クロマトグラフィーソリューション - 糖鎖の分析
生物由来の治療薬の開発はかつてないほど重要になっていますが、その中でも特に注目されているのが、モノクローナル抗体（mAb）をベースにした薬剤の開発です。このクラスの化合物は、分子に内在する複雑さと、製造プロセス中および製造後に生成されうる多くの変異のため、分離科学者に多くの課題を与えます。mAbのような糖タンパクの翻訳後修飾で最も重要なものの一つは、結合した糖鎖の追加です。これにより、mAbの構造が変化し、治療の有効性や毒性に影響を及ぼす可能性があります。ここでは、糖鎖分析の重要性と、製造後のタンパク上に形成された糖鎖の種類と性質を正しく判断するために適用できるアプローチについて説明します。
当該ホワイトペーパーの原本は、こちらをクリックしてご覧いただけます。
背景
バイオ医薬品市場の成長に伴い、製造プロセスの理解や最終製品の品質を保証するプロセスも大きく発展してきました。規制面では、バイオ医薬品の純度を決定するために特別に設計されたFDA規制の発展が挙げられます。これにより、最終製品のルーチン分析に適用される共通のワークフローが開発されました。このワークフローには様々な分離技術が含まれており、それぞれの技術は元のタンパクに対する共有結合または酵素修飾の種類を特定して分析することを目的としています。
このワークフローで実施される最も重要な分析の1つが、モノクローナル抗体（mAb）の形状、有効性、毒性に大きな影響を与える糖鎖構造の分析です。mAbは、ユニークな白血球をクローニングして作られた抗体です。mAbは一価の親和性を持ち、抗原の一部としか結合しません。これにより、病気のマーカーとなる特定の抗原の分離・検出を助けたり、シグナル経路を遮断したり、標的分子の機能をブロックして病気の原因となっている特定の細胞のアポトーシスを引き起こす治療法として利用することができます。このような特異性ともに、より高純度での製造・精製が可能であるため、これらの化合物（mAb）の開発・製造が大幅に増加してきました。現在は、製造プロセスの一環として、タンパク（mAb）を翻訳後に修飾し、タンパクの一次構造への糖鎖付加が可能です。
N-グリカン構造の例
糖鎖解析
糖鎖を構成する要素は一次糖類であり、その種類は多岐にわたる。主な違いは、環状構造に含まれる炭素数が5（ペントース）または6（ヘキソース）です。その後、水酸基の相対的な位置によって、異なる形の単糖に区分されます。結果として得られる糖鎖構造の複雑さは、完全な化学構造を描き出すことが非現実的であることを意味しており、その代わりに、標準化された絵によって、リリースロット仕様への準拠、有効性の保障、毒性の低減を表現してます。
N-グリカンは、mAbの潜在的な有効性と毒性に大きな影響を与える。製造中の翻訳後修飾（PTM）プロセスによってN-グリカンが生成される可能性があるため、N-グリカンのレベルと組成を注意深くモニターすることが必要です。バイオ医薬品の製造に関する世界的な規制の一つであるICH（Q6B）では、バイオ医薬品の特性評価および確認の一環として、糖鎖の含有量および構造を決定すべきであるとしています。mAbの糖鎖構造は、重要な品質属性（CQA）であり、日常的にモニターされるべきものです。
糖鎖分析によく使われる2-AB蛍光タグでグルコースの誘導体化。
バイオ医薬品業界では、多糖類は紫外や可視領域ではあまり吸収されず、質量分析計でもあまりイオン化しないことから、得られたN-グリカンに蛍光マーカー（一般的には2-AA-2アミノ安息香酸または2-AB-2アミノベンズアミド）をタグ付けするアプローチが最も好まれている。2AAと2ABは、質量分析タグとしても使用できるが、質量分析法を用いた糖鎖の測定には、より高いレベルの感度を提供する代替の誘導体化試薬が利用されている。
HILICモードにおける様々な種類の極性分析物と固定相の相互作用の模式図
一連の糖鎖を分離する方法としては、HILIC（親水性相互作用液体クロマトグラフィー）が好まれます。蛍光タグや質量分析タグを追加しても、糖鎖の全体的な極性には影響を与えず、分配係数も低いため、HILICはこれらの非常に極性の高い分子を分離するための理想的なアプローチです。
HILIC分離モードの理解
McCalleyとNeueは、典型的なHILIC条件下で、シリカ表面に水を多く含む層が存在することを実証しました。また、移動相中の水の含有量が30%まで増加すると、水を多く含む層が厚くなることも観察されました。その後、McCalleyは、親水性分配相互作用、吸着、イオン性相互作用、さらには疎水性相互作用の組み合わせからなる、非常に複雑なメカニズムの存在を明らかにしました。BuszewskiとNogaは、さまざまなHILIC保持モデルの広範なレビューを行っており、分析対象物の特性、移動相の組成、固定相の性質に依存するメカニズムを網羅しています。HILICの保持メカニズムを理解することで、一連の糖鎖を溶出させるためのクロマトグラフィー条件をより適切に設計することができます。この理解は、分解されたデキストランに由来する一連の糖鎖の分離を開発するために応用されました。
3種類の異なるバッチの充填剤を詰めた3本のAvantor® ACE® Glycanカラムでのデキストランラダースタンダードの分離
糖鎖アプリケーション
HILICは、放出されたN-グリカンの理想的な分離モードであり、理想的なカラムは中性だが極性のある固定相である。存在しうるグリカン構造の数は膨大であり、特定のカラムで特定のグリカン構造を分離できることを実証するのは不可能であるため、代わりにカラムの適用性を実証するために、増加しているグリカンユニット（GU）を含む一連のグリカンを分離します。結果として得られる一連の共役グリカンユニット（GU）のクロマトグラムは、グリカンラダーと呼ばれることが多いが、この場合はデキストランの部分加水分解から得られたサンプルを主原料としているため、デキストランラダーと呼ばれます。この分離では、Avantor® ACE® Glycanカラムで比較的浅いグラジエントを使用し、強溶媒は100 mMのギ酸アンモニウム（aq）としました。2-AB標識糖鎖の親水性は、糖鎖ユニットの数が増えるにつれて増加することがわかります。いずれの場合も優れたピーク形状が得られ、カラム間のバッチ間再現性も非常に良好です。
おわりに
ここでは、糖鎖分析の重要性を概説し、重要な品質分析に対する規制上の要求を満たすためにバイオ医薬品業界で使用されている一般的なアプローチを紹介しました。酵素的に切断された糖鎖にタグを付け、その後、蛍光検出器を用いてHILICで分離するアプローチについて説明し、Avantor® ACE® Glycanカラムを使用した例を紹介しました。このカラムは安定性が非常に高く、またバッチ間の再現性にも優れており、糖鎖ラダーの高い分解能からもわかるように、日常的な糖鎖の分離には理想的です。
