インターロイキン-27は新生児樹状細胞によるBCG抗原クリアランスとT細胞刺激能を障害する

2023年6月16日 12:40

微生物科学における現在の研究
第4巻、2023年、100176号
インターロイキン-27は新生児樹状細胞によるBCG抗原クリアランスとT細胞刺激能を障害する

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666517422000736

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https://doi.org/10.1016/j.crmicr.2022.100176Get 権利と内容
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BCGに反応して新生児樹状細胞でインターロイキン-27の発現が増加する。

BCGワクチンは、現在、結核に対して認可されている唯一のワクチンである。

BCGは、結核流行地では新生児に一般的に投与される。

IL-27はDCによるBCGクリアランスを制限し、インターロイキン12の産生を制限する。

IL-27は新生児樹状細胞によるT細胞刺激に対抗する。
概要
Bacille Calmette Guérin（BCG）は、結核菌に対する予防のためのライブアッテネートワクチンである。BCGは、乳児期や小児期には高い予防効果を示すが、肺結核に対する長期的な予防効果には乏しい。我々は、インターロイキン（IL）-27の上昇を含むユニークな免疫プロファイルが、新生児BCGの定期投与による十分な防御に寄与していると仮定している。新生児前駆細胞を得るための新しい方法を用いて、新生児骨髄由来樹状細胞（BMDC）がBCG刺激後にIL-27の産生を増加させることを明らかにした。BMDCsに対するIL-27の影響を調べるために、IL-27受容体αの欠損マウス（KO）を利用した。その結果、新生児KO BMDCsでは、WTと比較して、BCGクリアランスが大きく、IL-12産生が上昇することが確認された。さらに、KO新生児のBMDCsは、BCGワクチンを接種したマウスから分離したCD4+ T細胞からのインターフェロン-γ産生を、WTの対応するものよりも刺激した。これらの知見の重要性をさらに確認するために、C57BL/6マウスを、結核負荷の高い地域におけるヒトへのワクチン接種のアプローチと同様に、新生児としてワクチン接種した。IL-27レベルは5週間を通して徐々に上昇し、BCGを接種したマウスではコントロールと比較して有意に上昇した。BCGのクリアランスに対するIL-27産生の影響は大きく、KOマウスは末梢組織からBCGをクリアし、WTマウスではワクチン接種後5週目まで残存していました。これらの結果は、新生児期のDCに対するIL-27の抑制的役割と、BCGに対する新生児免疫応答への影響を強調した最初のものである。

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新生児
樹状細胞
BCG
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はじめに
インターロイキン-27（IL-27）は、サブユニットp28とEBI3からなるIL-12ファミリーのヘテロ二量体サイトカインである（Hunter、2015）。当初はTh1極性化およびインターフェロン（IFN）-γ産生を促進する役割について特徴づけられたが（Trinchieri, 2003）、その後の研究では、免疫抑制機能（Hunter, 2015; Stumhofer et al, 2008; Yoshida et al.も確認されている、 2009）、マクロファージにおけるリソソームトラフィッキングと酸性化の低下（Jungら、2013b；Kraftら、2013；Robinsonら、2008）、樹状細胞における抗原提示と移動の低下（Mascanfroniら、2013；Morandiら、2014）。慢性疾患の動物モデルでも、IL-27の抑制的な役割が強調されています。IL-27シグナル伝達の欠乏は、様々な病原体による感染後の炎症および組織病理の増大を促進し（Holscherら、2005；Liuら、2021；Pearlら、2004；Villarino 2003）、一方、IL-27生産は自己免疫に対する保護をもたらす（Battenら、2006；Mascanfroniら、2013；Stumhoferら、2006）。重要なことに、IL-27産生は、マウス（Kraftら、2013）およびヒト（Gleave Parsonら、2019）において新生児期に上昇することが示されている。免疫抑制における役割を考えると、新生児におけるIL-27の上昇レベルは、早期の感染と免疫において重要な意味を持つ可能性があります。
現在、CDCが推奨する小児期のワクチン接種スケジュールの一部として投与されるワクチンの大部分は、生後2カ月以前には投与されず、出生時に投与されるのはHepBのみです Center for Disease Control and (Center for Disease Control and Prevention, 2022) これは、主に、人生の初期に特有の免疫プロファイルによりこの年齢層でのワクチン接種効果が低下した結果です (Morris et al., 2016). 新生児期には、T細胞のTh2表現型への極性化、樹状細胞（DC）上のMHCクラス-II、CD80、CD86などの抗原提示に重要な分子の減少によって明らかなように、免疫系はより調節的で抗炎症性の状態へとプライミングされている（Willems et al、 2009）、IL-27を含む抗炎症性サイトカイン（Basha et al., 2014）の増加（Gleave Parson et al., 2019; Jung et al., 2016; Kraft et al., 2013）。ワクチン反応に対するこれらの要因の影響を調査することで、早期の予防接種を改善するための新しい解決策を提供できる可能性があります。世界的に、結核（TB）疾患の発生率が高い世界地域では、バシル・カルメット・ゲラン（BCG）が出生時または出生後間もない子どもに投与されている（世界結核レポート、2018）。幼児における結核菌（Mtb）による播種性感染に対して保護的であるが、BCGは肺疾患に対する信頼できる長期的な保護を付与することができない（世界保健機関、2018年）。新生児期にIL-27のレベルが上昇していることから、このサイトカインの免疫抑制活性がBCG接種後の保護応答を妨げる可能性があると仮定した。
我々は以前、IL-27がマクロファージにおけるBCGのリソソームへのトラフィッキングとリソソームの酸性化を低減することを実証した（Jung et al., 2013b; Jung et al., 2014）。リソソームの輸送と酸性化は、抗原処理とその後の提示に必要であるため、IL-27は、ワクチン媒介応答に対抗し得る。DCは長期記憶応答の生成に重要であるため、本研究では、BCGに反応する新生児DC活性に対するIL-27の効果を明らかにすることを目的とした。IL-27受容体α欠損マウス（KO）と野生型（WT）の骨髄由来DC（BMDC）において、細菌除去、IL-12産生、T細胞刺激に対するIL-27の効果を比較した。前者は機能的なIL-27受容体を発現していない。新生児DCを用いたin vitroでの研究は、新生児期にワクチン接種を受けたマウスでの知見により、さらに強化されました。ここで示されたデータは、新生児で観察された高レベルのIL-27が、DCによるBCGのクリアランス、IL-12の産生、およびその後のT細胞応答の誘導に反対しているという仮説を支持する。最終的に、これは細菌負担の持続をもたらし、ユニークな抗原の提示と多様なメモリーT細胞の活性化の可能性を低下させるかもしれない。
実験方法
動物
C57BL/6（WT）またはIL-27Rα欠損（KO）マウスのC57BL/6遺伝的背景の繁殖ペアをJackson Laboratories（Bar Harbor, ME）から購入し、West Virginia University School of Medicineで飼育した。雄および雌の仔マウスを実験的感染に使用した。この研究におけるマウスは、生後8日までの新生児と定義した（Bogaert et al., 2009; Siegrist 2007）。すべての手順は、ウェストバージニア大学機関動物ケアおよび使用委員会の承認を受け、全米研究会議（NRC、2011）による実験動物のケアおよび使用のためのガイドの勧告に従って実施された。
新生児骨髄の単離
人道的安楽死後、7-8日齢のWTまたはKOの仔から後肢と前肢を摘出した。皮膚、筋肉、脂肪はメスで除去した。骨は70％エタノールで2回、Ca2+とMg2+を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回洗浄し、10％FBS、2mMグルタミン、ペニシリン（100U/mL）/ストレプトマイシン（100μg/mL）を添加したMEM（Corning；コーニング、ニューヨーク）中で氷漬けにした。このようにしてすべての骨を準備した後、断片に切断した。断片と培地は、コレクションチューブ付きの40μmストレーナーに移した。断片は、3mlシリンジのプランジャーでストレーナーに押し付けてさらに破砕した。懸濁液を350×gで5分間、4℃で遠心分離した。赤血球を0.2%NaCl溶液で溶解し、次いで等量の1.6%NaClで懸濁液を中和した。遠心分離による溶解液の除去後、細胞を数え、凍結培地（80％FBS、10％DMEM、10％DMSO）中で-80℃にて保存するか、直ちに使用した。
樹状細胞（DC）培養
骨髄前駆細胞を、低付着性細胞培養皿（Corning）において、一次DC培地［0.55mM β-mercaptoethanol（Gibco; Waltham, MA）、20ng/ml GM-CSF（Shenandoah Biotechnology, Warminster, PA）、および10ng/ml IL-4（Shenandoah Biotechnology）を加えて上記のように補充したMEM］において前述のように培養した（Matheu et al., 2008）. 3日ごとに培養液を回収し、遠心分離して非付着細胞を集め、新鮮な培養液で培養皿に戻した。7日後、DCは、Ca2+とMg2+を含まず、5mM EDTAを補充したPBSで30分間氷上インキュベートすることにより除去した。細胞の収集と計数の後、DCは下流の実験使用のために培養液に再懸濁された。
BCG接種液
10％OADCおよび21.6μg/mlピマリシン（Sigma；St.Louis、MO）を補充した7H9培地（Difco；Franklin Lakes、NJ）中で増殖した単一コロニーから調製したBCGストック培養物。培養物は振盪インキュベーターで2週間維持した後、遠心分離により濃縮し、30％グリセロールを加えた7H9で凍結した。ストックは凍結後、タイターした。接種液を調製するために、BCGを予めタイト化したストックから解凍し、短時間ボルテックスした後、27ゲージの針に通して塊を除去した。PBSで洗浄し、遠心分離して凍結培地を除去した後、BCG懸濁液をボルテックスし、ウォーターバスソニケーター（Fisher Scientific, Waltham, MA）で7秒間超音波処理し、27ゲージの針に通した。
BCG回収アッセイ
WTまたはKO BMDCsマウスを指示通りに播種し、BCG（MOI 0.8-2）、BCG（MOI 0.8-2）およびIFN-γ（100ng/ml）のいずれかで処理するか、未処理にした。感染時に、培養液を完全なマウス培地（DMEM、10％FBS、2mMグルタミン、25mM HEPES）に交換し、BMDC培養を4時間インキュベートした。この時、培地を取り除き、後述のオーラミンO染色により細菌負担を評価した。72時間でのBCGの列挙のために、ウェルをCa2＋およびMg2＋を含まないPBSで洗浄し、BMDCを200μLの新鮮な培地とともに培養した。細胞は感染から合計72時間の間、培養した。この時、培地を除去し、オーラミンO染色により細菌負担を評価した。
オーラミンO染色
オーラミンO標識および蛍光分光分析によるBCGの列挙は、前述したように行った（Jung et al.、2013a）。感染期間の終了時に、培地を除去し、BMDCsを4％パラホルムアルデヒドで固定する前にPBSで洗浄した。30分後、BMDCsをPBSで3回洗浄し、製造業者のプロトコルに従ってオーラミンO（Scientific Device Laboratory; Des Plaines, IL）を用いて染色した。プレートは、水分が残らないように風乾させた。蛍光は、SpectraMax iD3（Molecular Devices; San Jose, CA）を用いて420nmと505nmで測定し、ウェル内の21点からの読み取りを提供するウェルスキャンオプションを用い、PMTオプションは一定の500ボルトで維持するように選択した。21点すべてを使用して、各処理における蛍光のウェル平均を生成した。各遺伝子型の培地のみの対照群からの平均蛍光は、バックグラウンド補正のために各遺伝子型のすべての処理群から差し引かれた。
RNA単離および遺伝子発現アッセイ
BMDCをBCG（MOI 0.5-2.5）またはLPS（100ng/ml）のいずれかで処理し、TriReagent（Sigma）を用いて収穫した。RNAは、DirectZOL（Zymo Research; Irvine, CA）のメーカープロトコールに従って単離した。iScript™ cDNA合成試薬（Bio-Rad, Hercules, CA）を使用して、メーカープロトコールに従って第一鎖のcDNAを生成した。Step One Plus (Applied Biosystems) リアルタイム検出システムを使用して、ヌクレアーゼフリー水で 1:2 に希釈した上記の調製物の cDNA、遺伝子特異的プライマープローブセット (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) および iQ™ Supermix (Bio-Rad) を含む反応のリアルタイムサイクリングを三重で実施しました。遺伝子特異的増幅率は、内部参照遺伝子としてactBの増幅率に正規化し、2-ΔΔCtの式で未処理BMDCsとの相対値を表現した。
T細胞刺激アッセイ
BMDCを、1.6-3のMOIで記載したように調製したBCGで24時間感染させ、CD4+ T細胞分離キット（Miltenyi Biotec; Auburn, CA, USA）を用いて5週間BCG（マウスあたり105-106）を接種した成体マウスの脾臓から分離したCD4+ T細胞を、BCG刺激またはTNF-α処理（100ng/ml）した対照BMDCと指示した比で72時間共培養した。上清を保存し、ELISAによりIFN-γの濃度を測定した。
ELISA法
培養上清中のIL-12p70（Invitrogen；Waltham，MA）、IFN-γ（Invitrogen）、及びIL-27（Biolegend，San Diego，CA）濃度を、製造者のプロトコルに従ってELISAにより測定した。タンパク質標準物質は、並行してアッセイした。
新生児ワクチン接種
BCG（BCG Pasteur）を、カルシウムおよびマグネシウムを含むPBS中で、マウスあたり50μLの最終体積で、上記のように予めタイト化されたATCCストック培養物（ATCC 35734）から調製した。次に、細菌懸濁液をボルテックスし、再び27ゲージフィルターに通した。マウスは、出生後7日目または8日目に、肩甲骨下領域に103CFUのBCGを接種した。ワクチン接種の時間帯は、最も典型的には午前10時から午後2時の間に行われたが、厳密には制御されていなかった。等量のPBSを接種したコントロールマウスも、すべての実験に並行して含まれた。マウスはワクチン接種後5週間安静にし、その時点でBCG量と血清サイトカインレベルを測定するために人道的に安楽死させた。
BCGの定量化
ワクチン接種5週間後、マウスをイソフルラン曝露で麻酔し、顎下出血により血液を採取した。キャピラリーチューブ（Sarstedt; Nürembrecht, Germany）に採取した血液を2,000 x gで10分間遠心分離して血清を採取し、-80℃で冷凍保存した。採血後すぐにマウスを致死的なイソフルラン曝露により安楽死させ、肺、肝臓、脾臓を採取し、BCGを計数した。組織は、PBS-Tween 80中でハンドヘルドホモジナイザーとプラスチックペストルを用いてホモジナイズし、連続希釈して7H10寒天培地にプレーティングした。細菌培養物は、5% CO2、37℃で14日間培養し、その時点でコロニーを数えた。
MSDによるサイトカイン検出
IL-27p28血清レベルは、製造者のプロトコルに従って電気化学発光U-プレックス試薬を使用して測定した（MesoScale Discovery [MSD], Rockville, MD）。プロトコルの推奨に従って、血清サンプルはアッセイ希釈液で2倍に希釈された。結果は、MSD Discovery Workbench ソフトウェア（v4.0.13）を用いて解析した。タンパク質標準物質は、サンプルと並行してアッセイされた。
統計解析
グループ間の相互作用を同定するために、まず一元配置（パラメトリックおよびノンパラメトリックバージョン）または二元配置ANOVAを使用した。交互作用が確認された場合、有意性を評価するための追加の多重比較検定が実施され、図解に詳述されている。該当する場合は、t検定を実施し、図中の説明文に記載した。統計的閾値はα=0.05に設定された。すべての統計は、GraphPad Prism version 9.3 (San Diego, CA, USA)を用いて行われた。
結果
新生児BMDCsのBCG刺激に応答してIL-27産生が増強される
私たちの研究室からの以前の研究は、ヒトおよびマウスの新生児マクロファージがベースラインで成人の対応物よりも多くのIL-27を産生することを実証した（Gleave Parsonら、2019；Kraftら、2013）。IL-27のベースラインレベルの上昇は、ヒト成体マクロファージにおけるBCGによる刺激によってさらに増加する（Jung et al.、2014）。DCはワクチン応答の編成において重要な役割を担っているため、我々はBCG刺激により、これらの細胞からのIL-27の産生がさらに評価されるかどうか、またDC機能への影響について調べようとした。そのために、年齢に関連したモデルを用いて、新生児マウスから骨髄前駆細胞を分離する方法を開発し、標準的なプロトコルによってこれらの細胞をDCに分化させました（Matheu et al., 2008）。フローサイトメトリーで表現型を確認し、CD11chiMHCII+CD80+ BMDCsであることを確認しました（Supp. Fig.1）。マウス新生児BMDCsをBCGで6時間または24時間刺激した後、遺伝子発現と分泌サイトカインを測定するために収穫した。BCG刺激は両時点でp28の遺伝子発現を有意に増加させた。ポジティブコントロールとして含まれるLPS刺激もp28の遺伝子発現を誘導した（図1a）。同様のパターンが24時間後のEBI3でも観察されたが、発現の増加はそれほど強固ではなかった（図1a）。これは、EBI3がより高いレベルで構成的に発現しており、p28がヘテロ二量体の集合に律速していることが知られているため、予想外のことであった。次に、IL-27ヘテロダイマーに特異的なアッセイを用いて、サイトカイン産生を測定した。BCGは、24時間後の非刺激細胞と比較して、IL-27の産生を有意に増加させた（図1b）。これらのデータは、新生児BMDCsが、BCGで刺激した後、すでに上昇している循環IL-27のレベルを増加させるようにプライミングされていることを実証している。これは、ヒトマクロファージを用いた我々の以前の研究（Jung et al.、2014）と一致する。これらの知見は、DCがBCGワクチン接種後のIL-27の重要な供給源である可能性があり、増加したレベルが宿主応答に影響を与える可能性があることをさらに示唆しています。
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図1. 新生児BMDCsのBCG刺激に応答してIL-27産生が増強される。BCGを0.5-2.5のMOIで処理した8日目（D8）のBMDCsを、指示した時間帯に処理した。値はβ-アクチンに正規化し、式2-ΔΔCtを用いて、非刺激対照に対する発現のlog2変化として表現した。9回（BCG）または6回（LPS）の複合実験から得られた平均結果±標準誤差を、実験ごとにバッチ化したBMDCから2-3個のテクニカルレプリケートから平均して示す。正常性テスト後、95％信頼区間における統計的有意性は、処理グループを非処理サンプルと比較するためにOne-Way ANOVAおよびTukeyの多重比較テストを使用して決定された、 ***p=0.0004, **p=0.0046. 実験ごとにバッチ化したBMDCから2〜3個のテクニカルレプリケートから平均した、5（BCG）または2（LPS）実験の組み合わせの平均結果±SEMが示される。95%信頼区間における統計的有意性は、ノンパラメトリックのKruskal-WallisおよびDunnの多重比較検定を用いて決定した、*p=0.048。
IL-27シグナルは新生児BMDCsのBCGクリアランスに反対する
新生児期におけるIL-27のレベルの上昇とBCGによる発現のさらなる増加を考慮し、BCG刺激に伴う新生児BDMCsに対するIL-27の影響を理解することを目指した。そのために、IL-27の受容体が機能しなくなったIL-27Rα-/-（KO）マウスを利用した。KOマウスの新生児から採取したDCをWTマウスと同様に培養し、BCG暴露時のIL-27の影響を調べた。我々および他の研究者は、マクロファージからのBCGおよびMtbクリアランスに対するIL-27の抑制効果を示している（Jungら、2014、Lienardら、2016、Robinsonら、2008、Robinsonら、2010、Sharmaら、2014）。DCはマイコバクテリアに感染することが知られているが、細菌クリアランスの速度や効力に対するIL-27の効果は検討されていない。そこで、IL-27Rα-/-BMDCsは、WTと比較して、BCGワクチン抗原をより効率的にクリアーすると仮定した。これを検証するために、古典的なDC活性化陽性コントロールとしてのIFN-γの存在下または非存在下で、新生児WTおよびKO BMDCsをBCGで4時間処理した。このとき、IL-27シグナルが細菌の取り込みに影響を与えるかどうかを確立するために、オーラミンオ染色を用いて細胞のサブセットにおける細菌負担を決定した（図2）。WTとKOのBMDC間のBCG取り込みに有意差は認められず、IL-27がin vitroでBCGを内在化するDC能力に影響しないことが示された（図2a）。しかし、IFN-γの添加は、同じ遺伝子型の未処理サンプルと比較して、BCGの貪食の増加を促進したが、これも遺伝子型間で統計的に有意ではなかった（図2a）。並行培養では、細胞外のBCGを除去し、培地を新しいものに交換して72時間培養を続け、クリアランス効率を測定した。細菌の取り込みの微妙な違いを考慮するため、この72時間の回復からの値を4時間の負担の平均値に対して正規化した。この分析により、WT BMDCsと比較して、KO BMDCsから72時間培養後に回収されたBCGが著しく少ないことが示された（図2b）。IFN-γ処理はWT BMDCsのBCGクリアランスを改善したが、IFN-γで処理したKO BMDCsはIFNγ処理したWT BMDCsと比較して有意に改善したクリアランスを示した。この発見は、IL-27シグナルがDCによるBCGクリアランスを妨害し、この改善された機能がIFN-γの存在下でさらに増強されることを実証している。
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図2. IL-27シグナルは、新生児BMDCsのBCGクリアランスに反対する。8日目（D8）のWTまたはKO BMDCsを、IFN-γの有無にかかわらず0.8-2のMOIでBCGで処理した。4時間または72時間に、細胞を固定し、オーラミンOで染色した。 a 4時間でのBCG内在化の代表的な測定値を、相対蛍光単位（RFU）±標準誤差として示す。 b 72時間でのBMDCからの正規化BCG回収を、実験ごとにバッチしたBMDCからの3技術複製から平均した3実験について±標準誤差として示す。72時間後のRFU値は、実験グループ内の4時間後のRFU値に対して正規化した。次に、各群の正規化値を、BCG処理したWT BMDC群に対する相対値で表し、実験間の殺傷能力を比較した。正規性検定後、95％信頼区間における統計的有意性は、1標本t検定を用いて決定した; *p=0.04; **p=0.005.
IL-27は、新生児BMDCsのBCG刺激に応答してIL-12の産生に対抗する
DCは、ナイーブT細胞に抗原を処理・提示した後、Th1細胞の強力なドライバーであるIL-12などのサイトカインを用いて分化を促進し、Mtbに対する宿主の反応に重要な役割を果たしています。これまでの研究で、マイコバクテリアに暴露されたマクロファージでは、IL-12の産生が障害されることが示されている（Nau et al., 2002; Pompei et al., 2007）。さらに、IL-27は、LPS刺激後の成体マウス脾臓DCによるIL-12産生を減少させることが示された（Wangら、2007年）。図1でBCGがIL-27産生を誘導することを示したので、BCG刺激に応答したIL-12産生がIL-27シグナルによって制御されているかどうかを調べた。新生児WTおよびKO BMDCsをBCGまたはLPSで6時間（図3a）または24時間（データ示さず）処理した。LPSは、IL-27およびIL-12の刺激として知られているコントロールとして含まれた。遺伝子発現レベルでは、BCGで刺激したWT BMDCsと比較して、KO BMDCsではIL12p35サブユニットの発現に一貫した増加が観察されたが、これらの差は統計的有意差には達しなかった（図3a、左）。LPSに応答したIL-12p35遺伝子発現は、WTおよびKO BMDCs間で同等であり、BCGによって誘導された発現と有意差はなかった（図3a、左）。IL-12p40遺伝子の発現は、BCGまたはLPSで刺激したWTとKOのBMDCs間で同等であった（図3a、右）。タンパク質の産生は遺伝子発現に従うので、BCGまたはLPSで処理した24時間後と48時間後の活性型IL-12p70を調査した。どちらの刺激も、どちらの遺伝子型のBMDCsからも分泌されるIL-12p70の量を増加させた（図3b）。しかし、KO BMDCsは、BCGに応答して、24時間という早い時期に、有意に多くのIL-12を産生した（図3b、左）。この産生量の増加は、BCGおよびLPSに応答して48時間まで持続した（図3b、右）。
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図3. IL-27は、新生児BMDCsのBCG刺激に応答してIL-12の産生に対抗する。8日目のマウスのWTおよびKO BMDCsを0.8-2のMOIでBCGまたはLPSで6時間または24時間処理した。a 細胞を6時間後に採取し、RNA単離とIL-12p35（左）またはIL-12p40（右）遺伝子発現を測定した。値はβ-アクチンで正規化し、2-ΔΔCtの式で非刺激対照に対する発現のlog2変化として表現した。b24時間（左）または48時間（下）の培養上清中のIL-12p70濃度をELISAで測定した。別々に行った3つの実験の代表的な実験についての平均結果±標準誤差を示す。95%信頼区間における統計的有意性は、二元配置分散分析の後にシダックの多重比較検定を使用して決定した; *p=0.03, **p= 0.006.
IL-27シグナルは新生児BMDCによるT細胞刺激を制限する
ワクチン接種後のDCの主要な機能は、T細胞に抗原を提示し、その活性化と分化を促進することである。IL-27Rα KO BMDCsでは細菌クリアランスとIL-12産生が改善されていることが確認されたので、これらの活動がT細胞活性化に及ぼす正味の影響を調べた。WTまたはKO BMDCsをBCGで24時間刺激した後、BCGワクチン接種済みの成体マウスから分離したCD4+ T細胞と比率を上げながら共培養した。成体T細胞は、新生児T細胞の応答性の制限を排除するために使用された。培養物をさらに72時間インキュベートし、応答性の読み出しとしてIFN-γ産生を測定するために、全体を通して24時間ごとに上清を回収した。図4に示すように、BCG刺激の非存在下では有意なレベルのIFN-γは検出されず、これらが抗原特異的な応答であることが示された。同様に、T細胞の非存在下では、IFN-γは評価できるレベルでは検出されなかった。しかし、CD4+ T細胞は、BCGで刺激したWTまたはKO BMDCsのいずれかと培養するとIFN-γを産生し、応答性は1：5の比率で同等であった（図4a）。一方、IFN-γの産生は、72時間後、BMDCとT細胞の比率が1：10で、WT BMDCと比較してKO BMDCを用いた培養で有意に大きかった（図4b）。このことは、BCG応答性T細胞活性を刺激するKO BMDCsの細胞あたりの能力が、WT細胞と比較して増加することを示唆する。BMDCとT細胞の比率がより同等であれば十分なT細胞刺激活性が、BMDCの密度が低下するとすぐに制限されるようになる。
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図4. IL-27シグナルは、新生児BMDCsによるT細胞刺激を制限する。新生児WTマウスまたはKOマウスのBMDCsをウェルあたり2×104（a）または104（b）細胞で播種し、1.6-3のMOIでBCGで処理した。抗原特異性のコントロールとして、BCGなしのBMDCsの成熟にTNF-αで処理したグループも含めた。刺激後24時間で、成人ワクチン接種WTマウスからのCD4+ T細胞を、ウェルあたり105細胞の一定密度でBMDCと培養した。72時間の共培養を通じて、上清のサンプルを24時間ごとに保存し、ELISAでIFN-γの産生を測定した。別々に行った3つの実験の代表的な実験について、48時間（左）または72時間（右）の平均結果±SEMを示す。95％信頼区間における統計的有意性は、二元配置分散分析に続いてシダックの多重比較検定を使用して決定した；***p < 0.0001.
新生児マウスワクチン接種後にIL-27レベルが上昇し、BCGクリアランスが損なわれる。
我々の観察によると、BCGによるIL-27の産生は、その後、in vitroでのDCによる細菌クリアランスを妨害することが示唆された。全動物モデルにおけるこれらの所見の関連性をさらに検討するために、我々は新生児のWTまたはKOの仔にBCGを接種した。BCGはMycobacterium bovisの弱毒株であり、免疫不全の子供では病気を引き起こさないが、BCGはMTBと同様のファゴリソーム抵抗性を持つことができる（Viaら、1998）。ワクチン抗原の持続性は、エフェクター応答を促進することが示されている（Orme 2010）。漸増量のBCGを1週間でワクチン接種し、5週間休ませたWTまたはKO仔を安楽死させ、BCG負担およびIL-27血清レベルの測定のために血液、肺、肝臓、脾臓を採取した。新生児期にワクチン接種を受けたWTマウスは、調べたすべての末梢組織で持続的な細菌が検出されたため、BCGを排除することができなかった（図5a）。これは、WT BMDCsで細菌の殺傷力が低下していることが確認されたin vitroの結果と類似していた。一方、ワクチン接種から5週間後、KO動物の末梢組織から回収されたBCGは著しく少なく、脾臓ではBCGは検出されなかった（図5a）。このことから、新生児ワクチン接種後のBCGの残存には、IL-27が直接寄与しており、その結果、IL-27の産生を促進し続けることができると考えられる。そこで、新生児期のBCGワクチン接種とBCGの持続が、時間の経過とともにIL-27産生の上昇を促進し続けるかどうかを検討した。その結果、BCG接種後2～5週間は、コントロールと比較してIL-27が継続的に進行していることが確認された（図5b）。ワクチン接種後4週間および5週間の両方で、年齢をマッチさせた非ワクチン接種動物と比較して、循環IL-27のレベルが有意に上昇することが観察された（図5b）。この結果は、新生児動物ワクチン接種モデルにおけるDCを用いたin vitroの知見の妥当性と有意義な貢献を支持するものである。
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図5. BCGは新生児WTマウスからうまく排出されず、IL-27レベルを上昇させる。新生児WTまたはKOの仔マウスに、生後7日または8日目に、1匹あたり103BCGを目標にワクチン接種した。雄マウスと雌マウスの両方を使用し、治療グループ間でほぼ均等に分配した。必要な数の動物を得るために、3匹のWTと2匹のKOのワクチン接種を行った。試験終了時、マウスを人道的に安楽死させ、肺、肝臓、脾臓を採取し、ホモジナイズし、連続希釈してBCGを定量化した。正規性検定後、各サンプルについてWTマウスとKOマウスを比較するノンパラメトリックMann-Whitney検定を用いて95％信頼区間の統計的有意性を決定した；*p=0.018（肺）, **p=0.001 （肝臓）, **p=0.003（脾臓）b必要な数の動物を得るために4回の独立した新生児ワクチン接種が行なわれた。血清は、顎下出血による毎週の採血から採取し、電気化学発光免疫測定法により測定した。95％信頼区間における治療群内のIL-27の経時的変化における統計的有意性は、混合効果分析およびSidakの多重比較検定により評価した。正規性検定後、ある時点におけるコントロールとBCG接種者との間の95％信頼区間における統計的有意性は、対にならないt検定による一対比較によって決定した；p=0.041（4週）およびp=0.034（5週）である。
考察
本報告では、早期のワクチンであるBCGに反応する新生児期のDC活性に対するIL-27の影響を探った。これは、IL-27の免疫抑制活性を示す我々の研究室および他の研究室からのデータ（Jungら、2014；Karakhanovaら、2011；Kraftら、2013；Mascanfroniら、2013；Morandiら、2014；Robinsonら、2008； Villarino 2003）を前提としていた。IL-27の転写物および分泌サイトカインレベルは、小児がBCGを最も頻繁に接種する新生児期に上昇するため（Gleave Parson et al., 2019; Jung et al., 2016; Kraft et al., 2013）、IL-27が保護免疫の発達の低下に寄与する可能性があると仮定した。小児期のワクチンに対する反応は、in vitroやin vivoで年齢に応じた細胞や動物でモデル化されることはほとんどありません。本研究では、新生児期のDCがBCGに応答してIL-27の産生を増加させることを示した。これは、新生児または成人のBCGワクチン接種モデルでこれまで示されておらず、新生児がベースラインでもより多くのIL-27を産生するようにプライミングされていることを示すヒト新生児マクロファージおよび新生児マウスからのデータと一致する（Gleave Parsonら、2019；Jungら、2016；Kraftら、2013）。我々はここでそれらの知見を拡張し、BCGワクチン接種中の継続的かつ持続的なIL-27産生、ならびに抗原の処理および提示、適応免疫の刺激に重要なDC応答への影響についての理解を示しました。新生児WT DCと、IL-27シグナルに反応しないIL-27Rα KO DCを比較すると、BCGのクリアランスの改善とIL-12の産生の増加が観察された。ワクチン接種の新生児マウスモデルに置き換えると、ワクチン接種後にIL-27シグナルが徐々に増加した状態で細菌クリアランスが減少するというこれらの所見を再現した。
DCの活性に対するIL-27の役割は、ヒトとマウスの両方で研究されているが、主に成人の状況においてである。Wangらは、脾臓マウス成体DCにおけるこれらの効果を研究し、LPS刺激後のIL-12産生の改善を強調した。T細胞刺激も、IFN-γ産生によって評価されるIL-27シグナルがない状態で、同種およびLPS刺激またはKLHパルスしたDCで培養すると改善した（Wangら、2007）。Mascanfroniらは、IL-27がCD39の発現を介して抑制的なDC表現型を誘導し、Th1およびTh17の活性化を阻害することを示した（Mascanfroniら、2013年）。Morandiらは、IL-27の存在下で、ヒトDCにおけるHLAクラスI分子の増加をもたらす、プロテオソームタンパク質の発現の減少を確認した（Morandiら、2014年）。しかし、Jungらは、IL-27シグナル伝達のタイミングが重要であることを実証した。IL-27存在下で成人ヒト単球から分化したDCは、IL-27を受けなかったDCと比較して優れた抗原提示細胞であり、T細胞の増殖が促進された（Jungら, 2015）。これらの著作を総合すると、IL-27がDC機能に及ぼす重要な影響について明確に概説されていますが、新生児や生後間もないBCGワクチン接種の文脈でこれらを評価したものはありませんでした。この年齢層は、IL-27産生の上昇を含む明確な免疫構造で定義されているため、これは些細なことではなく、重要である。したがって、新生児期のDCにおけるこのサイトカインの効果を研究することは、IL-27が上昇し、発達中およびワクチン誘発免疫応答における顕著なプレーヤーとなりうる時期のIL-27の機能についての関連モデルを提供する。我々の知る限り、本明細書の研究は、新生児DCおよびワクチン接種の新生児モデルにおいてこれらの効果を探求した最初のものである。
先行研究において、我々は、新生児ヒトおよびマウスマクロファージがベースラインでより大きなレベルのIL-27を発現すること（Gleave Parsonら、2019；Kraftら、2013）、およびBCG刺激がヒトマクロファージのIL-27生産をさらに上昇すること（Jungら、2014）を示した。ワクチン接種の文脈では、DCは優れた抗原提示細胞であり、リンパ節への移動もより効率的である。そのため、BCGに対するDC応答に対するIL-27の影響を調べることは重要であり、最も一般的にワクチン接種を受ける集団に関連するように新生児細胞を用いてそれを行う必要がありました。BCGはp28とEBI3の発現を増加させ、p28はヘテロ二量体形成の制限因子であることから、より顕著であることがわかった。また、IL-27分泌蛋白質もBCG刺激により対照と比較して有意に増加した。これらの新生児BMDCが24時間後のBCGに反応してより活性の高いIL-27タンパク質を分泌するという我々の知見と合わせて考えると、新生児BMDCはマクロファージと同様にIL-27産生のためにプライミングされていると考えられる。
我々の研究室は、ヒト新生児および成体マクロファージにおいて、リソソーム活性の負の調節およびマイコバクテリアを含む細菌のクリアランスに対するIL-27の重要な影響を確立した（Jungら、2013b；Jungら、2014；Kraftら、2013；Robinsonら、2008）。これは、ヒト成人マクロファージにおけるBCGのリソソーム輸送の減少およびコンパートメントの酸性化と一致した（Jung et al., 2013b; Jung et al.、2014）。BMDCのBCGクリアー能力に対するIL-27の影響を評価した。これは、免疫応答をエフェクターから長期中枢記憶相に移行させるための効率的な抗原提示と抗原の排除に必要だからである。IFN-γは、リソソーム活性化などの機能を促進する骨髄系細胞の活性化因子として確立されているため、このサイトカインを用いて、IL-27シグナルが古典的な活性化因子と比較してどのように阻害されるかを明らかにした。その結果、新生児IL-27Rα KO DCは、新生児WT DCに比べ、BCGを除去する能力が著しく向上していることがわかった。KO細胞におけるBCGの生存率の低下は、WT細胞におけるIFN-γ処理と同等であり、未処理のWT BMDCと比較して、BCGクリアランスの微妙な、しかし重要ではない改善が観察されました。しかし、最も印象的だったのは、IL-27Rα-KO BMDCsにIFN-γを加えることで、BCGを破壊するBMDCの能力がさらに向上し、IFN-γ処理したWT BMDCsと比較してBCGの数が著しく減少したことである。これは、IL-27シグナルを排除することで、IFN-γによる細胞活性化の可能性が向上し、これらのDCがワクチン応答中にそのようなシグナルに反応しやすくなり、全体的な免疫応答をさらに向上させることを示唆する。これらの実験は、IFN-γのような強力な刺激因子の存在下でも、リソソーム活性に対するIL-27の抑制効果、および細胞内細菌負荷と抗原処理に対する純効果をさらに強調している。免疫応答を駆動する際に持続的な抗原の存在を示すモデルを支持する議論がなされているが（Darrah et al., 2020; Kaveh et al., 2014）、長期保護免疫の駆動におけるBCGワクチン接種の限定的な有効性に関する一つの仮説は、ワクチン抗原が排除されると中枢記憶への道を開くことができない持続的エフェクター記憶応答の駆動にBCGが持続することである（Andersen et al., 2014; Lindenstrøm et al., 2013; Lindenstrom et al., 2018; Orme 2010）。我々の結果は、ワクチン抗原のクリアランスを促進し、ワクチン誘発免疫を改善する戦略として、IL-27に拮抗する可能性を物語っています。我々は、BCGワクチン接種に対する短期および長期の免疫応答におけるIL-27の関与を探るために、さらなる研究を行うことができるワクチン接種の新生児モデルを開発しました。
BCGによる刺激後のIL-12の産生を評価したのは、さまざまな理由からである。IL-12はTh1分化のための重要なシグナルであり、Th1軸はMtbに対する防御に重要である。つまり、Mtbに対するワクチン接種の文脈では、効果的なワクチン接種戦略はIL-12産生を促進する必要がある。また、マイコバクテリアに応答してマクロファージから産生されるIL-12は限られていることがよく知られており（Hickmanら、2002；Nauら、2002）、BCGワクチン接種やMtb感染時にはDCがこのサイトカインに大きく依存することになる。我々の発見は、IL-27がBCGに応答してIL-12の産生を制限することを示す；IL-27Rα KO DCは、WTの対応するDCよりも活性の高いIL-12を産生した。なお、この効果は活性型IL-12p70の産生においてのみ観察され、遺伝子発現レベルでは有意な変化は観察されなかった。このことは、観察されたIL-12の増加は、IL-27が転写後機構を制御した結果である可能性を示唆している。実際、IL-27は、mRNAの安定化および発現レベルに対する転写後の影響に関与し得るヒト単球由来マクロファージおよびDCのマイクロRNAおよびロングノンコーディングRNA（lncRNA）を制御することが示されている（Hu et al., 2017; Hu et al., 2019）。我々の知見は、他のグループがin vivoおよびin vitroで成体細胞およびマウスを用いて報告した知見と一致しています（Nortey et al., 2022; Villegas-Mendez et al., 2013）。別の研究では、IL-27シグナルがない場合、LPS刺激後の成体DCによるIL-12の産生が改善されることが示された（Wang et al.、2007年）。我々の発見は、これらのデータと一致しており、新生児細胞におけるBCG刺激にも及んでおり、早期生命ワクチン接種の文脈における重要な知識のギャップを埋めるものである。
以上より、IL-12とDCにおけるBCG殺傷力の低下に関する我々の結果は、IL-27存在下での新生児DCによる刺激後のT細胞活性化における潜在的な機構上の欠陥を示唆している。リソソーム抗原は、CD4+ T細胞を活性化するためにMHCクラスII受容体によって提示される抗原のリザーバーである。そこで、IL-27シグナルの存在下または非存在下で、CD4+ T細胞応答の新生児DC活性化の効率性を決定した。抗原特異的な方法でこれを探求するために、我々は成体ワクチン接種マウスからCD4+ T細胞を単離し、T細胞の数は同じままで培養中のDCの量を調整した、DCとT細胞の比率を変えたBCGプライミング新生児DCとの培養の時間経過にわたってIFN-γを生成するその能力を評価しました。これらの実験では、新生児T細胞の反応性に限界がある可能性を排除するために、ワクチン接種したT細胞の供給源としてWT成体マウスを使用することにしました。これらのマウスは、CD4+ T細胞を採取する前に、ワクチン接種後 5 週間休息させた。BCG 抗原を提示した BMDC に対する T 細胞応答を評価する際、細胞密度が活性化の効率に影響する可能性を検討した。我々は、1：10（DC：T細胞）の比率で、抗原特異的な成人WT CD4+細胞は、WT DCとの培養よりもKO DCとの培養で有意に多くのIFN-γを生成することを発見した。これらの結果は、IL-27に反応しないDCによって刺激されたT細胞からのTh1活性化の増加を示す成人の研究（Wangら、2007）と一致する。BCG抗原の非存在下ではIFN-γの有意な産生が見られないことから、我々が示す応答は抗原特異的である。1：5（DC：T細胞）の比率で、WTまたはIL-27Rα-KO BMDCsと培養したT細胞からのIFN-γ産生は同等であり、KO DCと同じ抗原提示効率を達成するには、2倍の抗原プライミングWT DCが必要であることが示唆された。
最後に、これらの知見を全動物モデルに適用することを試みた。これは、抗原の持続性がエフェクター応答とメモリー応答を促進することに関与しているためです（Lindenstrøm et al.、2013；Orme 2010）。さらに、新生児のBCG接種量が少ないと、より標準的な免疫接種量よりもTh1インプリンティングが促進されることが判明しました（Kiros et al.、2010）。IL-27シグナル伝達の有無にかかわらず、新生児ワクチン接種後のBCG負担を評価したところ、WTワクチン接種新生児は、KO動物と比較して、末梢器官に培養可能なBCGが有意に多く、その多くは器官に検出可能な細菌がなかった（図5a）。WTマウスのワクチン接種5週後までIL-27の産生が徐々に増加したことと相まって（図5b）、BCGに対する免疫応答の制限にIL-27が重要な役割を果たし、抗原クリアランスを促進し長期記憶免疫を改善することを示唆している。
本研究では、BCG刺激後の新生児DCに対するIL-27の抑制効果を初めて示し、その結果、T細胞の活性化能が低下することを明らかにした。さらに、BCG接種の新しい新生児モデルを用いて、IL-27シグナルが末梢臓器からのBCGのクリアランスを減少させることを示しました。私たちは、BCGワクチン接種とその後のMtbチャレンジのこのモデルを用いて、IL-27産生の持続とワクチン抗原が完全な免疫応答と保護効果に及ぼす影響を引き続き調査することができる。
もちろん、本研究には限界がある。新生児骨髄からの前駆細胞の収量がもともと少ないため、現在のところ性差を調べることはできない。しかし、新生児ワクチン接種動物からのクリアランスとIL-27血清レベルの予備分析では、これらのパラメータに対する性の影響は示唆されなかった（データ示さず）。ワクチン接種は実験全体で同様の時間枠で行われ、概日リズムの影響を受ける免疫応答が観察されているが（Bureauら、1986；de Breeら、2020）、この変数が厳密に標準化されていないことに注意することは重要である。今後の研究では、T細胞の多様性、記憶応答、Mtbチャレンジ時にIL-27シグナルが存在する場合と存在しない場合の防御など、興味のある多くのトピックを探求することが期待される。最後に、単量体IL-27p28（IL-30）は、gp130と相互作用し、IL-6シグナルのIL-27ヘテロ二量体をブロックすることによって、EBI3とは無関係に生物学的効果を発揮することができることが確立されている（Garbersら、2013；下里ら、2009；Stumhoferら、2010）。この可能性を特に評価したわけではないが、我々のIL-27Rα-KO動物ではgp130は無傷である。したがって、IL-27p28の影響だけでなく、IL-27のシグナル伝達が阻害された結果、同じような表現結果が得られたと考えられる。
まとめると、今回の結果は、初期免疫におけるIL-27を取り巻く知識のギャップを埋めるものであり、ワクチン接種期間中にIL-27シグナルを短期的に拮抗させることで、初期免疫に対する反応を改善できるという考えを支持するものである。これらの研究は、結核蔓延地域におけるワクチン接種と予防を改善するための新しい知見を提供する可能性がある。
倫理に関する声明
実験は、ウェストバージニア大学の動物ケアおよび使用委員会（プロトコル番号1709009365）によって承認されました。実験に使用した動物の数と苦痛を最小限に抑えるよう努力した。
資金提供
この研究は、CMRとWVUワクチン開発センターへの国立衛生研究所[R01 AI163333]の支援、CMRとSDBへのWV Higher Education Policy CommissionのDivision of Science and Researchからの研究チャレンジグラント [HEPC.dsr.18.6] による資金提供によって行われました。ウェストバージニア大学フローサイトメトリーおよびシングルセルコアファシリティに提供された、以下の助成金による追加資金援助に感謝する： WV CTSIグラントGM104942、Tumor Microenvironment CoBREグラントGM121322、NIHグラントOD016165。
CRediTの著者の貢献声明
シェルビー・D・ブラッドフォード概念化、方法論、調査、形式的分析、執筆（原案）。Michelle R. Witt：方法論。Jessica M. Povroznik：形式的分析、執筆-原案、執筆-レビュー・編集。コーリー・M・ロビンソン Cory M. Robinson：概念化、監督、執筆 - 原案、執筆 - 査読・編集、プロジェクト管理、資金獲得。
競合する利害関係の宣言
著者らは、本論文で報告された研究に影響を及ぼすと思われる競合する金銭的利益や個人的な関係がないことを宣言するものである。
謝辞
グラフ抄録はBioRender.comで作成しました。
付録補足資料
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引用元：(0)
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