待てSTOPコロナワクチン接種

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ファイザーの公開文書3ページめより   (2021年11月1日アクセス)

SARS-CoV-2 mRNA Vaccine (BNT162, PF-07302048) 2.6.4 薬物動態試験の概要文

ファイザー社によってマスクされている部分があるので、文章が途切れ途切れになっています。英語原文pdfへのリンクが無効 (?変更かもしれません)になった(2022年8月27日アクセス)ため公開します

1. まとめ
マスキング箇所:調整中
BNT162b2(BioNTech コード番号:BNT162，Pfizer コード番号:PF-07302048)は，重症急性呼 吸器症候群コロナウイルス 2(SARS-CoV-2)のスパイク糖タンパク質(S タンパク質)全長体を コードする修飾ヌクレオシド mRNA(modRNA)であり，SARS-CoV-2 による感染症に対する mRNA ワクチンの本質として開発が進められている。BNT162b2 の製剤化にあたっては，2 つの 機能脂質である ALC-0315(アミノ脂質)および ALC-0159(PEG 脂質)ならびに 2 つの構造脂質 として DSPC(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)およびコレステロールと混合することで BNT162b2 を封入する脂質ナノ粒子(LNP)が形成される(以降，「BNT162b2 封入 LNP」)。

BNT162b2 封入 LNP の非臨床薬物動態を評価するために，LNP に含まれる ALC-0315 および ALC-0159 の吸収(PK)，代謝および排泄を評価する in vivo および in vitro 試験ならびに BNT162b2 の代替レポーターとしてルシフェラーゼまたは放射能標識した脂質を利用した生体内分布試験 を実施した。

感染症予防を目的としたワクチンの開発では全身曝露量の評価を必要としないことを踏まえ (WHO, 2005; Infectious disease prevention vaccine non-clinical trial guidelines 感染症予防ワクチンの非臨床試験ガイドライン)1,2，BNT162b2 封入 LNP の筋肉 内投与による PK 試験は実施しなかった。PK 試験はPharmacokinetics: 薬物動態試験

また，本剤に含有される他の 2 種類の脂質(コレステ ロールおよび DSPC)は天然 {=自然界に] に存在する脂質であり，内在性脂質と同様に代謝，排泄されると考 えられる。加えて，BNT162b2 は取り込んだ細胞中のリボヌクレアーゼにより分解されて核酸代謝され，BNT162b2 由来の S タンパク質はタンパク分解を受けると予想される。以上のことから， あらためてこれらの成分の代謝および排泄を評価する必要はないと考えられた。

BNT162b2 の代替レポーターとしてルシフェラーゼをコードする RNA を 封入したLNP (ルシフェラーゼ RNA を BNT162b2 封入 LNP と同一の脂質構成を持つ LNP に封入:以降，「ルシフェラー ゼ RNA 封入LNP」)を Wistar Han ラットに静脈内投与した PK 試験では，血漿，尿，糞および 肝臓試料を経時的に採取して，各試料中の ALC-0315 および ALC-0159 濃度を測定した。その結果，ALC-0315 および ALC-0159 は血中から肝臓にすみやかに分布することが示された。また， ALC-0315 および ALC-0159 はそれぞれ投与量の約 1%および約 50%が未変化体として糞中に排泄され，尿中においてはいずれも検出限界未満であった

生体内分布試験では，ルシフェラーゼ RNA 封入 LNP を BALB/c マウスに筋肉内投与した。その 結果，投与部位にルシフェラーゼの発現が認められ、それより発現量は低値であったものの肝臓で も認められた。ルシフェラーゼの投与部位での発現は投与後 6 時間から認められ，投与後 9 日に は消失した。肝臓での発現も投与後 6 時間に認められ，投与後 48 時間までに消失した。また， ルシフェラーゼ RNA 封入 LNP の放射能標識体をラットに筋肉内投与して生体内分布を定量的に 評価したところ，放射能濃度は投与部位で最も高値であった。投与部位以外では肝臓が最も高 かった(投与量の最大 18%)。

ALC-0315 および ALC-0159 の代謝を CD-1/ICR マウス，Wistar Han または Sprague Dawley ラット， カニクイザルもしくはヒトの血液，肝ミクロソーム，肝 S9 画分および肝細胞を用いて in vitro で 評価した。また，上記のラット静脈内投与 PK 試験で採取した血漿，尿，糞および肝臓試料を用 いて in vivo 代謝についても検討した。これら in vitro および in vivo 試験から，ALC-0315 および ALC-0159 は，試験したいずれの動物種でも，それぞれエステル結合およびアミド結合の加水分解によりゆっくりと代謝されることが示された。

以上の非臨床薬物動態評価より，循環血中に到達した LNP は肝臓に分布することが示された。 また，ALC-0315 および ALC-0159 の消失には，それぞれ代謝および糞中排泄が関与することが 示唆された。

2. 分析法

報告書番号:PF-07302048_06 xxxx_072424

GLP 非適用のラット静脈内投与 PK 試験(M2.6.4.3 項)で LNP の構成脂質である ALC-0315 よび ALC-0159 濃度を定量するために適切な性能を有する LC/MS 法を開発した。すなわち，20 μL の 血漿，肝ホモジネート(肝臓の 3 箇所から採取した切片を用いてホモジネートを調製し，それら をプールしたものを適宜，ブランクマトリクスで希釈)，尿および糞ホモジネート(適宜，ブラン クマトリクスで希釈)試料をそれぞれ内部標準物質(PEG-2000)を含有するアセトニトリルで除 タンパクした後，遠心分離し，その上清を LC-MS/MS 測定に供した。

3. 吸収

報告書番号:PF-07302048_06xxxx _072424，概要表:2.6.5.3

ALC-0315 および ALC-0159 の体内動態を検討するため，ルシフェラーゼ RNA 封入 LNP を雄性 Wistar Han ラットに 1 mg RNA/kg の用量で単回静脈内投与し，経時的(投与前，投与後 0.1，0.25， 0.5，1，3，6 および 24 時間ならびに投与後 2，4，8 および 14 日)に血漿および肝臓をスパース サンプリングにより採取(3 匹/時点)した。血漿中および肝臓中の ALC-0315 および ALC-0159 濃度を測定し，PK パラメータを算出した(Table 1)

血中の ALC-0315 および ALC-0159 は，投与後 24 時間までにすみやかに肝臓へ分布した。また，投与後 24 時間の血漿中濃度は最高血漿中 濃度の 1%未満であった(Figure 1)

見かけの終末相消失半減期(t1⁄2)は血漿中および肝臓中で同程度で，ALC-0315 は 6~8 日，ALC-0159 は 2~3 日であった。本試験の結果から，肝臓が血中 からの ALC-0315 および ALC-0159 を取り込む主要組織の 1 つであることが示唆された。
本試験において実施した ALC-0315 および ALC-0159 の尿中および糞中濃度の検討結果について は M2.6.4.6 項で述べる。

4. 分布

報告書番号:R- xx-0072，185350，概要表:2.6.5.5A，2.6.5.5B

雌性 BALB/c マウス(3 匹)にルシフェラーゼ RNA 封入 LNP を投与し，ルシフェラーゼ発光を 代替マーカーとして BNT162b2 の生体内分布を検討した。すなわち，ルシフェラーゼ RNA 封入 LNP をマウスの左右の後肢に各 1 μg RNA(計 2 μg RNA)の用量で筋肉内投与した。その後，ルシフェラーゼ発光検出の 5 分前に発光基質であるルシフェリンを腹腔内投与し，イソフルラン麻酔下，in vivo における発光を Xenogen IVIS Spectrum を用いて投与後 6 および 24 時間ならびに 2， 3，6 および 9 日に測定することにより，ルシフェラーゼタンパクの同一個体での経時的な発現推移を評価した。その結果，ルシフェラーゼの投与部位での発現は投与後 6 時間から認められ，投与後 9 日には消失した。肝臓での発現も投与後 6 時間からみられ，投与後 48 時間までに消失した。肝臓への分布は局所投与したルシフェラーゼ RNA 封入 LNP の一部が循環血中に到達し，肝臓で取り込まれたことを示すものと考えられた。M2.6.4.3 項で詳述したように，ラットにルシフェ ラーゼ RNA 封入 LNP を静脈内投与した場合には，肝臓が ALC-0315 および ALC-0159 の主要な 分布臓器であることが示唆されており，このことはマウスに筋肉内投与した本試験結果の所見と 符合するものであった。なお，ラット反復投与毒性試験で肝障害を示す毒性所見は認められていない(M2.6.6.3 項)。

雌雄 Wistar Han ラットに，[3H]-コレステリルヘキサデシルエーテル([3H]- CHE)で標識した LNP を用いたルシフェラーゼ RNA 封入 LNP を 50 μg RNA の用量で筋肉内投与し，投与後 15 分なら びに 1，2，4，8，24 および 48 時間の各時点において雌雄各 3 匹から血液，血漿および組織を採 取し，液体シンチレーション計数法により放射能濃度を測定することで LNP の生体内分布を評価した。雌雄ともに，放射能濃度はいずれの測定時点においても投与部位が最も高値であった。 血漿中の放射能濃度は投与後 1~4 時間で最も高値を示した。また，主に肝臓，脾臓，副腎およ び卵巣への分布がみられ，これらの組織において放射能濃度が最も高くなったのは投与後 8~48 時間であった。投与部位以外での投与量に対する総放射能回収率は肝臓で最も高く(最大 18%)， 脾臓(1.0%以下)，副腎(0.11%以下)および卵巣(0.095%以下)では肝臓と比較して著しく低かった。また，放射能の平均濃度および組織分布パターンは雌雄でおおむね類似していた。

BNT162b2 がコードする抗原の生体内発現分布は LNP 分布に依存すると考えられる。本試験で用 いたルシフェラーゼ RNA 封入 LNP の脂質の構成は，BNT162b2 の申請製剤と同一であることか ら，本試験結果は BNT162b2 封入 LNP の分布を示すと考えられる。

5. 代謝

報告書番号:01049-xx008，01049-xx009，01049-xx010，01049x- 020，01049-x021，01049-x022，
PF-07302048_05xxxxx _043725，概要表:2.6.5.10A，2.6.5.10B，2.6.5.10C，2.6.5.10D

CD-1/ICR マウス，Wistar Han または Sprague Dawley ラット，カニクイザルならびにヒトの肝ミ クロソーム，肝 S9 画分および肝細胞を用いて，ALC-0315 および ALC-0159 の in vitro 代謝安定性を評価した。ALC-0315 または ALC-0159 を各動物種の肝ミクロソームまたは肝 S9 画分(120 分間インキュベーション)もしくは肝細胞(240 分間インキュベーション)に添加して，インキュ ベーション後の未変化体の割合を測定した。その結果，ALC-0315 および ALC-0159 はいずれの 動物種・試験系でも代謝的に安定であり，未変化体の最終的な割合は 82%超であった。

さらに ALC-0315 および ALC-0159 の代謝経路について in vitro および in vivo で評価した。これらの試験では，CD-1 マウス，Wistar Han ラット，カニクイザルおよびヒトの血液，肝 S9 画分お よび肝細胞を用いて in vitro での代謝を評価した。また，ラット PK 試験で採取した血漿，尿，糞 および肝臓試料を用い，in vivo での代謝を評価した(M2.6.4.3 項)。試験結果から，ALC-0315 と ALC-0159 の代謝はいずれも緩徐であり，それぞれエステル結合およびアミド結合の加水分解 により代謝されることが明らかになった。Figure 3 および Figure 4 に示した加水分解による代謝 は，評価したすべての動物種でみられた。

H:ヒト，Mk: サル，Mo:マウス，R:ラット

ALC-0315 はエステル加水分解を 2 回連続で受けることにより代謝される。この 2 回の加水分解 により，最初，モノエステル代謝物(m/z 528)，次に二重脱エステル化代謝物(m/z 290)が生成 される。この二重脱エステル化代謝物はさらに代謝され，グルクロン酸抱合体(m/z 466)となる が，このグルクロン酸抱合体はラット PK 試験で尿中にのみ検出された。また，2 回の加水分解 の酸性生成物がいずれも 6-ヘキシルデカン酸(m/z 255)であることも確認された。

ALC-0159 は，アミド結合の加水分解により N,N-ジテトラデシルアミン(m/z 410)が生成される 経路が主要な代謝経路であった。この代謝物は，マウス・ラットの血液ならびにマウス・ラット・ サル・ヒトの肝細胞および肝 S9 画分中に検出された。In vivo 試料からは ALC-0159 の代謝物は 確認されなかった。

6. 排泄

ルシフェラーゼ RNA 封入 LNP を 1 mg RNA/kg の用量でラットに静脈内投与した PK 試験 (M2.6.4.3 項)で経時的に採取した尿および糞中の ALC-0315 および ALC-0159 濃度を測定した。 ALC-0315 および ALC-0159 の未変化体はいずれも尿中に検出されなかった。一方，糞中には ALC-0315 および ALC-0159 の未変化体が検出され，投与量当たりの割合はそれぞれ約 1%および 約 50%であった。また，Figure 3 に示したように，ALC-0315 の代謝物が尿中で検出された。

7. 薬物動態学的薬物相互作用

本ワクチンの薬物動態学的薬物相互作用試験は実施していない。

8. その他の薬物動態試験

本ワクチンのその他の薬物動態試験は実施していない。

9. 考察および結論

ラット PK 試験において，血漿および肝臓中 ALC-0315 濃度は，投与後 2 週間までに最高濃度の それぞれ約 7000 分の 1 および約 4 分の 1 に減少し，ALC-0159 濃度はそれぞれ約 8000 分の 1 お よび約 250 分の 1 に減少した。t1⁄2は血漿中および肝臓中で同程度で，ALC-0315 は 6~8 日， ALC-0159 は 2~3 日であった。血漿中 t1⁄2値は，それぞれの脂質が LNP として組織中に分布し， その後，消失過程で血漿中に再分布したことを表すと考えられる。

ALC-0315 の未変化体は尿中と糞中のいずれにもほとんど検出されなかったが，ラット PK 試験 で採取した糞および血漿試料からモノエステル代謝物，二重脱エステル化代謝物および 6-ヘキシ ルデカン酸が，尿からは二重脱エステル化代謝物のグルクロン酸抱合体が検出された。この代謝過程が ALC-0315 の主要消失機序と考えられるが，この仮説を検証する定量データは得られてい ない。一方，ALC-0159 は投与量の約 50%が未変化体として糞中に排泄された。In vitro 代謝実験 において，アミド結合の加水分解により緩徐に代謝された。

BNT162b2 がコードする抗原の生体内発現分布は LNP 分布に依存すると考えられることから， BALB/c マウスにルシフェラーゼ RNA 封入 LNP を筋肉内投与し，代替レポータータンパク質の 生体内分布を検討した。その結果，ルシフェラーゼの発現が投与部位においてみられ，それより 発現量は低値であったものの肝臓でも認められた。ルシフェラーゼの投与部位での発現は投与後 6 時間から認められ，投与後 9 日には消失した。肝臓での発現は投与後 6 時間から認められ，投与後 48 時間までに消失した。肝臓への分布は局所投与したルシフェラーゼ RNA 封入 LNP が循環血中に到達し，肝臓で取り込まれたことを示すものと考えられた。また，ラットにルシフェラー ゼ RNA 封入 LNP の放射能標識体を筋肉内投与したところ，放射能濃度は投与部位で最も高値を 示した。投与部位以外では，肝臓で最も高く，次いで脾臓，副腎および卵巣でも検出されたが， これらの組織における投与量に対する総放射能回収率は肝臓より著しく低かった。この結果は， マウス生体内分布試験において肝臓でルシフェラーゼ発現がみられたことと符合した。なお， ラット反復投与毒性試験で肝障害を示す毒性所見は認められなかった(M2.6.6.3 項)。

以上の非臨床薬物動態評価より，循環血中に到達した LNP は肝臓に分布することが示された。 また，ALC-0315 および ALC-0159 の消失には，それぞれ代謝および糞中排泄が関与することが 示唆された。

10. 図表

図表は本文中および概要表に示した。

参考文献

1. World Health Organization. Annex 1. Guidelines on the nonclinical evaluation of vaccines. In: WHO Technical Report Series No. 927, Geneva, Switzerland. World Health Organization; 2005:31-63.

2. 感染症予防ワクチンの非臨床試験ガイドラインについて(薬食審査発0527 第1 号，平成 22 年 5 月 27 日)

後ろ略。有料部分には上記のpdfを保存してあるだけです