【研究】RNA-seq：ワークフローについて聞いてみたv20240309.0
こんにちは、あるいは、こんばんは。
今回は（いつもですが）データ処理ではなく、ワークフローについてChatGPT3.5さんから得た情報をメモしておきます。
回答の信憑性については裏取りをしていないため、関連する公式ページや書籍、原著論文などで再確認する必要があります。
雰囲気を掴むには良いように思いました。
ChatGPT 3.5さんからの自己紹介
ChatGPT3.5さん について簡単に教えて下さい。
わたし（ChatGPT3.5）は
・OpenAIが開発した自然言語処理モデルの一つ
・GPT-3.5アーキテクチャに基づく
・多様な文脈やトピックに対して自然な対話を生成する
・幅広いタスクに活用される
ChatGPT3.5の主な特徴
● 自然な対話生成
人間との対話に近い自然な応答を生成する。チャットボットや対話システムの開発、コンシューマーエレクトロニクス、カスタマーサポートなどの領域で広く活用される。
● 幅広い知識の利用
大規模なトレーニングデータセットから学習されている。多岐にわたるトピックや文脈に対応できる。一般的な知識問題から専門的な話題まで幅広い領域で利用される。
● 柔軟性とカスタマイズ性
柔軟性が高く、様々な用途に適応することが可能である。特定のタスクに合わせて fine-tuning を行うことで、特定のドメインやニーズに合わせたモデルを構築することができる。
● 利用の簡便さ
APIを介して簡単に利用することができる。開発者は自分のアプリケーションやプロジェクトに ChatGPT3.5 を統合することができる。
総じて、わたし（ChatGPT3.5）は、その高い柔軟性と能力を活かして、幅広い文脈での自然な対話生成や情報提供に役立っています。
スゴイデスネ
無償版と有償版の違いや特徴はありますか。
無償版と有償版の違いや特徴
● 機能の制限
無償版は有償版よりも機能が制限される。
例）API呼び出しの回数制限、利用可能な機能やモデルの種類の制限など
● サポートの有無
無償版は有償版よりもサポートが限定される。
有償版では、専門のサポートチームによるテクニカルサポートやアカウントマネージャーへのアクセスが提供される。
● 利用可能なモデルの範囲
無償版は有償版よりも利用可能なモデルが制限される。
有償版では、より多くのモデルが利用可能であり、さまざまなニーズに対応するためのオプションが提供される。
● 利用規約の違い
有償版と無償版の利用規約には違いがある。
有償版では、より厳格な利用規約が適用される。
● カスタマイズオプションの提供
有償版では、カスタマイズオプションや柔軟なプランが提供される。
特定のニーズや要件に合わせてサービスをカスタマイズできる。
一般的に、有償版はより高度な機能やサポートが提供されます。
無償版は基本的な機能を利用する場合に適しています。
企業やプロフェッショナルがビジネス目的で利用する場合は、有償版を選択することが一般的ですが、個人や小規模なプロジェクトには無償版が適している場合があります。
（今のところ、わたしにとっては無償版で良さそうですね。。。）
理解しました。無償版は多くの場合、基本的なニーズを満たすのに十分な機能を提供しています。必要に応じて、有償版へのアップグレードを検討することもできます。それまでに無償版を使用して、機能や利用方法に慣れることができます。
RNA-seqデータ解析ワークフロー
さて、ここからが本題です。
RNA-seqのデータ解析のワークフローについて教えて下さい。
RNA-seqデータ解析ワークフローは多岐にわたります。
一般的なステップを以下に示します。
生のRNA-seqデータから、遺伝子発現解析に適した形式にデータを前処理する一般的な流れです。
１）品質制御と評価
FastQCなどのツールを使用してデータの品質を評価する。
リードの品質、配列の長さ分布、アダプター配列の存在などが含まれる。
２）アダプター除去と品質フィルタリング
Cutadapt、Trimmomatic、Fastpなどのツールを使用して、リードからアダプターを除去し、品質の低いリードをトリミングする。
３）リードマッピング
Bowtie2、HISAT2、STARなどのツールを使用して、トリムされたリードをリファレンスゲノムまたはトランスクリプトームにマッピングする。
４）リードカウント（発現量行列の作成）
featureCountsやHTSeqなどのツールを使用して、各遺伝子へのリードの数をカウントする。
カウントされたリード数から、発現量行列が作成される。
サンプルごとの遺伝子発現量が含まれる。
５）発現量行列の正規化
発現量行列を正規化して、サンプル間の比較が可能な形式に変換する。
一般的な正規化手法には、
TPM（Transcripts Per Million）やFPKM（Fragments Per Kilobase Million）などがある。
６）発現差分解析
正規化された発現量行列を使用して、異なる条件間での遺伝子の発現差分を解析する。
統計的テスト（t検定、Wilcoxonの符号順位検定など）を実行して、有意な発現変動を見つける。
７）機能的解析
発現変動した遺伝子の機能や経路の解析を行う。
GO解析（Gene Ontology）、KEGG経路解析、バイオマーカーの同定などが含まれる。
８）結果の可視化
解析結果を可視化して、研究者が理解しやすい形式にする。
ヒートマップ、バイオマーカーのプロット、PCA（Principal Component Analysis）などが含まれる。
これらのステップは、RNA-seqデータの処理と解析の基本的なフローを示していますが、具体的な実装はデータセットや研究目的によって異なります。
全体のワークフローとデータ処理に必要なプロセスが大まかに分かりましたね。ChatGPT3.5さんを頼ると、一を聞いて十くらい教えてくれます。
１）品質制御と評価
品質制御と評価について教えて下さい。
品質制御と評価に使用される代表的なツール
● FastQC
単一のFASTQファイルに対して高速で詳細な品質レポートを生成する。
リードの品質、アダプターの除去、オーバーラップのチェックなど、さまざまな品質メトリクスを提供する。
インタラクティブなレポートを生成し、異常なパターンやトレンドを可視化する。
FastQCは単一のサンプルに対して品質評価を行うが、他のツールとは異なり、データの変更やトリミングはしない。
● MultiQC
複数の品質制御レポートを統合して1つのレポートにまとめる。
レポートの作成が容易で、さまざまなツールの出力を統一的な形式で表示する。
レポートを比較し、異常なパターンやトレンドを識別しやすくする。
カスタマイズ可能で柔軟性がある。
FastQCは単一のサンプルに対して品質評価を行うが、MultiQCは複数のサンプルの結果を結合してレポート化する。
２）アダプター除去と品質フィルタリング
アダプター除去と品質フィルタリングについて教えて下さい。
アダプター除去や品質フィルタリングといったデータ前処理の段階で幅広く使用される代表的なツール
● Cutadapt
アダプターシーケンスの除去や不要なリードのトリミングを行う。
フレキシブルなパラメータ設定が可能で、さまざまなシーケンスデータに適用できる。
複数のアダプターシーケンスの同時除去や、インデックス付き配列の利用など、高度な機能を提供する。
Cutadaptはアダプター除去に特化しており、品質フィルタリングは限定的である。
● Trimmomatic
リードトリミングを行うツールであり、品質低下やアダプターコンテンツの削除などを実行する。
ユーザーが指定したパラメータに基づいてトリミングを行う。
複数のファイル形式に対応し、柔軟性がある。
Trimmomaticはアダプター除去のほかにも品質フィルタリングやリードトリミングを行うことができる。
● Fastp
高速で並列処理を行いながら、アダプター除去、品質フィルタリング、リードトリミング、QCレポートの生成などを行う。
ユーザーフレンドリーなインターフェースと豊富なオプションを提供し、容易にカスタマイズできる。
メモリ効率が高く、大規模なデータセットにも適している。
Fastpは高速で並列処理を行うことができ、リード処理全体の効率性に焦点を当てている。
３）リードマッピング
リードマッピングについて教えて下さい。
リードマッピングに使用される代表的なツール
遺伝子発現解析やスプライスバリアント検出などの特定の目的に応じて、適切なツールを選択することが重要である。
● Bowtie2
高速かつ効率的なリードマッピングを実行する。
短いリードや長いリードの両方に対応しており、大規模なゲノムにも適している。
アラインメントアルゴリズムにはBurrows-Wheeler Transform（BWT）を使用している。
Bowtie2は基本的なリードマッピングのみを行い、splice junctionを考慮しない。
● HISAT2
リードのスプライスサイトを考慮したRNA-seqデータのリードマッピングを行う。
Hierarchical Indexing for Spliced Alignment of Transcripts（HISAT）アルゴリズムを採用しており、高い精度でのスプライス配列の検出を実現する。
メモリ効率が高く、多くのメモリを消費せずに大規模なデータセットを処理できる。
HISAT2はRNA-seqデータに特化したリードマッピングを行う。
● STAR
超高速なリードマッピングを提供する。
ジャンクションリードを考慮したRNA-seqデータのリードマッピングをサポートし、高精度なアラインメントを実現する。
スパイクインデックスを使用することで、大規模なゲノムデータにも適している。
まだSTARを実行したことがないため、いつの日か、試してみたいと思います。
素晴らしいです！STARは非常に効率的で高速なリードマッピングツールであり、RNA-seqデータの解析において広く使用されています。ぜひ機会があれば試してみてください。STARの使い方や解析方法について質問があれば、いつでもお知らせください。お手伝いできることがあれば嬉しいです！
（お、おぉう、ありがとうございます。。。また、いつの日か。）
４）リードカウント（発現量行列の作成）
リードカウントについて教えて下さい。
リードカウントに使用される代表的なツール
● featureCounts
マッピングベースの手法を使用してリードカウントを行う。
リファレンス遺伝子アノテーションファイルに基づいて、遺伝子やエクソンなどの特徴（features）に割り当てる。
マルチスレッド処理をサポートしており、高速なリードカウントが可能である。
特徴にリードを割り当てる際に、遺伝子やエクソンなどの特徴にリードを割り当てる際に、厳密なオーバーラップを要求する。
Rパッケージとして提供されている。
● HTSeq
マッピングベースの手法を使用してリードカウントを行う。
リファレンス遺伝子アノテーションファイルに基づいて、遺伝子やエクソンなどの特徴に割り当てる。
柔軟性があり、異なるマッピングフォーマットに対応している。
カウントの正確性やパフォーマンスを向上させるためのさまざまなオプションがある。
特徴にリードを割り当てる際に、オーバーラップしなくても割り当てることができる。
Pythonパッケージとして提供されている。
● Salmon
リードカウントを行うための高速なツールである。
マッピングベースではなく、トランスクリプトレベルでの発現量推定を行う。
マッピングの複雑さを回避し、高速かつ正確な発現量推定を提供する。
● Kallisto
Salmonと同様に、トランスクリプトレベルの発現量推定を行う。
高速なEMアルゴリズムを使用している。
高速、かつ、大規模なデータセットにも適している。
● RSEM
RNA-seqデータのリードカウントと発現量推定を行うためのツールである。マッピングベースの手法を使用し、EMアルゴリズムを用いて発現量を推定する。
RSEMは高い精度を持ち、遺伝子発現解析に広く使用されている。
● StringTie
トランスクリプトレベルの発現量推定に特化したツールである。
リードマッピングとアセンブリを同時に行い、トランスクリプトの構造と発現量を推定し、発現量行列を生成する。
複数のサンプルを同時に解析することも可能である。
「STAR + StringTie」は解析が速いという噂を聞いたことがあります。
基本的には、身の回りで実績がある解析法の組み合わせを行い、それと比較した形で他の手法を取り入れることが良いと思います。
５）発現量行列の正規化
正規化について教えて下さい。
発現量行列の正規化方法
● TPM (Transcripts Per Million)
トランスクリプトごとの発現量を正規化するための方法である。
各トランスクリプトのカウント数を総リード数で割り、さらにトランスクリプト長で補正する。
最終的な値は百万分率で表される。
サンプル間のトランスクリプトの相対的な発現量を比較するのに有用である。
● FPKM (Fragments Per Kilobase Million)
遺伝子またはトランスクリプトの発現量を正規化するための方法である。
各遺伝子またはトランスクリプトのカウント数を遺伝子（またはトランスクリプト）長と総リード数で補正し、さらに1キロベース長あたりの百万分率で表される。
● RPKM (Reads Per Kilobase Million)
FPKMと非常に類似しているが、カウント数の正規化において、トランスクリプト長ではなくリード数のみを使用する。
旧来のRNA-seqデータの解析で使用され、現在はFPKMやTPMに置き換えられることが一般的である。
● TMM (Trimmed Mean of M-values)
データセット内のサンプル間での発現量のバイアスを考慮するための正規化方法である。
サンプル間のスケーリングファクターを計算し、それに基づいて発現量を調整する。
バイアスのあるデータセットやサンプル数が少ない場合に特に有用である。
最も一般的な正規化方法は？
TPM（Transcripts Per Million）またはFPKM（Fragments Per Kilobase Million）です。トランスクリプトまたは遺伝子の相対的な発現量を示す指標であり、サンプル間の比較に使用されます。他の正規化方法（例：RPKM、TMMなど）と比較して、バイアスの影響を最小限に抑えることができます。
ただし、正規化方法の選択は、解析の目的や研究の文脈によって異なる場合があります。特定の研究や解析パイプラインでは、他の正規化方法が使用されることもあります。そのため、解析を行う前に、データセットや研究の要件に合った正規化方法を検討することが重要です。
６）発現差分解析
発現差分解析について教えて下さい。
発現差分解析の一般的な手法（RやPython）
RNA-seqの発現差分解析をRやPythonを使用して行うための一般的な手法です。
● Rを使用した発現差分解析
Rはバイオインフォマティクスや統計解析のための人気のあるプログラミング言語であり、多くのパッケージが発現差分解析に使用される。
◎ DESeq2パッケージ
RNA-seqデータの発現差分解析に広く使用されるパッケージである。
データの前処理、カウント行列の作成、正規化、統計的解析、多重検定の補正など、一連の解析手順を提供する。
◎ edgeRパッケージ
RNA-seqデータの発現差分解析に使用される別のパッケージである。
データの前処理、カウント行列の作成、正規化、統計的解析、多重検定の補正などの機能を提供する。
詳細な使い方や手順については、各パッケージのドキュメントやチュートリアルを参照してください。
● Pythonを使用した発現差分解析
RNA-seqデータの解析に使用される一般的なプログラミング言語である。
Pythonのいくつかのパッケージと関数を紹介する。
◎ DESeq2-Pythonパッケージ
RのDESeq2と同様の機能を提供する。
◎ edgeR-Pythonパッケージ
RのedgeRと同様の機能を提供する。
◎ その他のPythonパッケージ
scikit-learn、limma-voom、Sleuth、Bioconductorなどがある。
これらのツールやパッケージは、発現差分解析のための機能や手法を提供し、RNA-seqデータの解析をサポートします。選択するツールやパッケージは、分析の目的やデータの特性によって異なる場合があります。解析を行う際には、各ツールやパッケージのドキュメントやチュートリアルを参照し、適切な手順を選択してください。
７）機能的解析
機能的解析について教えて下さい。
発現量行列の機能的解析の一般的な手法
● GO解析（Gene Ontology解析）
遺伝子やトランスクリプトの機能的な特性を評価するための手法である。GOは、遺伝子やタンパク質の機能、プロセス、および細胞のコンポーネントに関する階層的なアノテーション体系である。
発現差分解析などで得られた遺伝子リストを入力とし、特定の機能カテゴリーに対して統計的に有意な遺伝子の過剰表現（または欠落）を評価する。
実験条件や疾患状態に関連した生物学的なプロセスや機能を特定することができる。
● KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）経路解析
KEGGは生物学的な経路や反応の情報を提供するデータベースである。
KEGG経路解析は、発現差分解析や遺伝子リストを入力とし、特定の生物学的な経路や反応に関連する遺伝子の統計的な偏りを評価する。
実験条件や疾患状態に関連した生物学的な経路の特定や、関連する遺伝子の機能的な解釈を行うことができる。
● モジュール検出
発現量行列をクラスタリングやネットワーク解析などの手法を用いて、同様の発現パターンを持つ遺伝子やトランスクリプトのグループを特定する手法である。
関連する生物学的なプロセスや機能を持つ遺伝子のサブセットを同定することができる。
● TF（転写因子）解析
発現量行列から転写因子の活動を推定する手法である。
転写因子は、遺伝子の発現を制御するために結合するタンパク質であり、発現変動の調節に重要な役割を果たす。
TF解析では、転写因子の結合モチーフの情報を利用して、遺伝子リストや発現量行列から転写因子の活動を予測する。
８）結果の可視化
可視化について教えて下さい。
結果の可視化の一般的な手法
結果の可視化は、発現量行列の機能的解析で得られた情報を視覚的に理解するための重要な手段である。
● ヒートマップ
発現量行列の各遺伝子やサンプルの発現値を色や濃淡のグラデーションで表示する手法である。
遺伝子発現パターンやサンプル間の類似性や相違を視覚的に把握するのに役立つ。
発現量の上昇や低下を色の濃淡や色の変化で表現することで、遺伝子やサンプルのクラスタリングやパターンの特定が可能となる。
● バイオマーカーのプロット
遺伝子やタンパク質の発現量をグラフ上にプロットする手法である。
バイオマーカーは、特定の条件や状態を示す生物学的な指標となる分子である。
プロットは、異なるサンプルやグループ間でのバイオマーカーの値の分布や差異を視覚化するために使用される。
一般的なプロットには、箱ひげ図、散布図、バイオマーカーの密度プロットなどがある。
● PCA（主成分分析）
多次元データの次元削減やデータの変動の主要な方向を把握するための統計的手法である。
発現量行列の遺伝子またはサンプルの次元を低次元空間に射影し、データの変動の主要な成分を特定する。
PCAによって得られた低次元空間では、データのクラスタリングや異常値の検出などの解析が容易になる。
● ネットワーク可視化
発現量行列の遺伝子やタンパク質の相互作用や相関関係をグラフとして表示する手法である。
遺伝子やタンパク質の相互作用ネットワークや調節ネットワークのパターンやハブ遺伝子を視覚的に特定することができる。
まとめ
ChatGPT3.5さんには、質問を投げかけることでおよそ一般的な回答をを返してくれます。真偽のほどは、自分で判断するか追加で調べる必要があります。大まかに全容を知るにはなかなか良いパートナーになるように思います。
（・・・相談する相手がいない、ぼっち研究者にとっては。→つまり、わたし）
更新
20240309.0：初版