アップストリーム工程の最適化
バイオ医薬品の研究者やメーカー、そして生産システムや材料を供給する企業は、世界的なバイオ医薬品市場の拡大に伴い、アップストリーム、ダウンストリーム、充填・仕上げの主要な生産工程の改善に注目しています。
近年、生物学的生産量の歩留まりを向上させる大きな進歩があり、これらのプロセスの強度と一貫性が向上しているにもかかわらず、治療用タンパク質のより効率的な生産を実現するために、この分野さらにイノベーションの可能性があります。タンパク質の発現を改善するための新たなアプローチの発見、歩留まりの向上につながる、より柔軟でコスト効率の高い堅牢な製造プロセスの開発、タンパク質を活性状態にリフォールディングするという複雑な課題の解決などが、この業界が直面している課題です。
細胞培養プロセスは、栄養素や微量元素の不純物の影響を受けるため、様々な培地成分を必要とする細胞培養ステップは、プロセス全体に影響を与え、最終製品の収率低下、製品に関連する不純物の増加、プロセス時間の延長などの問題を引き起こす可能性があります。培地やサプリメントの特性をよりよく理解することで、プロセス科学者は、細胞培養原料の品質と一貫性をよりよく管理し、アップストリーム工程での変動を最小限に抑えるための対策を講じることが可能です。
接種からバイオリアクター製造まで
バイオ医薬品をバイアルから本格的なバイオリアクターで製造するためのアップストリーム工程は確立されています。このワークフローは、小規模な細胞培養から始まり、細胞のゲノムを改変した後、一連のステップで培養を拡大し、目的のバイオ製剤を必要量生産します。培養条件は企業ごとに異なり、また分子固有のプロセスにも依存するが、バイアルから初期段階のバイオリアクターへのターゲト細胞の増殖を含む細胞増殖の基本的なステップは、最初の増殖（エクスパンション）段階で細胞を近づけておくために行われる。
細胞が健全に成長し、プロセス設計に沿ったタンパク質の発現を保証するためには、増殖段階を通じて、すべての細胞培養条件を可能な限りコントロールすることが重要です。これには、温度や主要なガス（酸素や二酸化炭素など）の存在を含む、各バイオリアクター内の条件を管理することが含まれます。また、グルコースなどの炭水化物、アミノ酸、補助ビタミンなど、すべての細胞培養液の組成、純度、安定性も考慮しなければなりません。
このプロセスにおいて、条件や材料を適切に理解し、管理しなければ、培養細胞が死に始めたり、次のステップへ十分なエクスパンションができなかったりします。この場合、プロセスを停止し、材料を廃棄して、最初の細胞接種からプロセスをやり直す必要があります。
発現システム
いくつかの発現系が存在しますが、細菌または微生物系、酵母および哺乳類細胞培養の3つが最も一般的です。
1980年代にバイオ医薬品の製造が本格化したとき、発現系として最も広く使われていたのは大腸菌でした。その後、酵母であるSaccharomyces cerevisiaeもバイオ医薬品メーカーに採用されました。昆虫細胞は、ワクチン指向のタンパク質を生産する方法として探求され、使用されましたが、哺乳類細胞株は、これらのプロセスに必要なグリコシル化されたタンパク質を生産する能力があるため、最も広く使用される細胞系となりました。
主要な発現システムの主な特徴を比較すると（図1）、細胞発現システムの効率を管理し、最適化を向上させるために重要な要素が浮き彫りになります。システムを比較する際に最も重要な制御因子は、増殖速度と細胞培地の複雑さの2つです。
微生物のシステムは、比較的速い増殖速度、複雑でない増殖培地、低コストの材料などが特徴である。一方、哺乳類のシステムははるかに複雑です。これらの細胞は、いくつかの複雑な細胞プロセス（N-結合型およびO-結合型のグリコシル化、アシル化、γ-炭水化物など）を経て、数日かけて展開されるため、制御が困難な場合があります。発現システムに問題があり、プロセスが目標通りに進まない場合、哺乳類細胞培養法と比較して、発現プロセスの途中で微生物システムを停止し、すべての材料を洗浄して再起動する際の時間ロスを減少します。
哺乳類細胞における糖鎖形成は、クローンの変動や細胞培養条件から、培地成分や細胞発現ステップで使用する物質（糖質や炭酸水素ナトリウムなどのpH調整物質）まで、複数の要因に依存するため、制御が難しいとされています。細胞培養液は細胞株に依存するため、グリコシル化の最適化はより困難です。細胞株が違えば、代謝や栄養素の消費量も異なる。細胞培養液に含まれる微量元素は、糖質や栄養補助剤（サプリメント）のような物質を介して導入され、細胞の発現収率に影響を与える異なる反応を引き起こすことが実証されています。
また、製造されるタンパク質が、微量金属や特定の金属の比率に反応する性質のある空間を持っている場合、タンパク質のフォールディングやアンフォールディングの際に、酸化などの反応が起こる可能性があります。酵素療法代替のバイオ製剤を製造している場合、酵素の摂取量の一部に微量金属が含まれている可能性があり、製造の歩留まりに影響を与える可能性があります。
細胞培養液中の微量元素の管理
細胞培養液に含まれる微量元素が、アップストリーム工程の展開やバイオリアクターのステップに与える影響は、多くのバイオ製剤メーカーにとって重要な関心事となっています。現在の業界の慣行では、出発点として標準的な基礎細胞培養培地を使用しています。多くの場合、企業が商業的に開発し、特定の細胞株に最適化された培地を提供しています。しかし、特殊な状況下では、バイオ製剤メーカーは、最適な性能を確保するために、特定のプロセス要件に合わせて独自の細胞培養用培地を開発することがあります。いずれの場合も、培地の製造工程で使用される成分の特性が十分でない場合、発現段階でのタンパク質のフォールディングおよびアンフォールディングを阻害する可能性のある微量金属（マグネシウムなど）が基礎培養液に含まれることになり、発現収量の不足や得られるタンパク質の汚染につながる可能性があります。
10億分の1という低濃度の微量金属がタンパク質のグリコフォームに影響を与えることが実証されています。ある研究では、サプリメントとして使用される硫酸第一鉄の様々なロットに含まれるマンガンの不純物が、モノクローナル抗体の異なるグリコシル化プロファイルを生成することが示されました。別の研究では、タンパク質のグリコシル化に対する鉄とマンガンの影響を調べたところ、鉄は100万分の1の濃度でタンパク質のグリコシル化を変化させ、マンガンは10億分の1（ppb）という低濃度でタンパク質のグリコフォームを変化させることがわかりました。
さまざまな発現ステップで基礎培養液に他の元素を加えると、微量金属の影響はさらに複雑になります。例えば、あるプロセスでは、タンパク質の発現を助けるために、特定のステップで1ナノモルのマンガンを添加することになっています。場合によっては、プロセスエンジニアがマンガンを10ナノモルまで増やそうとしますが、その結果、細胞の品質や収率に悪影響が出てしまいます。その場合は、1ナノモルの添加剤に戻します。もし、細胞培養成分の特性を十分に把握せずに基礎培地を作った場合、すでにかなりのレベルのマンガンが含まれているので、1ナノモルのサプリメントを追加しても、同じような悪影響が出る可能性があります。
このような複雑な問題を考えると、糖質やアミノ酸などの細胞培養液成分の特性を改善することで、異なるサイズのシステムをどのように移行させるかによって、発現系の性能を向上させることができる可能性は大きいでしょう。
そのためには、cGMPプロセスで製造された細胞培養用の培地やサプリメントに、微量金属の特性を十分に反映させて使用することが重要なステップとなります。ロット間で微量金属の濃度を一定にすることは、アップストリーム工程でのばらつきの原因を減らし、排除するための一つの方法です。しかし，細胞培養液から微量金属を完全に除去することが目的ではなく，むしろ，特定の発現系に対して設定されたppbレベルで金属を厳密に管理することが，結果の改善につながる。銅やマンガンなどの微量金属は，グリコシル化やその他のタンパク質発現プロセスを助けることが研究で明らかになっています。
また、研究者やメーカーにとっては、実験計画法（DOE）を用いて材料の特性を十分に把握した上で、プロセスや細胞株に応じた正確で信頼性の高い微量金属のレベルを確立することが不可欠です。これらの研究の結果は、各細胞株や細胞増殖プロセスに対する適切な微量金属レベルを正確に確立することができます。バイオ製剤メーカーは、バイオ製剤の製造プロセスで使用される材料がこれらの確立されたレベルに適合していることを確認する必要があり、その結果、生産者はアップストリームの収率を設定通りに維持することが可能です。
また、このレベルのコントロールを確立するには、発現および生産システムのプロセスによって生成されるデータをよりよく理解することが重要です。大手バイオ医薬品メーカーでは、この制御を実現するために、業務の中でデータマイニングやAIベースの分析技術の使用を拡大しています。この動きは、「インダストリー4.0」の製造業の取り組みと同じ技術の多くを適用しています。その目的は、生産プロセスから生成される豊富なデータを利用して、プロセスのパフォーマンスを支配する要因について深い洞察を得て、バイオ製剤の "未来の工場 "のビジョンを実現することにあります。
バイオファーマ4.0」と呼ばれるバイオロジカルな「未来の工場」では、IoTに接続された「スマート」デバイスが施設内に設置されることが多くなります。これらのデバイスは、接続されたソフトウェアプラットフォームとともに、工場のオペレーターがプロセスから生成されたリアルタイムデータを使用して、生産システムのパフォーマンスを維持・向上させることを可能にします。また、バイオファーマ4.0では、人工知能（AI）を搭載したプラットフォームを想定しており、自律的に最適な動作条件を予測・維持することができます。このようにデータの洞察力が向上し、プロセスをコントロールできるようになれば、一貫性が高まり、バッチ不良のリスクを低減することができます。
この目標を達成するためには、プロセスステップとそのプロセスで使用されるすべての原材料から統計的に関連するデータを収集する必要があります。そのためには、データの収集とアクセスを改善するために、サプライヤーとメーカーの強力なコラボレーションが必要です。サプライヤーは、予測モデルのためのデータを積極的に提供し、eデータの自動転送メカニズムを設定し、プロセスをさらに合理化するための分析機能を強化する役割を担っています。
cGMP条件下で製造された完全に特性化された材料とデータに基づく知見を組み合わせることで、新たなレベルのプロセス制御が可能となり、アップストリームの収率を大幅に向上させることができます。細胞培養液の場合、最先端の解析技術を導入することで、培養液の成分に存在するばらつきを、発現システムやバイオリアクターシステムの側面と合わせて、発現システムの結果のばらつきとより意味のある形で相関させる方法をメーカーが理解することができます。多変量解析などの様々なモデルを用いて、プロセスの出力傾向、複数の要因の影響を理解し、数週間にわたって行われる非常に複雑な細胞培養プロセスを予測することができます。
関連リンク
• 製品紹介ページ - もっと詳しく
• 研究成果を向上させるためのAvantorのソリューションについては、当社ウェブサイトをご覧ください。
