスの全グループ（TC-M、WF、CTRL）において、非共役胆汁酸の割合は小腸の近位端から遠位端にかけて徐々に増加した。胆嚢胆汁酸プロファイリング（図5b）により、すべての共食いマウスにおいて、胆汁酸は主に共役の形で十二指腸に分泌されることが確認された。このパターンは、微生物負荷の高い小腸を通過するにつれて、微生物の脱共役活性にさらされる胆汁酸が増加するという仮説と一致する（図2a）[54]。
大腸では、非コプロファジー（TC-F）マウスは、すべてのコプロファジー実験グループと比較して、非共役胆汁酸の割合が少なかった（図5b）。
共食症マウスの小腸における胆汁酸の脱共役は、本研究で測定したすべての一次および二次胆汁酸のグリコおよびタウロ共役について均一であり（追加ファイル1：表S7）、これらの動物の小腸では、広特性のBSH活性が複雑な糞便叢によってもたらされたことを示唆していた。
胆嚢胆汁中および胃から盲腸までのGITのすべてのセグメントにわたって、非コプロファジックマウスは、コプロファジックマウスよりも二次胆汁酸（共役および非共役）全体の割合が統計的に有意に低い（ただし、絶対レベルは低くない）（追加ファイル1：図S5）。この変化は、解析したものの二次胆汁酸プール全体について一様であった（Additional file 1: Table S7）。二次胆汁酸の画分の差が共食いマウスと非共食いマウスの間で統計的に有意でなかった腸のセグメントは、結腸だけであった。実際、共食いマウスと非共食いマウスの非共役胆汁酸の割合の差は、大腸の内容物や便の分析だけではほとんど検出されなかったと思われる。これらの結果は、消化管内の微生物叢と胆汁酸の間の複雑なクロストークを包括的に空間的に調べることの重要性をさらに強調するものである。
考察
本研究では、定量的な微生物叢のプロファイリングに最新のツールを用い、糞便叢の自己接種が妨げられると、マウス小腸の微生物叢の密度が劇的に低下し、微生物プロファイルが変化することを明らかにした。発表された文献[16, 21, 28, 29, 30, 31, 32]と同様に、金網床での単独飼育ではマウスの共食いを防ぐことができず、機能的なテールカップのみが糞便叢の自己接種を確実に防ぐことが確認された。
テールカップアプローチは、その有効性にもかかわらず、限界がある。テールカップの現在のデザインは、解剖学的な違いにより、尿が装置内に入ったり残ったりするため、雌のげっ歯類には適さない可能性があります[57]。動物が互いのテールカップを齧り、装置の故障や傷害を引き起こすのを防ぐために、動物を単独で収容する必要がある。テールカップアプローチは、若くて成長が活発なマウス（例えば、離乳前や離乳前後）には実施しにくいかもしれません。また、後肢のテールカップが体に接触する部分に、グルーミングのしすぎで皮膚病が発生するマウスがいた。したがって、現在の実施方法でのアプローチは、成体動物では2～3週間に限定されると結論付けた。
私たちの装置の設計は、以前の研究[33]で説明された尾の損傷と壊死のリスクを減らし、ハンドリングストレスを軽減するために24時間に1回だけカップを空にすることができます。宿主のストレスは微生物叢[58]や他の生理学的パラメータに影響を与える可能性があるため、模擬テールカップ群も用意しました。TC-FおよびTC-Mマウスは、WFおよびCTRLマウスと比較して、4群すべてで食物摂取率が同等であるにもかかわらず、同程度の体重減少（Additional file 1: Figure S3A）を示した（Additional file 1: Figure S3B）。模擬テールカップを装着したマウス（TC-M）は、CTRLマウスと同様の微生物パターンおよび胆汁酸プロファイルを有していたため、非嗜好性マウス（TC-F）で観察した上部GIT微生物叢および胆汁酸プロファイルへの影響は、ストレスに起因しないことがわかりました。
テールカップアプローチは、gnotobiotic環境（フレキシブルフィルムアイソレーターや個別換気ケージなど）で実施可能であり、マウスと定義された微生物群やヒト由来の微生物群との関連付けを含む研究を支援できると考えています。
非腐食性マウスモデルは、よりヒトに近いかもしれない
本研究では、定量的な微生物相プロファイリングを用いて、自己再接種を阻止することで、従来のマウスの上部消化管微生物相における偏性嫌気性菌のいくつかの著名な分類群（Clostridiales、Bacteroidales、Erysipelotrichaleなど）の総レベルが劇的に低下することが示された。このように分類群に違いはあるものの、胃ではなく小腸と盲腸の乳酸菌レベルは、共食い動物と非共食い動物で同程度に保たれていた（図3c）。胃や小腸などの上部消化管に乳酸菌が持続的に生息していること、および消化管全体に乳酸菌が一貫して存在していることの宿主にとっての生理的意義 [14, 59] は十分に解明されていない。しかし、胃や小腸における乳酸菌のコロニー形成は、病原体によるコロニー形成に対する抵抗性を促進することが示されている（[60、61]に総説あり）。
従来のマウス（coprophagic）と比較して、非coprophagicマウスは、小腸の微生物叢と胆汁酸プロファイルにおいて、ヒトの小腸で見られるパターンに近い特徴を示した：桁外れに低い微生物叢密度、偏性嫌気性細菌叢の存在量の減少とLactobacillalesの優勢、高い抱合胆汁酸の比。これらの知見は、ヒトの健康における宿主と微生物叢の相互作用に関連する質問に答えるために使用されるマウスモデルにおいて、自己再接種を理解し制御する必要性を強調しています。
マウスGITにおける自己再接種と微生物生態学
本研究の約2週間の期間中、マウス大腸マイクロバイオームの分類学的多様性は、持続的な微生物の自己接種がない場合でも安定していることが観察された。
非共食性マウスの大腸におけるいくつかの分類群（Bacterodales、Erysipelotrichales、Betaproteobacteriales）の絶対量の傾向的変化は、自己再接種がなくなった結果、あるいは小腸から盲腸に入る胆汁酸のプロファイルの変化、あるいは他の生化学環境の未検出の変化の結果と思われます。さらに、ある種の分類群の絶対量の変化は、代謝的に結合している他の分類群の絶対量の変化につながるかもしれない。胆汁酸の脱共役の程度が微生物叢のプロファイルを変化させる可能性があることが以前示唆されている [46] 。マウスの回腸および盲腸のErysipelotrichales（Turicibacter属を含む）は、非共役回腸および盲腸［62］および血漿［63］胆汁酸と正の相関を示すことが示されている。盲腸のBacteroidales（Muribaculum spp.を含む）は、非共役コール酸およびチェノデオキシコール酸を食事で補給すると増加し[64]、βproteobacteriales（Parasutterella spp.を含む）はマウスの非共役第一および第二胆汁酸に正の相関があった[65、66]。したがって，非吸収性マウスの大腸における非共役胆汁酸の割合の減少（図5b）は，非吸収性マウスの盲腸におけるこれら3分類群の絶対量の減少に関与していると考えられる．胆汁酸プロファイルと微生物叢組成の相関は、相対存在量データに基づいて記述されており、相対存在量データが持つ固有の組成性を考慮することなく、相関分析に不正確さをもたらすことが知られている[67]ことは注目に値する[64, 68]。本研究では、相関解析を改善するために、分類群の絶対量を報告しており、このことが、本研究で観察された相関と既報の相関との間に不一致をもたらす可能性があります。
継続的な種の再導入の有無にかかわらず、摂動に応じた複雑なマイクロバイオームの安定性は、微生物生態学の重要な研究課題である [69, 70]。糞便摂取をなくすことで、現代人により近い方法でマウスの腸内細菌叢の安定性と回復（例えば、食餌変化や抗生物質曝露に応じたもの[71]）を研究する方法が得られる。このように、非腐食性マウスモデルは、このような研究に大きく貢献することができます。
糞便叢の自己接種により、GITの胆汁酸プロフィールが変化する
我々は、小腸の微生物叢の密度と組成の変化が微生物機能に顕著な影響を及ぼし、その結果、小腸の胆汁酸脱離が増加することを証明した。胆汁酸の脱共役は微生物叢を介したプロセスであり、健康なヒトでは従来、遠位小腸（回腸）と大腸で行われると考えられており[72]、消化物が回腸に達するまでに小腸で脂質の乳化（共役胆汁酸による）および吸収が十分に行われるようになる[73]。小腸の胆汁酸濃度は大腸に比べてはるかに高いため、小腸での胆汁酸の脱共役化が変化すると、腸肝系全体に対してより広範な影響を及ぼす可能性がある。このことは、動物モデルや小腸細菌過剰増殖（SIBO）のヒトにおけるこれまでの知見と一致している[74,75,76,77,78]。
驚くべきことに、本研究における非吸収性マウスの小腸における胆汁酸の脱共役化の程度は、無菌動物 [79,80,81]、胆汁酸を脱共役化できない微生物のみをコロニー形成した無菌動物 [82,83,84,85] および抗生物質処理動物 [86,87,88] に見られるプロファイルと似ている。このことから、小腸の微生物叢の密度や組成と、小腸における胆汁酸の修飾との間に、メカニズム的な関連があることが示唆された。健康なヒトの小腸には、主に共役型の胆汁酸が存在すると考えられており[89]、（共食性マウスと比較して）非共食性マウスの小腸が健康なヒトの小腸により近いことがさらに立証された。
共食いマウスと非共食いマウスの大腸における微生物叢の密度および組成はほぼ同様であったが、非共食いマウスでは、大腸で共役型に留まる胆汁酸の割合が高く（図4b）、これは、回腸から大腸に入る胆汁酸が共役型であることが多い結果と考えられる。さらに、すべての研究グループにおいて、小腸の胆汁酸の総濃度は、大腸の10倍程度であった。つまり、共食いマウスでは、糞便叢で汚染された小腸が胆汁酸の脱共役の主要な場所であったと推測されます。
腸における胆汁酸脱共役活性の制御は、血中コレステロール値の低下など、多くの文脈で健康増進の可能性があると考えられています（[90,91,92]で総説）。BSH活性プロバイオティクスは、腸内の胆汁酸脱共役の増加を促進するための有望な送達手段となり得る。私たちの研究は、BSH活性を持つ微生物株やプロバイオティクス [48, 93, 94, 95, 96, 97, 98] （特に特定の胆汁酸結合体に対して高い選択性を持つもの [47, 82, 85] ）の効果を研究するためにマウスを使用する際に自己再接種の制御の重要性を強調しています。なぜなら従来の（ coprophagic ）マウスではすでにその小腸で顕著なBSH活性を持っています。このような研究においては、非コプロファジックマウスがより良い動物モデルとなる可能性があります。
また、今回の発見は、従来の（coprophagic）マウスを使った食事療法研究にも示唆を与えている。脱共役胆汁酸は共役胆汁酸に比べ、脂質の乳化や脂肪ミセル形成の効果が低い [74, 99]. 動物やヒトの小腸で胆汁酸の脱共役化が進むと、脂質の吸収不良や脂溶性ビタミンの欠乏につながり、極端な場合にはステアトルレアにさえなる[77、100]。これまでの研究で、小腸の微生物叢が高脂肪食の宿主への影響を媒介する上で重要な役割を果たすことが示されています [101]; 今回の結果は、高脂肪食の微生物叢を介した影響に関する今後の研究が、糞便叢の自己接種によるマウス腸内の微生物の胆汁酸脱離増加を考慮する必要があると示唆しています。
胆汁酸脱共役は、二次的な胆汁酸代謝（大腸で主に起こると考えられている[72]）が行われる前に、義務的に行われると考えられている [84, 102, 103]. これらの反応は、多くの場合、微生物叢の異なるメンバーによって行われる。したがって、非吸収性マウスの小腸における脱共役活性が低下し、その結果、微生物がさらに修飾するための遊離一次胆汁酸の利用可能性が低下したことは、本研究における非吸収性マウスのGITおよび胆嚢胆汁全体の胆汁酸プールにおける二次胆汁酸分率（全胆汁酸の割合）が減少したことを説明できる。同様の、しかしより顕著な傾向がウサギで観察されている[104]。共食いをなくした結果、経口摂取量と糞便中の二次胆汁酸のリサイクルが減少したことも、これらの動物の腸肝循環における総胆汁酸プール中の二次胆汁酸の割合が低くなる一因であると考えられる。
胃内の総胆汁酸レベルは、共食いマウスと非共食いマウスで同様であった（文献[104, 105]と一致）；しかし、胆汁酸プロファイル（総非共役胆汁酸および総二次胆汁酸の割合を含む）は、大幅に異なっていた。驚くべきことに、すべての共食いマウスにおいて、胃の非共役胆汁酸の割合は、小腸と大腸のプロファイルの中間であるように見えた（図5b）。これは、共食いマウスの胃の胆汁酸が、糞で再摂取された胆汁酸と十二指腸から逆流した胆汁酸から蓄積されている可能性を示唆する。このパターンは非共食性マウスでは観察されなかったことから、共食性マウスは上部消化管内の胆汁酸プロファイルを直接（糞便中の代謝物の再摂取を介して）、間接（微生物叢機能の変化を介して）変化させている可能性が示唆された。
胆汁酸および薬物修飾における微生物機能の推論
定量的な機能遺伝子推論を行った結果、BSHオルソログの絶対量が、共食いマウスと非共食いマウスの小腸で異なることが予測された（図4a）。このアプローチには、遺伝子アノテーションが不完全であること、16S rRNA遺伝子配列が類似した微生物株が複数存在する場合にマーカー遺伝子配列からメタゲノムを推定する能力に限界があること [44, 45] 、遺伝子発現や酵素活性、特異性を正確に予測することが困難であることなどが挙げられます。BSHに関する我々の予測を検証するために、我々はマウス胃腸サンプルの標的胆汁酸メタボローム解析を採用し、小腸胆汁酸脱共役の違いを観察しました（図5b）。これは、これら2種類の動物の小腸における推定BSH遺伝子量の違い（図4a）と一致するものでした。興味深いことに、共食症マウスと非共食症マウスの盲腸における推定BSH遺伝子量が同程度であるにもかかわらず、非共食症マウスの盲腸および結腸における非共役胆汁酸の割合は、共食症マウスと比較して統計的に有意に低かった（図5B）。
多くの既知のBSHアイソフォームのMichaelis-Menten定数（Km）は数百ナノモルの範囲にあり [72]、本研究のすべてのグループのマウスの小腸で観察された胆汁酸のレベルと同様であった（図5a）。盲腸と結腸の総胆汁酸レベルは小腸のそれよりも10倍ほど低く、したがってBSHのKmよりも10倍ほど低い（図5a）。非コプロファジックマウスの小腸から盲腸に到達した胆汁酸は主に共役型であり、その絶対濃度（BSH Kmの10倍以下）は、通常の胃腸通過の時間スケールで、これらの動物の大腸における胆汁酸脱共役の程度が低い（コプロファジックマウスと比較）ことを説明できるかもしれない。
このことから、機能推論（分類学またはin silicoの隠れ状態予測[44, 45, 106, 107]のいずれかに基づく）を、変動する生化学的環境（例えば、基質の利用可能性）および宿主消化管生理（分泌、消化管通過、吸収および輸送など）の文脈で考えることの重要性が明らかになり、機能検証（例えば、メタボロミクス）の保証が得られた。さらに、16S rRNA遺伝子配列数（次世代シーケンサーによる）と16S rRNA遺伝子配列絶対量（本研究）に基づく機能推論の妥当性についても、今後の研究においてさらに検討する必要がある。
次に、小腸における微生物相に依存した薬物修飾や毒性がげっ歯類でこれまでに観察されていることから[109,110,111,112,113,114,115,116,117,118,119]、自己再接種がゼノバイオティクス修飾に関与する微生物遺伝子オルソログの絶対存在量に与える影響についても検討した。ヒトおよびマウスに経腸および非経口投与された多くの薬物は、全身循環に達した後、肝臓で抱合体（グルクロン酸、硫酸、グルタチオン抱合体など）に変換され、胆汁とともにGIT内腔に排泄される。このような変換により、ゼノバイオティクスの小腸での再吸収が減少し、便とともに体外への排泄が促進されると考えられています。小腸微生物叢の変化はまた、微生物酵素によるそのような結合体の加水分解を増加させ、薬物の局所毒性を促進し、小腸からの再取り込み（すなわち、腸肝循環を経る）を可能にし [10, 116] 、結果として肝臓を経由するxenobioticフラックス [120, 121] を増加させ、薬物薬物動態の微生物叢依存性の総合変化をもたらすかもしれません。
推定されたBSHの絶対量の違い（胆汁酸脱共役測定で確認した活性との相関）と同様に、我々の解析では、共食いマウスと非共食いマウスの小腸の間で、薬物結合体の加水分解を担う微生物遺伝子オルソログ（例：β-グルクロニダーゼ、サルホヒドロラーゼ）の絶対量（図4b、c）に違いがあると予測した。この予想がさらに実験的に確認されれば、マウスを用いた薬物薬理学の研究において、自己再接種を制御または考慮する必要があることを示唆することになる。
プロバイオティクス研究における自己再接種との関連性
プロバイオティクスとその宿主動物の生理学への影響に関する多くの研究は、生きたプロバイオティクス微生物をネズミに繰り返し経口投与することに依存している。本研究は、実験用マウスに生きた糞便叢を自己接種することで、生きたプロバイオティクスを投与するレジメンに支障をきたし、矛盾をもたらす可能性があることを示唆している。先に述べたように、胆汁酸の脱共役および代謝を標的としたプロバイオティクスおよびその他の治療法 [48, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98] の健康効果を評価しようとする研究では、自己接種と小腸の胆汁酸プロファイルに対するその影響に特に注意を払う必要がある。
ヒト微生物叢研究におけるマウスモデルの妥当性
ヒトの微生物叢研究におけるマウスモデルの役割は、依然として議論の対象となっている[13, 14, 122]。同時に、この分野では、マウスモデルを使用する腸内細菌叢研究における再現性の重要性が認識されつつある [58, 122]。最近のいくつかの研究では、動物の系統や由来に関連した実験用マウスの微生物叢のばらつきが強調されている [36, 123,124,125,126,127]. また、実験用マウスおよび野生マウスにおける「正常」または「コア」な腸内細菌[128,129]、その空間構成[35,36]、機能[130]のカタログ化を試みたものもある。最近では、小腸マイクロバイオームが宿主の生理 [101] や疾患 [4, 131] との関連でマウスで行われる研究の焦点となっている。しかし、自己再接種が腸内細菌叢の空間構造と機能に与える影響や、マウスモデルにおいてこの実験パラメータを制御する（あるいは制御しない）ことで研究結果にどのような影響が出るかについては、これまでほとんど注目されていませんでした。
げっ歯類への自己再接種は、本来の微生物叢だけでなく、個々の微生物コロニー形成者 [24] （gnotobiotic動物など）や複雑な異種微生物叢（human microbiota-associated （HMA）マウスなど）にも影響を与える可能性があります。HMAマウスは、その限界を認めながらも、健康や病気における腸内細菌叢と宿主の表現型との間のメカニズム的なつながりを解明するための重要な研究モデルとして浮上してきた [132, 133] 。霊長類やヒトの小腸と大腸のマイクロバイオーム間の組成の違い [12, 40, 41] は、実験用マウスで報告されたもの [35, 130] よりも実質的であるようです。我々の研究は、従来の実験用マウスにおける小腸と大腸の微生物叢の組成的類似性が、糞便叢の自己再接種の結果である可能性を強調している。したがって、HMAマウスにおけるヒトの微生物叢の空間的な構成と機能に対する自己再接種の効果は、将来的に調査する必要がある。
結論
結論として、本研究は、哺乳類の消化器系における微生物生態と機能の文脈における自己再接種の重要性を、最新のツールを用いて実証した。本研究は、小腸の微生物相とその機能を解析するマウス研究において、ヒトの生理学や病態生理学との類似性を示すために、自己再接種を認識し、適切にコントロールすることの重要性を強調するものである。さらに、大腸や便のサンプルだけを解析した場合、小腸のマイクロバイオームプロファイル、機能、メタボロームにおける劇的な変化も見過ごされる可能性があるため、マウスモデルにおける腸内細菌叢とその機能の空間的解明は重要である。
研究方法
実験動物
すべての動物の取り扱いおよび処置は、カリフォルニア工科大学（Caltech）のInstitutional Animal Care and Use Committee（IACUC）に従って行われた。C57BL/6 J雄の特異病原体フリー（SPF）マウスは、Jackson Laboratory（米国カリフォルニア州サクラメント）から7〜8週齢で入手し、1ケージに4匹ずつ収容した。2つのコホートを使用した：最初のコホートは、カルテックの動物施設で2ヶ月間馴化させ、試験開始時にマウスは4ヶ月齢であった；第2のコホートは6ヶ月間馴化させ、試験開始時にマウスは8ヶ月齢であった。
すべての動物は、チャウ食（PicoLab Rodent Diet 20 5053, LabDiet, St.Louis, MO, USA）およびオートクレーブ処理した水でアドリブで維持し、馴化中および試験期間中、毎日13：11明暗サイクルに従わせた。マウスには測定された量の餌を与え、実験中の餌の摂取量は、各動物の毎週のケージ交換時および終了時点の餌の重量を測定することによって測定された。体重は、実験開始時、毎週のケージ交換時、終了時に測定した。
動物飼育条件
実験中、すべてのマウスはオートクレーブ処理したケージ（Super Mouse 750, Lab Products, Seaford, DE, USA）内に単独で収容した。コントロール（CTRL）、モックテールカップ（TC-M）、およびファンクショナルテールカップ（TC-F）処置のマウスは、熱処理した広葉樹チップ寝具（Aspen Chip Bedding, Northeastern Products, Warrensburg, NY, USA）上で飼育し、ティッシュペーパー（Kleenex、 Kimberly-Clark, Irving, TX, USA）の巣材を与えた。WF処置のマウスは、1平方インチあたり3×3のメッシュサイズを有する隆起したワイヤー床（#75016、Lab Products）に収容され、床なしのペーパーハット（#91291、Shepherd Specialty Papers, Watertown, TN, USA）を提供した。動物からの液体排泄物を吸収するために、ワイヤー床の下にウッドチップの薄い層を加えた（追加ファイル1：図S1D）。
テールカップの設計と取り付け
テールカップは、ロック機構を含む公開文献 [30, 134,135,136,137] に基づいて設計した [30]. 各カップは、垂直な溝を持つように設計されたテールスリーブに固定することで、動物の後肢の周囲に固定された。このようなテールスリーブは、テールカップの総重量が尾部皮膚の大きな表面積に沿って分散されるように、カップを動物に対してぴったりと保持することを可能にし、合併症を最小限に抑えることができる。テールカップを装着すると、長手方向に自由に回転できるため、ロック機構が尾を絞めつけることがありません。
テールカップは、Additional file 1に記載されているように、20 mLシリンジ（#4200.000 V0 Norm-Ject 20 mL Luer-Lock, Henke-Sass Wolf GmbH, Tuttlingen, Germany）から手作業で作りました： 図S1A-C。複数の穿孔は、捕獲された糞便ペレットの乾燥を促進するように設計されていた。横方向のスリットにより、ロックエッジの直径を大きくすることができ、2本の指でスリットを押すことで、テールカップをテールスリーブから素早く取り外すことができる。模擬テールカップは、糞ペレットがカップから落ちるように、壁面に広い隙間を設けるようにした。
マウスがテールカップのプラスチック部分をかじるのを防ぐため（ギザギザができ、その後の怪我につながる可能性がある）、ステンレス鋼グロメット（#72890, SS-4, C.S. Osborne, Harrison, NJ, USA）をサイズと重量を減らすために加工した金属製フレアリングで補強した。金属リングは、ラテックスチューブ（Amber Latex Rubber Tubing #62996 -688, 1/2″ ID, 3/4″ OD; VWR, Radnor, PA, USA）から切り出した4mm幅のゴムリングを用いてテールカップに装着した。
テールスリーブは、高純度シリコーンチューブ（HelixMark 60-411-51, 1/8" ID, 1/4" OD; Helix Medical, Carpinteria, CA, USA）から作った。チューブを長手方向に分割し、動物によって異なる尾の直径に対応するため、また尾の長さに沿って、尾の不均一な圧縮を防ぎ、組織接着剤を均一に塗布しやすくするために、壁の2.0mm幅の長手方向のストリップを除去した。垂直方向のテールカップ取り付け溝は、カッティングディスク（RD1、Perma-Grit Tools、Lincolnshire、UK）を備えた回転工具（Craftsman #572 .610530, Stanley Black & Decker, New Britain, CT, USA）を用いて作った。各テールカップとスリーブを合わせた重量は約4.12gで、空であった。
テールカップを装着する前に、動物をイソフルランで10分間麻酔し、体温を維持するためにヒーティングパッドに乗せた。スリーブの内側を70%エタノールで脱脂し、動物用組織接着剤（GLUture Topical Adhesive #32046 , Abbott Laboratories, Lake Bluff, IL, USA）を尾部基部に塗布した。接着剤を5分間硬化させた後、テールカップを装着した。マウスをケージに戻し、麻酔から回復させて歩かせた。
テールカップは毎日午前8時に糞ペレットを空にした。マウスは、黒のポリプロピレン製50mL円錐管（TB5000 LiteSafe, Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, USA）から作られた拘束具［138］に入るように促され、テールカップはクリップを外され、素早く空にされた。尾部カップに付着した残留物は、カップの再装着前にペーパータオルとRescue溶液（Virox Technologies, Oakville, ON, Canada）を用いて洗浄した。模擬テールカップを装着した動物にも、取り扱い条件を合わせるために同じ手順を踏ませた。
テールカップは12日から20日の間、動物に装着された。すべてのTC-F動物はTC-M動物と時間的に一致させた（すなわち、TC-Fグループの各動物は、時間的に一致したTC-Mグループの動物を同時に取り扱い、安楽死させた）。
サンプル採取と処理
すべてのマウスは、安楽死に関する米国獣医師会ガイドライン[139]に従い、Caltech IACUCの承認を得て安楽死させた。マウスは、イソフルラン麻酔（誘導室内で較正されたガス気化器により投与され、その後ノーズコーン上で維持される）下で、心臓穿刺の後に頸椎脱臼により安楽死された。血液は、1mLシリンジ（#309659、Becton Dickinson）と21G×1″針（#26414、EXELINT International, Redondo Beach, CA, USA）を用いて採取された。
血液を直ちにK2EDTA血漿分離チューブ（MiniCollect 450480, Greiner Bio-One GmbH, Kremsmünster, Austria）に入れ、穏やかに混合し、遠心分離の前に氷上に最大1時間保存した。胆汁および尿は、1mLシリンジ（#4010.200 V0 Norm-Ject 1-mL Tuberculin Luer, Henke-Sass Wolf GmbH）および27G×1/2″針（#26400, EXELINT International）を用いて胆のうおよび尿のうからそれぞれ直接収集し、氷上に保管した。
安楽死時に存在する場合は、糞便サンプルを採取した。消化管全体を胃食道接合部から肛門括約筋まで切除し、処理中は氷上で保存した。
血漿の分離
血液サンプルを血漿分離チューブで2000RCFで4℃、5分間遠心分離した。血漿を分離し、-80 ℃で保存した。
GIT内容物の処理
主な実験分析（図2、3、4）のための試料を準備するために、各マウスのGITを胃、小腸の3等分の長さ、盲腸、および結腸に分割した。超純水（Milli-Q, MilliporeSigma, Burlington, MA, USA）中の冷（4℃）滅菌オートクレーブ生理食塩水（0.9% NaCl (#S5886, Sigma-Aldrich) ）2-5mLを用いてGITの各セグメントからの内容物を流し、その後ピンセットで粘膜損傷を避けるために非常に穏やかに搾り出した。すべてのサンプルは、処理中は氷上で保存した。
生理食塩水で希釈した各サンプルのアリコートを、25,000RCF、4℃で10分間遠心分離して濃縮した。上清を除去し、ペレットを9容量の1×DNA/RNAシールド（DRS）溶液（R1100-250、Zymo Research, Irvine, CA, USA）で再構成し、ボルテックスで混合し、将来のDNA抽出のために-80℃で保存した。各サンプルの別のアリコートは、メタボローム（胆汁酸）分析のために-80℃で保存された。
MPNベースの微生物定量化および16S rRNA遺伝子アンプリコン配列決定のためのGIT内容物の調製（パイロット試験；Additional file 1: Figure S4B）は、上記と同様であったが、5％の水素、10％の二酸化炭素および85％の窒素の雰囲気でビニル嫌気性チャンバー（Coy Laboratory Products, Grass Lake, MI, USA）内で実施した。すべてのサンプルは氷上に維持され、培養ベースのアッセイに直ちに処理された。
GIT粘膜の調製
内容物を洗い流した後、GITの各セグメントを滅菌した冷たい（～4℃）生理食塩水で静かに洗い、長手方向に切断し、スライドグラスの上に平らに置く。粘膜は、2枚目の清潔なスライドグラスを使用して組織から静かに削り取った。粘膜を採取し、9容量のDRS溶液と合わせ、ボルテックスで混合し、DNAとRNAの抽出に備えて-80℃で保存した。
最確数（MPN）アッセイ
パイロット試験（Additional file 1: Figure S4A）では、MPNアッセイ（[140,141,142,143,144]から適応）を、機能的テールカップを装着したマウス5頭とコントロールマウス5頭の各GITセクション（胃、小腸の3サブセクション、盲腸、結腸）に対して実施しました。増殖培地は、超純水（Milli-Q）で調製し、オートクレーブで滅菌し、室温まで冷却させた脳心筋梗塞ブロス（Bacto BHI、#237500、Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA）に、1． 0 mg/L ビタミンK1（#L10575、Alfa Aesar, Haverhill, MA, USA）、5 mg/L ヘマチン（#H3281、Sigma-Aldrich St.Louis, MO, USA）、および 0.25 g/L L-システイン（#168149、Sigma-Aldrich）。培地は、使用前に少なくとも24時間、嫌気性チャンバー内で平衡化させた。
MPNアッセイは、透明で滅菌された非処理ポリスチレン384ウェルプレート（Nunc 265202, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）において行った。各サンプルから、滅菌オートクレーブ生理食塩水（嫌気槽内で少なくとも24時間平衡化）中で2系列の連続10倍連続希釈液を、透明な滅菌非処理ポリスチレン96ウェルプレート（Corning Costar 3370, Corning, NY, USA）上で調製した。各シリーズからの各連続希釈液10μLを、90μLのBHI-Sブロス培地を満たした4つ（希釈液あたり合計8つ）の培養-培地複製物（ウェル）に注入した。
プレートは通気性膜（Breath-Easy BEM-1, Diversified Biotech）で密閉し、嫌気性チャンバー内で37.0℃で5日間インキュベートされた。最初の24時間は均一なガス平衡化を促進するために蓋をせず、その後24時間から培養期間終了まで（120時間）、プラスチック製の蓋をプレートにかぶせたままにした。
インキュベーション終了後、フラットベッドスキャナー（HP ScanJet 8250, Hewlett-Packard, Palo Alto, CA, USA）を用いて、黒背景の反射モードで300 dpiの解像度でプレートをスキャンした。取得した各高解像度画像を目視で観察することにより、陽性ウェル（複製）を呼び出した。各サンプルのMPNは、Microsoft Excelを使用して、「Calc_MPN」マクロで計算した[145]。
DNA抽出
解凍したGIT内容物およびDRS溶液で保存した粘膜サンプルのアリコートから、ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit（D4300, Zymo Research）を用いて、製造者の説明書に従ってDNAを抽出した。サンプルは、ビーズビーター（MiniBeadBeater-16、Model 607、Bio Spec Products、Bartlesville、OK、USA）上で3450RPMのデフォルト速度で5分間ホモジナイズしました。サンプル中の複数オーダーの微生物負荷にまたがるDNAの定量的な回収は、[38, 39]で以前に検証されています。
抽出物中のDNA収量および純度は、吸光度（NanoDrop 2000c, Thermo Fisher Scientific）および蛍光光度計（Invitrogen Qubit 3, Thermo Fisher Scientific）上の蛍光アッセイ（Qubit dsDNA HS Assay Kit Q32854, Thermo Fisher Scientific）により評価しました。
16S rRNA遺伝子DNAコピーの列挙のための定量的PCR(qPCR)
qPCR反応は、各DNAサンプルについて3連でセットアップした。15μLの単一複製反応容量には、1. 5μLのDNA抽出物をqPCRマスターミックス（SsoFast EvaGreen Supermix, #172 -5200, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA）、500nMの最終濃度でフォワードおよびリバースプライマー（統合DNA技術、サンディエゴ、 CA, USAにより合成；追加ファイル1：テーブルS1）、超純水（Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water 10977-015, Thermo Fisher Scientific）と結合して、1つのレプリケート反応量とした。反応は、PCRテープ（#MSB1001, Bio-Rad Laboratories）で密封した白色96ウェルPCRプレート（#HSP9655, Bio-Rad Laboratories）にセットアップした。
標準曲線は、「標準」SPFマウス糞便DNA抽出物（デジタルPCRを用いて16S rRNA遺伝子コピーの絶対濃度を定量化したもの）の10倍希釈の付属シリーズに基づいて、各qPCRランについて構築した。
増幅は、リアルタイム蛍光測定で行った（CFX96 Real-Time PCR Detection System, Bio-Rad Laboratories）。サーモサイクルの条件は、Additional file 1: Table S2に従って使用した。qPCRデータファイルは、Bio-Rad CFX Manager 3.1 (#1845000, Bio-Rad Laboratories)を用いて解析し、Cqデータはさらなる処理のためにMicrosoft Excelにエクスポートした。
絶対16S rRNA遺伝子DNAコピー列挙のためのデジタルPCR（dPCR）
Droplet digital PCR（ddPCR）反応は、[38, 39]に従ってセットアップした。20μLの単一複製反応容量には、ddPCRマスターミックス（QX200 ddPCR EvaGreen Supermix, #1864033 , Bio-Rad Laboratories）、最終濃度500nMのフォワードおよびリバースプライマー（統合DNA技術により合成；追加ファイル1：表S1）、超純水（Thermo Fisher Scientific）と組み合わせたDNA抽出物の2.0μLを含む。
QX200液滴発生装置（#1864002、Bio-Rad Laboratories）でDG8カートリグ（#1864008、Bio-Rad Laboratories）、液滴発生オイル（#1864006、Bio-Rad Laboratories）、DG8パッキン（#1863009、Bio-Rad Laboratories）を用いて液滴を生成し、QX200 Droplet Digital PCR System（#1864001, Bio-Rad Laboratories）で液滴リーダーオイル（#1863004, Bio-Rad Laboratories）を用いて分析しました。ddPCRデータファイルはQuantaSoft Software (#1864011, Bio-Rad Laboratories)を用いて解析し、生データはMicrosoft Excelにエクスポートしてさらに処理した。
サーモサイクル条件は、[38, 39]とAdditional file 1: Table S3に従って使用した。増幅は、96ディープウェルサーモサイクラー（C1000 Touch, #1841100 , Bio-Rad Laboratories）上のPCRプレートシーラー（PX1, #1814000 , Bio-Rad Laboratories）を用いて、ピアス式ヒートシール（#1814040, Bio-Rad Laboratories）でシールしたPCRプレート（#0030133374, Eppendorf, Hauppauge, NY, USA）において行った。
次世代シーケンサー（NGS）のための16S rRNA遺伝子DNAアンプリコンバーコード化
PCR反応は[38, 39]に従って設定し、各DNAサンプルについて3連複で行った。30μLの単一複製反応容量には、3μLのDNA抽出物とPCRマスターミックス（5PRIME HotMasterMix, #2200400 , Quantabio, Beverly, MA, USA）、DNAインターカレート色素（EvaGreen, #31000 , Biotium, Fremont, CA, USA）メーカー推奨濃度（×1）、バーコード付きフォワードおよびリバースプライマー（統合DNA技術により合成、追加ファイル 1： Table S1）、最終濃度500 nMの超純水（Thermo Fisher Scientific）。反応は、フラットな光学キャップ（#TCS0803, Bio-Rad Laboratories）を備えた0.2mL白色PCRチューブ（#TLS0851）にセットした。サーモサイクル条件は[38, 39]とAdditional file 1: Table S4に従って使用した。増幅はリアルタイム蛍光測定（CFX96 Real-Time PCR Detection System, Bio-Rad Laboratories）で行い、アンプリコン収量を最大化し、過剰増幅に関連するアーチファクトを最小化するために、サンプルは指数中期（対数）段階まで可変サイクル数で増幅させた［146］。
イルミナライブラリー定量のためのデジタルPCR(dPCR)
20μLのシングルレプリケート反応量には、イルミナアダプターでライゲーションした希釈アンプリコンサンプル2.0μL、10μLのddPCRマスターミックス（QX200 ddPCR EvaGreen Supermix, #186 -4033, Bio-Rad Laboratories）、イルミナP5およびP7アダプターをそれぞれ最終濃度125nMで標的としたフォワードおよびリバースプライマー（統合DNA技術によって合成；追加ファイル1：テーブルS1）、超純水（Invitrogen社）を含んだ。サーモサイクルの条件は、Additional file 1: Table S5に従って使用した。PCR増幅および液滴解析は上記と同様に行った。
バーコード付きサンプルの定量、プーリング、ライブラリー精製、品質管理
各バーコードアンプリコンサンプルのトリプリケートを結合した。各サンプルを105〜107倍に希釈し、自作のddPCRライブラリ定量アッセイとKAPA SYBR FAST Universal qPCR Library Quantification Kit（#KK4824, Kapa Biosystems, Wilmington, MA, USA）を用いてメーカーの指示に従いバーコード付きアンプリコンのモル濃度を定量した（qPCR反応のセットアップは上記と同様である）。
バーコード付きサンプルは、等モル量でプールされた。プールしたライブラリーは、Agencourt AMPure XP beads (#A63880, Beckman Coulter, Brea, CA, USA) を用いて、メーカーの指示に従って精製し、超純水 (Invitrogen) で溶出した。
精製したライブラリーは、NanoDrop 2000c分光光度計（Thermo Fisher Scientific）を用いて、260 nmから280 nmの吸光度比が> 1.8であることが確認された。平均アンプリコンサイズが約〜400bpであることを、2200 TapeStation装置（Agilent Technologies）とAgilent 2200 TapeStation Software A.02.01（Agilent Technologies）を用いてHigh Sensitivity D1000 ScreenTape System（#5067-5584 and #5067 -5585, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA）を用いて確認しました。
プールしたライブラリーのモル濃度をddPCRおよびKAPA qPCRアッセイを用いて測定し、Additional file 1: Table S1に記載のシーケンスプライマーを用いてNGSに提出した。
次世代シーケンシング
ライブラリーはMiSeq装置（Illumina, San Diego, CA, USA）でMiSeq Reagent Kit v3（#MS-102-3003, Illumina）を用いて300ベースペアエンドモードで配列決定しました。PhiXコントロールのスパイクインは15%で添加した。
PCRプライマーオリゴヌクレオチド（Additional file 1: Table S1)
同じユニバーサル微生物16S rRNA遺伝子V4プライマー（［147、148］から改変し、［38、39］で検証した（Barlow JT、Bogatyrev SR、Ismagilov RF： A quantitative sequencing framework for absolute abundance measurements of mucosal and lumenal microbial communities, submitted）））を用いて、16S rRNA遺伝子の519位から806位までのV4領域を標的とした16S rRNA遺伝子DNAコピー定量化および16S rRNA遺伝子アンプリコン配列決定に基づく多重化微生物群プロファイリングを行った。16S rRNA遺伝子DNAアンプリコンバーコードのためのリバースバーコードプライマーは、[148]に従った。
バーコードアンプリコンおよびddPCRアッセイを用いたプールライブラリー定量用のP5およびP7イルミナアダプターを標的とするプライマーは、[147、148、149、150、151]に従った。
シーケンシングリード処理
デマルチプレックスされた2×300リードは、Qiime2-2019.01パイプライン[152]を用いて処理した。DADA2プラグイン[153]を使用して、フィルタリング（フォワードトリミング、5；フォワードトランケーション、230；リバーストリミング、5；リバーストランケーション、160）、ノイズ除去、ペアエンド配列のマージ、およびキメラの除去を行った。分類学的配列（amplicon sequence variant, ASV）の分類は、Silva rRNA reference database, release 132 [156] （[157]からダウンロード可能）の16S rRNA遺伝子配列のV4 515-806bp領域に対して[155]のトレーニングを行った分類器（[154]からダウンロード可能）で行いました。
PICRUSt2[44,45]を用いた機能遺伝子推論をQiime2環境下でASVに対して実施した。ASVの絶対量および相対量は、推定された16S rRNA遺伝子のDNAコピー数を用いて正規化した。得られた予測メタゲノムデータは、Pythonツール（後述）を用いて、目的の遺伝子オルソログの正規化相対量および絶対量を算出するために使用した。
シーケンシングデータ処理
データの取り扱い、計算、統計解析は、Microsoft Excel with the Real Statistics Resource Pack [158]、PythonパッケージNumPy [159]、Pandas [160]、SciPy [161] 、Statsmodels [162] を用いて実施しました。プロットは、Matplotlib [163]とSeaborn [164]を用いて実施した。すべてのPythonパッケージは、Anaconda環境[167]で配布されているJupyterノートブック[166]内のIPython[165]を使用して実行した。
各サンプルの分類群に割り当てられた16S rRNA遺伝子ASVの頻度データは、各サンプルの相対存在量に変換された。次に、各サンプルのqPCRおよびddPCRアッセイから得られた全16S rRNA遺伝子DNA負荷の対応する値を用いて、相対的存在量を絶対的存在量に変換した。
絶対量データは、カスタムメイドのPython関数（Qiime2 "Taxa" プラグインの "collapse" メソッドと同じ結果が得られることを確認済み[152]）を使用して、属（図3a）または目（図3b、c）の分類学レベルに折り畳まれました。盲腸内容物サンプル16個中1個以上（各群6匹中4匹×4群）存在しない分類群と、弊社がPythonで実装した頻度ベースのcontaminant identification [168] で同定した分類群の2つの方法で（採取時のサンプル取り扱い、DNA抽出キットやPCR試薬から）混入分類群の定義を行いました。植物由来の葉緑体およびミトコンドリア（チャウ食由来と思われる）のデータは、図3aおよびcではデータセットに残し、図3bでは削除しました。各グループの分類群の平均絶対量を計算し、相対量に変換して図3bにプロットした。
相対存在量データ（Additional file 1: Figure S4B）の主成分分析（PCA）は、Python Scikit-learnパッケージ［171］を用いて、中心対数比（CLR）変換した［169, 170］（データセット内の最小非ゼロ配列数に等しい疑似カウントをすべてのゼロ値に追加後）属レベルの相対存在量データで行った。
絶対量データ（図3a）のPCAは、Python Scikit-learnパッケージ[171]を用いて、log10変換および中央標準化（平均＝0、標準偏差＝1の正規分布データに変換）[172]した属レベルの絶対量データに対して行った。
胆汁酸の分析
試薬
TαMCA、TβMCA、TωMCA、THCA、αMCA、βMCA、ωMCA、HCA、HDCA、MCA、GCDCA、GDCA、GCA（追加ファイル1：表S6）はSteraloids（米国ニューポート、RI）より入手した。
TCA、CA、DCA、TCDCA、TDCA、TUDCA、TLCA、CDCA、UDCA、LCA、D4-TCA、D4-DCA、D4-CA、D4-TCA、D4-GLCA、D4-GUDCA、D4-GCDCA、D4-GCAの各製品（追加ファイル1: 表S6）はIsciences (Ambler, PA, USA) から取得した。
LC/MSグレードのアセトニトリル（#A955-500）、水（#W6500）、ギ酸（#A117-50）は、Thermo Fisher Scientific社から入手した。
試料調製
試料の緩衝性（pHの問題）を克服するため、試料を0.5%ギ酸を含む9容量のエタノールで抽出し（[83,84,85]から適応・修正したプロトコルを使用）、9種類の重同位体（D4）内部標準を5μMで抽出しました。D4内部標準は、タウロコール酸（TCA）、コール酸（CA）、デオキシコール酸（DCA）、タウロデオキシコール酸（TDCA）、グリココール酸（GCA）、グリコリドコール酸（GLCA）、グリコールデオキシコール酸（GUDCA）、グリコチェンデオキシコール酸（GCDCA）、グリコードキシコール酸（GDCA）。サンプルは、900RPMでオービタルシェイクしながら、70℃で1時間加熱した。固形物を17,000RCF、4℃で15分間の遠心分離により沈殿させた。上清を元のサンプルの10％としてデカンテーションし（例えば、1mLの抽出サンプルの100μL）、ロトバップ（Centrivap Concentrator #7810016 , Labconco, Kansas City, MO, USA）上でRTで約100mTorrで蒸発させた。蒸発したサンプルは、0.1%ギ酸を含む20%アセトニトリル、80%水に、元のサンプルから100倍希釈で再懸濁した（例えば、100μLデカント溶液は1mLで再懸濁）。
少量のため、胆嚢胆汁サンプルをまず10容量の100%エタノール（#3916EA, Decon Labs, King of Prussia, PA, USA）で希釈した。エタノールによる希釈液を9容量の超純水（Invitrogen）と合わせ、上記と同様に抽出に供した。
各10μLの抽出および再分散されたサンプル注入は、Acquity UPLC HSS T3 1.8 micron, 2.1 × 10-mm column (# 186003539) および Acquity UPLC HSS T3 1.8 micron Guard Column (# 186003976) を用いてXevo-qTOF質量分析計 (Waters, Manchester, UK) と連結された Waters Acquity UPLCで分析した。ニードルウォッシュは、イソプロパノール2部、水1部、アセトニトリル1部。パージ溶媒は、5%アセトニトリル水溶液。反応のドリフトを補正するために、8回の注入ごとにプールされた品質管理サンプルを実行した。
質量分析計の装置パラメータは以下の通りである： キャピラリー電圧2.4 kV、衝突エネルギー6.0 eV、サンプリングコーン90 V、ソースオフセット40 V、ソース120 ℃、脱溶媒ガス温度550 ℃、コーンガス50 L/h、および脱溶媒ガス900 L/h。飛行時間型質量スペクトルは、30,000m/Δmに対応する分解能モードで収集された。質量軸はギ酸ナトリウムクラスターで較正し、ロイシンエンケファリンを用いてロックした。
胆汁酸標準物質（0.05、0.1、0.5、1、5、10、30μM）の0.05から30μMまでのラン内で、7点の外部検量線を3回収集した。外部標準は、タウロコール酸（TCA）、タウロα-ムリコール酸（TαMCA）、タウロβ-ムリコール酸（TβMCA）、タウロω-ムリコール酸（TωMCA）、タウロヒョコール酸（THCA）、タウロデオキシコール酸（TDCA）、 タウロウルソデオキシコール酸（TUDCA）、タウロチェンデオキシコール酸（TCDCA）、タウロリトコール酸（TLCA）、グリココール酸（GCA）、グリコヒオコール酸（GHCA）、グリコデオキシコール酸（GDCA）、グリコヒデオキシコール酸（GHDCA）です、 コール酸（CA）、α-ムリコール酸（αMCA）、β-ムリコール酸（βMCA）、ω-ムリコール酸（ωMCA）、ヒオコール酸（HCA、γ-ムリコール酸とも）、デオキシコール酸（DCA）、チェンデオキシコール酸（CDCA）、 ウルソデオキシコール酸（UDCA）、ヒオデオキシコール酸（HDCA）、ムロコール酸（ムリデオキシコール酸、MDCA）、リトコール酸（LCA）、グリコールイソコール酸（GLCA）、グリコウソデオキシコール酸（GUDCA）、グリコチェンコデオキシコール酸（GCDCA）。UDCAとHDCAは分離できなかったため、合計を報告した。
抽出されたイオンクロマトグラムの積分面積は、QuanLynx (Waters, Milford, MA, USA) と10 mDaの質量抽出ウィンドウを使用して求めました。装置感度のドリフトを考慮した最終補正は、Microsoft Excelで行った。
溶出グラジエント
試料は、0.1%ギ酸を含む水（"A"）と0.1%ギ酸を含むアセトニトリルのバランスで、以下のグラジエントで溶出させた：
1.
0分、68% Aで0.55 mL/min
2.
2 min, 0.55 mL/min at 60% A, 10 curve
3.
5 min, 0.55 mL/min at 40% A, 5 curve
4.
6 min, 1.1 mL/min at 0% A, 10 curve
5.
6.2分、0%Aで1.2mL/min、6曲線
6.
6.5分、0%Aで1.47mL/分、6曲線
7.
8.9 min, 1.5 mL/min at 0% A, 6 curve
8.
9.0 min, 0.9 mL/min at 68% A, 6 curve
9.
10分、0.55 mL/分、68%A、6カーブにて
胆汁酸のデータ処理
胆汁酸データ解析は、"Sequencing data processing "に記載されたツールを用いて実施した。
データおよび材料の入手可能性
本論文の結論を裏付けるデータセットは、論文およびその追加ファイル内に含まれています。シーケンスデータ（FASTQのペアエンドリード）とQiime2での解析用マニフェストファイルは、CaltechDATA: https://doi.org/10.22002/D1.1295、CC-BYライセンスで入手できます。補足情報には、すべてのシーケンスサンプルメタデータ、数値微生物定量データ（メイン研究の16Sコピー＋パイロット研究のMPN）、Qiime2シーケンス出力データ、PICRUSt2出力データ、数値胆汁酸分析データ、数値体重データ、数値食物摂取データ、原稿中のすべての図および統計解析のための解析スクリプト（iPython Notebooks）を含むzipファイルが含まれています。
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リファレンスのダウンロード
謝辞
実験資源を提供してくれたKaren Lencioni、Janet Baer、Caltech Office of Laboratory Animal Resources、Church Animal Facilityの獣医技師に感謝する。Liang Maには16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンスの紹介を、Heidi Klumpeには予備的なMPN実験の支援を、Justin BoisにはPythonによるデータ解析の紹介を感謝する。S.R.B.は、プロジェクトに関する個人的なフィードバックとインスピレーションを与えてくれたKimberly Zhouに感謝したいと思います。このプロジェクトは、Caltech Environmental Analysis Centerが提供する機器の使用とNathan Dalleskaの技術サポートから恩恵を受けた。この原稿の執筆と編集に貢献したNatasha Shelbyに感謝する。
資金提供
本研究は、Kenneth Rainin Foundation Innovator Award（2018-1207）、陸軍研究局（ARO）Multidisciplinary University Research Initiative（MURI）契約#W911NF-17-1-0402、Jacobs Institute for Molecular Engineering for Medicineから一部支援を受けました。全米科学財団（NSF）Emerging Frontiers in Research and Innovation Award Grant 1137089。資金提供者は、研究の設計、データの収集、分析、解釈、および原稿の執筆に関与していない。
著者情報
著者と所属
カリフォルニア工科大学生物工学部（米国カリフォルニア州パサデナ市
サイード・R・ボガティレフ＆ルステム・F・イスマギロフ
カリフォルニア工科大学化学・化学工学部、1200 E. California Blvd、Pasadena, CA, USA
ジャスティン・C・ロランド＆ルステム・F・イスマギロフ
貢献度
SRB コンセプション、マウステールカップ開発、動物実験実施、定量的16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンス用動物実験サンプル処理、定量的16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンスおよびデータ解析、メタボローム解析用動物実験サンプル処理、バイエル酸メタボロームデータ解析、原稿作成。JCR メタボローム解析法の開発・検証、メタボローム解析のための動物実験試料処理、UPLC-MS装置の設定と試料分析、クロマトグラフィーとマススペクトルのデータ分析。RFI プロジェクトの監督と管理、資金獲得、原稿のレビューと編集。すべての著者が最終原稿を読み、承認した。
コレスポンディングオーサー
Rustem F. Ismagilovに対応します。
倫理に関する宣言
倫理的承認と参加への同意
すべての動物の取り扱いおよび処置は、カリフォルニア工科大学（Caltech）のInstitutional Animal Care and Use Committee（IACUC）に従って行われた。
論文発表の同意
該当なし
競合する利益
この記事の内容は、Caltechが出願した特許の対象です。
追加情報
出版社ノート
シュプリンガー・ネイチャーは、出版された地図や所属機関の管轄権主張に関して、中立を保っています。
補足情報
追加ファイル1： 図S1.
共食い防止のためのテールカップの設計と実験セットアップ。図S2. 機能的なテールカップをマウスに装着したところ。図S3. 試験期間中の食物摂取量に関連した、マウスの全グループにおける体重の変化。図S4. 機能性テールカップを装着したマウス（TC-F）およびコントロールマウス（CTRL）のGIT全体に沿った培養可能な微生物負荷および微生物叢プロファイルの定量化を示す。図S5. GIT全体に沿った胆嚢胆汁および内腔内容物中の胆汁酸プロファイル。表S1. 本試験で使用したプライマーオリゴヌクレオチド配列。表S2. 16S rRNA遺伝子DNAコピー定量用定量PCR（qPCR）アッセイのサーモサイクリングパラメーター。表S3. 16S rRNA遺伝子DNAコピーの絶対量測定のためのデジタルPCR（dPCR）アッセイに関するサーモサイクリングパラメーター。表S4. 次世代シーケンサー（NGS）用16S rRNA遺伝子DNAアンプリコンバーコーディングPCR反応のサーモサイクリングパラメーター。表S5. バーコードアンプリコンおよびイルミナNGSライブラリー定量のためのデジタルPCR（dPCR）アッセイのサーモサイクリングパラメーター。表S6. 胆汁酸メタボロミクスアッセイで使用した試薬および化学標準物質。表S7. GIT全体に沿った胆嚢胆汁および管腔内容物中の胆汁酸濃縮。
権利と許可
オープンアクセス この記事は、クリエイティブ・コモンズ 表示 4.0 国際ライセンス (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) の条件の下で配布されています。これは、原著者と出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズのライセンスへのリンクを提供し、変更を加えた場合に示すことを条件に、あらゆる媒体での無制限の使用、配布、複製を許可します。本記事で公開されているデータは、特に断りのない限り、クリエイティブ・コモンズ・パブリック・ドメインの放棄(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)が適用されます。
転載と許可
この記事について
この記事を引用する
Bogatyrev, S.R., Rolando, J.C. & Ismagilov, R.F. 糞便叢の自己接種により微生物叢の密度と組成が変化し、マウス小腸の胆汁酸プロファイルに変化が生じる。Microbiome 8, 19 (2020). https://doi.org/10.1186/s40168-020-0785-4
引用元：ダウンロード
2019年9月26日受理
2020年1月5日受付開始
2020年2月12日発行
DOIhttps://doi.org/10.1186/s40168-020-0785-4
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キーワード
微生物の定量化
メタボロミクス解析
マウスモデル
小腸内細菌叢
胆汁酸類
脱共役化
共食い
微生物によるコロニー形成
16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンス
マイクロビオーム
ISSN: 2049-2618
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投稿に関するお問い合わせ： lyndie.manicani@springernature.com
一般的なお問い合わせ先： info@biomedcentral.com
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