XBB株とBA.2.86系統の適応度の向上と抗体回避を組み合わせた明確な進化（2024年3月）
Distinct evolution of SARS-CoV-2 Omicron XBB and BA.2.86/JN.1 lineages combining increased fitness and antibody evasion
元→https://www.nature.com/articles/s41467-024-46490-7
Abstract
SARS-CoV-2 の絶え間ない循環により、新しいウイルスの亜系統が継続的に出現しています。ここでは、2024 年 1 月の循環変異体の 80% 以上を占める XBB.1、XBB.1.5、XBB.1.9.1、XBB.1.16.1、EG.5.1.1、EG.5.1.3、XBF、BA.2.86.1、JN.1 の変異体を分離して特徴付けます。XBB 亜変異体はスパイクに少数ですが繰り返し発生する変異を持ちますが、BA.2.86.1 と JN.1 には 30 を超える追加の変化があります。これらの変異体は IGROV-1 では複製されますがVero E6 では複製されず、顕著な融合性はありません。これらは鼻の上皮細胞に強力に感染し、EG.5.1.3 が最も高い適応性を示します。
抗ウイルス薬は活性を維持しています。ワクチン接種者および BA.1/BA.2 感染者からの中和抗体 (NAb) 反応は BA.1 に比べて著しく低く、変異体間で大きな違いはありません。XBB のブレイクスルー感染は、XBB および BA.2.86 変異体の両方に対する NAb 反応を強化します。JN.1 は BA.2.86.1 と比較して ACE2 に対する親和性が低く、免疫回避特性が高くなります。
したがって、これらの変異体は異なるものの、その進化の軌跡は、適応度の向上と抗体回避を組み合わせています。
Introduction
オミクロンのその後の亜系統は、2021年11月にBA.1が出現して以来広がっています。人類の90%以上が、おそらく1つのオミクロン亜変異体に感染しています。 以前の感染やワクチン接種によってもたらされた新しいウイルス獲得に対する効果的で長期的な保護がないため、ウイルスはさらに進化し、多様化しています。
2022年9月に特定されたXBB系統は、2つのBA.2由来の変異体（BJ.1とBM.1.1.1）の組み換えから始まり、以前のオミクロン株のほとんどを徐々に置き換えてきました。この系統のメンバーは、伝染率の向上と免疫回避特性が特徴です。
これらの変異体は、多くの国で小規模な汚染の波を引き起こしています。地理的分布はやや不均一です。
変異体は密接に関連しており、段階的な変化の蓄積に対応するスパイクの追加の限られた一連の変異を持っています。このプロセスには収斂進化が関連している可能性があります。たとえば、多くの系統は、スパイクの受容体結合ドメイン (RBD) に、中和抗体の回避変異として知られる F486P や F456L などの変異を独自に獲得しました。
他の組み換え体は、世界の地域で頻度が増加しましたが、広範囲に拡散することはありませんでした。たとえば、オーストラリアまたはニュージーランドで確認され、F486P 置換を持つ XBF (BA.5.2.3 系統と BA.2.75.3 系統の組み換え体) や XBC (BA.2 系統と Delta 系統の組み換え体) です。
この収束進化は、オミクロン感染および/またはワクチン接種によって引き起こされる刷り込み免疫またはハイブリッド免疫によって及ぼされる同様の選択圧によるものと考えられます。
2023年8月、重要な進化の飛躍に相当するBA.2.86という系統が複数の国で検出され、世界保健機関によって注目の変異体として分類されました。BA.2.86 の有効再生産数は、XBB.1.5 および EG.5.1 よりも高いか同等であると推定されています。BA.2.86 の感染率が高く (85% 以上)、大規模な介護施設での流行でその感染力の高さが確認されました。
BA.2.86 の病原性増加の臨床的証拠は今のところありません。ハムスターでは、BA.2.86 は弱毒化表現型を示します。この前例のない変異の組み合わせが抗体回避に与える影響が解明され始めています。
最近のいくつかの論文とプレプリントでは、BA.2.86 に対する NAb 応答は BA.2 よりも低いが、同時に循環している他の XBB 由来の変異体と同等かわずかに高いことが報告されています。これらの研究のほとんどは、レンチウイルスまたはVSV擬似型で実施されました。
BA.2.86ウイルスの分離により、この株の抗体回避特性が確認されました。BA.2.86 スパイクは他の変異体よりも ACE2 に対する親和性が強いですが、ウイルスの複製と向性への影響は十分に理解されていません。
その後、BA.2.86 系統は急速に進化し始め、2023 年 9 月には JN.1 サブ系統が出現しました。2023年12月、JN.1はヨーロッパと米国で急増しました。世界中で優勢となり、2023年12月から2024年1月にかけての流行の急増を引き起こした主な変異体でした。疫学的モデリングに基づくと、JN.1はEG.5.1.1と比較して2.3倍の成長優位性を示すと推定されています。JN.1 擬似型を使用したプレプリントでは、BA.2.86 と比較して、特にクラス 1 中和抗体に対する免疫回避特性が強化され、ACE2 に対する親和性が低下したことが報告されています。
ここでは、2023 年後半から 2024 年初頭にかけて流行していた 9 つのウイルス株を分離し、特徴づけました。細胞株と関連するヒト一次鼻腔上皮細胞におけるそれらの複製、ACE2への結合、融合性を並べて比較しました。これまでに承認されたmAbと抗ウイルス薬、さまざまなワクチン療法を受けた人の血清、XBB流行中に突発感染を経験した個人に対するそれらの感受性を調べました。
Results
XBB由来、BA2.86.1およびJN.1変異体のVero E6誘導体およびIGROV-1細胞における複製
我々は、9つの変異体の適応度を、異なる細胞での複製を評価し、対照としてD614G、BA.1、BA.5、またはBQ.1.1を追加することで特徴付けました。JN.1は他の変異体よりも後に分離されたため、ほとんどの実験に含まれていましたが、すべての実験には含まれていませんでした。
我々は最初に、フローサイトメトリーで検証されたように、ACE2を自然に発現しますが、融合のためにSARS-CoV-2をプライミングするプロテアーゼであるTMPRSS2を発現しないVero E6細胞とIGROV-1細胞を選択しました（図S3）。
Vero E6細胞は、プレオミクロン株を効率的に複製しますが、以前のオミクロン変異体に対する感受性は低くなります。そこで、Vero E6 細胞と IGROV-1 細胞の許容性をすべての変異体と比較しました (図 S4a)。
ウイルスストックを段階的に希釈し、2 つの標的細胞とともにインキュベートしました。48 時間後、細胞を抗 SARS-CoV-2 N モノクローナル抗体で染色しました。感染細胞の巣は自動的にスコア付けされました (図 S4b)。
祖先の D614G 株は、2 つの細胞株で同様に感染性がありました (図 S4)。対照的に、12 の Omicron 変異体はいずれも Vero E6 に効率的に感染しなかったが、IGROV-1 では感染力が非常に強かった。
次に、Vero E6 における変異体の感染力の低さが TMPRSS2 の欠如によるものかどうかを検討しました。そこで、TMPRSS2 を発現するように設計された 2 つの Vero E6 サブクローンを選択しました。最初のクローン（Vero E6 TMP-1 と名付けられました）は当研究室で生成され、TMPRSS2 の発現レベルが高く、ACE2 の発現レベルはかなり低いことが示されています。これは、この受容体がプロテアーゼによって切断されるためと考えられます（図 S3）。Vero E6 TMP-2 は以前に説明されています。TMPRSS2 の表面発現レベルは低く、ACE2 レベルは Vero E6 細胞と同等です（図 S3）。そこで、IGROV-1、Vero E6、Vero E6-TMPRSS2 クローン 1 および 2 におけるウイルス複製の速度を比較しました。デルタ株と BQ.1.1 (BA.5 由来のオミクロン株) をコントロール として使用し、XBB.1、XBB.1.5、EG.5.1.3、および BA.2.86.1 と比較しました (図 2a)。すべてのウイルスは IGROV-1 細胞で効率的に複製され、感染後 2 日目 (p.i.) に感染細胞のピークが検出されました。オミクロン株は、4 日間の調査期間中に Vero E6 に強力に感染しませんでした。
2 つの Vero E6-TMPRSS2 クローンは、変異体に対する感受性に関して異なる挙動を示しました。
Vero E6 TMP-1 は、デルタ株の成長を可能にしたにもかかわらず、オミクロン株の強力な複製をサポートしませんでした。対照的に、Vero E6 TMP-2 は新しい変異体を効率的に複製しました (図 2a)。
Vero E6 TMP-1 と TMP-2 の違いは、クローン効果によるものと考えられます。あるいは、TMPRSS2 レベルが高く、Vero E6 TMP-1 における ACE2 の表面発現が低下していることが、XBB 由来および BA.2.86.1 変異体にとって有害である可能性があります。
根本的なメカニズムに関係なく、私たちの結果は、最近の XBB 由来および BA.2.86 変異体が、一部の細胞株に対してプレオミクロンウイルスとは異なる親和性を示すことを示しています。Vero E6 細胞における TMPRSS2 の発現が低いことは、XBB 由来および BA.2.86.1 感染に対する細胞の許容性と関連しています。
我々はさらに、IGROV-1 が SARS-CoV-2 複製に対して高い感受性を示すメカニズムを調査しました。これらの細胞におけるウイルス侵入経路を調べ、TMPRSS2 阻害剤である Camostat、カテプシン L 阻害剤である SB412515、または主にエンドサイトーシス プロテアーゼに作用する汎システイン プロテアーゼ阻害剤である E-64d のいずれかの存在下で感染を行いました。薬剤は感染の2時間前に添加され、感染細胞をスコアリングする前に24時間維持されました（図S5）。まず、プレオミクロン株と最近のオミクロン株をいくつか選択し（D614G、Delta、BA.1、XBB.1、XBB.1.16.1）、IGROV-1、Vero E6、Vero TMP-1細胞で薬剤の効果をテストしました。
カモスタット（100µM）は、IGROV-1およびVero E6細胞でウイルスの複製を阻害しませんでした。これは、フローサイトメトリーでこれらの細胞でTMPRSS2が検出されなかったことと一致しています。カモスタットはVero E6 TMP-1細胞でウイルスの複製を50～80%阻害し、TMPRSS2が標的細胞に存在するとウイルスの侵入を促進することを確認しました。Vero E6 TMP-1 細胞におけるカモスタットに対する変異体の感受性には有意差はなかった。
SB412515 と E-64d (両方とも 10 µM) は IGROV-1 細胞におけるウイルス感染を強力に阻害した (すべての変異体で 90% を超える阻害) が、Vero E6 細胞ではそれほど効果的ではなかった (図 S5)。これは、エンドサイトーシスによるウイルス侵入がIGROV-1で特に活発であることを示唆している。SB412515 と E-64d の両方で、D614G、XBB.1.5、EG.5.1.3、および BA.2.86.1 バリアントで同様の ED50 が得られました。これは、すべてのバリアントが IGROV-1 細胞で同様の侵入経路を使用していることを示している可能性があります (図 2b)。
IGROV-1 での強力な抗ウイルス効果と Vero E6 細胞での低い活性とは対照的に、SB412515 と E-64d は Vero E6 TMP-1 細胞ではほとんど不活性であり、TMPRSS2 が存在する場合、ウイルスの侵入と融合は細胞表面で優先的に発生することが確認されました。
次に、IGROV-1 細胞と Vero E6 TMP-2 細胞における Delta、BA.2.86.1、JN.1 の Camostat (100 µM)、SB412515、E-64d (10 µM) に対する感受性を評価しました。SB412515 と E-64d は、IGROV-1 細胞における 3 つの変異体の複製を効果的に阻害しました。Camostat は、Vero E6 TMP-2 細胞における Delta、BA.2.86.1、JN.1 の複製を阻害しましたが、IGROV-1 細胞では阻害せず、他の変異体で観察された結果を確認しました (図 S6)。
したがって、IGROV-1 はすべての SARS-CoV-2 株に対して非常に敏感であり、これはおそらくウイルスの侵入を促進する強力なエンドサイトーシス経路によるものと考えられます。
XBB由来およびBA2.86.1変異体の融合性とACE2結合
次に、スパイクの融合性と、ウイルス複製とは無関係にシンシチウムを形成する能力を調査しました。融合細胞がGFP+になるGFP-Splitベースのモデルを使用しました（図3a）。我々は、スパイクをGFP-11サブユニットを発現する293T細胞にトランスフェクトし、GFP1-10サブユニットを発現するIGROV-1細胞と共培養した（図3a）。
トランスフェクトされたHEK293T細胞上のスパイク発現は、汎コロナウイルス抗S2 mAbで染色して測定したところ、変異体間で同様であった（図S7）。
我々や他の研究者が以前に報告したように、祖先のD614G株とDelta株は、初期のOmicron BA.1株とBA.4/5株よりも融合性が高い。BQ.1.1 および XBB.1.5/XBB.1.9.1 スパイクは部分的に融合性を回復しましたが、XBB.1.16.1 および最近の EG.5.1.1 および BA.2.86.1 スパイクはBA.4/5 スパイクよりも融合性が低いことがわかりました (図 3b、c)。この融合性のプロファイルは、Vero E6 細胞をターゲットとして使用した場合にも同様に観察されました (図 3d)。
Vero E6 TMP-1 を標的細胞とした場合、Vero E6 細胞と比較すると、すべての変異体でシンシチウムの数が約 2 倍増加しました (図 3d)。これは、TMPRSS2 がそれらの融合活性を高めることを示しています。したがって、最近の XBB 由来および BA.2.86.1スパイクは、少なくともテストした細胞株では、デルタ株 またはその前身であるオミクロン株 と比較して、高い融合特性を示しません。
次に、さまざまな変異スパイクの ACE2 に対する親和性を調べました。この目的のために、ほとんどの変異体を IGROV-1 細胞に 24 時間感染させました。細胞は、生産的に感染した細胞を視覚化するために抗 N 抗体で染色され、可溶性ビオチン化 ACE2 の連続希釈液にさらされました。結合はフローサイトメトリーで測定されました (図 S8a)。ACE2 滴定結合曲線が生成され、EC50 (50% 結合に必要な ACE2 の量) が計算されました (図 S8b)。
XBB.1、XBB.1.16.1、EG.5.1.3 のスパイクは Delta と同等の ACE2 親和性を示しましたが、BA.2.86.1 は受容体に強力に結合しました (図 3e)。
異なるスパイクを一時的に発現する 293 T 細胞でも同様の結果が得られました (図 3f)。これは、組み換えタンパク質で得られた最近の報告を裏付けるものです。
一次鼻上皮細胞におけるXBB由来およびBA2.86.1変異体の複製
我々は、多孔膜上で増殖し、気液界面で4週間分化した（MucilAirBTM由来）一次鼻上皮細胞（hNEC）を使用して、SARS-CoV-2感染の関連モデルで異なる変異体を比較しました。細胞は、同様の低ウイルス接種量（2 x 10³感染単位/mlを含むウイルスストック100µl）で各変異体に感染しました。
報告されているように、感染後4日まで毎日モニタリングされたウイルスRNA（vRNA）放出によって定量化されたところ、BA.1はデルタ株およびD614Gよりも速く複製しました（図4a、b）。デルタ株と比較して、BA.1は感染後24時間で測定されたvRNAレベルが最大60倍増加しました。XBB 由来の変異体は BA.1 と比較して複製の利点を示し、EG.5.1.3 は 24 時間で vRNA 放出が 16 倍増加しました。BA.2.86.1 の複製速度は BA.1 と似ており、他の XBB 由来の変異体よりも高くはありませんでした (図 4a、b)。
感染性ウイルスの放出は感染後 48 時間でモニタリングされ (図 4c)、vRNA レベルと相関していました。
変異体によって誘発される細胞変性効果を免疫蛍光法で評価しました。
感染したhNECは、感染後4日目に抗SARS-CoV-2 N抗体、ファロイジン（F-アクチンを可視化するため）、抗αチューブリン抗体（繊毛を可視化するため）、抗切断カスパーゼ3抗体（アポトーシス死細胞を可視化するため）で染色されました。デルタまたはBA.1と比較した場合、EG.5.1.3およびBA.2.86.1は、繊毛構造の消失やカスパーゼ3の活性化など、細胞変性のマーカーが上昇していました（図4d、図S9）。
したがって、オミクロン株、特にBQ.1.1およびXBB由来の分離株は、D614Gおよびデルタと比較してhNECでより高い感染性を示します。その中で、EG.5.1.3は最も高い適応性を示しています。さらに、EG.5.1.3 および BA.2.86.1 変異体はいずれもこれらの細胞に顕著な細胞変性効果を示します (図 S9)。
BA.2.86.1 と JN.1 の亜種の比較
BA.2.86 の世界的な循環は、急速な多様化と関連しています。スパイクに置換を持つものも含め、複数の亜系統が指定されています (図 7a)。前述のように、JN.1 亜系統は 2023 年 12 月から 2024 年 1 月にかけて世界中で優勢になりました。そこで、BA.2.86.1 と JN.1 の融合性、ACE2 への親和性、hNEC での複製、免疫血清への感受性を比較しました (図 7)。
BA.2.86.1 と JN.1 の融合能は、S-Fuse 細胞の感染時に形成されるシンシチウムを視覚化することで評価したところ、全体的に類似していました (図 7b)。
ACE2 に対する親和性は、上記のように測定しました。ACE2 結合の EC50 は JN.1 では 1.8 倍増加し、受容体に対する親和性が低下したことを示しました (図 7c)。hNEC では、感染後 24 時間で両方の変異体が複製され、有意差は認められませんでした (図 7d)。
オリジナルのファイザーワクチンを3回接種した人の血清によるJN.1の中和に対する感受性は特に低く、BA.2.86.1と比較してEC50が約2分の1に減少しました（図7eおよび表S4）。BA.5二価ワクチンのブースト接種後も同様の傾向が見られ、NAbレベルの中程度かつ短期的な上昇を引き起こしました（図7e）。しかし、ブレークスルーXBB感染によりED50中和力価が約10³に上昇し、BA.2.86.1とJN.1の間に有意差はありませんでした（図7e）。
したがって、最近流行している他のXBB由来の変異体について上で説明したように、XBBのブレークスルー感染により交差防御反応が引き起こされ、中程度ではあるが有意なJN.1の中和が可能になりました（図7eおよび表S4）。
よって、JN.1 は BA.2.86.1 と比較して ACE2 に対する親和性が低く、免疫回避特性が高いため、おそらく疫学的要因と相まってその成功に寄与していると考えられます。
以下省略。