ウェスタンブロッティング無染色法 (Stain-free method for Western blotting)

はじめに

ウェスタンブロッティングは、発現を相対的に検出する一般的に使用される分子生物学的ツールのひとつです。ウェスタンブロットで標的タンパク質レベルの変化を確実に評価するには、線形ダイナミックレンジにおける標的タンパク質とローディングコントロールタンパク質の両方の測定が必要であり、無染色技術により、ゲルやブロット中のタンパク質の可視化と定量化が可能になりました。

方法

タンパク質（炭酸脱水酵素）を2倍希釈（338～2,64 ng）し、18ウェルCriterionTM TGX stain-freeTM ゲルにロードし、。Criterion TGX stain-free, pre-cast gelで、200V、40〜50分、タンパク質を分離する。その後、VWR® Imager Chemi 5QE システムを用いてタンパク質を確認するため、1分間UV光を照射し、ゲルを活性化する。タンパク質をPVDF膜に移し、200Vで1時間加熱した後、VWR® Imager Chemi Premium system (Cat.No. 730-1469) を用いて無染色ブロット画像を撮影し、各サンプルレーンの総タンパク質を測定する。ブロットを5％BSA緩衝液で1時間室温でブロッキングし、4℃で一晩一次抗体でプローブする（1：500 β-actin; Santa-Cruz Biotechnology Inc.）。HRP結合ヤギ-抗マウス（Santa-Cruz Biotechnology Inc.）を1:4000で1時間室温でブロットに塗布する。

すべての抗体は5％BSAで希釈する。化学発光シグナルはSuper Signal West Dura substrate (ThermoFisher, UK) を用いて現像し、VWR® Imager Chemi Premium システムで捕捉する。画像データは、VWR® Gel Doc Software (VWR® International)を用いて解析する。

リニアレンジと検出限界の決定(LOD)

Carbonic anhydrase (CA) を 338 から 2,64 ng まで 2 倍希釈し、Criterion TGX stain-free gel にロードする。CAはトリプトファンの含有率が高いことから選ばれた。VWR® Gel Doc Software (VWR® International) により、ゲルにロードされた CA の量を生の量（シグナル強度）に対してプロットする（図 1）。無染色法の直線性と感度は、メンブレンに転写された総タンパク質を正確に定量します (R2- 0,9883 linear over 338 to 5,28 ng)。化学発光基質スーパーシグナルウエストデュラによる検出も良好な直線性を示します（169から5,28 ngの範囲でR2- 0,9926 ）。

結論

中波長紫外線トランスイルミネーターと紫外線フィルター、またはエピ中波長紫外線と紫外線フィルター、これらの推奨する照明とフィルターの組み合わせを使用することにより、ユーザーはVWR® Imager Chemiイメージングシステムを使ってCriterionTM TGX無染色ゲルを正常に画像化することができます。無染色法は、化学発光法に匹敵する感度を有しており、無染色ゲルを使用することで、ウェスタンブロットのプロセスを大幅に改善することができます。メンブレンにタンパク質が転写されたことを容易に確認でき、化学発光で検出する前に総タンパク質を算出することができます。

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