擬似無菌動物モデルにおける軽症、中等症および重症のデキストラン硫酸ナトリウム誘発潰瘍性大腸炎に対する糞便微生物叢移植の有益な効果

2024年1月23日 22:58

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擬似無菌動物モデルにおける軽症、中等症および重症のデキストラン硫酸ナトリウム誘発潰瘍性大腸炎に対する糞便微生物叢移植の有益な効果

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38255150/

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雑誌名 Biomedicines 第12巻第1号 10.3390/biomedicines12010043
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擬似無菌動物モデルにおける軽症、中等症および重症のデキストラン硫酸ナトリウム誘発潰瘍性大腸炎に対する糞便微生物叢移植の有益な効果

https://www.mdpi.com/2227-9059/12/1/43

Stanislav Lauko 1,†,Sona Gancarcikova 1,*,†ORCID,Gabriela Hrckova 2ORCID,Vanda Hajduckova 1,Zuzana Andrejcakova 3ORCID,Livia Kolesar Fecskeova 4ORCID,Izabela Bertkova 5ORCID,Emilia Hijova 5ORCID,Anna Kamlarova 5ORCID,Martin Janicko 6ORCID、 Lubos Ambro 7ORCID,モニカ・クヴァコヴァ 5ORCID,ズザナ・グラソワ 5ORCID,ラディスラフ・ストロイニー 5,ガブリエラ・ストルコルコヴァ 8ORCID,ダグマール・ムドロノヴァ 1ORCID,マリアン・マダー 1,ヴラスタ・デメコヴァ 9ORCID,ダニエラ・ネメトヴァ 1,イヴァン・パクタ 1 andadd 著者一覧を表示する
1
コシツェ獣医薬科大学微生物学・免疫学教室、041 81 コシツェ、スロバキア
2
スロバキア科学アカデミー寄生虫学研究所、041 81 コシツェ、スロバキア
3
スロバキア・コシツェ獣医学薬科大学・生物生理学教室（041 81 コシツェ
4
パヴォル・ヨゼフ・サファリク大学医学部・ルイ・パスツール大学病院（UHLP）付属組織バンク、コシツェ、040 11 コシツェ、スロバキア
5
コシツェ・パヴォル・ヨゼフ・サファリク大学医学部臨床・前臨床研究センター（スロバキア、コシツェ、040 11
6
パヴォル・ヨゼフ・サファリク大学医学部第2内科およびルイ・パスツール大学病院（スロバキア、コシツェ、040 11
7
コシツェのパヴォル・ヨゼフ・サファリク大学、テクノロジー・イノベーション・パーク、学際バイオサイエンス・センター、040 01 コシツェ、スロバキア
8
コシツェ獣医学薬科大学、疫学・寄生虫学・人の健康保護学部、041 81 コシツェ、スロバキア
9
コシツェのパヴォル・ヨゼフ・サファリク大学理学部生物学・生態学研究所動物生理学部門、040 01 コシツェ、スロバキア
*
Author who correspondence should be addressed.
†
これらの著者は本研究に等しく貢献した。
Biomedicines 2024, 12(1), 43; https://doi.org/10.3390/biomedicines12010043
投稿を受理した： 2023 年 11 月 30 日／改訂：2023 年 12 月 18 日／受理：2023 年 12 月 19 日／発行：2023 年 12 月 22 日： 2023年12月19日 / 掲載：2023年12月22日
(この論文は、Section Microbiology in Human Health and Diseaseに属しています。）
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要旨
糞便微生物叢の移植（FMT）は、一般に副作用の少ない安全な治療法と考えられている。特発性炎症性腸疾患（IBD）に対するFMT療法の普及を制限する主な要因は、感染のリスクを最小限に抑える必要性と他の疾患への移行である。DSS（デキストラン硫酸ナトリウム）曝露によるUC（潰瘍性大腸炎）動物モデルの獲得は、結果に大きく影響する多くの要因に左右される。水と一緒に黄砂を1回当たり摂取することは、それぞれの動物にとって個体差があり、その結果、誘発されるさまざまな形態のUCが発症する。このため、我々の研究の目的は、軽症、中等症および重症のUCを化学的に誘発したBALB/c系統の擬似無菌マウス（PGF）において、臨床的、病理組織学的反応および腸管微小環境の変化に対するFMTの調節および再生効果を評価することであった。その目的は、FMTの安全性と有効性に関する新たなデータを得ることであり、FMTの改善と最適化に貢献することであった。FMT治療を受けた軽症および中等症UCの動物は、疾患の重症度が低く、臨床的および組織学的疾患指数の低下、結腸粘膜の炎症反応の低下など、結腸の損傷が顕著に低かった。しかし、重篤なUC活性を有する動物では、FMT治療は期待された治療効果を達成できなかった。本研究の結果から、重篤なUCと診断された動物に対するFMT治療には、菌血症の発症や腸内細菌叢の非病原性代表因子の移行を含む潜在的な安全性リスクがあることが示唆された。
キーワード：糞便微生物叢移植；擬似無菌マウス；黄砂；軽症；中等症；重症潰瘍性大腸炎

はじめに
特発性炎症性腸疾患（IBD）は、腸管バリアの障害、微生物群集の変化、全身の生化学的異常 [1] および免疫機能障害 [2,3] を伴う、世界的に発生する慢性再発性炎症性腸疾患である。この疾患の病因は未だ不明であるが、IBDは患者の遺伝的体質、環境因子、腸内細菌叢、免疫系の相互作用が関与していることが一般的に認められている [4,5] 。IBDは、潰瘍性大腸炎（UC）とクローン病（CD）という2つの主な臨床型で発症し、炎症の臨床症状とその局在が異なり、独特の微生物シグネチャーによって特徴づけられる。
腸管バリアの機能不全と崩壊は、腸管炎症性疾患の発症と進行に重要な役割を果たしている。上皮バリアの損傷は、微生物や免疫原性因子の侵入と吸収を増加させる。免疫担当細胞の刺激により、炎症性サイトカイン（TNF-α、IFN-14、IL-1β）が産生され、潰瘍形成や粘膜劣化の一因となる [6] 。IBD病態における腸内細菌叢の変化という概念は一般的に受け入れられており、腸内細菌叢および腸内細菌叢異常症が炎症性腸疾患の病因および発症にも重要な役割を果たしていることを示唆する臨床的および実験的解析 [7,8,9,10] によって確認されている。しかし、患者の腸内細菌叢異常症が原因であると考えられるのか、あるいは疾患の経過中に誘導される炎症反応や抗菌反応の単純な反映に過ぎないと考えられるのかは、依然として不明である [11] 。IBD治療の従来の方法には、炎症を抑えることを目的とした薬物療法や外科的介入が含まれるが、それらの効果は低く、副作用のリスクも高いため、必然的に、寛解を誘導または維持できるような、効果の高い新たな代替治療戦略、または毒性の少ない医薬品の組み合わせを開発し、実施することが求められている。マイクロバイオームの操作は、腸内細菌叢の組成が変化した疾患患者に対する潜在的な治療法である [12,13] 。このようなアプローチの成功は、多くの疾患において微生物叢が重要な役割を果たしていることを示している [14,15,16] 。微生物叢補充療法または糞便微生物叢移植（FMT）は、非免疫抑制療法であり、要するに、健康な個体から患者への糞便微生物集団の移植または移入を意味し、その目的は、dysbiosisを除去し、量的および質的に損なわれていない微生物叢でレシピエントの消化管を再殖民することである［17］。他の腸内細菌叢の治療的操作（抗生物質、プロバイオティクス、プレバイオティクスの使用など）と比較した場合のFMTの主な利点は、健康な個体から採取した微生物の全領域からなる完全な機能的生態系を提供できることであり、その結果、IBDの発症に重要な、今のところ特徴付けられていないディスバイオシスや機能障害を改善できる可能性があることである [18] 。FMTを完全価値のある治療アプローチとして用いるという考えは、新しいものではない。中国中部の古墳で発見され [19]、主にアジアと近東の文化圏で知られている [20]。しかし、FMTが治療法として認められるようになったのは、2013年に米国食品医薬品局（FDA）がクロストリジオイデス・ディフィシルによる再発性難治性感染症の治療法としてFMTを承認してからである［21］。潰瘍性大腸炎の治療におけるFMTの使用は1988年にさかのぼり、最初の特発性大腸炎患者がFMT治療を受け治癒したことが報告されている[22]。Clostridioides difficile感染症の患者に対するFMT治療は、即座に治癒効果をもたらし、治療の成功率は87～90％に達したが [23,24,25]、潰瘍性大腸炎に対するFMT治療の有効性を評価することを目的とした多くのランダム化比較試験では、あいまいな結果が報告されている [24,26,27,28,29] 。IBD治療におけるFMTの有効性を示すエビデンスはコンパクトではないため、この治療法はまだ完全に説明され、一貫性があるとは考えられていない。IBDの微生物代替療法の結果があまり芳しくないのは、FMTの投与方法、治療前の抗生物質の投与、マルチドナーFMTかシングルドナーFMTか、投与量、ドナーとレシピエントの微生物プロファイル、患者の栄養状態、IBD疾患の重症度などの追加因子の影響によるものと考えられる[18]。近年、軽度から中等度の潰瘍性大腸炎患者を対象に実施された無作為化臨床研究 [24,26,30] で得られたFMT療法の有望な結果を確認するために、さらなる研究を実施すべきである。今後の研究では、FMT治療前後のドナーとレシピエントの便の微生物的・分子的成分の特徴に注目し、ドナーの選択を改善することを目的として、それぞれのUC患者の腸内で欠乏している特定の分類群や微生物産物で腸内細菌叢が特に濃縮されているドナーを優先的に選択する研究に焦点を当てるべきである[29]。
本研究の目的は、潰瘍性大腸炎の軽症型、中等症型、重症型（活動性）を化学的に誘発した擬似無菌動物モデルにおいて、臨床的・病理組織学的反応と腸内微小環境の変化に対するFMTの調節・再生効果を評価することであり、FMTの安全性と有効性に関する新たなデータを得ることで、FMTの改善と最適化に貢献することを期待している。
材料と方法
2.1. 動物、グノト施設での飼育条件および飼料
in vivo試験では、飼育施設Velaz s.r.o.（チェコ共和国、プラハ）の遺伝子系統BALB/cの特定病原体フリー（SPF）雌マウス（6週齢）、計72匹を用いた。マウスは特別な輸送ユニットでスロバキアのUVMPコシツェ（SK U 16016）の微生物学・免疫学部門の認定されたGnotobiology研究所に空輸された。その後、EHRET THF 3271IE 101/97（EHRET Labor-und Pharmatechnik GmbH Co.&KG,Emmendingen,Germany）のタイプのgnotobiotic飼育施設に移し、長さ365 mm、幅207 mm、高さ140 mmのポリプロピレン製容器1個あたり7～8匹からなるCBC（CBC, Ltd., Madison, WI, USA）のタイプのツーピースグローブアイソレーターに入れた。モデル動物には、バリアー飼育マウス用の照射済み完全混合飼料（Ssniff Spezialdiäten GmbH, Soest, Germany）を自由摂取させた。 7％、カルシウム0.7％、リン0.5％、鉄100mg、亜鉛100mg、マンガン30mg、セレン0.10mg、銅5mg（ビタミンD3 2200IU、ビタミンA 28,000IU、ビタミンE 100mg）からなり、ガラス瓶入りのオートクレーブ水を無制限に利用できた。寝具はSSniff H1 505-739727（Charles River Laboratoire, Écully, France）から提供されたもので、照射処理も施されていた。セントラルヒーティングを備えたニョートルームとアイソレーター環境との間の空気交換により、マウスにとって最適な温度20～24℃を確保した。HEPAフィルター（CBC, Ltd., Madison, WI, USA）に基づく濾過システムによる出入空気の濾過と定期的な寝具の交換により、アイソレーター内の相対湿度を最適な状態（45～65%）に保った。アイソレーターのろ過ユニットは、過圧50～70kPa、風量8～30m3で、1時間あたり最低10～15回の空気交換を確保した。グノトビオティック施設内の騒音レベルは、メーカーが公表している45dBを超えることはなかった。アイソレーター内のサーカディアンリズムは、自然の外光だけでなく、内部の人工的なネオン照明によって確保された。蒸留水、ガラス、金属材料を含むすべての実験材料は、121℃、圧力1.3MPaで30分間オートクレーブ滅菌した。
第1段階として、すべての動物に5日間の選択的抗生物質除染Amoksiklav (Sandoz Pharmaceuticals, Ljubljana, Slovenia)とCiprinol con infusion (Krka d.d., Novo Mesto, Slovenia)を行った。腸内細菌叢が減少した擬似無菌（PGF）モデルを得た後、第2段階として動物を2群に分けた： FMT群（n＝18）は潰瘍性大腸炎を誘発しない対照群、DSS-FMT群（n＝27）は5％DSS（40 kDa, TdB Consultancy AB, Upsala, Sweden）に5.5日間曝露することにより急性大腸炎を誘発する実験群である。消化管における微生物学的、生化学的、組織学的および免疫学的パラメーターの観察が研究の目的であったため、処置の終了時に、マウスは頸椎脱臼後、86 mg/kgの投与量でRepose 500 mg/mL (sodium pentobarbital, Le Vet Beheer, B.V., Oudewater, Nederland)をi.p.投与することにより、人道的に安楽死させた。選択したマウスは、ATB投与前（C0、n＝5）；アモクシクラフおよびシプリノールcon infusione投与後（C5、n＝10）；10日間の回復後（C15、n＝12）；処置20日目（急性UC誘発後、n＝10）；およびFMT処置後（FMT群n＝18、DSS-FMT群n＝17）に安楽死させた。
Biomedicines 12 00043 g001図1. 実験デザインと蛍光活性化細胞選別（FACS）による盲腸内微生物の生存率。(a）実験デザインとタイムライン。(b）抗生物質投与前のマウス盲腸（C0、n＝6）；FACS分析（77.6％）。(c）ATB処理後5日目のマウス盲腸の内容物（C5、n = 6）；FACS解析（20.2%）。(d）ATBを投与しない10日目のマウス盲腸の内容物（C15、n = 6）；FACS解析（71.1%）。
2.2. 擬似無菌モデル動物
擬似無菌動物は、Gancarcikovaら[31,32]による既述の方法に従った適用スキーム（図1a）を用いて、BALB/c系統のSPF雌マウスに広域抗生物質を投与することにより得た。PGFモデルを得るための手順の第1段階では、SPFの微生物学的状態を有するマウスに、経口的にAmoksiklav 2×457 mg/5 mL（Sandoz Pharmaceuticals, Ljubljana, Slovenia）を0.2 mLの用量（有効成分387.11 mg/kg/マウス）で投与し、皮下に製剤Ciprinol con infusione 5×10 mL/100 mg（Krka d.d..、 Novo Mesto, Slovenia）に0.1 mL（有効成分19.60 mg/kg/マウス）を12時間ごとに5日間皮下投与した。
選択的抗生物質によるマウスの消化管の汚染除去の結果、盲腸内容物中の培養可能な微生物の数は、形態学的に異なる2種類のコロニーに減少した。16S rRNAに対応するDNA配列をBLAST-n解析で調べたところ、大腸菌Escherichia coli RM9245（GenBank: CP 044314.1）および腸球菌Enterococcus gallinarum CIFRI-ONUSEG1（GenBank: MN 481049.1）という種と最も一致することが示され、これは以前の結果と一致した[32]。細菌配列の同定結果の再現性は、種のレベルで確認されたが、GenBankデータベースの番号は異なっていた。塩基配列はGenBankにアクセッション番号Enterococcus galinarum OR939681およびEscherichia coli OR939682で寄託された。
2.3. 急性潰瘍性大腸炎モデル動物の作製
急性潰瘍性大腸炎は、既述の方法[32]に従い、照射した（Bioster, Veverska Bityska, Czech Republic）合成多糖類硫酸塩DSS（デキストラン硫酸ナトリウム、40 kDa, TdB Consultancy AB, Upsala, Sweden）に化学曝露することにより誘発された。
2.4. FMTに最適なヒトドナーの選択とその処理
2.4.1. FMTドナーのスクリーニング
レシピエントの安全性が便ドナーの選択の主な基準である。選択のプロセスは、感染因子の移行の危険性を排除するために、臨床検査および検査室での検査に加え、入力されたアナムネティックデータの評価を含む、各ドナー候補のチェックから始まる。研究プロジェクトNo.14/2018/OVaVの中で実施されたFMTドナー候補からの生体試料採取は、スロバキアのコシツェにあるL.パスツール大学病院の倫理委員会によって承認された。ヒト糞便微生物叢移植に最適なドナーを選択する際には、以下のようなアナムネティックデータを考慮した：体格指数（BMI）が30を超えないこと、そして、セリアック病、過敏性腸症候群、様々なタイプの大腸炎、炎症性腸疾患、ヘリコバクター・ピロリ菌による感染症、最近の下痢性疾患、過去3ヶ月間の抗生物質の服用、免疫抑制薬の使用、過去6ヶ月以内の第三世界諸国への渡航歴など、ドナーのライフスタイルが考慮された。FMTドナーの複雑な微生物学的（細菌学的、ウイルス学的）および寄生虫学的検査には、血液病原体であるサルモネラ菌、赤痢菌、クロストリジウム・ディフィシル菌（GDHおよび毒素A、B）のスクリーニングが含まれる； HIV、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、E型肝炎、トレポネーマ・パリダム、大腸菌（腸管毒素原性、腸侵入性、腸病原性、腸凝集性、志賀様毒素産生株）、ビブリオコレラ種、カンピロバクター属の血清学的検査。寄生虫検査ではストロンギロイデス属、ジアルジア属、クリプトスポリジウム属、エンタモエバ・ヒストリティカを、ウイルス検査ではサイトメガロウイルス（CMV）、ロタウイルス、ノロウイルスIおよびII、アデノウイルス40および41を検出した。炎症マーカーのうち、カルプロテクチンについてはドナーの便を免疫学的に検査した。われわれの研究で使用したヒトFMTドナーは、35歳の男性で、BMI指数は24であり、上記の条件をすべて満たし、非喫煙者で禁欲的であり、特定の食事パターンを守っておらず、過去6ヵ月間に第三世界諸国を訪問しておらず、選択的検査項目はすべて陰性であった。
2.4.2. 糞便微生物叢移植の処理
便は、ドナーのスクリーニング検査後、遅くとも1ヵ月以内に、安全クラスIIのラミナリーボックス（TelStar, Bio II Advance, Terrassa, Spain）で、糞便採取後6時間以内に処理された。ヒトFMTの調製には、提供された便50gを用い、これに生理的食塩水250mLを加えた。この混合物を、ステンレス製ミキサー（Waring 7011HS Speed Heavy-Duty Lab Blender, Stamford, CT, USA）で、22,000回転/分で4～5回、2回に分けてホモジナイズした。得られた混合物を、メッシュ2.0→1.0→0.5→0.25 mmの一連の実験室用ふるいで濾過し、より大きなサイズの非消化粒子を除去した。ろ過後の便を-4℃で15分間、6000回転/分で遠心分離した（Hettich™ ROTINA 420 R, Andreas Hettich GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany）。上清を除去し、得られたペレットを125mLの生理的食塩水に懸濁した。凍結保護剤として滅菌医薬用グリセロールを最終濃度10%でFMTに添加した。処理したFMTは、5mLの凍結バイアル（TruCool® Cryogenic Vials, BioCision LLC, Mill Valley, CA, USA）に入れ、使用まで-70℃で保存した。
2.5. 臨床的大腸炎の評価
大腸炎の臨床的活動性を判定するために、我々の先行研究 [32] に従って疾患活動性指数 (DAI) のような特定の基準を用いた。結果を表 1 に示す。
表1. 疾患活動性指数（DAI）スコア。

2.6. 血液学的分析
マウスの血漿をパスツールピペットで眼窩洞からK3-エチレンジアミン四酢酸（K3EDTA）を含むチューブに採取した。分析はオートアナライザーBC-2008 VET（Mindray, Shenzhen, China）を用いて行った。
2.7. 微生物学的分析
2.7.1. 微生物培養
0.5gの生物試料（糞便、盲腸内容物）を無菌的に採取した。これらをホモジナイズし（Stomacher Lab Blender 80, Seward Medical Limited, London, UK）、正確に定義された組成の栄養寒天を含むペトリ皿で静置培養した。以下の培地を使用した：好気的培養（37.5℃で24時間）には、5％脱血ラム血を加えたトリプシン大豆寒天培地（Biolife社、ミラノ、イタリア）、嫌気的条件下（37.5℃で48時間）での細菌培養には、Schaedler寒天培地（HiMedia Laboratories社、ムンバイ、インド）。嫌気性環境の形成には化学的方法を用い、密閉された嫌気スタット（BBL GasPak™ EZ Container Systems BD Diagnostics, Cockeysville, MD, USA）内で、素酸素（O2）を含まない雰囲気（BBL GasPak™ Plus, BD, Cockeysville, MD, USA）を得るための嫌気性生物生成装置を使用した。
2.7.2. 盲腸内微生物の生存率
実験用マウスの盲腸内の細菌細胞の生存率（生存率）の評価は、サンプルをカルボキシフルオレセインジアセテート（Sigma-Aldrich、Saint Louis、MO、USA）でインキュベートした後、フローサイトメーターBD FACS Canto（Becton Dickinson and Company、Franklin Lakes、NJ、USA）を用いて、以前の研究[32]で発表された手順で行った。細菌の生存率（％）は、BD FACS DivaTM software v6.1.3（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）を用いて作成したヒストグラムで表した。
2.7.3. 培養可能な細菌の同定
DNAは、生物学的検体の微生物学的培養によって得られた純粋な細菌培養物から単離した。市販のキットZymoBIOMICS DNA Kits（Zymo Research, Irvine, CA, USA）の製造者の指示に従ってDNAを抽出した。抽出したDNAは、サーモサイクラーTProfesional Basic（Biometra GmbH, Göttingen, Germany）を用いて、27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）と1492R（5′-CGGYTACCTTGTTACGACTT-3′）のユニバーサルプライマーを用いてPCR反応により増幅した。PCRプロトコルは、94℃で5分間のいわゆるホットスタート、94℃で1分間、55℃で1分間、72℃で3分間の31サイクル、および72℃で10分間の最終延長工程からなる。得られたリボソームRNAの16Sサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列は、Blast-n解析によりGenBankデータベースと比較した。
2.7.4. NGS Amplicon Sequencingに基づく細菌叢組成の検出
SPFマウス糞便、糞便ドナーFMT、盲腸FMT群（n = 3）およびDSS-FMT群（n = 4）のプール検体である体積1gの生物学的サンプルを採取し、DNA抽出まで-70℃で保存した。DNA の抽出は、市販のキット ZR Fecal DNA MiniPrep™（Zymo Research, Irvine, CA, USA）を用い、製造者の指示に従って行った。抽出したDNAの濃度の分析的検証は、NanoDrop™ 1000 Spectrophotometer（Thermo Fisher Scientific, Wilmington, NC, USA）を用いて行った。抽出されたDNAは、16S rRNA遺伝子アンプリコンライブラリーの調製と塩基配列決定のため、スイスのMicrosynth AGに送られた。16S rRNA遺伝子のV3-V4領域は、Illumina MiSeqプラットフォームで2×250 bpリードでシーケンスした。生のリードを提供し、デマルチプレックスし、Cutadapt [33]を用いて生物学的プライマーを除去した。得られたリードの品質はfastQC [34]を用いて検査し、さらなるバイオインフォマティクス処理はRStudio（R v4.1.1）でdada2パッケージv1.20 [35]を用いてデフォルトパラメータで実施した。フォワードリードとリバースリードをそれぞれ225bpと223bpにトリミングし、最大予想エラー率を2として、Nsを許容しないようにした。さらに、デフォルトのパラメーターを用いてこれらをマージし、"consensus "という方法でキメラを除去した。10サンプルから合計734のアンプリコン配列バリアント（ASV）と313,291の配列が得られ、サンプルあたりの平均配列数は31,329±4057であった。ASVはSILVA reference database version 138 [36]を用いて分類学的に分類した。細菌群集解析はRパッケージphyloseq v1.36 [37]とvegan v2.6-2 [38]を用いて行い、プロットはggplot2パッケージv3.3.5 [39]を用いて可視化した。アルファ多様性指標は、ASVレベルでフィルタリングされていない全コミュニティを用いて計算した。16S rRNAライブラリーのRawリードは、NCBI Sequence Read Archive (SRA)にアクセッション番号PRJNA1016130で寄託されている。
2.7.5. 大腸菌の病原性因子をコードする遺伝子を同定するためのマルチプレックスプロトコルのPCR
PCR反応のプロトコールは以下の通りである： 95℃-3分（94℃-30秒、63℃-90秒、72℃-90秒） 30サイクル、75℃-5分。大腸菌11501-O:149株（K88+、LTF+、STb+）のDNA濃度c = 10 ng/µLを陽性対照として用いた。以下のプライマーを使用した： K88: P1FW 5′-GTA TCT GTC CGA GAA TAT CA-3′ a P1Rev 5′-GTT GGT ACA GGT CTT AAT GG-3′（478 bpの生成物の予想サイズ）、LTF．P2Fw 5′-GGC GTT ACT ATC CTC TCT AT-3′ a P2Rev 5′-TGG TCT CGG TCA GAT ATG T-3′（生成物の予想サイズ274bp）、およびSTb．P3Fw、5′-TGC CTA TGC ATC TAC ACA AT-3′、P3Rev、5′-CTC CAG TAC CAT CTC TA-3′（生成物の予想サイズ124bp）。DNAzol direct（Molecular research centre, Cincinnati, OH, USA）を用いて検体のDNAを単離した。PCR増幅産物は、3％アガロースゲル分離でGelRed（Biotium, Fremont, CA, USA）を用いて核酸を蛍光染色し、紫外線下で可視化した。
2.8. 組織学的および免疫組織化学的分析
各群のマウス（n = 5-7/群）から大腸（遠位部）を分離し、PBSで内容物を除去した後、PBS（pH 7.2）中4％パラホルムアルデヒドで8℃、72時間固定した。水道水ですすいだ後、一連のエタノール濃度を用いて大腸を脱水し、パラフィンブロックに包埋した。大腸のパラフィン切片（厚さ7 µm）を標準的な手順で処理し、組織学的分析に用いた。組織切片の一部をHarrison's haematoxylin and eosin (H&E)で染色し、炎症と組織損傷の強さを調べた。2枚目の切片は、0.9%アルシアンブルー溶液、0.045%サフラニン溶液で染色し、ゴブレット細胞とその分泌物を可視化した（水色に見える）。その後、切片を脱水、清拭し、Histochoiceマウンティングメディウム（Amresco LLC, Solon, OH, USA）でマウントした。各群の結腸／マウスについて、重ならない5切片を組織学的活性指数（HAI）の測定に用いた。次に、Olympus Microscope BX51とDigital Analysis Imaging system "Analysis Docu" (Soft Imaging System 3.0, Prague, Czech Republic)を用いて、50個の絨毛の長さと50個の陰窩の深さについて形態分析を行った。タンパク質PCNAと抗アポトーシスBcl-xL（B細胞リンパ腫-特大）、炎症マーカーiNOS（誘導性一酸化窒素合成酵素）とCOX2（シクロオキシゲナーゼ2）の発現を免疫組織化学的に評価した。抗原除去は、スライドをクエン酸緩衝液で2分間煮沸した後、以前の研究[32]に記載された手順で行った。簡単に言えば、切片を以下の一次抗体とインキュベートした：抗PCNA（マウスモノクローナル）および抗Bcl-xL（マウスモノクローナル；いずれも希釈度1：250）4℃で一晩。抗iNOS（マウスモノクローナル）および抗COX2（マウスモノクローナル；いずれも希釈度1：50）と37℃で1時間インキュベートした（すべての抗体はSanta Cruz Biotechnology Inc.）二次ヤギ抗マウスIgG抗体（Dako REAL™ EnVision™/HRP, Rabbit/Mouse (ENV), ready-to-use, Dako, Denmark）とのインキュベーションを室温で2時間行い、発色剤としてジアミノベンジジン（DAB）を使用した（Dako REAL™ DAB+ Chromogen, Dako, Denmark）。結腸組織における免疫組織化学反応の強度を定量的に評価するため、各検査動物（各群n = 6）の切片から約6枚の画像を、パブリックドメインのImageJソフトウェアv1.8.0（National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA）を用いて解析した。免疫陽性シグナルを示したすべての細胞の輪郭を手作業でマークし、褐色免疫反応産物の強度を相対光学密度（ROD）として表し、Smolen [40]およびGancarcikovaら[32]による我々の以前の研究に記載された式を用いて計算した。
病理組織学的所見の評価
組織学的分析と粘膜の完全性は、経験豊富な病理学者が盲検下で評価・分類し、組織学的スコア（上皮びらん、陰窩の消失、炎症細胞の浸潤）は、Gancarcikovaらの先行研究[32]に従い、表2に示すパラメータに基づいて評価した。ゴブレット細胞の減少は形態分析を用いて判定し、クリプト間粘液とクリプトプルーム粘液の混合組織によって形成された陽性染色粘液の面積を測定した（表2）。
表2. 結腸の組織学的活性指数（HAI）。

2.9. RNA抽出、cDNA合成、リアルタイムRT-PCR
マウスから摘出した大腸の内容物をPBSを用いて除去し、遠位部（長さ2-3 mm）を剥離、洗浄し、RNAlater（Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA）に浸漬し、-80℃で保存した。大腸組織をRiboZol TM RNA Extraction Reagent (VWR)でホモジナイズし、製造元の説明書に従って全RNAを単離した。RNAの濃度と純度はAstraGene spectrophotometer（Harston, Cambridge, UK）を用いて測定した。DSSおよびDSS+FMTを投与されたマウスから単離されたRNAは、DSS多糖類を除去することを目的としたViennoisら[41]によって記述されたプロトコールに従った後、さらに精製された。簡単に説明すると、RNAは8M塩化リチウムを用いて単離し、3M酢酸ナトリウム（pH5.2）で沈殿させた（いずれもSigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA）。次に、RevertAid H Minus M-MuLV逆転写酵素と100pmolのオリゴdTプライマーを用い、20UのRNase阻害剤と1mMのdNTPmix（すべてThermoScientific社、Burlington, ON, Canada）を反応液に加えた。mRNA種の相対的存在量の定量的RT-PCR分析では、iTaq SYBR greenマスターミックス（BioRad, Hercules, CA, USA）とiNOS、COX2、TNF-α、IL-6、IL-1β、TGF-β、IL-10のオリゴヌクレオチド対、およびマウスハウスキーピング遺伝子GAPDHのオリゴヌクレオチド2組を用いた反応で、cDNAが鋳型となった。単一産物の増幅を確認するために、メルティングカーブ解析を用いた。すべてのRT-PCRはCFX96サーモサイクラー（BioRad, Hercules, CA, USA）で行った。Ct値はハウスキーピング遺伝子の両産物のCt値に対して正規化し、2-∆∆Ct法を用いて相対的な遺伝子発現として表した。キャリブレーターとして、無処置の健常マウス大腸組織（n = 5）のコントロールサンプルのCt値を用いた。次に、各サンプルの相対遺伝子発現の平均値±SDを算出した。プライマーとその配列のリストを補足資料（Table S1）に示す。
マウスから摘出した大腸の内部をPBSを用いて除去し、遠位部（長さ2-3 mm）を解剖、洗浄し、RNAlater（Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA）に浸漬し、-80℃で保存した。大腸組織をRiboZol TM RNA Extraction Reagent (VWR)でホモジナイズし、製造元の説明書に従って全RNAを単離した。RNAの濃度と純度はAstraGene spectrophotometer（Harston, Cambridge, UK）を用いて測定した。DSSおよびDSS+FMTを投与されたマウスから単離されたRNAは、DSS多糖類を除去することを目的としたViennoisら[41]によって記述されたプロトコールに従った後、さらに精製された。簡単に説明すると、RNAは8M塩化リチウムを用いて単離し、3M酢酸ナトリウム（pH5.2）で沈殿させた（いずれもSigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA）。次に、RevertAid H Minus M-MuLV逆転写酵素と100pmolのオリゴdTプライマーを用い、20UのRNase阻害剤と1mMのdNTPmix（すべてThermoScientific社、Burlington, ON, Canada）を反応液に加えた。mRNA種の相対的存在量の定量的RT-PCR分析では、iTaq SYBR greenマスターミックス（BioRad, Hercules, CA, USA）とiNOS、COX2、TNF-α、IL-6、IL-1β、TGF-β、IL-10のオリゴヌクレオチド対、およびマウスハウスキーピング遺伝子GAPDHのオリゴヌクレオチド2組を用いた反応で、cDNAが鋳型となった。単一産物の増幅を確認するために、メルティングカーブ解析を用いた。すべてのRT-PCRはCFX96サーモサイクラー（BioRad, Hercules, CA, USA）で行った。Ct値はハウスキーピング遺伝子の両産物のCt値に対して正規化し、2-∆∆Ct法を用いて相対的な遺伝子発現として表した。キャリブレーターとして、無処置の健常マウス大腸組織（n = 5）のコントロールサンプルのCt値を用いた。次に、各サンプルの相対遺伝子発現の平均値±SDを算出した。プライマーとその配列のリストを補足資料（Table S1）に示す。
2.10. 統計解析
多様な変数間の両側線形依存性の相関は、ピアソン相関係数を用いて決定した。ピアソン相関係数は95%の信頼性区間に基づいており、p < 0.05は統計的に有意とみなされる。統計解析は、GraphPad Prism 5.0 for Windows（GraphPad Software, San Diego, CA, USA）を用いて行った。分子生物学的、免疫組織化学的、臨床的、血液学的、組織学的解析から得られたデータは、一元配置分散分析（one-way ANOVA）により評価し、続いて多重比較を用いてTukey post hoc testを行った。実験動物間の有意差は、分散分析および非対Student t-testで検定した。結果は平均値±SDで表した。結果間の差は、少なくともp < 0.05で有意とみなした。ANOSIM（類似性分析）統計検定は、FMT群とDSS-FMT群のサンプルの群集組成の差を計算するために使用した。FMT群とDSS- FMT群間のα多様性指標の有意性の算出にはMann-Whitneyノンパラメトリック検定を用い、FMT群とDSS- FMT群間の選択細菌分類群の相対存在量の有意性の算出にはvegan RパッケージとGraphPadソフトウェアを用いた。
3. 結果
3.1. ドナーのFMTの微生物学的組成の次世代シーケンス（NGS）解析
アンプリコンシークエンシング（16S rRNAのV3-V4領域）を用いたNGSデータの解析により、ヒト便移植は6つの異なる細菌門から構成され（図S1b）、合わせてドナーの糞便微生物叢の98.9％を占め、ファーミキューテス門（58.94％）、バクテロイデーテス門（20.68％）、およびアクチノバクテリオータ門（18.47％）であることが明らかになった。バクテロイデーテス門は主にバクテロイデス科（図S1c；17.34％）でバクテロイデス属（図S1d；17.34％）が優勢であり、放線菌門はビフィドバクテリウム科（図S1d；17.13％）でビフィドバクテリウム属が優勢であった。バクテロイデーテスおよびアクチノバクテリオータとは対照的に、ヒトドナーの糞便中のファーミキューテス門の代表は、より多様な属の混合物を形成しており（図S1d）、ラクノスピラ科の属（図S1c；39. 99％）、すなわちフシカテニバクター属（9.99％）、ブラウチア属（9.54％）、アネロスチペス属（6.40％）、コプロコッカス属（3.31％）、ドレア属（3.19％）、アガトバクター属（2.89％）およびラクノスピラ属（1.05％）が優勢であった。Ruminococcaceae科（図S1c；9.96％）のうち、優勢な属（図S1d）はFaecalibacterium属（7.25％）とSubdoligranulum属（2.09％）であった。ファーミキューテス門の代表のうち、分類されていないLachnospiraceae（1.17％）とIntestinibacter（1.11％）も存在した。Roseburia属の他の代表者、非分類Ruminococcaceae、EnterococcusおよびLachnoclostridiumは、ヒトFMTにおいて1％を超えることはなかった。NGSデータの解析から、ヒトの便から調製した移植片には病原性種が含まれておらず、FMTは潰瘍性大腸炎の発症に関与する病原性微生物の保菌者ではなく、リストアップされた移植者がこの種の研究に適したFMTドナーであることが確認された。
3.2. 従来のSPFマウスの糞便の細菌組成
従来型SPFマウスの糞便のNGSアンプリコンシークエンシングの結果、98.16％がファーミキューテス（54.15％）とバクテロイデーテス（44.01％）の2つの門で占められていた（図S1a）：プロテオバクテリウム（0.83％）、カンピロバクテリウム（0.40％）、デスルホバクテリウム（0.33％）、アクチノバクテリウム（0.24％）。バクテロイデーテス門（図S1a）は、主にムリバキュラ科（13.66％）、マリニフィラ科（12.02％）、リケネラ科（8.95％）、バクテロイデーテス科（5.94％）で代表され、プレボテラ科（3.24％）は少なかった。主な属（図S1d）はオドリバクター属（12.02％）、アリスティペス属（8.38％）、バクテロイデス属（5.94％）で、アロプレボテラ属（2.88％）の代表も存在し、1％以下の割合で検出された属はリキネラ属（0.39％）、プレボテラ科UCG 001属（0.36％）、パラバクテロイデス属（0.20％）であった。ATB投与前のSPF動物の糞便微生物叢では、ファーミキューテス門は様々なファミリーが混在しており（図S1c）、Lachnospiraceae（29.95%）が優勢で、Enterococcaceae（7.97%）、Lactobacillaceae（4.99%）、Oscillospiraceae（4.29%）、Ruminococcaceae（1.19%）は少なかった。Lachnospiraceae NK4A136 (9.83%)、Enterococcus属 (7.97%)、Lachnospiraceae UCG 006 (5.36%)、Lactobacillus属 (4.99%)が優勢で、より多様な属群が存在することが観察された（図S1d）。また、Marvinbryantia属（2.67%）、ASF 356属（2.31%）、Oscillibacter属（1.78%）、Lachnoclostridium属（1.6%）も存在した。これらのデータは、明らかにSPFマウス系統BALB/cにおける腸内微生物の十分な豊富さを示しており、潰瘍性大腸炎の病因に関与する病原性微生物の存在を確認するものではない。
3.3. 動物への抗生物質投与は糞便微生物叢の生存率に悪影響を及ぼした
抗生物質による除菌（アモキシシリンとクラブラン酸の経口投与およびシプロフロキサシンの経口投与）後、蛍光活性化細胞選別法（FACS）によりマウスの糞便微生物叢の生存率が低下した疑似無菌動物モデルを得た（図1b-d）。ATBの5日間投与は、ATB投与前（図1b；77.0±1.14％）と比較して、細菌の生存率（図1c；18.15±2.09％）の有意な減少（p＜0.001）によって反映されるように、糞便微生物叢の生存率に悪影響を与えた。広域抗生物質の投与により大部分の細菌種がかなり減少したが、一部の微生物は腸内に残存していた。これは、ATB投与終了後10日間の間隔を置いた後に、糞便微生物叢の生存率が64.5±6.05%（図1d）という有意に高いレベル（p < 0.001）で確認されたことからも明らかである。
3.4. 急性大腸炎に対するFMT効果の臨床的評価
腸内細菌叢が減少したPGFモデルを得た後、マウスを2群に分けた：潰瘍性大腸炎を誘導しないFMT群と、5％DSSを5.5日間投与して急性大腸炎を誘導した群（DSS-FMT）に分けた。動物が飲料水中の黄砂を個々に摂取しているため、直腸出血や体重減少を含む潰瘍性大腸炎の臨床像（表3）が個々に発現していることに基づいて、DSS-FMTマウスを軽症（DSS-FMT/Mi）、中等症（DSS-FMT/Mo）、重症（活動性）（DSS-FMT/S）のグループに分けた。
表3. 潰瘍性大腸炎の臨床像の形態

3.4.1. FMTは動物の直腸出血を軽減する
黄砂による大腸炎の実験モデルでは、直腸出血と潜在性血球減少がみられる。このような出血は、上皮障害、特に上皮下細胞が黄砂の影響を受け、毛細血管病変が生じ、内腔の血液が失われるメカニズムと一致する。すべての型のUCを有する動物において、我々は直腸出血のスコアの有意な漸増（p ˂ 0.05）を観察した（図2a）。黄砂曝露4日目から5.5日目にかけて、UC活性の軽度なPGFマウスでは、直腸出血のスコアは平均0.75から1.25であり、糞便中にはわずかな血液の痕跡が観察されたのみであった。臨床像によると、軽度の疾患活動性のグループには6匹しか含まれていなかった。中等度（n = 9、DSS-FMT/Mo）および重度のUC活性を有するマウス（n = 12、DSS-FMT/S）では、直腸出血はDSS曝露4日目および5日目に有意に増加し続け（p ˂ 0.05）、スコアは0.95から1.43の間であった。UC活性の個体差は、DSS曝露5日後および12時間後に観察され（図2a）、重篤なUC活性を有するマウス（DSS-FMT/S）で最も高いスコアが記録され、直腸出血のレベル（1.82）は肛門からの中等度の出血を示した。DSSへの曝露を中止し、ヒト糞便微生物叢移植を行った後でも、DSS-FMT群では直腸出血が認められたが、その強さは個体差であった（図2a）。FMT投与2日目まで、すべてのUC型で直腸出血のスコアが徐々に上昇し、軽度のUC活性（DSS-FMT/Mi）のスコアレベルが1.6であったのに比べ、DSS-FMT/MoおよびDSS-FMT/Sでは最高レベルの2.0に達した。その後の期間において、DSS-FMT/Mi群の動物は、FMT投与3日目の直腸出血のスコアが他の2つのUC型と比較して有意に低く（0.6；p ˊ 0.05）、投与4日目のスコアが重度のUC活性を有する群と比較して有意に低い（0.25；p ˊ 0.001）ことにより確認され、FMTによる治療のプラスの効果を示した。中等度UC活性のマウスでは、FMT治療の好影響は投与3日目と4日目にも観察された。これらの動物における直腸出血は有意な減少を示し（p ˂ 0.01）、FMT投与4日目のスコアは重度のUC活性を有する動物に比べ有意に低かった（0.85；p ˂ 0.01）。これとは逆に、DSS-FMT/S動物における直腸出血のスコアはFMT治療終了まで比較的高いままであり、1.4～2の範囲であった。腸壁の広範な形態学的変化は、腸粘膜の透過性の潜在的な増加と細菌移行のリスクに関連している。重症型UCの2匹のマウスは、FMT投与3日目に死亡した。このとき、16S rRNAの可変領域を増幅するPCR反応によって、腹腔滲出液中に大腸菌のトランスロケーションが確認された（図2b）。得られた長さ1082bpの塩基配列を、一般的なデータベースであるGenBankを用いてBLAST-n解析を行ったところ、Genbank MK621216.1に登録されている大腸菌と98.24％の類似性が検出された。GenBankに登録された大腸菌のDNA配列のアクセッション番号はOR939683であった。転移してきた大腸菌の病原性遺伝子（K88, LTF, STb）の有無をPCRで検査した結果（図2b）、これらの遺伝子は確認されず、非病原性菌の転移してきたことが敗血症の原因であった。
Biomedicines 12 00043 g002図2. FMTの効果の臨床的評価。(a）直腸出血。(b）転移してきた大腸菌の病原性遺伝子（K88、LT、STba）のMultiplex PCRによる陰性PCR検出。(c）（1-6）死後所見の代表図。(c)(1)ATB投与後の腸内細菌叢の顕著な減少に伴う鼓腸と盲腸の拡大。(c)(2)ATB投与後10日目の腸内細菌叢異常時の巨腸。(c)(3)FMT投与後のdysbiotic microbiotaのポジティブアジャストメント。(c）（4）軽度のUC活性。(c）（5）中等度のUC腸炎の活動性。(c)(6)重度のUC-出血性腸炎の活動性。(d) DSSおよびFMT投与5日後の体重減少。(e) DSS投与5日後の疾患活動性指数。(f）FMT投与5日後の疾患活動指数。FMT（UC誘導のない動物群、FMT投与あり、n＝18）；DSS-FMT/Mi（UC誘導のある動物群、FMT治療-軽症型、n＝6）；DSS-FMT/Mo（UC誘導のある動物群、FMT治療-中等症型、n＝9）；DSS-FMT/S（UC誘導のある動物群、FMT治療-重症型、n＝12）。a, b p < 0.05; A,B p < 0.01（グループ内の統計的差異）; * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001（UC型間の有意差）。X p < 0.05; Y p < 0.01; Z p < 0.001（黄砂期間とFMT投与の間の有意差）。
3.4.2. FMT投与はDSS誘発大腸炎後のマウスの総体重減少を減少させる
重篤なUC活性を有する動物では、他の2つのUC形態と比較して、DSS曝露5日目に最も高い体重減少（p ˂ 0.05）が記録され、5.5日後の体重減少スコアは0.64に達し、これは5～10％の総体重減少に相当した。DSS-FMT/Mi群の動物にFMTを施したところ、直腸出血スコアで観察されたのと同様に、総体重減少スコア（図2d）が減少した。この群では、スコア0.3までの体重減少はFMT投与3日目までしか観察されなかった。DSS-FMT/Mo群およびDSS-FMT/S群では逆の傾向が観察され、FMT投与3日目のスコア1.14をピークとする総体重減少が同様の傾向を示し、体重減少は10％前後で変動した。FMT治療5日目には、体重減少スコアが0.43に減少し、これらの群では、有意ではないが、より顕著な体重の調整が検出された。
3.4.3. DAI調整に対するFMTの効果
5.5日間のDSS曝露後、最も高い疾患活動性指数（DAI、図2e）は、DSS-FMT/S群の動物で観察された。これらの動物は、軽度のUC活性を有する動物と比較して有意に高いDAIを示し（p ˂ 0.05）、10点満点で4.6レベルに達した。UCのすべての形態において、我々は、中等度および重篤なUC活性におけるこのパラメータの有意な減少（p ンスコア0.05）、ならびにDSS曝露後の期間と比較したDSS-FMT/MiマウスにおけるDAI（p ンスコア0.01）の有意な減少によって確認された総DAI（図2f）に対するFMT治療のプラスの効果を記録した。しかし、この有意な減少にもかかわらず、DSS-FMT/SマウスのDAIは比較的高く、そのスコアレベル（3.25）が高いため、活動性が軽度でスコア1.6の動物のDAIと比較して有意に高かった（p ˂ 0.05）。
3.4.4. FMTはDSS誘発大腸炎後のマウスの病理解剖学的所見の調整を引き起こす
糞便微生物叢移植後の重要な病理解剖学的所見のひとつは、DSS-FMT群の69.8％の動物で観察された脾臓の大きさの調整であった。しかし、DSS-FMTマウスの脾臓の相対重量は、UCを誘導しなかった群（FMT）と比較して、依然として有意に高かった（p ˂ 0.05）。同様に、数倍に肥大した盲腸の調整も観察されたが、これは腸内細菌叢の顕著な減少に起因しており、その大きさは75％のマウスで調整されていた（図2c（1-3））。DSSの肝毒性および腎毒性作用により、DSS-FMT動物の31.2%で腎臓の肥大が、18.75%で肝臓の肥大が観察され、これらの動物ではFMT群と比較して肝臓の相対重量も高かった（p ˂ 0.01）。FMT投与により、腸炎（図2c(5,6)）、特にその出血型（図2c(6)）の発生も21.6％減少した。
3.5. DSS誘発急性大腸炎マウスの血液学的パラメーターに対するFMTの効果
3.5.1. 急性大腸炎誘発 PGF 動物モデルにおける血液学的パラメーター
UCのような全身性炎症性疾患は総循環白血球（WBC）レベルに影響を及ぼす。白血球数の調査（表4）により、5.5日間のDSSへの曝露により、すべてのDSS-FMT型のUCとFMT群との間で、観察されたすべてのパラメータに有意差が生じたことが示された。
表4. DSSおよび5日間FMT投与後のPGF動物モデルにおける血液学的パラメータのレベル。

血液学的分析では、対照のFMT群と比較して、特に潰瘍性大腸炎の中等症型（DSS-FMT/Mo）から重症型（DSS-FMT/S）の群で観察された総白血球増加を明らかにした。重篤な潰瘍性大腸炎の動物（DSS-FMT/S）では、リンパ球（Lys）と同様に白血球の総数が有意に高い（p < 0.05）ことが観察された。顆粒球(Grans)の割合が高く、UCのない群(FMT)と比較して2.7倍高い値は、これらの動物における急性炎症プロセスを示した。WBC数の増加は活発な潰瘍性大腸炎を意味し、WBCが浸潤した炎症性病変の特徴である。進行中の炎症過程は、中等症および軽症のUC（DSS-FMT/Mo、Mi）でも確認されたが、その強度は低く、FMTと比較して総WBC数が有意に（p < 0.001）高いことが特徴であったが、DSS-FMT/S群と比較して2〜2.6倍低かった。UC活性の両形態（Mi、Mo）では、FMT群と比較してLy数が有意に（p＜0.001）高く、Granおよび単球（Mo）数が高かった（p＜0.01）。
上記の所見と同様に、赤血球数においても、DSS-FMT群と対照FMT群のすべてのUC型の間で有意差が観察された（表4）。DSS-FMT/Sマウスでは、急性出血に起因する貧血が確認され、FMT群と比較して赤血球数（RBC）、ヘマトクリット値（HCT）、ヘモグロビン濃度（HGB）が有意に低く（p＜0.001）、平均赤血球ヘモグロビン（MCH）が高かった。大腸炎再燃時の血液喪失は貧血にかなり寄与し、直腸・結腸粘膜の潰瘍性炎症性変化と関連している。末梢循環における血小板の活性化が亢進し、急性出血による貧血が顕著な血小板増加によって確認された。出血を止め、血管内皮の完全性を維持する主な役割を持つ無核成分としての血小板（PLT）は、DSS-FMT/S群では、FMT群と比較してだけでなく、UC活性が軽度（DSS-FMT/Mi、p < 0.01）および中等度（DSS-FMT/Mo、p < 0.05）の動物とも比較して、有意に高い数（p < 0.001）で存在した。DSS-FMT/Mo群では逆の傾向が観察され、FMT群と比較して、赤血球の数、HCT、HGB、MCHのレベル、平均赤血球容積（MCV）が有意に増加（p < 0.001）し、脱水による相対的な多血小板症を示した。UCの軽症型（DSS-FMT/Mi）の動物では、赤血球のパラメータはFMT群で決定されたレベルであった。UCを誘発しなかった動物（FMT）と比較して、観察された唯一の違いは、PLTの割合が有意に高い（p < 0.001）ことであり、これは損傷した血管内皮の修復による血小板への負荷の増加を示していた。しかし、DSS-FMT/Miマウスで検出された軽度の出血は、他の赤血球パラメーターには影響しなかった。このことは、UC型（DSS-FMT/Mo, S）と比較してPLTの割合が有意に低いこと（p < 0.001, p < 0.01）でも確認された。
3.5.2. DSS誘発急性大腸炎マウスにおける血液学的パラメーターの回復に対するFMTのプラス効果
5 日間の FMT 療法後の白血球数の解析（表 4）では、DSS-FMT 群と FMT 群のすべての UC 型の間で、調査したすべてのパラメータに有意差が認められた。
軽度および中等度のUCを有する動物では、WBC、Lys、MosおよびGransの減少によって確認された動物の炎症反応の緩和という点で、FMT治療によるプラスの効果があり、軽度のUCを有する群（DSS-FMT/Mi）では、WBCおよびLysの数が有意に減少した（p＜0.01）。重篤なUCの動物（DSS-FMT/S）では、DSS投与後と比較してWBC数が減少したにもかかわらず、FMT群と比較してMosとGransの割合が有意に増加し（p < 0.01）、DSS曝露後と比較してMosの割合が有意に増加した（p < 0.05）。すべてのUC型で赤血球成分の回復にFMT投与がプラスの効果を示したにもかかわらず、DSS-FMT/Sマウスでは急性出血による貧血が確認され、DSS曝露後に検出された貧血と類似していた。この貧血は、FMT群と比較して、赤血球数、HGBレベル（p＜0.001）、HCT（p＜0.05）、およびMCH（p＜0.01）の有意な増加を伴っていた。FMT治療によりDSS-FMT/S群ではPLTが積極的に減少したが、FMT群と比較して血小板の割合が有意に高く（p < 0.001）、急性出血による血小板増多と貧血が確認された。中等度UCの動物では逆の傾向が観察された。FMT群と比較して、赤血球数、HCT、HGB、MCHのレベル（p<0.01）、MCVのレベル（p<0.05）が有意に増加しており、脱水による相対的な多血症や血液濃縮の予後がより有望であることが示唆された。しかし、血小板の割合が有意に低い（p < 0.01）ことから、DSS曝露後と比較して、DSS-FMT/Mo群の動物の腸粘膜では重要な修復過程が進行中であることが示唆された。
3.6. 急性潰瘍性大腸炎モデルにおけるFMT投与の効果（光顕および疾患の組織学的活性指数（HAI）の観点から
3.6.1. DSS誘発急性潰瘍性大腸炎の病理組織学的特徴
C15群の健常マウスの大腸の組織像（図3a(1-4)）と5％DSSに曝露した実験群DSS-FMTの大腸の組織切片を比較すると、粘膜中膜と粘膜下膜の組織構造にかなりの損傷が認められた（図3b-d）。動物による5.5日間のDSS水中摂取により、化学的に誘発された3つの臨床型急性潰瘍性大腸炎が発症し、マウス大腸の組織切片の光学顕微鏡検査により確認された。消化管（結腸）の尾側セクションにおける病態生理学的変化は、上皮びらん、炎症浸潤、腸陰窩の破壊または消失、ゴブレット細胞ムチン陽性領域の枯渇/消失の有無の評価（スコア）によって特徴づけられる組織学的活性指数（HAI）として定義された。ゴブレット細胞の数と大きさの減少に代表されるムチンの枯渇は、黄砂曝露によって誘発される急性潰瘍性大腸炎の重要な特徴である。大腸の組織切片の光学顕微鏡で観察された、誘発された急性潰瘍性大腸炎の個々の臨床型の異なる病理組織は、選択的な形態学的パラメータ（絨毛の断面積、絨毛の高さと周囲、陰窩の深さ、絨毛の高さと陰窩の深さの比）の定性的評価によっても確認された。UCの軽症型（DSS-FMT/Mi）に分類されたマウスの結腸粘膜は、化学物質であるDSSに対して最小限の炎症反応を示し、結腸組織の粘膜下層に好中球が適度に分布していることが特徴であった（図3b(1)）。腸陰窩の損傷とゴブレット細胞の消失に関連した中膜粘膜の表面びらんは、最小限の程度であった（Figure 3b(2,3)）。DSS-FMT/Mo群の結腸切片の組織学的写真は活発な炎症を示し、中膜粘膜と漿膜下粘膜に限局した炎症性浸潤の存在によって確認された（図3c(1,2)）。これらの炎症性浸潤は、結腸の表面上皮層の深刻な破壊的変化を伴っていた。中膜粘膜の完全性が損なわれた結果、腸陰窩の変形変化（陰窩炎、不規則陰窩）が生じ、中膜粘膜のある部分では完全に消失していた（図3c(2-4)）。重症型(DSS-FMT/S)の大腸組織を観察したところ、粘膜中膜と粘膜下膜の横から筋層粘膜にまで及ぶ巨大な炎症巣が存在した(図3d(1))。
Biomedicines 12 00043 g003Figure 3. 化学的に誘発された急性UC活性の3つの臨床型の組織病理学的像。(a)(1-4)デキストラン硫酸ナトリウム暴露前のC15対照群（n=12）。(b)(1-4)DSS-FMT/Mi群のUC活性軽度型（n = 6）。(c)(1-4)DSS-FMT/Mo群の中等度UC活性（n = 9）。(d)(1-4) DSS-FMT/S群（n = 12）の重篤なUC活性。炎症細胞の浸潤、陰窩の損傷、上皮のびらん（矢印；ヘマトキシリン-エオシン；100倍）；ゴブレット細胞ムチン陽性領域の枯渇／消失（矢印；アルシアンブルー-サフラニン＋ギルソンヘマトキシリン；100倍）。
炎症反応は、腸陰窩とゴブレット細胞ムチン陽性領域の消失を伴う結腸上皮の変形びらんを伴っていた（図3d(2-4)）。DSS曝露後の両形態のUC（DSS-FMT/Mo、DSS-FMT/S、図4a）に罹患した動物において、DSS-FMT/Mo群の動物ではスコアレベル1.78でムチンの25％喪失に相当し、DSS-FMT/S群ではスコアレベル2.76でムチンの40％喪失に相当するGoblet細胞ムチン陽性領域の消失が確認された。重症型の動物におけるHAI測定では、上皮びらんとゴブレット細胞ムチン陽性領域の減少（r = 0.8715）との間に高い正の相関があり、腸小窩の破壊とゴブレット細胞ムチン陽性領域の喪失（r = 0.9993；p<0.001）との間に有意で非常に高い正の相関があり、びらん性上皮損傷がムチンの減少と腸小窩の損傷に大きく影響していることが確認された。
Biomedicines 12 00043 g004図4. FMT5日間投与後の結腸組織構造の病理組織学的観察。(a)(1-4)FMT対照群は黄砂に曝露せず、FMTを5日間投与した（n = 18）。(b)(1-4) DSS-FMT/Mi-軽度型急性UC活性（n = 6）。(c)(1-4)DSS-FMT/急性UC活性の中等度型（n = 9）。(d)(1-4)DSS-FMT/S-重症型急性UC（n = 12）。炎症細胞の浸潤、陰窩の損傷、上皮のびらん（矢印；ヘマトキシリン-エオシン；100倍）；ゴブレット細胞ムチン陽性領域の枯渇／消失（矢印；アルシアンブルー-サフラニン＋ギルソンヘマトキシリン；100倍）。
大腸の腸管粘液バリアのコンパクトさと完全性に対する黄砂の毒性効果は、HAIスコアと出血の間に高い正の相関（r = 0.8189）が確認されたことからも、黄砂-FMT/S群で明らかであった。DSSの5％多糖類の毒性作用の最も顕著な悪影響は、コントロールのFMT群と比較して、重症型（DSS-FMT/S）のグループに含まれる動物（表S2）で観察され、絨毛の断面と陰窩の深さが最も低く（p < 0.001）、絨毛の高さと周囲が最も低かった（p < 0.01）。DSS-FMT/Sマウスでは、DSS-FMT/Mi、DSS-FMT/Moと比較して、絨毛の断面積と高さが有意に減少し（p < 0.001）、DSS-FMT/Miマウスと比較して、絨毛の周囲と陰窩の深さが減少した（p < 0.001）。
観察された大腸粘膜中膜および粘膜下膜の組織構造は、上皮の変性、ムチンの消失、好中球による固有層および粘膜下層の浸潤、上皮のびらんを伴う腸陰窩炎によって示され、DSS誘発急性潰瘍性大腸炎の組織像と一致した。急性潰瘍性大腸炎の病理組織像は重症型（DSS-FMT/S）群で最も顕著であり、DAIとHAIスコアの間に非常に高い正の相関（r = 0.8189）が検出された。
3.6.2. FMTは疾患の組織学的活動性指標を変化させる
軽症型DSS-FMT/Miに分類され、ヒトFMTで治療された動物の結腸粘膜を光学顕微鏡で観察したところ、HAIの調整（図5b(1-4)）、中膜粘膜の完全性の回復、上皮びらんの欠如、ならびに定性的形態学的パラメーターの修正が認められた（表S2）。FMT治療の好影響は、対照群FMT（図5a（1-4））および両形態のUC（DSS-FMT/Mo、DSS-FMT/S）と比較しただけでなく、急性UC誘発後の期間とも比較して、絨毛の断面積、絨毛の高さ、陰窩の深さ（p＜0.001）が有意に増加したことで確認された（p＜0.05）。軽症のUCを有する動物におけるFMTのこの好影響は、低用量で結腸細胞のエネルギー源となりうる摂取された多糖類DSSの利用によって強調された可能性が高い。DSS-FMT/S群とDSS-FMT/Mo群の大腸の組織切片を観察したところ、FMT治療により、両形態で炎症細胞の浸潤が減少した。このことは、DSS-FMT/Mo群では有意にスコアが低下し（図4b；p ˂ 0.05）、重症型UC群（DSS-FMT/S；0.44）では、DSS曝露後の期間と比較してHAIスコアが有意に低下したことで確認された。このことは、DSS-FMT/Sではゴブレット細胞ムチン陽性面積の減少が有意に減少して0.99点（図4b；p≦0.001）となり、ムチンの減少が20％以下となったこと、DSS-FMT/Moでは0.75点まで減少したことで確認された。DSS-FMT/Mo型の動物におけるFMT治療の好ましい効果は、炎症細胞の浸潤の減少（図5c(1)）、ムチンの回復、上皮びらんによる円柱状上皮中膜粘膜の損傷の減少によって確認されたが、結腸の上皮内膜の完全な再生は達成されなかった（図5c(3,4)）。また、選択的形態学的パラメーターの完全な回復は観察されず（図5c(2)）、DSS曝露期間と比較して、絨毛の周囲および高さが有意に低く（p < 0.05）、絨毛の断面積が低い（p < 0.01）ことが確認された（表S2）。しかし、陰窩の断面積と深さに関しては、コントロールのFMTマウス群とある程度の類似性が見られた。DSS-FMT/S動物との比較では、逆に陽性で、すべての調査パラメータの有意に高い値（p < 0.001）が観察された。ある程度まで、重症型の動物においても、黄砂の毒性作用の緩和に対するFMT治療のプラスの効果が観察された。DSS-FMT/SマウスのFMT治療後、これらの動物は組織学的炎症浸潤のスコアが減少し、腸管ムチンの産生にも好影響を示した。しかし、腸陰窩の変形損傷を反映するスコアはほとんど影響を受けず（図5d(2)）、これは残りの形態学的パラメーターの定性的評価（表S2）によって確認され、この形態では、すべてのパラメーターに顕著な損傷が認められた（図5d(1-4)）。
Biomedicines 12 00043 g005図5. 大腸の組織学的活動指数（HAI）。(a)急性UC誘発後のHAI。(b）FMT投与5日後のHAI。FMT（UC誘導のない動物群、FMT投与あり；n＝18）；DSS-FMT/Mi（UC誘導のある動物群、FMT治療-軽症型；n＝6）；DSS-FMT/Mo（UC誘導のある動物群、FMT治療-中等症型；n＝9）；DSS-FMT/S（UC誘導のある動物群、FMT治療-重症型；n＝12）。結果は平均値±SDで示した。* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001（UC型間の有意差）。X p < 0.05; Z p < 0.001（DSS期間とFMT投与の間の有意差）。
消化管遠位部の組織学的解析から、急性潰瘍性大腸炎モデルにおける糞便微生物叢移植療法の有効性と、UCの3つの臨床状態すべてにおいて観察された組織学的パラメーターの回復にこの療法が多かれ少なかれ寄与していることが示された。しかし、我々の結果は、健康なドナーからのFMTによる治療のみでは、DSS-FMT/MiおよびDSS-FMT/Mo動物と比較して、重篤なUC活性を有する動物（DSS-FMT/S）では期待された治療効果が得られなかったことを示している。
3.7. FMTは潰瘍性大腸炎に関連する選択的な免疫組織化学的マーカーを修飾する
細胞増殖マーカーPCNA（増殖細胞核抗原）と細胞アポトーシスマーカーBcl-xL、炎症マーカーiNOS（一酸化窒素合成酵素）とCOX2（シクロオキシゲナーゼ）を化学的に誘発された潰瘍性大腸炎の大腸組織で免疫組織化学分析によりモニターした。
3.7.1. FMTはPCNAマーカーの発現を調節する
マウスの大腸の免疫組織化学的断面（図6a）を観察すると、PCNA陽性細胞は主に陰窩の基部と固有層に位置していた。マウスの消化管の同じ断面における免疫組織化学反応の強度とPCNA発現の定量化（図6b）は、断面の相対光学密度（ROD）で表され、DSSへの曝露後、FMT群（p ˂ 0.001）と比較してだけでなく、DSS-FMT/Mi群（p ˂ 0.01）とも比較して、中等症および重症型のUCにおいて細胞増殖が有意に低下していることが明らかになった。DSSへの5.5日間の曝露が細胞増殖に及ぼす悪影響は、重篤なUC（DSS-FMT/S）におけるPCNAマーカーと組織学的活性指数（HAI、r = -0.690）の負の中相関が記録されたことでも確認され、組織学的スコアの上昇と細胞増殖の低下との関係が示唆された。同時に、この型のUCでは、Goblet細胞減少スコアとPCNAマーカー（r = -0.567）の間に負の中相関が確認された。糞便微生物叢移植療法は細胞増殖の回復にプラスの効果を示し（図6b）、3つの形態のUCすべてにおいてDSS曝露期間との比較で確認された（Mo, Mi p ˊ 0.001; S p ˊ 0.01）。細胞増殖の最も顕著な増加は、DSS-FMT/Mi形態で記録された。この形態では、PCNAマーカーの相対光学密度（ROD）が、DSS-FMT/MoおよびDSS-FMT/S（p ˂ 0.001）形態だけでなく、UCを誘導しない群（FMT、p ˂ 0.001）とも比較して、有意に高かったからである。
Biomedicines 12 00043 g006図6. FMT群（n＝18）およびDSS-FMT/Mi/Mo/S群（n＝6；n＝9；n＝12）のマウスの結腸の腸壁におけるマーカーPCNAおよびBcL-xLの免疫組織化学的検出。これには、ATBの除染期間（C5；n＝10）、回復期（C15；n＝12）、およびDSSおよびFMT治療への曝露期間が含まれる。(a)増殖細胞核抗原（PCNA）の免疫組織化学的染色強度の代表的画像（倍率400倍）。矢印は陽性反応。(b）マウスの結腸における免疫組織化学反応とPCNA発現の強度を、切片の相対光学密度（ROD）で表した定量化。(c) 抗アポトーシスマーカー(BcL-xL)の免疫組織化学的染色強度の代表的画像（400倍）。矢印は陽性反応。(d) マウスの結腸における免疫組織化学反応の強度とBcL-xLの発現を切片の相対光学密度(ROD)で表した定量化。結果は平均値±SDで示した。* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001（UC型間の有意差）。Y p < 0.01; Z p < 0.001（DSS期間とFMT投与の間の有意差）。
3.7.2. FMTは抗アポトーシスマーカーBcl-xLの発現を調節する
炎症性腸疾患の重要な側面の1つはアポトーシスであり、その発症と進行に関連している。アポトーシスは、細胞の過剰で冗長な構成要素や細胞全体の破壊をもたらす、プログラム可能な細胞の死を伴う。タンパク質Bcl-xLはBcl-2ファミリーの一員で、ミトコンドリアからのチトクロームcの流出を防ぎ、アポトーシスを阻害することから、抗アポトーシスマーカーの役割を果たしている。DSS-FMT群では、DSSによって誘導されたUCのすべての形態において、マウス結腸の切片におけるBcl-xL発現強度の低下が観察され（図6d）、特にDSS-FMT/S形態では、FMT群と比較して有意に低下していた（p ˊ 0.001）。重篤なUCにおける5％DSSへの曝露の負の影響は、Bcl-xLとHAIスコアとの高い負の相関（r = -0.850）、およびGoblet細胞ムチン陽性面積減少スコアとBcl-xLとの低い負の相関（r = -0.340）によっても確認された。マーカーPCNAにおける観察と同様に、抗アポトーシスマーカーBcl-xLのレベルはFMT治療後に増加し、その正の刺激効果が確認された。その結果（図6d）、すべてのUC型において糞便微生物叢の移植後、Bcl-xLマーカーの有意なROD（p ˂ 0.001）がUC誘導期と比較して観察された。そのレベルは、DSS-FMT/Mi型とDSS-FMT/Mo型、およびFMT群との比較で有意に異なっていた（p ˊ 0.05）。
3.7.3. FMTは炎症性COX2マーカーの発現を調節する
シクロオキシゲナーゼ（COX）は、プロスタグランジン、プロスタサイクリン、トロンボキサンなど、プロスタノイドと呼ばれる重要なメディエーターの産生を担う酵素である。COX1は哺乳類細胞の大部分に見られる構成的酵素と考えられている。一方、生理的条件下では、COX2はほとんどの組織で検出されない。COX2は誘導性酵素であり、炎症部位の活性化マクロファージやその他の細胞に多く存在する。本研究で得られた結果を解析すると、DSS-FMT群で急性UCを誘発すると、FMT群と比較して、大腸組織におけるCOX2マーカーの免疫組織化学的反応（図7a,b）が有意に増加し、特に中等度UC（Mo, p ˂ 0.01）および重篤型UC（S, p ˂ 0.001）において顕著であった。これらの結果は、DSS-FMT/Mo（p ˂ 0.05）およびDSS-FMT/S（p ˂ 0.001）における炎症性タンパク質COX2をコードする遺伝子の発現レベルの上昇（図7c）によっても支持された。重症型UCでは、Mi型（p ˊ 0.001）およびMo型（p ˊ 0.05）と比較して、COX2マーカーの有意な発現が認められ、COX2と上皮びらんスコア（r = 0.626）との間に正の中相関が確認された。糞便微生物叢移植後、すべてのUCにおいて、このタンパク質のレベルの低下によって記録される大腸炎に関連した炎症の緩和が観察された。COX2の発現が、DSSへの曝露期間と比較して最も顕著に抑制されたのは、DSS-FMT/Miの形態で検出され、タンパク質の光学濃度（図7b、p ˊ 0.001）およびその遺伝子発現（図7c、p ˊ 0.05）が有意に低いレベルを示した。炎症反応の軽減に対するFMTのポジティブな効果は、中等症および重症のUCの動物でも観察された。免疫組織化学的試験の結果、COX2の染色強度（図7a,b）はDSS曝露期間と比較して両形態（Mo, p ˂ 0.01; S, p ˂ 0.05）で有意に減少していたが、このタンパク質の遺伝子発現は（図7c）中等度形態のDSS-FMT/Moでのみそのレベルの有意な減少が確認され（p ˂ 0.05）、重篤なUCでは炎症の抑制が不十分であることが示された。
Biomedicines 12 00043 g007図7. FMT群（n＝18）とDSS-FMT/Mi/Mo/S群（n＝6；n＝9；n＝12）のマウスの結腸の腸壁におけるマーカーCOX2とiNOSの免疫組織化学的検出。これには、ATBの除染期間（C5；n＝10）、回復期（C15；n＝12）、DSSおよびFMT治療への曝露期間が含まれる。(a)COX2の免疫組織化学的染色強度の代表的画像（倍率400倍）。矢印は陽性反応。(b）切片の相対光学密度（ROD）で表した、マウスの結腸における免疫組織化学反応の強度とCOX2の発現の定量化。(c）逆転写-定量的ポリメラーゼ連鎖反応によるmRNA COX2の発現レベルの定量化。(d)iNOSの免疫組織化学的染色強度の代表的画像（倍率400倍）。矢印は陽性反応。(e）切片の相対光学密度（ROD）で表したマウス結腸における免疫組織化学反応とiNOS発現の強度の定量化。(f）逆転写-定量的ポリメラーゼ連鎖反応によるmRNA iNOSの発現レベルの定量。結果は平均値±SDで示した。* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001（UC型間の有意差）。X p < 0.05; Y p < 0.01; Z p < 0.001（DSS期間とFMT投与の間の有意差）。
3.7.4. FMTは炎症性iNOSマーカーの発現を調節する
内因性NOは、L-アルギニンから、すなわち一酸化窒素合成酵素（NOS）によって触媒される反応でグアニジン基の末端窒素が酸化されることによって生成される。この蛋白性分子は潰瘍性大腸炎に関連する特異的炎症マーカーである。デキストラン硫酸で潰瘍性大腸炎を誘発したDSS-FMT群の動物（図7e）は、誘導性一酸化窒素合成酵素（iNOS）のレベルの上昇を示した。FMT群と比較して、iNOSマーカーの相対光学密度の有意な増加が、特に中等度型（p ˊ 0.01）および重篤型UC（p ˊ 0.001）で観察された。DSS-FMT/S型では、UC型（Mi、Mo）と比較して、炎症マーカーiNOSのレベルが高く（p ˊ 0.001, p ˋ 0.05）、DSSエンドトキシンに対する炎症反応がより顕著であった。UCを誘発した動物の変化した炎症性粘膜では、DSS-FMT/S（図7f）において、FMT群（p ˊ 0.001）およびUCの両形態（Mi、Mo、p ˊ 0.001）と比較して、iNOSの発現増加が観察された。重篤な大腸炎におけるUCの化学的誘導の負の影響は、NOSの誘導性アイソフォームと上皮びらんスコア（r = 0.643）、iNOSとゴブレット細胞ムチン陽性面積減少スコア（r = 0.627）、iNOSとHAIスコア（r = 0.561）の間の中程度の正の相関によっても確認された。5日間の糞便微生物叢移植後、特にDSS-FMT/Mi型およびDSS-FMT/Mo型において、このタンパク質のmRNA発現のダウンレギュレーションが観察され（図7f）（p ˊ 0.01, p ˊ 0.05）、炎症が抑制されていることが示された。しかしながら、DSS-FMT/S型UCでは、炎症性iNOSマーカーの相対的遺伝子発現が減少したにもかかわらず（図7f）、より高いmRNA転写レベルが記録され、これはDSS-FMT/MiおよびDSS-FMT/Mo型UC群とは統計学的に異なっており（p ꇴ 0.001）、重症型UCではFMTによる炎症反応の抑制が不十分であることを示していた。
3.8. FMTは急性UC誘発PGF動物モデルにおいてサイトカインの遺伝子発現を調節した。
サイトカインは、大腸組織における炎症過程の良好な指標であり、主にリンパ球やマクロファージなどの様々な細胞型によって産生される。本研究では、炎症性サイトカインであるIL-1β、IL-6およびTNF-α、ならびに大腸の恒常性維持に関与する制御性サイトカインであるIL-10およびTGF-βのmRNA転写レベルを調べた。抗生物質による除染後（C5）、UCを誘導せずにFMT療法を行った群における10日間の再生後（C15）、および黄砂への曝露とその後のFMT療法によって急性UCを誘導したマウスの大腸における遺伝子発現を調べた（図8）。マウスの消化管を5日間抗生物質で除染した結果、IL-1β、IL-6、TNF-αが軽度上昇したが、これは10日間の再生期間後に再調整された。その後、これらのサイトカインが、重要ではないものの、軽度かつ陽性に減少したことは、UCを誘導しないFMT（FMT）を行ったグループでも観察された。しかし、5.5日間の黄砂への暴露は、FMT群と比較して、軽症、中等症、重症のUCにおいて、これらのサイトカインの遺伝子転写活性の有意な上昇をもたらした（p < 0.001）。すべてのUC型において、IL-6とIL-1βの転写レベルが最も高く、TNF-α遺伝子の発現は中程度にしか刺激されなかった。UCを誘発した群でFMT療法を行ったところ、大腸組織における炎症が抑制され、これらのサイトカインの転写レベルは低下したが、それでもFMT群で認められたレベルより有意に高かった。IL-1βの場合、FMT処理（図8a）はDSS-FMT/Mo（p<0.05）およびDSS-FMT/S（p<0.001）において遺伝子発現を減少させた。IL-6の転写（図8b）は、3つのUC型すべてにおいてFMT適用後にダウンレギュレートされ（p < 0.001）、TNF-α（図8c）はDSS-FMT/Mo（p < 0.05）およびDSS-FMT/Mi（p < 0.05）型でダウンレギュレートされた。動物による水中での黄砂摂取の依存性では、FMT群と比較して抗炎症性サイトカインTGF-β（図8d）の有意な（p < 0.001）転写活性の低下が観察され、DSS-FMT/Mi形態と比較してDSS-FMT/S形態でmRNAレベルが最も低かった。しかしながら、FMT治療は、特にUCの軽度および中等度型において、TGF-βに対するDSSの抑制効果を有意に減弱させた（p < 0.05）。大腸組織におけるIL-10（図8e）の発現は、FMT群では刺激されたが、DSS-FMT群では急性UCの誘発後にその低下が認められ、それはDSS-FMT/S型で最も深かった（p < 0.001）。同様に、DSS-FMT群のFMT療法は、DSS-FMT/Mi型（p < 0.001）およびDSS-FMT/Mo型（p < 0.05）でmRNAレベルを有意に上昇させたが、DSS-FMT/S型では上昇させなかった。
Biomedicines 12 00043 g008図8. (a)IL-1β；(b)IL-6；(c)TNF-α；(d)TGF-β；および(e)IL-10についてリアルタイムPCR法で決定したmRNAの相対発現。C5（ATB除染期間；n＝10）；C15（回復期；n＝12）；FMT（UC誘導のない動物群、FMT投与あり；n＝18）；DSS-FMT／Mi（UC誘導およびFMT治療-軽症型の動物群； N=6）；DSS-FMT/Mo（UC誘導およびFMT治療-中等症型の動物群；N=9）；DSS-FMT/S（UC誘導およびFMT治療-重症型の動物群；N=12）。結果は平均値±SDで示した。* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001（UC型間の有意差）。X p < 0.05; Z p < 0.001（DSS期間とFMT投与の間の有意差）。
得られた結果から、サイトカイン産生細胞に対するDSSの効果は濃度依存的であり、FMTは臨床的および組織学的データと一致して、組織損傷の臨界レベル以下の炎症を減衰させることができたことが示唆される。
3.9. 糞便微生物叢の生存率に対するFMTの効果
DSS-FMT群におけるDSS誘発急性潰瘍性大腸炎の病像は、観察された大腸の粘膜中膜および粘膜下膜の組織学的構造の病理学的変化と直接的な相関関係があり、UCの活性の程度に依存して、糞便微生物の生存率が低下していた。回復期（図1d）後の微生物の生存率は比較的高いレベル（71.1%）に達したが、DSS-FMT動物におけるDSSの結腸粘膜バリアの完全性に対する毒性作用は、特に重篤な病型では、糞便微生物叢の生存率の完全な喪失によって明らかになった（図9c、6.2%）。腸内細菌叢の生存率に対する薬剤の悪影響は、軽症および中等症でも確認され（図9a,b）、PGF動物の生存率と比較して、微生物の生存率が有意に低い（p < 0.001）レベル（44.6％、33.6％）を示した。化学物質（DSS）に対して最小限の炎症反応しか示さなかったDSS-FMT/Mi動物にFMTを施した結果、中膜粘膜の組織学的構造の完全性が回復し（図9d）、これはまた、微生物の有意に高い糞便生存率（p < 0.001、73.6%）に反映された。しかし、DSS-FMT/S群の動物の結腸組織では、FMT処理後にもかかわらず、広範な上皮びらんが認められ、これは腸陰窩の損傷とそれに続くゴブレット細胞の消失に関連しており、腸上皮への微生物叢のコロニー形成と付着が不可能であることを反映していた。糞便微生物の生存率はまだ不十分であった（図9e、7.9%）。UCを誘導していない動物（図9f）では、5日間のFMT処置が好影響を与え、糞便微生物叢の生存率は77.2％のレベルで維持された。この結果は、糞便微生物の生存率の増加が、大腸中膜粘膜の組織学的構造の完全性の回復と直接的な相関関係があることを示している。誘発急性潰瘍性大腸炎におけるFMT療法の微生物生存率レベルでの有効性は、主に軽症型UCにおいて示された。
Biomedicines 12 00043 図9. FMT投与後の便サンプルの蛍光活性化セルソーティング（FACS）およびNGS解析により決定された盲腸内微生物の生存率（FMT vs. DSS- FMT）。DSS曝露後の生存率：（a）DSS-FMT/Mi 46.6％、n＝3；（b）DSS-FMT/Mo 33.6％、n＝3；（c）DSS-FMT/S 6.2％、n＝4。FMT投与後の生存率：（d）DSS-FMT/Mi 73.9％、n＝3；（e）DSS-FMT/S 7.9％、n＝6；（f）FMT 77.2％、n＝6。 g）ファミリーレベルの相対細菌数。(h) 属レベルの相対細菌数。(i) アルファ多様性。(j)選択した細菌分類群の相対存在度を0-1のスケールで示す。データは平均±SDで示す。統計的有意性は、Mann-Whitneyノンパラメトリック検定を用いて、FMT群（n = 3）とDSS-FMT群（n = 4）の間で計算した。有意性を示す： * p ≤ 0.05.
3.10. 急性UCマウスモデルにおける糞便微生物叢組成に対するFMTの効果
潰瘍性大腸炎を誘発したDSS-FMT動物群の糞便微生物叢の組成をNGSで解析した結果、その微生物叢はFMT群で検出されたものと同じ菌株で構成されていたが、その割合は異なっていた。FMT群とDSS-FMT群間でASVレベルの群集組成を比較したところ、統計的に有意な差が認められ、Bray-Curtis非類似度（ANOSIM: R = 1, p = 0.026；図S2）に基づいて完全に分離された。従来のSPFマウスの糞便では、FMT群では、ファーミキューテス（54.15%）とバクテロイデーテス（44.01%）の2つの菌株の優勢な割合（98.16%）が確認されたのに対し、糞便微生物叢移植後の結果では、ファーミキューテス菌株（77.13%）が優勢でバクテロイデーテス菌株（18.86%）が抑制された。DSS-FMT群では、ファーミキューテス属の割合が88.04％に達し、バクテロイデーテス属の割合はわずか6.67％であった。FMT動物の糞便微生物叢では、ファーミキューテス門は様々な科で代表されていた（図9g,h）。図9hによると、Lachnospiraceaeの代表が支配的（約69%）で、Oscillospiraceae（5.63%）とButyricicoccaceae（1.73%）は少なく、糞便微生物叢で1%未満の割合で見られる科のメンバーがそれに続いた：ルミノコッカス科（Ruminococcaceae）とペプトコッカス科（Peptococcaceae）である。このグループでは、マウスの初期微生物叢に由来する属がより多く観察され（図9i,j）、Clostridia（クロストリジウム）綱の属が最も多く（図9j）、非分類属（28. 61％）、Lachnospiraceae UCG 006（10.13％）、Roseburia（7.57％）、Lachnospiraceae NK4A136（8.75％）およびOscillibacter（3.45％）であり、1％未満の割合で存在する属はMarvynbriantia、Lachnoclostridium、A2属およびASF 356であった。バクテロイデーテス（Bacteroidetes）属は、ムリバキュラ科（15.66%）とバクテロイデーテス科（2.91%）が多く、マリニフィラ科（Marinifilaceae）とリケネラ科（Rikenellaceae）の割合は少なかった（図9g,h）。最も多かったのは非分類のムリバキュラ科（15.76%）、次いでバクテロイデス属（2.91%）で、1%以下の割合で存在する属はオドリバクター属、パラバクテロイデス属、アリスティペス属であった。FMT群の糞便微生物叢はFMTドナーの代表的な多様な混合物で濃縮されており、Eisenbergiella属（8.32%）、Butyricicoccus属（1.73%）、Lachnospiraceae FCS020、Akkermansia属、Anaerostipes属、Barnesiella属、Colidextribacter属、Incertae-Sedis属、Parasutterella属、Blautia属、Coprobacter属のメンバーが含まれていた。選択的抗生物質除染によって誘導されたFMT群のPGFマウスのdysbiosisは、ヒト微生物叢の5日間の移植後に修正された。したがって、FMT治療は健康で多様な微生物叢を回復させた。FMTグループの糞便微生物叢と比較すると、糞便微生物叢移植を行ったDSS-FMT動物では、上位10科（図9h）によると、Lachnospiraceae科のメンバーの割合が高かった（75. 21％対68.66％）、Oscillospiraceae（8.97％対5.63％）、Bacteroidaceae（4.93％対2.91％）、Tannerellaceae（1.51％対0.29％）、Ruminococcaceae（2.62％対0.77％）およびAcholeplasmataceae（1.04％対0.00％）であった。
ムリバキュラ科の代表的な細菌は、FMT群では比較的高い割合（15.66％）で存在したが、UCを誘発した動物（DSS-FMT、p＜0.05）の糞便微生物叢には存在しなかった。FMT群と比較して、Lachnospiraceae科（図9j）では、Lachnospiraceae NK4A136属（p < 0.05）、Blautia属（p < 0.05）、Roseburia属（9.12% vs. 7.57%）、Lachnoclostridium属（6.49% vs. 1.01%）のメンバーが特に検出された。
Oscillibacter属と分類されていないLachnospiraceae属は両グループに同程度存在し、後者の割合は約23％に達した。Lachnoclostridium属とLachnospiraceae属FCS020は中程度の増加を示し、逆にLachnospiraceae属UCG 006（2.93％対10.13％）とEisenbergiella属（1.71％対8.32％）ではFMTグループと比較してより顕著な減少が検出された。FMT群と比較して（図9j）、DSS-FMTマウスの糞便微生物叢では、Bacteroides属の軽度の増加（4.93％ vs. 2.91％）およびEisenbergiella属（1.71％ vs. 8.32％）の参加が認められた。 91％）、Akkermansia属、Butyricicoccus属、Acetatifactor属、Anaerotruncus属、Adlerocreutzie属、Bilophile属、Enterococcus属、Anaeroplasma属、Incertae-Sedis属、Coprobacter属、Parasutterella属、Barnesiella属、Colidextribacter属の参加が認められた。
誘発された急性潰瘍性大腸炎にヒト糞便微生物叢を移植したところ、腸内細菌叢の組成に対するFMT適用の回復効果が明確に確認された。また、病原性微生物の感染は確認されず、潰瘍性大腸炎の発症に関与する代表的な微生物の増殖は認められなかった。
4. 考察
ヒトの腸内細菌叢に関する知識の進歩により、腸内細菌叢の異常と広範な疾患や疾病との間に関連性があることが明らかになってきた。この知識は、FMTの治療的役割を決定する上で、世界中の科学者の関心を高めている [42] 。現在のエビデンスに基づけば、糞便微生物叢の移植は一般的に副作用の少ない安全な治療法と考えられている。IBD治療におけるFMTの普及を制限している主な要因は、感染リスクと他の疾患への移行の最小化である。臨床研究やシステムレビューの大半は、FMT後に、腹部障害、下痢、便秘、軽度の発熱などの一時的な軽微な望ましくない現象がみられたと報告している[13]。これらの副作用は、生きた微生物とその代謝産物が消化管に導入されることに対する身体の自然な反応である。これらは速やかに消失し、患者の健康により大きな危険をもたらすことはない [43] 。重篤な副作用は、潜在的な内視鏡合併症としばしば関連していた [15,24]。FMTの副作用は主に、ドナーの不適当なスクリーニングとドナーの便材料の不正確な分析に関連しており、病原微生物（ウイルス、細菌、寄生虫、真菌など）による患者の汚染やレシピエントの慢性疾患の発症につながる可能性があるが [43,44,45] 、全敗血症への進展という点では、レシピエントにとって致命的な結果につながる可能性さえある [21] 。以上の問題点から、FMTに最適なドナーの同定が臨床上の主要な問題点であることがわかる。したがって、本研究では最適なドナーの選択が重要な要素と考え、急性UCを誘発したPGF動物モデルに対するFMT治療の有益な効果を検証することを目的とした手順は、米国赤十字が設定したすべての要件（セクション2.4.1.FMTドナーのスクリーニングを参照）を満たし、非喫煙者で禁欲的であり、特定の食事を使用せず、過去6ヶ月間に発展途上国を訪問していないヒトドナーを用いて実施され、このドナーのすべての選択的検査室検査は陰性であった。同時に、NGSアンプリコンシーケンスによるFMTドナーの分析により、FMTは潰瘍性大腸炎の発症に関与する病原性微生物の保菌者ではないことが確認された。FMT治療の過去数年間、多くの科学的研究により、まだ解明されていないが、正確な科学的結果を得ることの成功の観点から重要な役割を果たす、さらなる疑問が提起された。その一つは、糞便微生物叢の生存率を測定するための適切な方法を選択する必要性を十分に正当化していないことである。FMTドナーからの処理物中のマイクロバイオームの特性は、しばしば決定されず、決定されるとしても、そのプロセスには通常、抽出された糞便DNAの高効率シークエンシングが含まれる[46]。このようなアプローチでは、生存可能な生物と生存不可能な生物に由来するDNAが検出されるため、どの細菌が生存可能で、レシピエント内で複製できるかを示す能力には限界がある。培養法では、腸内細菌叢全体のごく一部のサブグループしか容易に分離できないため、FMTの処理による多くの常在嫌気性菌種への影響を明らかにするには適さない[47]。我々の研究では、生菌が分解して蛍光を発するカルボキシフルオレセインジアセテートを添加したフローサイトメトリーで細胞をカウントした。しかし、FMTの処理方法は本質的に細菌の生存率に影響する。酸素存在下での処理、凍結・解凍後の処理では、嫌気的処理のみと比較して、生菌の割合の有意な減少が観察された。厳密な嫌気条件下で即時処理した後の糞便移植では、平均してわずか半分の細菌しか生存していなかったが[47]、これは我々の研究と相関しており、処理後のFMTにおける微生物の生存率は44％のレベルであった[48]。この研究から、ミキサーでの均質化が生菌の組成に深く影響することが明らかになった。高速ミキシングに伴う空気の流れの増加は、酸素への暴露を増加させ、手動のホモジナイズと比較して酸素に敏感な種に有害な影響を及ぼす可能性がある[47]。FMT用の材料を準備する際、2秒間の短い間隔でホモジナイズすることで、ミキサーの高速回転と温度上昇が糞便微生物叢に及ぼす悪影響を減らそうとした。
過去数十年にわたり、げっ歯類は多くの生物学的プロセスや病理学的メカニズムを解析するためのモデル生物としての役割を果たしてきた。近交系系統として開発され、少なくとも20世代以上の兄弟姉妹交配の連続的な産物であるこれらの動物は、ほぼ100％の均質性を示す。すなわち、同じ年齢と性別の動物は遺伝的に同一であるべきであり、これは結果の再現性と実験の統計的強度をかなり高める。動物モデルは低コストで比較的容易に適用できるため、特にDSS誘発モデルは、IBDの病因、IBDの遺伝的素因、免疫機構、IBDの発症における微生物叢の役割など、IBDの様々な側面の研究に最も頻繁に使用されるモデルの一つである[49]。本研究では、腸内細菌叢が減少したPGFモデルを得るために、BALB/c系統の微生物学的SPF状態を有する動物マウスモデル（雌）を用い、潰瘍性大腸炎を誘導しない対照群（FMT）と、5％黄砂に5.5日間曝露することにより急性UCを誘導する黄砂-FMT群に分けた。しかし、われわれの以前の研究[32]の結果でも確認されたように、黄砂曝露による急性UCの最適な動物モデルを得るには、使用するマウスの系統の感受性、分子量、黄砂の濃度、曝露期間など、結果に大きく影響する多くの要因に左右される。同様の性格の多くの研究で見落とされてきたもう一つの重要な要因は、この濃縮多糖類の水中摂取量であり、これはすべての動物で個体差があり、その結果、DSSの摂取量に依存し、さまざまな形態の誘発性潰瘍性大腸炎が発症する。我々の研究の目的は、潰瘍性大腸炎の軽症型、中等症型、重症型（活動性）を化学的に誘導したPGF動物モデルにおいて、臨床的・病理組織学的反応と腸管微小環境の変化に対するFMTの調節・再生効果を評価することであった。動物における潰瘍性大腸炎の個々の病型は、直腸出血や総体重の減少を含む潰瘍性大腸炎の発達した個々の臨床像に基づいて同定され、それに従って軽症（DSS-FMT/Mi）、中等症（DSS-FMT/Mo）、重症（DSS-FMT/S）の病型（活動性）に分けられた。特に軽症型UC（DSS-FMT/Mi）では、体重減少はFMT後2日目までしか観察されなかった。しかし、DSS-FMT/MoおよびDSS-FMT/S動物では逆の傾向が観察され、FMT後3日目まで体重減少が進行したため、同様の総体重減少傾向を示した。これらの群では、体重減少の増加はFMT後3日目から4日目の間に止まった。我々の研究はまた、化学的に誘発されたUC動物に対するFMT治療が、特にDSS-FMT/MiおよびDSS-FMT/Mo動物において、総重量減少のスコアの減少とともに、疾患の重症度にプラスの影響を及ぼすことを示した。また、DSS-FMT/Mi動物では、FMT後3日目と4日目にDAIが有意に減少し、直腸出血のスコアが低下したことが観察され、これは血液学的パラメーターの調整と一致していた。さらに、脾臓（動物の70％）、盲腸（75％）、腎臓（31.2％）、肝臓（18.5％）の大きさの調整も観察され、すべてのUC型、特に出血型において腸炎の発生が21.6％減少した。同様の結果が[50]の研究でも得られている。著者らは、黄砂に曝露され、その後FMT治療を受けたマウスでは、FMT治療を受けなかった黄砂群と比較して、体重が有意に増加していることを検出している。しかし、この研究[50]では、動物がそれぞれの臨床像に基づいて個々のUC型に分けられたわけではなく、それでもなお、すべての動物の体重を平均したにもかかわらず、FMT治療後の体重の調整を検出することができたことに留意すべきである。これらの結果は、BALB/c系統の誘発性UCモデルマウスにFMT治療を行った結果、総体重の減少が認められ、疾患の臨床的スコア（DAI）が有意に低下し、直腸出血のスコアが低下したことを確認した著者らの結論と一致した[9,51,52]。
DSS誘発性大腸炎に関連する結腸遠位部の組織学的変化は、主に粘膜中膜および粘膜下膜の組織構造の病理学的変化に関与し、上皮変性、ゴブレット細胞の消失、上皮びらんを伴う粘膜固有層および粘膜下層への好中球の浸潤および腸陰窩炎によって示される。さらに、粘膜下組織はしばしば顕著な水腫と過形成の徴候を示す [53] 。免疫細胞に関しては、結腸組織への浸潤は、黄砂によるUC誘発の初日に既に観察され、時間の経過とともに増加する。我々の研究で観察された結腸の粘膜中膜と粘膜下膜の組織学的構築の病理像は、DSS誘発急性潰瘍性大腸炎の組織像と一致し、DSS-FMT/S病型で最も顕著であり、DAIとHAIスコアの間に非常に高い正の相関（r = 0. 8189）、抗アポトーシスマーカーBcl-xLとHAIスコアとの間に高い負の相関（r = -0.850）、炎症マーカーiNOSと上皮びらんスコアとの間に中程度の正の相関（r = 0.643）、ゴブレット細胞ムチン陽性面積減少（r = 0.627）とHAIスコア（r = 0.561）、炎症マーカーCOX2と上皮びらんスコアとの間に中程度の正の相関（r = 0.626）を示した。われわれの研究では、軽度および中等度の活動性を有する病型において、FMTが粘膜炎症の軽減に正の影響を及ぼすことが確認された。大腸の組織学的切片は、FMT後に炎症細胞浸潤の減少を示し、これは黄砂曝露期間と比較して有意に低いスコアによって反映された。炎症の抑制は、PCNA免疫反応によって示されるように、中膜粘膜の完全性の回復と細胞増殖の回復を伴い、抗アポトーシスマーカーBcl-xLの高値、DSS-FMT/Miにおける絨毛の断面積、高さ、陰窩の深さの有意に高い形態測定値、上皮びらんの同時不発生によって裏付けられた。軽度および中等度のUCの動物で観察されたFMT治療後の結腸粘膜の炎症反応の低下は、炎症マーカーiNOSおよびCOX2の発現低下によっても証明され、これらのUCの結腸粘膜で進行中の修復過程を示していた。同様に、これら2つの型のUCにおいて、いくつかの免疫学的パラメーターの正常化が記録され、それは、炎症性サイトカインIL-1β、IL-6、TNF-αのmRNAのダウンレギュレーションと、脾臓とパイエル板におけるTcリンパ球、脾臓におけるNK細胞とNKT細胞の調整を伴う、大腸の恒常性の維持に関与する抗炎症性サイトカインIL-10とTGF-βの発現の刺激によって確認された [55]。腸組織におけるTNF-α、IL-1p、IL-10、TLR-4およびMyD88の発現低下によって示されるDAIおよびHAIスコアの調整に対するFMT治療処置の保護効果を確認する同様の結果が、黄砂に暴露されたマウスの結腸粘膜の損傷を調査した著者らによって報告された [9,51,52,56,57]。潰瘍性大腸炎に対する有望な治療法としてのFMTの使用は、潰瘍性大腸炎患者に対する糞便微生物叢の移植の長期にわたる安全性と有効性、すなわち下痢の重症度、血便、Mayoスコア（便の回数、直腸出血、医師による総合評価）、EQ-5D指数の減少を示した臨床研究[58]によって確認された。しかし、動物モデルを用いた実験的研究を行っている著者の中で、UC誘発時にみられる重篤な出血症状に罹患している動物に対するFMT治療のリスクについて言及している者はいなかった。消化管（GIT）の上皮表面は粘液層で覆われており、腸粘膜と消化管内容物の間にバリアを形成している。この粘液層の重要な機能は、GITの細菌コロニー形成に対する防御を提供するコロニー形成抵抗性のメカニズムである [59] 。バリア機能障害とは、腸上皮の連続層が失われ、上皮間接合部や上皮間隙が遮断された状態と定義される [60] 。バリア機能の障害は、腸内細菌叢と上皮細胞との間の暴露を増加させ、その結果、局所免疫をさらに刺激することになり、その結果、腸炎症の発症を助長する [61] 。UC患者の大腸生検標本では、粘液層の減少がみられた。クローン病、潰瘍性大腸炎 [62,63]、セリアック病 [64,65,66]、腸閉塞 [67,68]、消化管感染症 [69]などの慢性・急性腸疾患患者や実験モデルにおいて、微生物群集の変化に伴う上皮バリア障害が観察された。粘液バリアの障害は、腸粘膜の透過性の潜在的な増大と関連しており、細菌のトランスロケーションのリスクの増加を示している [70]。我々の研究では、FMT投与3日目に死亡したUC活性の高いマウス2匹において、腹腔内の滲出液中に大腸菌の転移していることが確認された。大腸菌の病原性遺伝子（K88、LT、STb）の有無に関するPCR検査では陰性であり、全敗血症は非病原性菌の転座によるものであった。IBD患者を対象に実施されたいくつかの病歴およびコホート研究では、FMT治療後の患者の小集団でIBDの再燃が認められた[71,72]。Queraら [72] は、一過性の菌血症が腸管透過性を変化させ、疾患の再燃をもたらす可能性を示唆したが、FMT後のIBD再燃の決定的なメカニズムは依然として不明である。一部の専門家は、FMT治療後に免疫系が低下した患者では感染リスクが高くなる可能性があることを懸念している。われわれの研究では、重症型UCにおいても、黄砂の毒性作用に対するFMT治療の効果が確認された。しかし、DSS-FMT/S群のマウスでは、FMTにより組織学的炎症浸潤のスコアが減少し、腸管ムチンおよびPCNAとBcl-xLマーカーの産生が穏やかに調整されたものの、腸陰窩の損傷と上皮びらんスコアはほとんど影響を受けなかった。同様に、炎症マーカーであるiNOSとCOX2の活性、炎症性サイトカインであるIL-1β、IL-6、TNF-αのmRNAが相対的に低下したにもかかわらず、これらのパラメーターのレベルは依然として比較的高く、重篤なUCではFMTによる炎症反応の抑制が不十分であることを示していた。
常在菌、特にファーミキューテス（Firmicutes）およびバクテロイデーテス（Bacteroidetes）の代表的な菌株の多様性 [1] と割合 [73] の減少は、腸内細菌異常症の徴候である。最も顕著なのは、バクテロイデス属、ラクトバチルス属、ユーバクテリウム属 [1,74]、ブラウチア属、ローズブリア属 [75,76]の有益な細菌種の数の減少と、腸内細菌科の細菌種の割合の相対的な増加である [1,77]。IBDの発症は、Clostridioides difficile、腸管毒素原性大腸菌、サルモネラ属菌 [78,79] 、Fusobacterium属菌 [73] など、IBDでその割合が増加する病原性細菌の関与によって起こることを示す研究もある。Shangら[80]は、Bacteroides属、Escherichia-Shigella属、Helicobacter属、Mucispirillum属、Clostridiales vadinBB60グループ、Odoribacter属、Ruminiclostridium属、Turicibacter属と炎症関連パラメータとの間に有意な正の相関が存在する一方、Lachnospiraceae NK4A136グループと分類されていないMuribaculaceae属では有意な負の相関が記録されたと報告している。同時に、CD8+T細胞の活性化を阻害するプロピオン酸 [81] とムリバキュラ属の割合との間に強い相関が検出された。このことは、ムリバキュラ科植物と炎症状態との間に同時にみられる負の相関関係を説明することができる [80]。同様のことが、UCを誘発したグループにおける我々の研究でも確認され、FMTグループの動物ではかなりの割合でムリバキュラ科の属が検出されたのに比べ、ムリバキュラ科の属が検出されなかった。DSS-FMT群の糞便微生物叢におけるLachnospiraceae科のメンバーの有意な参加に関する知見もまた肯定的であり、特にこのグループ内の多くの種が酪酸と関連していること[83]、そして何よりも、Lachnospiraceae属NK4A136グループ[80]のような炎症と負の相関を持つメンバーの割合のためである。FMT治療後、我々の研究では、IBDと大腸癌の病態との直接的な関係が確認され、そのメンバー数が有意に減少したRoseburia属という別の酪酸産生細菌群の腸内細菌叢への参加が検出された[84]。Chenら [85] は、UCまたはCDと診断された患者の腸内細菌叢の欠損が特徴的であることを示した。これらの証明は、腸疾患における酪酸産生腸内細菌叢の重要性を強調している。5日間のFMT治療後の盲腸を蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）で解析したところ、プローブ（Lab 158）で検出されたラクトバチルス属／腸球菌属、およびプローブ（Bif 164）で検出されたビフィドバクテリウム属の数が有意に多かった（p ≤ 0.001）、プローブ（Bif 164）で検出された乳酸菌とビフィズス菌は、DSS-FMT動物と比較して、FMT群では6.0-6.2 log10 CFU/gのレベルであり、これはFMT由来の乳酸菌とビフィズス菌が腸の保護に有益な種としての役割を果たすことの証明と考えられた[86]。同時に、DSS-FMTマウスの糞便微生物叢のα多様性（シャノン指数およびシンプソン指数）は、FMT治療後、UCを誘導していない対照FMT群と比較して、UCを誘導した動物で糞便微生物叢の高い多様性が検出されたことを証明し、これは糞便微生物叢移植に由来する微生物叢のポジティブな役割を示した。UCを誘発した群におけるFMTからの微生物叢の良好な結果は、糞便微生物叢の再コロニー化に有利な条件に基づいており、これは抗生物質の除染によるマウスの本来の微生物叢の減少だけでなく、その後の黄砂の糞便微生物叢に対する毒性作用によっても裏付けられていた。しかし、我々の研究で得られた結果は、すべてのUCを代表するものではなく、中等度のUCに罹患した動物のみがNGS解析の代表動物として用いられた。
我々の研究における関連パラメーターのモニタリングは、急性潰瘍性大腸炎モデルにおける糞便微生物叢移植療法の有効性を確認し、3つの臨床型UCすべてにおいて観察されたパラメーターの調整に多かれ少なかれ貢献した。しかしながら、我々の結果は、重篤なUC活性を有する動物では、健康なドナーからのFMTだけでは期待された治療効果を得ることができなかったことを示している。重篤なUC型では、FMTによる炎症反応の抑制が不十分であっただけでなく、この型のFMTによる生残性糞便微生物の利用率が極めて低い（約7％）ことも確認された。動物モデルを用いた我々の研究から得られた結論は、他の著者の経験 [18] や、FMTが軽度から中等度のUCを患う患者の治療に最も適しており、免疫調節治療を開始する前の前生物学的治療として、あるいは補完的治療として適応される可能性があることを確認した研究によって提示されたデータによって部分的に支持されている。重篤な潰瘍性大腸炎におけるFMTの役割の研究には、興味深い症例報告やケースシリーズもあるが、これらの研究のデザインは不均一であり、短期間の調査であり、参加者の数も少ないため、その重要性を判断することは困難である。われわれの研究結果は、重篤な潰瘍性大腸炎と診断された動物にFMTを使用した場合、菌血症の発症や腸内細菌叢の非病原性代表因子の移行に関連した安全性のリスクがあることを指摘している。
我々の研究にはいくつかの限界があった。我々は、微生物叢が減少したPGF動物モデルを用い、化学的にUCを誘導した。現在のところ、IBD患者における微生物叢の異常が疾患の病因に本当に関与しているのか、あるいは単に疾患を通じて誘導される炎症反応や抗菌反応の反映に過ぎないのかはまだ不明である。このような理由から、炎症性疾患の誘発と腸内生態系のより複雑な病態の誘発を目的として、以下の研究では、活動型UC患者の微生物叢による黄砂曝露によるUCの誘発を補足する必要がある。ただし、この患者は禁煙者で、特別な食習慣がなく、潰瘍性大腸炎と初めて診断され、抗生物質やコルチコイドによる治療や生物学的療法を同時に受けていないことが望ましい。我々の研究では、潰瘍性大腸炎の個々の病型において、病理解剖学的所見、DAIおよびHAIスコアの評価、形態学的パラメータに裏付けられた血液学的パラメータ、細胞増殖マーカーを含む関連する特異的基準をモニタリングした、細胞増殖マーカーPCNA、抗アポトーシスマーカーBcl-xL、炎症マーカーiNOSとCOX2、炎症性サイトカインIL-1β、IL-6、TNF-α、制御性サイトカインIL-10とTGF-βのmRNA転写レベル、微生物の生存率などである。しかし、炎症プロセスをより正確に解釈し、潰瘍性大腸炎に関連する種のレベルまで腸内細菌叢の個々の分類学的メンバーを同定するためには、その後の研究を拡張して、個々のUC型のNGS解析も含める必要がある。我々の研究は、抗生物質除染前のマウスの微生物叢の初期組成と、FMT治療後の糞便微生物叢に関する情報を提示した。しかし、腸内微生物の生存率に関する結果は、DSSによる化学的誘導後の個々のUCにおける腸内細菌叢のNGS解析によって提供される情報で補足されるべきである。バクテリオファージは細菌群集を調節する可能性を持っているが、哺乳類における腸疾患や健康との関連性はまだ不明である。バクテリオファージは腸内細菌叢の構成に大きく関与しているため、UCに関連するファージの活性に関する解析が行われていないことも、本研究の限界である。
5. 結論
ヒト糞便微生物叢の移植により、腸内細菌叢の組成に対するFMT治療の明らかな回復効果が確認された。実験動物では、病原性微生物の移入は確認されず、潰瘍性大腸炎の発症に関与する代表的な微生物の増殖も検出されなかった。軽度および中等度の潰瘍性大腸炎の動物において、FMT治療は潰瘍性大腸炎の重症度を低下させ、大腸の損傷を有意に減少させ、疾患の臨床的および組織学的指標を低下させ、大腸粘膜の炎症反応を減少させた。しかしながら、われわれの結果は、健常ドナーからのFMTだけでは、DSS-FMT/Mi型およびDSS-FMT/Mo型の動物と比較して、重篤なUC活性を有する動物（DSS-FMT/S型）において期待された治療効果を達成できなかったことも明らかにした。この観察から、大腸粘膜の治癒をサポートし、腸細胞に必要なエネルギー基質を供給し、同時に健常ドナーのFMTに含まれる微生物叢との負の相互作用を誘発しない、有益な添加物（理想的には天然由来）でFMTを濃縮することの実現可能性が提起された。
補足資料
https://www.mdpi.com/article/10.3390/biomedicines12010043/s1、表S1：RT-PCR反応に使用したオリゴヌクレオチドとその配列のリスト。表S2：5.5日間のDSS曝露および5日間のFMT投与後のPGFマウスの大腸形態。図S1：PGFマウスと健常ドナーのFMTの細菌叢組成の比較。図S2：Bray-Curtis非類似度を用いたNon-Metric Multidimensional Scaling（NMDS）プロット。
著者貢献
構想、S.G.およびS.L.；方法論、S.G.、S.L.、Z.A.、G.H.、V.H.、L.K.F.、G.S.、D.M.、D.S.；検証、S.G.、G.H.、V.D.、L.K.F.、M.J.、S.L.；形式分析、S.L.、 S.G.、V.H.、L.K.F.、Z.A.、I.B.、E.H.、A.K.、G.H.、M.J.、L.A.、M.K.、Z.G.、L.S.、G.S.、D.M.、M.M.、V.D.、D.N.、I.P.、D.S.、調査、S.G.、S.L.、G.H.、L.K.F.、Z.A、 M.J.およびM.M.；執筆-原案作成、S.G.、S.L.、G.H.およびL.K.F.；執筆-校閲および編集、S.G.、S.L.、G.H.およびV.D.；視覚化、S.G.、S.L.、Z.A.、G.H、監修、G.H.およびV.D.、プロジェクト管理、S.G.およびI.B.、資金獲得、S.G.およびI.B.。すべての著者が本原稿の出版版を読み、同意した。
資金提供
本研究は、スロバキア研究開発庁から契約番号APVV-16-0176およびプロジェクトVEGA番号1/0015/21の助成を受けた。
施設審査委員会声明
提出された実験（プロトコル番号4073/18-221/3）は、スロバキア共和国国家獣医食品局の承認を得ており、動物の世話および操作に関するすべての手順は、スロバキア共和国コシツェの獣医薬科大学の各倫理委員会が動物実験を実施するために定めたガイドライン、および欧州議会とEU理事会の指示と国際指令に準拠している。FMTドナー候補からの生物学的材料の収集は、スロバキア共和国コシツェL.パスツール大学病院の倫理委員会によって承認された研究プロジェクトNo.14/2018/OVaVの枠組みの中で行われた。
インフォームド・コンセント
FMTの健康なドナーは、研究目的のためのデータ収集および解析に関するインフォームド・コンセントに署名した。
データ利用声明
すべてのデータは原稿に含まれている。
謝辞
Luboslava ScirankovaおよびUVMPコシツェ、微生物学・免疫学研究所、Gnotobiology研究所の動物研究施設のスタッフの技術支援および動物飼育に感謝する。
利益相反
著者らは利益相反はないと宣言している。
参考文献
Khan、I.; Ullah、N.; Zha、L.; Bai、Y.; Khan、A.; Zhao、T.; Che、T.; Zhang、C. 炎症性腸疾患（IBD）における腸内細菌叢の変化：原因か結果か？腸内細菌叢を標的としたIBD治療。Pathogens 2019, 8, 126. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed].
Khalili, H.; Chan, S.S.M.; Lochhead, P.; Ananthakrishnan, A.N.; Hart, A.R.; Chan, A.T. The role of diet in the aetiopathogenesis of inflammatory bowel disease. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 2018, 15, 525-535. [Google Scholar] [CrossRef].
Wan, P.; Peng, Y.; Chen, G.; Xie, M.; Dai, Z.; Huang, K.; Dong, W.; Zeng, X.; Sun, Y. Modulation of gut microbiota by Ilex kudingcha improves dextran sulfate sodium-induced colitis. Food Res. Int. 2019, 126, 108595. [Google Scholar] [CrossRef].
Fang, X.; Monk, J.M.; Mih, N.; Du, B.; Sastry, A.V.; Kavvas, E.; Seif, Y.; Smarr, L.; Palsson, B.O. 炎症性腸疾患患者で流行している大腸菌B2株は、腸粘膜のコロニー形成を可能にする明確な代謝能力を有する。BMC Syst. Biol. 2018, 12, 66. [Google Scholar] [CrossRef].
Oligschlaeger, Y.; Yadati, T.; Houben, T.; Condello Oliván, C.M.; Shiri-Sverdlov, R. 炎症性腸疾患：ストレスを受けた「腸・感覚」。Cells 2019, 8, 659. [Google Scholar] [CrossRef].
IL1Bは、オクルディンmRNAを分解するMIR200C-3pのアップレギュレーションによって腸のタイトジャンクション透過性を増加させる。消化器病学2020, 159, 1375-1389. [Google Scholar] [CrossRef].
Rosen, C.E.; Palm, N.W. 微生物の海を航海する： Triangulation finds a way forward. Cell Host Microbe 2018, 23, 1-3. [Google Scholar] [CrossRef].
Knox, N.C.; Forbes, J.D.; Van Domselaar, G.; Bernstein, C.N. IBD治療のターゲットとしての腸内マイクロバイオーム：まだそこに到達していない。Curr. Treat. Options Gastroenterol. 2019, 17, 115-126. [Google Scholar] [CrossRef].
Zhang, W.; Zou, G.; Li, B.; Du, X.; Sun, Z.; Sun, Y.; Jiang, X. Fecal microbiota transplantation (FMT) alleviates experimental colitis in mice by gut microbiota regulation. J. Microbiol. Biotechnol. 2020, 30, 1132-1141. [Google Scholar] [CrossRef].
Schierova,D.、Brezina,J.、Mrazek,J.、Fliegerova,K.O.、Kvasnova,S.、Bajer,L.、Drastich,P. 活動性左側潰瘍性大腸炎患者における糞便マイクロバイオーム移植および5-アミノサリチル酸局所療法後の腸内細菌叢の変化。Cells 2020, 9, 2283. [Google Scholar] [CrossRef].
Celiberto, L.S.; Graef, F.A.; Healey, G.R.; Bosman, E.S.; Jacobson, K.; Sly, L.M.; Vallance, B.A. 炎症性腸疾患と免疫栄養：食事と腸内細菌叢の調節による新規治療アプローチ。Immunology 2018, 155, 36-52. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed].
Cammarota, G.; Ianiro, G.; Cianci, R.; Bibbò, S.; Gasbarrini, A.; Currò, D. The involvement of gut microbiota in inflammatory bowel disease pathogenesis：治療の可能性。Pharmacol. Ther. 2015, 149, 191-212. [Google Scholar] [CrossRef].
Gupta, A.; Saha, S.; Khanna, S. Therapies to modulate gut microbiota：過去、現在、そして未来。World J. Gastroenterol. 2020, 26, 777-788. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed].
リンチ、S.V.; ペダーセン、O. 健康と病気におけるヒト腸内マイクロバイオーム。N. Engl. J. Med. 2016, 375, 2369-2379. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed].
Vindigni, S.M.; Surawicz, C.M. 糞便微生物叢移植。Gastroenterol. Clin. North Am. 2017, 46, 171-185. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed].
微生物叢移植の概念、方法論とその現代的戦略：概念、方法論、およびその近代化のための戦略。Protein Cell 2018, 9, 462-473. [Google Scholar] [CrossRef].
Tan, P.; Li, X.; Shen, J.; Feng, Q. Fecal microbiota transplantation for the treatment of inflammatory bowel disease： An update. Front. Pharmacol. 2020, 11, 574533. [Google Scholar] [CrossRef].
炎症性腸疾患の治療における糞便微生物叢移植の役割。Curr. Opin. Pharmacol. 2020, 55, 8-16. [Google Scholar] [CrossRef].
Leung, P.C.; Cheng, K.F. 糞便微生物叢移植：歴史的レビューと現在の展望。World J. Meta Anal. 2019, 7, 423-427. [Google Scholar] [CrossRef].
Goldenberg, S.D.; Merrick, B. 糞便微生物叢移植の役割：クロストリジオイデス・ディフィシル感染を越えて。Ther. Infect. Dis. 2021, 8, 2049936120981526. [Google Scholar].
Wang, J.W.; Kuo, C.H.; Kuo, F.C.; Wang, Y.K.; Hsu, W.H.; Yu, F.J.; Hu, H.M.; Hsu, P.I.; Wang, J.Y.; Wu, D.C. 糞便微生物移植：総説と最新情報。J. Formos. Med. Assoc. 2019, 118, 23-31. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed].
Borody、T.J.; Campbell、J. 糞便微生物叢移植：現状と今後の方向性。Expert Rev. Gastroenterol. Hepatol. 2011, 5, 653-655. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed].
Cammarota, G.; Ianiro, G.; Gasbarrini, A. クロストリジウム・ディフィシル感染症治療のための糞便微生物叢移植：系統的レビュー。J. Clin. Gastroenterol. 2014, 48, 693-702. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed].
潰瘍性大腸炎患者に対する糞便移植のランダム化比較試験の結果。Gastroenterology 2015, 149, 110-118.e4. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed].
Gupta, S.; Allen-Vercoe, E.; Petrof, E.O. 糞便微生物移植：を参考にした。Therap. Adv. Gastroenterol. 2016, 9, 229-239. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed].
Paramsothy,S.、Kamm,M.A.、Kaakoush,N.O.、Walsh,A.J.、van den Bogaerde,J.、Samuel,D.、Leong,R.W.L.、Connor,S.、Ng,W.、Paramsothy,R.、他。活動性潰瘍性大腸炎に対する多臓器集中糞便微生物移植：無作為化プラセボ対照試験。Lancet 2017, 389, 1218-1228. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed].
Newman、K.M.、Rank、K.M.、Vaughn、B.P.、Khoruts、A. 炎症性腸疾患患者における糞便微生物叢移植を用いた再発性クロストリジウム・ディフィシル感染症の治療。Gut Microbes 2017, 8, 303-309. [Google Scholar] [CrossRef].
Costello, S.P.; Hughes, P.A.; Waters, O.; Bryant, R.V.; Vincent, A.D.; Blatchford, P.; Katsikeros, R.; Makanyanga, J.; Campaniello, M.A.; Mavrangelos, C.; et al. 潰瘍性大腸炎患者の8週間寛解に対する糞便微生物叢移植の効果：無作為化臨床試験。J. Am. Med. Assoc. 2019, 321, 156-164. [Google Scholar] [CrossRef].
Allegretti, J.R.; Mullish, B.H.; Kelly, C.; Fischer, M. The evolution of the use of faecal microbiota transplantation and emerging therapeutic indications. Lancet 2019, 394, 420-431. [Google Scholar] [CrossRef].
Cammarota, G.; Ianiro, G.; Tilg, H.; Rajilić-Stojanović, M.; Kump, P.; Satokari, R.; Sokol, H.; Arkkila, P.; Pintus, C.; Hart, A.; et al. 臨床における糞便微生物移植に関する欧州コンセンサス会議。Gut 2017, 66, 569-580. [Google Scholar] [CrossRef].
Gancarcikova, S.; Popper, M.; Hrckova, G.; Madar, M.; Mudronova, D.; Sopkova, D.; Nemcova, R. gnotobioticモデルとしての抗生物質処理SPFマウス。In Antibiotic Use in Animals; Savic, S., Ed.; InTech： Rijeka, Croatia, 2018; pp. [Google Scholar].
Gancarcikova, S.; Lauko, S.; Hrckova, G.; Andrejcakova, Z.; Hajduckova, V.; Madar, M.; Kolesar Fecskeova, L.; Mudronova, D.; Mravcova, K.; Strkolcova, G.; et al. 疑似無菌マウスにおけるDSS誘発潰瘍性大腸炎の革新的動物モデル。Cells 2020, 9, 2571. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed].
遺伝子発現を解析した結果をまとめたデータベース。EMBnet. J. 2011, 17, 10-12. [Google Scholar] [CrossRef]。
Andrews, S. FastQC：高スループットシーケンスデータの品質管理ツール。2010. Available online: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (accessed on 9 September 2023).
DADA2：イルミナアンプリコンデータからの高分解能サンプル推論。Nat. Methods 2016, 13, 581-583. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed].
SILVA：ARBと互換性のあるリボソームRNA配列データの品質チェックおよびアライメントを行う包括的なオンラインリソース。Nucleic Acids Res. 2007, 35, 7188-7196. [Google Scholar] [CrossRef].
微生物学的研究（Microbiome Census）:微生物学的研究（Microbiome Census）:微生物学的研究（Microbiome Census）:微生物学的研究（Microbiome Census）:微生物学的研究（Microbiome Census）。PLoS ONE 2013, 8, e61217. [Google Scholar] [CrossRef].
Oksanen, J.; Blanchet, F.G.; Friendly, M.; Kindt, R.; Legendre, P.; McGlinn, D.; Minchin, P.R.; O'Hara, R.B.; Simpson, G.L.; Solymos, P.; et al. Vegan：コミュニティ生態学パッケージ。R Package Version 2.5-6. Available online: https://CRAN.R8project.org/package=vegan (accessed on 9 September 2023).
Wickham, H. ggplot2： Elegant Graphics for Data Analysis, 2nd ed.; Springer： New York, NY, USA, 2016. [Google Scholar].
Smolen, A.J. Image Analytic Techniques for Quantification of Immunocytochemical Staining in the Nervous System; Methods in Neurosciences; Conn, P.M., Ed.; Academic Press： New York, NY, USA, 1990; pp. [Google Scholar］
デキストラン硫酸ナトリウムはポリメラーゼと逆転写酵素の両方の活性を阻害する：塩化リチウム精製、迅速かつ効率的なRNA精製技術。BMC Res. Notes 2013, 6, 360. [Google Scholar] [CrossRef].
Aira, A.; Arajol, C.; Casals-Pascual, C.; González-Suárez, B.; Martí, S.; Domínguez, M.Á.; Guardiola, J.; Soriano, Á. 糞便微生物叢移植のための便ドナー選択に関する推奨事項。カタルーニャ消化器学会、カタルーニャ感染症・臨床微生物学会、スペイン感染症・臨床微生物学会のGEMBIOTAグループによって承認されたコンセンサス文書。Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. (Engl. Ed.) 2022, 40, 142-146. [Google Scholar］
Antushevich, H. 疾患治療における糞便微生物叢移植。Clin. Chim. Acta 2020, 503, 90-98. [Google Scholar] [CrossRef].
便微生物移植における有害事象：文献のレビュー。J. Hosp. Infect. 2016, 92, 117-127. [Google Scholar] [CrossRef].
DeFilipp、Z.; Bloom、P.P.; Torres Soto、M.; Mansour、M.K.; Sater、M.R.A.; Huntley、M.H.; Turbett、S.; Chung、R.T.; Chen、Y.B.; Hohmann、E.L. 糞便微生物叢移植により感染した薬剤耐性大腸菌血症。N. Engl. J. Med. 2019, 381, 2043-2050. [Google Scholar] [CrossRef]。
Fouhy, F.; Deane, J.; Rea, M.C.; O'Sullivan, Ó.; Ross, R.P.; O'Callaghan, G.; Plant, B.J.; Stanton, C. The effects of freezing on faecal microbiota as determined using MiSeq sequencing and culture-based investigations. PLoS ONE 2015, 10, e0119355. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed].
Papanicolas, L.E.; Choo, J.M.; Wang, Y.; Leong, L.E.X.; Costello, S.P.; Gordon, D.L.; Wesselingh, S.L.; Rogers, G.B. 糞便移植における細菌の生存率：どの細菌が生き残るか。EBioMedicine 2019, 41, 509-516. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed].
O´Reilly, S. Transplantation of Faecal Microbiota-Alternative Method of Therapy of Ulcerous Colitis. Ph.D. Thesis, The Universtity of Veterinary Medicine and Pharmacy in Kosice, Kosice, Slovakia, 2022. [Google Scholar].
Perše, M.; Cerar, A. デキストラン硫酸ナトリウム大腸炎モデルマウス：罠とトリック。J. Biomed. Biotechnol. 2012, 2012, 718617. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed].
κ-カラギーナンのTNBS誘発炎症に対する増強効果。Int. Immunopharmacol. 2016, 39, 218-228. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed].
また、このような炎症性腸疾患の治療には、腸内細菌叢移植が有効であることが示唆された。Front. Cell Infect. Microbiol. 2019, 9, 393. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed].
Wen, X.; Wang, H.G.; Zhang, M.N.; Zhang, M.H.; Wang, H.; Yang, X.Z. Fecal microbiota transplantation ameliorates experimental colitis via gut microbiota and T-cell modulation. World J. Gastroenterol. 2021, 27, 2834-2849. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed].
このような背景のもとで、消化管内における腸内細菌叢の変化や腸内細菌叢の病態の解明がなされ、消化管内における腸内細菌叢の変化や腸内細菌叢の病態の解明がなされ、消化管内における腸内細菌叢の病態の解明がなされた。Exp. Ther. Med. 2020, 20, 1987-1994. [Google Scholar] [CrossRef].
Randhawa, P.K.; Singh, K.; Singh, N.; Jaggi, A.S. A review on chemical-induced inflammatory bowel disease models in rodents. Korean J. Physiol. Pharmacol. 2014, 18, 279-288. [Google Scholar] [CrossRef].
天然由来化合物の免疫調節効果のモデル生物への影響に関する研究。Ph.D. Thesis, The Universtity of Veterinary Medicine and Pharmacy in Kosice, Kosice, Slovakia, 2021. [Google Scholar].
マウスの実験的大腸炎に対する糞便微生物叢移植の効果。Exp. Ther. Med. 2019, 17, 2581-2586. [Google Scholar] [CrossRef].
Xu, H.M.; Huang, H.L.; Xu, J.; He, J.; Zhao, C.; Peng, Y.; Zhao, H.L.; Huang, W.Q.; Cao, C.Y.; Zhou, Y.J.; et al. 便微生物叢移植後の潰瘍性大腸炎における酪酸と腸内細菌叢のクロストーク。Front. Microbiol. 2021, 12, 658292. [Google Scholar] [CrossRef].
また、このような疾患は、大腸癌の治療において重要な役割を果たすと考えられている。Drug Saf. 2019, 42, 869-880. [Google Scholar] [CrossRef].
Van Dijk, A.J.; Enthoven, P.M.; Van den Hoven, S.G.; Van Laarhoven, M.M.; Niewold, T.A.; Nabuurs, M.J.; Beynen, A.C. The effect of dietary spray-dried porcine plasma on clinical response in weaned piglets challenged with a pathogenic Escherichia coli. Vet. Microbiol. 2002, 84, 207-218. [Google Scholar] [CrossRef].
Quigley, E.M. Leaky gut-Concept or clinical entity. Curr. Opin. Gastroenterol. 2016, 32, 74-79. [Google Scholar] [CrossRef].
Wang、A; Keita、Å.V.; Phan、V.; McKay、C.M.; Schoultz、I.; Lee、J.; Murphy、M.P.; Fernando、M.; Ronaghan、N.; Balce、D.; et al. 上皮バリア機能障害と大腸炎を軽減するためのミトコンドリア由来活性酸素種の標的化。Am. J. Pathol. 2014, 184, 2516-2527. [Google Scholar] [CrossRef].
Martini, E.; Krug, S.M.; Siegmund, B.; Neurath, M.F.; Becker, C. Mend your fences：炎症性腸疾患における上皮バリアと粘膜免疫との関係。細胞。Mol. Gastroenterol. Hepatol. 2017, 4, 33-46. [Google Scholar] [CrossRef].
中瀬博之：OPeNing the epithelial barrier： Osteopontin preserves gut barrier function during intestinal inflammation. Dig. Dis. Sci. 2019, 64, 294-296. [Google Scholar] [CrossRef].
Elgamrani, Y.; Errami, A.A.; Krati, K. A rare association：セリアック病と潰瘍性大腸炎。J. Med. Diagn. Meth. 2016, 5, 3. [Google Scholar].
Girbovan, A.; Sur, G.; Samasca, G.; Lupan, I. Dysbiosis a risk factor for celiac disease. Med. Microbiol. Immunol. 2017, 206, 83-91. [Google Scholar] [CrossRef].
セリアック病と炎症性腸疾患の関連性。J. Clin. Gastroenterol. 2019, 53, 514-522. [Google Scholar】【CrossRef】。
Perathoner, A.; Kogler, P.; Denecke, C.; Pratschke, J.; Kafka-Ritsch, R.; Zitt, M. Crohn病における腸石症関連イレウス。World J. Gastroenterol. 2012, 18, 6160-6163. [Google Scholar] [CrossRef].
Brinkman, D.J.; Ten Hove, A.S.; Vervoordeldonk, M.J.; Luyer, M.D.; de Jonge, W.J. Neuroimmune interactions in the gut and their significance for intestinal immunity. Cells 2019, 8, 670. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed].
Kirchgesner, J.; Lemaitre, M.; Carrat, F.; Zureik, M.; Carbonnel, F.; Dray-Spira, R. 炎症性腸疾患の治療に関連する重篤な日和見感染のリスク。Gastroenterology 2018, 155, 337-346.e10. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed].
Strowski, M.Z.; Wiedenmann, B. Probiotic carbohydrates reduce intestinal permeability and inflammation in metabolic diseases. Gut 2009, 58, 1044-1045. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed].
再発性Clostridium difficile感染症に対する糞便微生物叢移植後の潰瘍性大腸炎の一過性再燃。Clin. Gastroenterol. Hepatol. 2013, 11, 1036-1038. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed].
クローン病および再発性Clostridium difficile感染症患者における糞便微生物叢移植の有害事象としての菌血症。J. Crohns Colitis 2014, 8, 252-253. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed].
Zuo, T.; Ng, S.C. The gut microbiota in the pathogenesis and therapeutics of inflammatory bowel disease. Front. Microbiol. 2018, 9, 2247. [Google Scholar] [CrossRef] [PubMed].
Sha, S.; Xu, B.; Wang, X.; Zhang, Y.; Wang, H.; Kong, X.; Zhu, H.; Wu, K. The biodiversity and composition of the dominant fecal microbiota in patients with inflammatory bowel disease. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2013, 75, 245-251. [Google Scholar] [CrossRef].
クローン病の腸内細菌叢におけるFaecalibacterium prausnitziiの存在量の減少。J. Gastroenterol. Hepatol. 2013, 28, 613-619. [Google Scholar] [CrossRef].
クローン病の糞便微生物群集における酪酸産生菌種の減少. Digestion 2016, 93, 59-65. [Google Scholar] [CrossRef].
炎症性腸疾患の発症における腸内細菌叢の機能的影響。Inflamm. Bowel Dis. 2015, 21, 139-153. [Google Scholar] [CrossRef].
Salas-Jara, M.J.; Ilabaca, A.; Vega, M.; García, A. Biofilm forming Lactobacillus：プロバイオティクスの開発における新たな課題。Microorganisms 2016, 4, 35. [Google Scholar] [CrossRef].
Alagón Fernández Del Campo, P.; De Orta Pando, A.; Straface, J.I.; López Vega, J.R.; Toledo Plata, D.; Niezen Lugo, S.F.; Alvarez Hernández, D.; Barrientos Fortes, T. 炎症性腸疾患における腸内細菌叢と樹状細胞応答を調節するためのプロバイオティクス療法の使用。Med. Sci. 2019, 7, 33. [Google Scholar] [CrossRef].
大腸炎マウスモデルにおける中核微生物の変化：大腸炎モデルマウスにおけるコア変化微生物：包括的な時系列および糞便微生物叢移植解析。Antibiotics 2021, 10, 643. [Google Scholar] [CrossRef].
アカルボース投与マウスにおける腸内細菌叢と発酵産物の変化と寿命の延長。BMC Microbiol. 2019, 19, 130. [Google Scholar] [CrossRef].
Ma, N.; Guo, P.; Zhang, J.; He, T.; Kim, S.W.; Zhang, G.; Ma, X. Nutrients mediate intestinal bacteria-mucosal immune crosstalk. Front. Immunol. 2018, 9, 5. [Google Scholar] [CrossRef].
Meehan, C.J.; Beiko, R.G. A phylogenomic view of ecological specialization in the Lachnospiraceae, a family of digestive tract-associated bacteria. Genome Biol. Evol. 2014, 6, 703-713. [Google Scholar] [CrossRef].
潰瘍性大腸炎患者由来の糞便中Clostridium coccoides/Eubacterium rectale種のムチン環境下in vitro動的腸内モデルにおけるコロニー形成の減少。FEMS Microbiol. Ecol. 2012, 79, 685-696. [Google Scholar] [CrossRef].
中国人の炎症性腸疾患患者における糞便および粘膜関連微生物叢の特徴。Medicine 2014, 93, e51. [Google Scholar] [CrossRef].
炎症性腸疾患（IBD）の予防と治療における腸管生態系の標的調節の研究における異種動物の使用。Ph.D. Thesis, The Universtity of Veterinary Medicine and Pharmacy in Kosice, Kosice, Slovakia, 2022. [Google Scholar].
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共有と引用

MDPIおよびACSスタイル
Lauko, S.; Gancarcikova, S.; Hrckova, G.; Hajduckova, V.; Andrejcakova, Z.; Fecskeova, L.K.; Bertkova, I.; Hijova, E.; Kamlarova, A.; Janicko, M.; et al. 擬似無菌動物モデルにおける軽症、中等症および重症のデキストラン硫酸ナトリウム誘発潰瘍性大腸炎に対する糞便微生物叢移植の有益な効果。Biomedicines 2024, 12, 43. https://doi.org/10.3390/biomedicines12010043

AMAスタイル
Lauko S, Gancarcikova S, Hrckova G, Hajduckova V, Andrejcakova Z, Fecskeova LK, Bertkova I, Hijova E, Kamlarova A, Janicko M, et al. 擬似無菌動物モデルにおける軽度、中等度、重度のデキストラン硫酸ナトリウム誘発潰瘍性大腸炎に対する糞便微生物叢移植の有益な効果。Biomedicines. 2024; 12(1):43. https://doi.org/10.3390/biomedicines12010043

シカゴ/チュラビア式
Lauko, Stanislav, Sona Gancarcikova, Gabriela Hrckova, Vanda Hajduckova, Zuzana Andrejcakova, Livia Kolesar Fecskeova, Izabela Bertkova, Emilia Hijova, Anna Kamlarova, Martin Janicko, and et al. "Beneficial Effect of Faecal Microbiota Transplantation on Mild, Moderate and Severe Dextran Sodium Sulphate-Induced Ulcerative Colitis in a Pseudo Germ-Free Animal Model" Biomedicines 12, no. 1: 43. https://doi.org/10.3390/biomedicines12010043.

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