次世代抗体の論文を読む Next generation of multispecific antibody engineering（2回目）
皆さま、こんばんは。
この記事では下記の次世代抗体に関する論文を紹介しています。
長い記事なので、一度に書き上げることができず、何回か追記を繰り返して完結させるつもりでいます。主旨としては、二重特異性抗体あるいは多重特異性抗体は、薬効の面からは非常にポテンシャルが高いが、製造の観点からは困難さが伴う。この論文では、製造の困難さと多重の特異性をもたらすためのビルディングブロック（FabやscFvなど）の特徴や、それらの組み合わせた時に生じる特徴について述べているようです。
論文のタイトル、著者、出典は以下の通り。
Next generation of multispecific antibody engineering
Daniel Keri , Matt Walker, Isha Singh, Kyle Nishikawa and Fernando Garces
Antibody Therapeutics, 2024, Vol. 7, No. 1 37–52
https://doi.org/10.1093/abt/tbad027
まずは、要旨
多重特異性抗体は、同じまたは異なる標的にある 2 つ以上のエピトープを認識します。タンパク質設計によるこの追加機能により、これらの人工分子は、モノクローナル抗体やサイトカインのみなどの単一の標的ではもはや不可能な、満たされていない医療ニーズに対応できます。ただし、これらの多重特異性分子の開発へのアプローチは多くの障害に直面しており、多重特異性分子の新しいワークフローが必要であることが示唆されています。構成要素を非ネイティブの四次構造にうまく組み立てるための分子基盤の調査は、多重特異性のためのプレイブックの作成につながります。これは、制御可能で、成功を予測できるワークフローを設計する場合に必須です。ここでは、治療用生物製剤の現在の最先端技術を振り返り、タンパク質の観点から構成要素と、そのような次世代ワークフローの基礎を構築するために使用できるツールについて検討します。
次にイントロダクション
分子生物学および構造生物学の分野における並外れた進歩と、免疫システムおよび感染症や疾患と闘うそのメカニズムの理解の深まりにより、免疫細胞を操作して人間の寿命を改善し延命させる機会がもたらされました [1]。新薬発見の取り組みは、19世紀後半の近代的な始まり以来、一連の重要な技術革新に触発され、アプローチと薬物の形態の両方で大きな変化を遂げてきました。1950年代のX線結晶構造解析の確立により、対象のタンパク質を原子レベルで視覚化できるようになり、その後数十年にわたって構造に基づく医薬品設計が可能になりました。1970年代の組み換えDNAおよびハイブリドーマ技術の発見により、イーライリリー/ジェネンテックのヒューマリン [2]、アムジェンのエポジェン [3]、バイオジェンのイントロン-Aなどの最初の組み換えタンパク質治療薬、および最初のモノクローナル抗体（mAb）治療薬であるオーソクローンOKT3 [4、5]が可能になりました。これらの技術は、生物学的製剤という新しい薬物モダリティの幕開けとなり、現在までに約 160 種類のタンパク質治療薬が臨床使用が承認されています [6] (図 1)。モノクローナル抗体 (mAbs) などの免疫グロブリンなどの生物学的製剤 (ただしこれに限定されません) は、現在、治療開発において最も追求されている薬物モダリティです [7]。しかし、mAbs を使用した単一標的化の限界と満たされていない医療ニーズの高まりから、研究者はさらなる進歩を遂げ、多重特異性を持つ分子を概念化するようになりました [8, 9]。多重特異性抗体 (MsAbs) の特徴は、同じまたは異なる標的にある 2 つ以上のエピトープを認識できることです。この多重認識能力により、従来の mAbs の機能が拡張され、腫瘍細胞を破壊するために免疫細胞をリクルートしたり、異なる細胞表面タンパク質を架橋したりするなど、多様な用途が可能になります [8–10]。
カトゥマキソマブ、ブリナツモマブ、エミシズマブなどの最初の MsAbs は、異なる特異性/エピトープを持つ Ab から抽出された Ab フラグメントの単純な複合体として始まりましたが [11–14]、非 Ab タンパク質（すなわち、サイトカイン、さらにはタンパク質内因性リガンド（41BB））を Ab ドメインに融合すると、治療上の大きな可能性を秘めながらも予測不可能な挙動を示す複雑なタンパク質キメラの配列が得られることが観察されました [15–17]。MsAbs は、結合モジュールのサイズ、構成、価数、柔軟性、アプローチ角度、および開発可能性、分布、薬物動態特性が変化することがよくあります [8, 9]。これらの新しい分子実体（NME）は、現在臨床開発中であると報告されている分子が約 300 個あるにもかかわらず、これまでに承認された MsAbs はわずか 7 個であり、医薬品開発とそのプラットフォームの限界をすぐに明らかにしました [6]。失敗の多くは、ターゲットの特定や検証が最適ではなかったことに起因するが、臨床候補の薬物特性の低さにも対処する必要がある[18]。より合理的なワークフローと統合された計算タンパク質設計ツールの出現は、私たちが制御でき、成功を予測できる医薬品開発ワークフローの設計の鍵となる可能性がある[19–21]。
機械学習（ML）や人工知能（AI）など、ハイテク分野の最先端技術の多くがバイオテクノロジーに波及しており、いくつかの大手バイオ医薬品企業がこの分野で注目すべき投資を行っています（Rathore、cell、2022）。たとえば、Generate BiomedicineとAmgenは提携して、いわゆるアンドラッグターゲットに関する課題を克服するためにMLを使用しています。過去2年間で、タンパク質構造の予測におけるAlphafold2やRosettafoldなどのツールの使用により、MLが創薬を変革する可能性が実証されました[22–27]。さらなる進歩は、大規模なデータセットの可用性と収集に依存します。このレビューでは、選択されたタンパク質ビルディングブロック（BB）のグループの特性と、予測可能な結果を持つMsAbsの設計を促進するためにそれらをどのように活用できるかを検討します。次に、構造および計算誘導タンパク質工学の最新技術を検討し、そのようなツールを効果的に展開して次世代の MsAbs の設計を可能にする方法について説明します。
ビルディング ブロック
MsAbs は、従来の抗体に比べて重要な利点があり、強力な生化学的特性と新しい機能を持つ複数のタンパク質を標的とする強力な分子に加工することができます。抗体やサイトカインなどの結合能力を持つ自然界の既存のタンパク質は、貴重な BB (図 2) を提供します。その配列とフォールディングは、何百万年もかけて最適化されてきました [28–30]。同様に、自然界に似た MsAbs の開発では、適切な BB の選択と、リンカーを介した遺伝子融合またはタンパク質ドメインのヘテロ二量体化 (つまり、鎖対合) の場合の共有結合によって相互接続した場合の互換性が、これらの高機能な多価分子の設計と生成を計画する際に重要な考慮事項となります [31–35]。正しく組み合わせると、多くの BB からさまざまな MsAbs 形式を生成できます。天然由来のBBには、抗原結合フラグメント（Fab）、単鎖可変フラグメント（scFv）、結晶化フラグメント（Fc）、単一ドメイン抗体（VHH）、サイトカイン（図3）が含まれます[31、36–41]。対照的に、ミニタンパク質やde novoタンパク質などの人工BBも、Rosetta [35]（図2）などの次世代計算ツールで可能です。
以下では、各BBの特性を注意深く見て、治療製品プロファイル（TPP）の観点から、各クラスのBBがMsAbsの組み立てにもたらす利点と欠点を検討します。
2024年10月10日追記
これからは、多重特異性抗体を作るためのビルディングブロックについて、それらの特徴を羅列していきます。
最もよく使われるビルディングブロック、Fab
MsAbs を設計するためのシンプルで最小限のアプローチは、IgG の Fab 部分を使用することです。Fab は、HC の VH および CH1 ドメインと LC 全体 (VL および CL) で構成されており [42, 43]、約 100 個の残基が水素結合、塩橋、疎水性相互作用、ファンデルワールス力などの複数の安定化接触に関与する非常に安定したヘテロ二量体界面を形成します [43]。さらに、scFv (下記参照) とは大きく異なり、IgG からの Fab の抽出には、CH1 を Ab ヒンジに接続する柔軟なリンカーの切断のみが必要であるため、Fab 表面は溶媒への曝露が可能です。このように、安定したタンパク質コアと広大な親水性表面により、Fab は MsAbs の組み立てによく使用され、特に高濃度で処方された薬剤や皮下 (SC) 投与される薬剤によく使用されます。しかし、2つの異なるポリペプチド鎖からなるBBはヘテロ二量体アセンブリを必要とし、これは2つ以上の異なるFab（すなわち、Hetero-IgG）を含むMsAbsにとって重要な考慮事項であり、各HCとLCの正しい同族対合が必要である（図2）。Hetero-IgGのような分子の単一細胞発現は最大10の異なる誤対合種を生成する可能性があるため[32]、正しい鎖対合を強制するための多くの工学戦略が構想されてきた（電荷対合変異（CPM）、ノブ・イン・ホール（KiH）、単鎖Fab（scFab）など）[43–46]。scFabはscFvとは異なりFabの生物物理学的特性を保持しており、最近印象的な結果を示している[47]。とはいえ、CDRによって引き起こされるVH/VLインターフェースの配列変異により、これらの鎖対合プラットフォームアプローチはあまり成功していない[32、48]。別の方法は、共通LC（cLC）を使用することである。これらのcLCは、非同族HCによって駆動され、結合をほとんどまたは全く妨げることなく2つ以上の異なるHCと対になることができ、cLCトランスジェニックマウス[49]、ディスプレイ[50]を使用するか、または単に特定のLCが同族HCに加えて非同族HCとも対になって発現および結合できるかどうかを試験することによって、生体内で発見することができる[32]。Cortellisによると、現在臨床試験中の約300のMsAbsのうち約58％に、BBとして少なくとも1つのFabが含まれている（図3）。さらに、米国食品医薬品局（FDA）と欧州医薬品庁から承認を受けた最初のMsAbsの1つは、共通のLCを共有する2つのFabを含む血友病治療薬エミシズマブであった。
ScFvs、隠れた欠点を持つ最も魅力的な構成要素
ScFv は、重鎖 (VH) と軽鎖 (VL) の可変領域を、柔軟性の高いリンカーを介して接続することで生成される分子です [51]。いくつかの Fv リンカーが臨床に導入されています。最も一般的なのは (Gly4Ser)3 [14] ですが、リンカー配列をより剛性の高いものや静電的に帯電したものにカスタマイズすることもできます [52]。さらに、scFv 分子内の VH–VL または VL–VH の方向は、この BB の結合特性と開発特性に影響します [53]。これにより、単一のポリペプチド鎖によって鎖対合の複雑さが回避され (上記の Fab を参照)、Fab の約半分のサイズ (約 25 kDa) になるため、scFv は MsAbs を作成するための魅力的な BB になります (図 2)。さらに、さまざまなリンカーを使用して Fc の N 末端と C 末端にタンデムに融合したり、2 ～ 4 コピーのストリングにリンクしたりすることもできます [8、54]。しかし、この BB には Fab の定常領域である CH1 と CL がないため、CH1–CL インターフェースの C 末端にある天然のジスルフィド結合も存在しません。タンパク質リンカーは精製および保存中の Fv 固有の不安定性を克服するのに役立ちますが、動的な VH/VL インターフェースのため、熱安定性は平均して親 Fab よりも低くなります [51、53、55]。これを改善するために、ジスルフィド結合を導入してこのインターフェースを強化し、熱安定性を高めることに成功しました。しかし、プラットフォームジスルフィドソリューションを導入すると (つまり、VH40–VL100)、多くの Fab は scFv に変換しても機能を保持できなくなります [53、56、57]。安定性を向上させるカスタマイズされたジスルフィド結合は、計算によるタンパク質設計によって特定できます [31、58]。 scFvの生成によりCH1/CL領域が切断され、Fv表面の約25%が溶媒にさらされます（図2）。その結果、Fvのパラトープの反対側にあるこの領域は、凝集傾向のある重要な領域になります[53]。凝集は分子濃度と相関していることが多いため、scFvを含むMsAbsは、Abのような濃度にさらされると単分散性が低下し、TPPが制限されます。一般的に、シンプルなプラットフォーム技術の魅力と、開発サイクルの後半でのみ明らかになる欠点が相まって、多くのscFvを含むMsAbsが臨床に進んでいます。その結果、現在臨床開発中の約 300 の MsAbs のうち約 36% には、BB の 1 つとして少なくとも 1 つの scFv が含まれており (図 3)、Amgen の 2 つの scFv を直列に持つ分子である blinatumomab は、2014 年に FDA の承認を受けました。scFv の欠点と鎖のペアリングの複雑さを克服するために、この分野では VHH への移行が進んでいます。
VHH: scFvsに代わる新承認のビルディングブロック
ラクダ科動物やサメはIgGに加えて、抗原結合領域が重鎖の単一の可変ドメイン（VHH）で構成される重鎖のみの抗体を自然に産生します[59]（図2）。さらに、VHHは、ヒト化VHHを発現するトランスジェニックマウスモデル[60、61]やディスプレイ[62]によっても生成できます。これらのVHHはナノボディまたは単一ドメイン抗体（sdAbs）とも呼ばれ、MsAbsの組み立てにおいてBBとして大きな利点を提供し、Fabの場合のような同族HC/LCペアリングの必要性を回避し、scFvの場合のような相互接続リンカーの配置を回避します[59、63]。さらに、約 12～15 kDa のコンパクトな構造 (図 2) のため、VHH は、高収量、高タンパク質濃度でのストレス (2W@4deg) 時の凝集性が低い、高熱安定性、低粘度など、望ましい開発特性を示す可能性があります [64, 65]。最適な生物物理学的特性の結果として、VHH はサイズが小さいため全身循環での半減期が短いため、吸入によって安全に送達することもできます [66]。VHH の結合親和性はピコモルまで高く、VL パラトープがなくても最高の Fab または scFv 分子の親和性に匹敵します [63]。VHH の非ヒトフレームワークに関する当初の安全性の懸念がありましたが、2019 年に FDA がカプラシズマブを承認したことで、これらの懸念はすぐに緩和されました。それ以来、25 種類の VHH 含有 MsAbs (約 10%) が臨床開発段階に入り (図 3)、臨床における VHH の道筋が明確になったことが示唆されています。
多機能な構成要素であるFc
抗体工学における Fc
生物製剤の重要な BB としての Fc の役割は、30 年以上前に HIV 感染を阻害するために開発された最初の Fc-CD4 融合によって長い間認識されてきました [67, 68]。さらに、MsAbs は、チェーンペアリング技術の導入により Fc がヘテロ二量体化する能力から大きな恩恵を受けています (図 2)。Fc ヘテロ二量体化の 2 つの一般的なアプローチは、ノブホール (KiH) 変異と CPM の使用です [46, 69]。KiH 変異は、一方の鎖にトリプトファンやチロシンなどの立体的にかさばるアミノ酸を導入し、もう一方の鎖にグリシンやアラニンなどの小さなアミノ酸を導入して、それぞれ突起とポケットを作成します。このアプローチはノブ-ノブ ホモ二量体を減らすのに特に効果的ですが、ホール-ホール ホモ二量体も形成される可能性があり、追加の精製手順で目的のヘテロ二量体から分離する必要があります。対照的に、CPM は、ヘテロ二量体形成を促進するために、一方の鎖に正に帯電した残基を導入し、もう一方の鎖に負に帯電した残基を導入します。ここでは、同じ電荷を持つ鎖は反発すると予想され、反対の電荷を持つ鎖はヘテロ二量体形成を促進するでしょう。これにより、Fc は、Fc の各半分の N 末端と C 末端の両方に異なる BB を結合できるため、非対称フォーマットが必要な分子の生成エンジンになります [8、9、70] (図 2)。これは、最適な開発プロファイルを示すことでも知られており、Fc を含む MsAbs に、より高い発現収率、プロテイン A 捕捉による精製の容易さ、および高い溶解性をもたらします [71]。さらに、Fc はさまざまな細胞の表面にあるいくつかの受容体を認識できるため、これを操作して TI を改善できます (図 2)。当然のことながら、現在臨床試験中の約 300 の MsAbs のうち約 83% に Fc が含まれています (図 3)。
Fc生物学
Fcは、免疫応答を変化させたり、生体内で抗体の半減期を延長したりする複数のエフェクタータンパク質と相互作用します[72]。たとえば、IgG Fcドメインは、Fcガンマ受容体ファミリー（FcγR）のタンパク質と相互作用してエフェクター細胞応答を誘発し、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害または抗体依存性細胞媒介性貪食作用を引き起こします[73]。新生児Fc受容体（FcRn）は、エンドソームリサイクルプロセスの重要な部分であるため、他の機能の中でも、Fc含有MsAbsの半減期を延長する役割を果たしています[74]。C1qもFcに結合し、膜攻撃複合体の形成を介して補体系を活性化し、最終的に補体依存性細胞傷害を引き起こします[75]。したがって、Fc含有治療薬における各相互作用は、不必要な免疫応答を防ぐために慎重に調整する必要があります。
FcγR
Fcγ R ファミリーは、抗体結合に反応して細胞内シグナル伝達イベントを介して細胞毒性と貪食作用を調節します。これらのタンパク質は、Fcγ RI、Fcγ RIIa、Fcγ RIIb、Fcγ RIIc、Fcγ RIIIa、および Fcγ RIIIb で構成されています [76, 77]。各 Fcγ R は、細胞内シグナル伝達モチーフに基づいて、活性化型または阻害型に分類されます。Fcγ RI、Fcγ RIIa、Fcγ RIIc、および Fcγ RIIIa は、ヒトでは活性化されていると考えられており、細胞内ドメインに免疫受容体チロシン活性化モチーフ (ITAM) が含まれています [78–80]。Fcγ RI を除く受容体は、Fc に対する親和性が低く、IgG 複合体と最もよく相互作用します。結果として生じるITAMモチーフのクラスター化は、SRCキナーゼ、SYKキナーゼ、Rho GTPaseおよびアクチンポリメラーゼを含むシグナルカスケードにつながり、貪食作用をもたらします[80–86]。MAPキナーゼ、RAS経路およびMEKもこのシグナル伝達カスケードを介して活性化され、サイトカインの発現につながります[87–89]。シグナル伝達カスケードの結果は細胞タイプに特異的であり、各細胞で発現している受容体のタイプに依存します。対照的に、FcγRIIbは、免疫受容体チロシン阻害モチーフ（ITIM）を含む唯一の阻害ファミリーメンバーです[90– 92]。ITIMとITAMの相互作用は、SHIP-1およびSHIP-2のリクルートメントと活性化をもたらし、IP3前駆体の枯渇につながり、下流のシグナル伝達を妨げます[93]。このように、FcとFcγRとの相互作用は、腫瘍学、炎症学、ウイルス学で研究できる局所的な方法で免疫細胞応答をリクルートして誘発するようにFc含有MsAbをプログラムするユニークな機会を提供します。FcのP238D変異は、FcγRIIaよりもFcγRIIbの結合を強化し、アゴニスト活性を高めると報告されています[94]。対照的に、ジェネンテックで開発されたLALAやアムジェンのSEFL2などの変異は、すべてのFcγRへのFcの結合を完全に無効にするように設計されました[31、42、95、96]。どちらの場合も、LALAとSEFL2により、治療効果はMsAbのFabまたは他の標的BBからのみ得られます。
FcRn
FcRnは、免疫応答につながるシグナル伝達カスケードに直接関与しないため、ユニークなFc受容体です。β2ミクログロブリン（β2m）との二量体としてFcと相互作用し、構造的にはMHC1に似ています[97、98]。FcRnは細胞内に存在し、エンドソームを介してリサイクルすることでIgGの半減期を延長する働きをします[99]。弱酸性条件下では、FcRnは、CH2とCH3の接合部に位置するFc上の残基His310とHis435のプロトン化を介してFcに対して高い親和性を示します[100]。IgGがこれらのエンドソームに入ると、酸性条件によりヒスチジンのプロトン化が起こり、その後FcRnが結合します[101]。その後、FcRn-IgG複合体はエンドソームに保持され、他の分子は分解のためにリソソームに輸送されます。エンドソームが細胞膜と融合すると、pH の変化によって FcRn-IgG 複合体が解離します。この作用機序は、胎盤を含む複数の組織への IgG の転座にも関係しています。
半減期延長 (HLE) 変異によって、Fc によって提供される半減期をさらに延長することには、多くの場合利点があります。したがって、低 pH で FcRn に対する Fc 親和性を高める変異は、投与頻度を減らすために HLE が好まれるため、臨床的に関連性があります。HLE 技術の 2 つの例としては、Xencor の LS (M428L/N434S) 変異と Medimmune の YTE (M252Y/S254T/T256E) があり、これらは FcRn-Fc インターフェースの点変異スキャンに基づいて特定されました [102–104]。
この論文では、このあとビルディングブロックとして補体、サイトカイン、DARPinなどのミニプロテインについても言及いていますが、この投稿ではそれらは割愛します。次回は次のセクションである『治療フォーマットの組み立て』に進みます。