グラフェンアクティブセンサーアレイによる広帯域皮質脳活動の長時間・無線マッピング
公開日：2021年1月11日
R. Garcia-Cortadella, G. Schwesig, ...J. A. Garrido
Nature Communications 12巻 記事番号：211 (2021)
元記事はこちら。
概要
グラフェンアクティブセンサーは、脳内の電気生理学的信号の検出に有望であることが示されている。その機能特性、柔軟性、安定性、生体適合性から、大規模センシング神経インターフェースの有望な構成要素であると考えられている。
しかし、神経科学および生体医工学の応用に信頼性の高いツールを提供するためには、この技術の成熟度を徹底的に研究する必要があります。ここでは、ワイヤレスの準商用ヘッドステージを用いて、64チャンネルのグラフェンセンサーアレイの性能を均質性、感度、安定性の観点から評価し、上皮型グラフェン慢性インプラントの生体適合性を実証している。さらに、低周波から高周波までの皮質信号を検出する技術の可能性を示すため、自由行動下におけるネズミの長期無線記録を実証した。
本研究は、グラフェンを用いた技術の成熟度を示すものであり、慢性的な広帯域神経センシングインターフェースの有望な候補となるものである。
はじめに
広い周波数帯域における空間分解能と感度の観点から、ニューロエレクトロニクスインターフェースの帯域幅を広げることは、神経工学の主要かつ継続的な課題である。この数十年間、生体適合性の高い頭蓋内神経プローブ11,12,13,14に必要な、コンフォーマル基板上の高センサカウントの神経センシングインターフェース開発に、大きな努力が注がれてきた。この中で、アクティブセンサーは、多重化配列2,4,6,7,8,9が可能であり、センサー数の多いプローブが実現できることから、高帯域神経インターフェースの有力な構成要素として浮上してきた4,6,15,16,17,18,19。アクティブセンサの検出原理は、一般に、ゲートを通して生体環境と電気的に結合するトランジスタチャネルの導電性の変調に基づいており8,9,15,18,20,21,22、局所信号の前増幅を生成しています。アクティブセンシング技術は、従来の微小電極アレイと比較して大きな利点があるが、現在のところ、要求される厳しい材料特性によってその実現が制限されている。長期的かつ高感度な神経記録を実現するために、アクティブセンシング用材料には、半導体または半金属の特性、高い電気移動度および低い固有雑音に加え、高い安定性、フレキシブル基板への容易な組み込み、生体適合性が期待される。有機半導体や薄いSiナノ膜を用いたアクティブセンサーは、新しいトランジスタ構造17,22や絶縁技術4,14によって、周波数特性や長期安定性など、通常制約を受けるいくつかの側面において性能が向上し、有望な性能を示している。グラフェンは、その柔軟性23,24、高い期待安定性25、生体適合性26,27に加え、電荷キャリアの高い移動度28,29などの電子特性を備えているため、グラフェンを用いたアクティブセンサーもこれらの要求を満たす有力な候補の一つである。グラフェン溶液ゲート電界効果トランジスタ（g-SGFET）は、局所電位15（LFP）の検出において高い感度を示すとともに、多重化動作においても高い性能を発揮することが実証されている6,7。さらに、g-SGFETは近年、低速（0.5 Hz以下）の脳活動（ISA）30,31,32を高い空間分解能でマッピングできることを実証しています6,7,33,34。
ISAは、そのユニークな神経生理学的基盤30や、安静時ネットワーク31,35,36,37や脳状態36,38,39,40との関係から、近年ますます注目を集めている。今日まで、ISAは一般的にフルバンド脳波計（fb-EEG）41,42を用いて研究されてきた。しかし、小型の電極を使用してISAモニタリングの空間分解能を高めることは、結局、使用する電極のインピーダンスにアンプのゲインが依存することによって制限される。この依存性は、低周波での信号対雑音損失と信号歪み43につながる。このため、高空間分解能を有するISAの研究は、一般的に機能的磁気共鳴画像法31,37、光学的方法44、または高周波数における信号パワーの超低速変化の解析などの間接的測定方法に制限されてきた45。G-SGFETは、アクティブセンサーとして、脳内の電気化学的電位信号（Vsig）をドレイン-ソース間電流（Ids）信号に変換します（図1aを参照）。
gmは、単位面積あたりのゲート容量(集中特性)とトランジスタのW/L比に比例し、有効面積には比例しない17,46,47,48,49。したがって、電界効果メカニズムに基づく信号検出は、超低速周波数帯の小型パッシブセンサーに見られる信号の歪みや利得の損失を防ぐことを可能にする。この利点は、安定した伝達特性を持つすべてのFETベースのセンサー技術に有効であると期待されるが、実験的に証明されているのは、特に高い化学的不活性を示すg-SGFETのみである25,33。g-SGFETの特性は、ISAの研究において質的な変化をもたらし、向上した空間分解能でその生理学的役割を探求することを可能にするものである。しかし、g-SGFETアレイの実際の応用を進めるためには、いくつかの技術的側面を徹底的に評価することが必要である。
図1：広周波数帯域の上皮神経活動を慢性的に無線モニタリングするためのグラフェンアクティブセンサーアレイ。
図1
a g-SGFETとその等価回路の模式図。電圧から電流への小信号変換は、電流源GmVsigでモデル化されており、Gm≡dIds/dVgsとなる。直流電流はRds素子でモデル化。 b 8g-SGFETの平均定常転送特性（左軸）と64g-SGFETのgm（右軸）。塗りつぶした部分は標準偏差を示す。 c テザーなしの記録システムを埋め込んだラットの図。ヘッドステージとそれを保持するための3Dプリントされたフレームが、3Dプリントされた筐体で覆われている。上部にはモーションキャプチャ（Mocap）システムの位置マーカーが固定されており、室内に設置されたMocapカメラに光を反射して戻ってくる。d ラット大脳皮質に設置したg-SGFETアレイ。小脳に接触する参照電極の位置と、g-SGFETアレイの両脇にある2つの白金電極の位置を矢印で示す。e これらの実験のために設計されたワイヤレスヘッドステージの写真。 f カスタムコネクタに取り付けられた64 g-SGFETアレイの写真（左）およびプローブ活性領域の拡大画像（右）。赤い四角はアレイ上のg-SGFETを示し、これらはDC機能付きヘッドステージの入力に接続されている。
本稿では、柔軟な64チャンネルg-SGFETアレイと無線ヘッドステージからなるセンシングシステム（図1c-fおよび補足情報S1）を用いて、自由に動く動物における長期および広い周波数帯域の記録能力という点でこの技術の成熟度をシステム面から実証する。
まず、グラフェンセンサーの歩留まりや均質性、固有ノイズ、データ収集（DAQ）システムがこれらのデバイスの感度に及ぼす影響など、システムの体外的特性の評価に重点を置いている。
第二に、グラフェンドープの安定性、g-SGFET感度の長期安定性、急性および慢性生体適合性など、生体内での慢性的な応用に重要な側面が解決されました。
最後に、この方法を用いて、自由行動するラットモデルにおいて、約24時間の長時間に渡って、3次元位置と同時に大脳皮質局所電位（LFP）をモニターしました。行動データと電気生理学的データを組み合わせることで、脳の状態が変化していないときに脳のダイナミクスをモニターする無線記録システムの能力を評価し、疎な行動イベントに伴う高周波振動を検出する感度を検証するために使用されました。
その結果、高電圧紡錘体（HVS）に伴う低速のトポグラフィー特異的で脳状態不変のパターンを初めて実証した。さらに、徐波睡眠（SWS）と急速眼球運動（REM）の間で徐波信号のパワーが変化することを見出し、REMおよびSWS中のDC信号の徐波ダイナミックスの位相によるシータ振動と睡眠スピンドルの調節をそれぞれ同定した。本成果は、グラフェンアクティブセンサーアレイを用いた神経プローブが、高い感度、安定性、生体適合性を有し、自由行動下における広い周波数帯域の大脳皮質ダイナミクスを慢性的にマッピングすることを可能にする成熟した技術であることを実証しています。
研究成果
グラフェンアクティブセンサー技術の均質性と高感度化
グラフェンアクティブセンサーアレイを神経科学研究に利用するためには、大規模かつ柔軟なグラフェンエレクトロニクスの成熟が不可欠である。これらの技術開発における主な課題は、高品質の単層グラフェン（SLG）の製造と、必要な基板上への転写の2つであるのが一般的である。SLGを製造するためのウェーハスケール法の開発は、過去10年間に多くの努力と投資がなされ、最近では、化学気相成長法（CVD）によるグラフェンの成長に重要な進展が見られた51。ここでは、市販の単層グラフェンをCVDで作製し、フレキシブル高分子基板（4インチSiウェーハ上にスピンコート）上に転写することで、gmと電気的低周波ノイズの両面で均質な良好性能を持つg-SGFETアレイの作製が可能になることを明らかにする。
図2aは、9個の神経プローブのgmのボックスプロットを示しており、各プローブには64個のg-SGFET（メソスケールの上皮性LFP解析用に選ばれた100×100μm2の大きさ10）が含まれています。これらのプローブは、すべて独立したバッチで処理された3つのウェハーからランダムに選択された（製造の詳細については、「方法」を参照）。gmの観点から高い均質性と歩留まりを観察することができ、99%のチャンネルが動作している（中央値の0.7倍以上のgmを持つトランジスタと定義される）。測定されたgmの中央値1.9 mS/Vは、フレキシブルシリコンFET8に対して比較的高く、g-SGFETの高い電気移動度とゲート容量により、典型的な有機トランジスタの値17,52と同等です。図2bには、同じデバイスのゲートでの等価ノイズ（Vgs-rms）が示されています（補足情報S2参照）。Vgs-rmsは、センサ47の感度を評価する上で重要な数値で、トランジスタの積分電流ノイズ（Ids-rms）とそのトランスコンダクタンスとの比として定義されます。このパラメータはgmよりも大きなばらつきを示しますが、g-SGFETの96%が10 µVrms以下のVgs-rmsを示し、9つのプローブ中3つを特定することが可能で、測定ノイズがgmと直接関係しないことが示唆されています。実際、グラフェンにおける低周波ノイズは、電荷のトラップ-デトラップ現象に由来すると報告されており53、このため、ノイズはトラップ密度に正比例し、グラフェンの環境中の不純物に敏感に反応する。図2c、dは、図2aでアスタリスクが付けられたプローブ#3に対するgmとVgs-rmsの分布をそれぞれ示している。g-SGFETのトランスコンダクタンスにおける分散は、神経信号の校正において考慮され、信号増幅における分散を補正することが可能である。したがって、g-SGFETの性能の均質性の観点から真に制限される要因は、ゲートにおける等価ノイズである。Vgs-rmsは対数正規分布54を示し、平均は4.13 μVrms、標準偏差は1.14 μVrms（図2bに示した外れ値を除く）であった。これらの結果は、4インチウェハスケールの製造プロセスを用いて作製したグラフェンベースの神経プローブが、高い均質性と感度で得られることを示しています。さらに、製造プロセスを工業規模に拡大することで、g-SGFETの特性、特に汚染に依存する電荷ノイズの均質性がさらに向上することが期待されます47,53。
図2: システム感度の評価
図2
a 独立したバッチで生産された3つの異なるウェハーからランダムに選択した9つのプローブのgmの箱ひげ図。b 1～10 Hzの周波数領域で測定したVgs-rmsの箱ひげ図，aで評価したのと同じ神経プローブについてプロットした．ボックスは、中央値に線を持つ下位四分位値から上位四分位値まで拡張します。c プローブ#3（パネルaでラベル付け）の64個のSGFETのgmのヒストグラムと、パネルaで示した外れ値を除いたヒストグラムのガウシアンフィット。d プローブ 3 の 64 トランジスタの Vgs-rms のヒストグラム（パネル b 参照）と，パネル b に示した外れ値を除いたヒストグラムの対数正規分布フィット e ワイヤレスヘッドステージの等価回路 f プローブ 3 の DC チャンネル（黒）と交流チャンネル（オレンジ）からのノイズのパワースペクトル密度 (PSD)．1/f依存性は赤の実線で表している。オレンジの縦線は、ACチャンネルに0.15 Hzで適用されるハードウェアハイパスフィルタを示す。DCおよびACチャンネルの量子化ノイズは、水平の赤色破線で示されている。 g異なる帯域幅（DCチャンネル（左）、1-10 Hzバンド（中央）、20-200 Hz（右））について示したプローブ＃3内のすべてのg-SGFETのVgs-rmsの表示。アレイ上のg-SGFETの位置が接続されている。
ヘッドステージのDCチャンネルに接続されたアレイ上のg-SGFETの位置は赤の四角で示されている。 h fとgの部分に示されたノイズスペクトルの時間領域表示（DCチャンネルは 0.05-0.5 Hzバンド、ACチャンネルは 20-200 Hzバンドでフィルタリングされている）。8つのチャンネルの信号が重なっている。
ワイヤレスヘッドステージの設計と特性
録音システムの感度に寄与するもう一つの側面は、増幅とデジタル化の過程でヘッドステージからもたらされるノイズです。広い周波数帯域の活動を増幅するためには、DC結合のシステムが必要であり、それは大きなDCオフセットを持つ信号のデジタル化を意味します。このような大きなダイナミックレンジの信号をデジタル化し、量子化ノイズを最小化するために、2段のトランスインピーダンスアンプが実装されている（図2eの回路図参照）。初段では、g-SGFETからのIds電流を電圧に変換し、Idsの低速周波数成分を含む広帯域の信号を含む。第2増幅段（図2e参照）では、DCオフセットを除去し、アナログ・デジタル・コンバータ（ADC）のフルスケールを埋めるために、信号がハイパス・フィルタリングされる。各チャンネルのDCまたはACカップリングを動的に選択するために、第1段と第2段の出力を切り替えるマルチプレクサが追加されています（図2e参照）。マルチプレクサは64チャンネルのうち8チャンネルにしか実装されていませんが、これは消費電力を最小限に抑えるためで、その結果、専用のワイヤレスヘッドステージの重量と体積を減らすことができます。
トランスインピーダンスアンプのノイズフロアを超える信号を前置増幅するためには、比較的高いトランスコンダクタンスを持つことが重要である。しかし、アクティブセンサーには一般的に1/fノイズが内在しており、これはドレイン-ソース間電流に比例して増加します47。したがって、Vgs-rms は、アクティブセンサの感度を評価するためのより適切な指標となる。記録システムの感度がアクティブセンサの固有ノイズによって制限されることを検証するためには、広い周波数帯域において、増幅エレクトロニクスがシステムの感度に与える影響を評価することが最も重要である。DCおよびACチャンネルのノイズレベルは、ゲートにおける等価電圧ノイズのパワースペクトル密度 (PSD) (SVgs(f)) から評価することができ、トランスコンダクタンスに対する電流ノイズのPSDとして定義されます (図2f参照)。スペクトルの中央部、約0.05 Hzから10 Hzは、グラフェン・トランジスタの1/f固有ノイズによって支配されている53。0.05 Hz以下の周波数では、DCチャネルが1/fノイズよりもわずかに増加している。これは、増幅チェーンにノイズ源が追加されたため、0.005～0.05 Hz帯でVgs-rms値がわずかに大きくなったためと考えられる（補足情報S2参照）。10Hz以上では、ヘッドステージアンプの量子化ノイズに起因する1/fノイズが大幅に増加しており、これはDCチャンネルでより顕著になります。図2gは、神経プローブ#3の全チャンネルについて、異なる周波数帯域で積分したSVgs(f)を示したものである。3つのマップは、異なる帯域でのシステムの感度が類似していることを示し、20-200Hzの帯域でのみ顕著な増加を示している。この帯域では、DCチャンネルのノイズがACチャンネルのノイズを上回っているが、異常値を除くすべてのグラフェンセンサがVgs-rms値を15 µV未満に抑えている。交流チャンネルのデジタル化ノイズは、第2増幅段の利得をさらに最適化することで低減できる可能性がある。しかし、増幅器が持つ固有のノイズが、増幅器利得を大きくすることで支配的になることが予想される。図2hは、周波数に対する一定の感度をよりよく示すために、ISA帯（0.05～0.5 Hz）と高周波帯（20～200 Hz）でフィルタリングしたノイズ信号の時間領域表現である。両信号の時間領域表現の隣にプロットされたヒストグラムは、それらの確率密度分布を示し、これらの周波数帯の1/fスペクトルの積分から予想されるように、それらの分散の類似性を示している。なお、時間領域表現で低速度ノイズの振幅が小さく見えるのは、両周波数帯の1/fノイズのタイムスケールが異なるためであり、信号の分散が異なるわけではありません。
これらの結果から、インフラスロー周波数帯ではVgs-rmsが5μV以下となり、広い周波数帯域で高感度であることがわかります。ヘッドステージの設計では、高周波領域で最大感度に達することと、比較的チャンネル数の多いDC結合型記録システムの消費電力を最小にすることの妥協点を検討しました。小型のg-SGFETは，あらゆるアクティブまたはパッシブセンサーで予想されるように，高い固有ノイズを示すことが予想されます（補足情報S2参照）。
したがって、我々の結果は、100×100μm以下のセンサー領域では、g-SGFETの超低速周波数での感度が増幅エレクトロニクスに影響されないことを示している。これは、センサーの寸法が小さいほど利得損失と信号歪みが大きくなると予想される受動電極を用いたISA検出とは強い対照をなすものである。これらの結果は、ISA検出機能を持つ高密度アレイに向けたg-SGFET技術の限界とスケーラビリティを実証しています。
信号の安定性と感度の経時変化
グラフェン・トランジスタとヘッドステージの性能が適切に評価されると、記録システムの信頼性を確保するために、in vivo慢性環境におけるg-SGFETの安定性を評価する必要がある。
g-SGFETのIds-Vgs曲線は、測定されたドレイン-ソース間電流と、グラフェン-電解質界面の電気化学的電位との関係を表している。Idsの最小値は、電荷中性点（CNP）と呼ばれる特定のゲート電圧で発生し、これはデバイスの感度の最小値にも関連している（図1a参照）。CNP は、グラフェンチャネルのフェルミエネルギーが、平均して状態密度が最小となるエネルギー（ディラック点）に最も近くなるバイアス条件に相当する55。このエネルギーに到達するために必要な Vgs オーバーポテンシャルは、グラフェン・チャネルのドーピング56や参照電極の電気化学ポテンシャルに依存する。したがって、これら 2 つのパラメータのいずれかが不安定になると、Vgs 軸における伝達特性のシフトが生じることになる。このシフトは、Idsがドリフトすることを意味し、Vgsのオーバーポテンシャルが一定であれば、g-SGFETの感度が時間とともに変化する可能性があることを意味しています。したがって、g-SGFETの制御可能なドーピングとセンサー間の均質なCNPを持つことは、センサーアレイの良好な感度を維持するために最も重要である。
図3aは、神経プローブを埋め込んだ後、4週間にわたる伝達特性の変化を示している（埋め込みの詳細については「方法」を参照）。観察されたCNPのシフトは、グラフェン-電解質界面の電気化学的クリーニングによる汚染物質の脱着57、環境に存在する荷電化学種の吸着、あるいは参照電極電位の変化などの複合要因によると推測される（補足情報S3参照）。しかし、これらの結果から、すべての異なる寄与を区別することは不可能である。最初の24時間の記録で測定されたCNPの累積ドリフトは約50mVに達し、最初の1時間で最大約20mV/hの変化率であった（補足情報S3参照）。図3bは、記録の最初の2時間の間のDC結合された2つのチャンネル（1mHzでハイパスフィルタリング）の測定されたシグナルを示す。図3cは、0.005-0.05Hz帯におけるこれら2つのDC結合チャンネルの間の振幅-位相関係を示す（「方法」のセクションを参照）。左のパネルはPBSで測定した振幅-位相結合を示し、右のパネルはin vivoでの同等の結果を示している。このことから、トランジスタの1/fノイズやヘッドステージノイズが、このような低速の振動の原因であることは否定された。さらに、0.005-0.05 Hz帯で記録された生体内信号は逆位相の揺らぎを示し、参照電極の不安定性やグラフェンへの化学種の吸着・脱着がこれらの揺らぎに関係していないことが確認された。最後に、図3dに、グラフェンセンサのVgs-rmsに対するグラフェン添加量のドリフトの影響を示す。これらの結果は、初期バイアスを適切に選択すれば、最大24時間の間、累積ドリフトによってセンサーの感度が大きく変化しないことを実証している。したがって、毎日CNPを追跡し、Vgsオーバーポテンシャルを最適値に再調整することで、脳ダイナミクスの長期モニタリングにおいて一定の感度を維持することができるのである。
図3：g-SGFETのインビボでの安定性。
a CNPの4週間にわたる経時変化。挿入図は、Ids-Vgs曲線を示しています。n = 8 g-SGFETの平均値と標準偏差（1つの異常値を除外）。 b 2つのDC結合チャンネルからの信号。パネルhのマップに対応する示された位置。チャネル（5,7）のスペクトログラムが示されている（下）。 c ビーカーで測定したノイズ（左）と生体内で測定した信号（右）のパネルbのチャネル間の位相振幅関係。 d Vgs-rmsのボックスプロット対64 g-SGFETの有効ゲート（Vgs-VCNP）におけるシフト。着色された領域は、記録の最初の24時間の間にAg/AgCl電極を参照したCNPの測定ドリフトを示す。e gm（上）とVgs-rms（下）は，移植後4週間にわたって測定したもので，gmはDC結合チャネルのIds-Vgs曲線から求めた（n = 8 g-SGFET，1つの異常値を除く）．数値は動作中のデバイスの歩留まりを示す（補足情報S4参照）。パネルaおよびd-fのボックスは、中央値に線を引いて、下位四分位値から上位四分位値まで延びている。g 周波数依存のトランスコンダクタンス（｜gm｜（f））の平均と標準偏差は、移植後の異なる日数について示した（n = 10 g-SGFET）。挿入図は、アレイに近いPt-Ir電極のおおよその位置、導電性平面における等電位輪郭線のシミュレーション、およびアレイ内の各g-SGFETによって測定された相対信号振幅を示す（補足情報S5参照）。 h移植後1日目と6日目のシータ活動の増加状態においてアレイ上のすべてのg-SGFETによって測定された信号。
グラフェンのドーピングの変化に加え、g-SGFETのトランスコンダクタンスとノイズは、例えばグラフェン格子中の欠陥の生成などにより、時間の経過とともに変化する可能性がある。純粋なグラフェンは、そのsp2混成により優れた化学的安定性を示している25。しかし、エッジのダングリング・ボンド、粒界、原子空孔、原子格子の再構成などがグラフェンの反応性を高め、経時的に欠陥が生成される可能性がある25。さらに、グラフェンの基板からの剥離や、グラフェン格子および金属-グラフェンコンタクトの曲げによるひずみなど、性能劣化の機械的な原因もあり得る。感度劣化のもう一つの原因として、グリア瘢痕組織によるデバイスの封じ込めが考えられる58。この組織の層は、グラフェン-電解質界面と直列に並んだ電気インピーダンスとしてモデル化することができ59、最終的にg-SGFETの周波数特性の劣化につながる可能性がある。
慢性インプラントにおける感度の経時変化を追跡するため、DC結合した8チャネルについて、Ids-Vgs曲線から抽出したgmとVgs-rmsを4週間にわたり定期的に測定した。図3eから、gmはほぼ一定であり、生体内環境においてグラフェンチャンネルに大きな欠陥の生成がないことが示唆される。同様に、Vgs-rmsは最後の数日間においてわずかな上昇を示しただけである。図3fは、4週間にわたり200Hzで測定した全64チャネルの電流ノイズ（Ids-rms）を示している。この周波数では、高周波の神経信号の平均パワーが低いため、記録システムの感度の変化を推定することが可能である（補足情報S4参照）。図3fに表示された数値は、g-SGFETが動作している割合を示している（補足情報S4参照）。トランスコンダクタンス（gm（f））の周波数応答も、移植後4週間にわたってin vivoで測定されている。この目的のために、2つのPt-Ir電極をg-SGFETアレイの両側に埋め込み（図3gの挿入図を参照）、電流源を用いて異なる周波数の1μA振幅の純音信号を印加した。図3gは、神経プローブの移植後の異なる日数におけるgm（f）の大きさを1Hzにおける平均の大きさで正規化したものである；gm（f）の位相は、補足情報S5に示されている。ほぼ一定の傾き（対数スケール）は分数次減衰（すなわち、約∝1/f0.1）に従っており、これは最近、グラフェン-電解質界面の非理想的容量反応に起因するとされている34。また、このようなトランスコンダクタンスの変動を補正するためのキャリブレーション手法も提案されている34。周波数特性の推移を見ると、gm減衰の傾きに大きな変化は見られないことから、デバイスの封止によりグラフェン-電解質界面と直列の電気インピーダンスが大きく増加することはないことがわかる60。結論として、図3gは、移植後1日目と6日目にシータパワーが増加した状態で記録された神経活動を示しており、g-SGFETの性能の良好な均質性と安定性を示している。今後の研究では、電気生理研究およびブレインコンピュータインターフェースの長期性能にとって重要な点である、生体信号の経時的安定性について、大規模な動物コホートの研究によって、より詳細に取り上げることができるだろう61,62。さらに、基板やパッシベーション層として使用したポリマーを改良して吸湿性を低減し14,63、デバイスの中立面をグラフェンチャネルの位置に移動させることができる（「方法」セクション参照）。しかし、本セクションで紹介した結果から、長期にわたって安定した性能が期待できることが明らかになった。これは、慢性的なインプラント環境におけるg-SGFETの安定性の下限を設定するものである。さらに、システムの観点から、g-SGFETアレイは非常に遅い生体信号（1 mHz以上のハイパスフィルター）を測定することができることを示す。
亜急性期および慢性期移植後のグラフェンデバイスの生体適合性
自然行動下での脳活動の長期モニタリングに対するg-SGFETアレイの適用性を評価するため、我々はグラフェンベースの大脳皮質デバイスの生体適合性についても調査した。この目的のために、動物は3つのデバイスのうちの1つを脳の頭頂皮質に移植されるか、あるいは、いかなるデバイスも移植せずに完全な手術を受けた（偽のコントロール）。対照として、何も介入していない素朴な動物のコホートを使用した。組織反応を評価するために3つの時点を選択した。移植後2週間、6週間、12週間である（Fig.4a）。非機能性デバイスは、CVDグラフェンの表面積を拡大し、脳組織への材料の露出を最大化するようにカスタム設計された（デバイスの寸法は図4bを参照）。実験は、医療機器の生物学的評価について詳述したISO 10993規格のガイダンスに従って設計された。移植前にエチレンオキサイド滅菌を行った64。移植後、組織の免疫組織化学的反応と挙動への潜在的な影響を調査した。
図4：非機能性g-SGFETと対照デバイスの生体適合性試験。
図4
a 時系列は、生体適合性試験中に動物に対して行われた手順を説明している。 b インビボでの生体適合性試験のために開発された高表面積g-SGFETプロトタイプの概略。 c 移植後の異なる日にわたるNOR試験からの識別比（「方法」のセクションを参照）。試験した5つのグループすべてにおいて、識別比はすべてのタイムポイントで0.5を上回った。12週を除くすべての時点において、1群あたりn = 7匹で評価（n = 3（偽薬）、n = 4（白金とナイーブ）、n = 7（ブランク））。d 全群・全時点の脳組織中の炎症マーカーIL-17a。2週間後と12週間後にn=4匹、12週間後にn=3匹で評価。 e 微小グリア活性化状態、電極周辺部位の全微小グリア存在率として表現。f Iba-1免疫蛍光染色により、動物あたり40切片から得た手術部位のミクログリアの活性化状態を評価した。移植後2週間のヘモトキシリン・エオジン染色により、デバイス移植部位の皮質層に直接構造的損傷がないことが示された。1匹あたり25μmの切片を40枚撮影した。スケールバーは1mm（上）および200μm（下）である。パネルdおよびeでは、n = 3以上の各タイムポイントにおいて、ナイーブコントロールとのダネットの多重比較による二元配置ANOVA検定。*はそれぞれ、p = 0.015、p = 0.007、p = 0.0016、p < 0.0001を示す。
行動は、認知・記憶の障害を評価するために用いられる新規物体認識（NOR）試験で評価した65。いずれのデバイスを移植した動物でも、どの時点でも識別率に有意差は認められなかった（図4c）。組織の炎症反応は、主に2つの手法で評価した。炎症性サイトカインのパネルについて血液または脳組織のELISAを行い、炎症に関連する細胞について脳組織の免疫組織化学分析を行った。ELISAは、インターロイキン-6（IL-6）、インターロイキン-17a（IL-17a）、インターフェロンγ（IFN-γ）、腫瘍壊死因子α（TNF-a）の4つのサイトカインについて行われた。血中血清では、どの時点でもどの材料にも有意差はなかった（図S6参照）。脳組織におけるサイトカイン発現については、グラフェンおよびプラチナデバイスのいずれにおいても、対側半球の対照と比較して、2週間の時点で4種類すべてのサイトカインレベルが有意に高いことが確認された。これらの因子の放出は、通常、CNS組織へのさらなる損傷を防ぐことを目的としているが、発現が長引くと有害となる。移植後6週間までに、グラフェンおよびプラチナデバイスのIL17aおよびIFN-γの両方が、対照発現に対して依然として有意に上昇し、12週間までに、どの治療グループにおいても、いかなるサイトカインの有意な発現も見られなかった（図4dおよび図S7）。これらの知見は、グラフェンに対する有害な組織反応は一過性のものであり、現在の臨床標準と同等で、移植部位に特異的で、全身的な合併症は観察されないことを示すものである。
ELISAデータを確認するために、脳内の炎症状態を評価するために、ミクログリア細胞の活性化状態の手動カウントも実施した。ミクログリア細胞は脳内に常に存在するが、その形態は脳内の炎症状態の指標となる62。活性化したミクログリアの発現は、移植後2週間と6週間の両時点で増加し、この活性化は、対側半球と比較すると、4つの治療群すべてにおいて移植後2週間で有意なレベルまで存在した。しかし、ELISA法と同様に、ミクログリアの活性化は12週間までにベースラインレベルに戻り、デバイスに対する炎症反応が長引かないことを示した（図4e、fおよび図S8）。デバイスの移植による組織内の細胞死を評価するため、TUNEL細胞計数も実施した。移植後2週間では、グラフェン群と偽手術群の両方で、TUNEL陽性細胞の数が有意に増加した。しかし、6週目には細胞死の証拠はなく、これは12週目でも同様であった（図S9）。最後に、ヘモトキシリン・エオジン染色で見られる明らかな形態学的変化はなかった。一部の脳で皮質が陥没しているように見えるが、これはガラス窓をつけたまま灌流固定したためであり、図4gに示すように移植部位の下の皮質層の厚さには影響がなかった。
全体として、サイトカインの発現と移植部位の脳領域の組織学的解析の両方が、デバイスの移植に対する急性反応を示した。しかし、これは、材料固有の反応を最大化するためにグラフェンの表面積を拡大したとはいえ、グラフェンデバイスに特異的なものではありませんでした。6週間後までには、反応は明らかに改善の兆しを見せ、12週間後までには、どの手法を用いたデバイスにも検出可能な反応は見られなくなった。グラフェンおよび白金デバイスは、「ブランク」デバイスと比較して、同程度のミクログリア活性化を示したが、後者では、グラフェンや白金よりも炎症マーカーの存在が非常に小さくなっていることがわかった。これらの結果から、ミクログリアの活性化は外科的処置やプローブ挿入とより強く関連し、炎症は主にデバイスの材料に影響されることが示唆された。このように、グラフェン面積が非常に小さい機能性センサーアレイは、「ブランク」デバイスが引き起こす炎症に近い炎症を引き起こすと予想される。さらに、NOR試験によると、グラフェンデバイスは、急性期および慢性期のいずれにおいても、動物の行動に大きな影響を与えなかった。これらの結果から、グラフェンデバイスは、プラチナベースのデバイスと同程度の、慢性的な埋め込みに適した生体適合性を示すことがわかった。
自然行動時の広帯域皮質脳活動の長期モニタリング
g-SGFET感度のin vivo長期評価では、自由行動中のラットの皮質上部の脳活動を24時間まで記録した。記録期間中、動物の3次元運動はモーションキャプチャシステムで追跡した（「方法」セクションおよび図5aを参照）。動物の動きと広帯域の皮質信号の同時記録により、記録期間中の脳状態と行動状態を分類した。そして、この分類は主に2つの目的をサポートするために使用された。第一に、自由に動くラットの複数の脳状態において長期的に安定した記録を行うグラフェンベースの無線記録システムの能力を検証し、低速の大脳皮質LFPダイナミクスを研究するのに適しているかどうかをテストすること。第二に、自発的行動と関連するLFPダイナミクスの高周波領域におけるg-SGFETの感度を評価すること。大脳皮質の脳活動と自由行動との関係の解析は、無線記録システムによって可能になった時間スケールで行われました。この機能は、まばらに発生する行動イベントや、異なる脳状態におけるISAパターンの研究に不可欠である。
図. 5: 睡眠と行動状態のインフラスローからハイガンマまでの相関関係。
a ラットの頭部位置の 3 次元軌跡。b 脳の状態（上）：徐波（SW）、高電圧紡錘（HVS）、シータについて、スペクトログラムと生のLFP信号が表示されている。運動状態（中）、脳状態（下）の分類とともに運動速度が表示される。 c 上：活動状態と非活動状態の時間の割合（電池交換のための中断は含まない）。d REMエピソード開始時にトリガーした1つのDCチャンネルの平均0.015-4Hzスペクトログラム（n = 44） e REM開始前後の30秒間のSWS-REM遷移エピソード（n = 44）全体のPSDの中央値。f レム睡眠（左）とSWS（右）状態において、1つのDCチャンネル（パネルg参照）から得られる0.05-0.2Hzの範囲におけるISAの位相による、低周波領域（y軸）にわたるLFPパワーの変調の強さを色分けしたもの。灰色は有意でない変調を示す。g REM睡眠中のシータバンド（左）とSWS睡眠中のスピンドルバンド（右）のLFPパワーのISA位相変調の色分けされたトポグラフィーマップ。h レム睡眠時の0.05-0.2HzのISA位相（左）と低周波リズムのLFP位相（右）によるガンマ周波数範囲（y軸）でのLFPパワーの変調の強さを色分けして示した。j 頭部挙上（下）および高ガンマパワー（上、iと同じチャンネル）を、リアリング開始を中心に色分けし、リアリング事象の継続時間ごとにソートして表示した。
脳の状態は、大脳皮質のLFP信号のスペクトルの特徴と運動データの組み合わせによって分類された。この方法で、次のクラスを区別した：徐波睡眠（SWS）、レム睡眠（REM）、覚醒シータ（AwT）、および覚醒非シータ（AwNT）。図5bは、「方法」のセクションで詳細に説明した、脳状態の分類の基準を示している。まず、1〜25Hz帯のパワー増加を示す徐波（SW）状態と、シータ状態とを識別した（図5b参照）。次に、運動追跡データから、動物の行動を活動期と非活動期に分類した（図5b及び「方法」の項参照）。非活動時の運動行動では、SW状態はHVS事象に直接的に近接している場合を除きSWSに分類され、シータ状態はSWSに直接的に先行する場合をREMに分類された。一方、能動的行動時に発生するシータ状態はAwT、SW状態はAwNTに分類された。最後に、シータ状態やSW状態に分類されない期間は、動物の行動に関係なくAwNTに分類された。ラットの睡眠は多相性であることから、記録時間の大部分において4つの睡眠・覚醒状態すべてが少なくとも1度は発現していた66,67,68。しかし、その相対的な優位性は、運動状態の変化と同様に、記録日の経過とともに大きく変化し（図5c）、概日リズムに沿ったものであった。
脳の状態の分類は、通常、デルタ、アルファベータ、シータ周波数帯（「方法」の項参照）に基づき、速い時間スケールの状態特異的なネットワークダイナミクスを反映するものである。しかし、最近のいくつかの研究では、睡眠中の高次LFP周波数帯の変調を介した脳サブ状態40の制御における低速ダイナミクスの役割、および安静状態の動的調整と分離35,70に焦点が当てられた。これらの結果は、脳状態を完全に分類し研究するためのISAの潜在的な重要性を示している。ここで紹介するグラフェンベースの記録システムは、自由に行動する動物において、高い精度と空間分解能で皮質ISA信号の研究を行うための理想的なツールである。図5bのスペクトログラムは、SWSとREMの間の遷移における0.015～4Hzの周波数のスペクトルパワーの変化を示している。SWSからREMへの移行に伴い、ISAバンドのパワーが明らかに増加することが、単一試行レベルでも確認できる（Fig.） このようなSWS-REM（REM時間40秒以上）の状態遷移が24時間以内に44回まばらに発生することを、我々のシステムの長期記録機能を利用してサンプリングすることができた。さらに、g-SGFET技術によって可能になったISAの空間マッピングは、SWS-REM状態遷移におけるISAの局所的な領域特異的変調を解決することができる（補足情報S12を参照）。興味深いことに、低速振動に関連するδバンドパワーと低速度パワーは、SWSとREM睡眠の間で反対方向の変化を示した。デルタバンドパワーがSWSからREMにかけて、皮質の非同期状態に関連して予想通り減少するのに対し、低速度パワーはREMで増加した（図5d、e、図S12、「方法」の統計解析参照）。
記録システムの広い周波数帯域の感度をさらに説明するために、REMとSWS中のISA活動の位相による低周波領域（1-15 Hz）のLFPパワーの変調の強さを定量化した。興味深いことに、ISAの位相はレム睡眠中のシータパワー（8-9Hz）（図5f-左）とSWS中の紡錘帯パワー（9-13Hz）（図5f-右）を有意に変調させた。ISA位相変調の強さはSWSに比べREM睡眠時に10倍高く、最大LFPパワーのISA位相はREMではピークに近く（〜340°）、SWSでは上昇相（〜300°）と状態間で異なっている。大脳皮質背側外套膜の広い範囲をカバーするアレイを利用して、LFPパワーのISA位相変調の空間的範囲を評価したところ、REM時のシータパワーとSWS時のスピンドルパワーは共にアレイの後方部分で最も強い変調を示した（図5g）。皮質表面で測定されるシータ振動が、内嗅-海馬回路の複数のシータリズム電流発生器の体積伝導によって生成されるのに対し、睡眠スピンドルは、視床-皮質の粒状皮質層への突起のリズミック電流によって生成されます73。海馬のシータと皮質紡錘帯のパワーが皮質表面からのISAの位相によって調節されるのは、大脳辺縁系と皮質回路の両方を共変調するグローバルな超低速ダイナミクスを反映していると思われる。ISAの位相によるシータパワーの局所的プロファイルは、海馬のシータ電流発生器の解剖学的局在と一致するが、皮質後部の紡錘体パワーのより強い変調は、上皮質DC信号よりISAダイナミクスによってより強く共同変調される解剖学的視床-皮質サブサーキットを反映している可能性がある。最後に、我々はg-SGFETのSNRが異なる時間スケールでの高周波LFPダイナミクスの変動を検出するのに十分であるかどうかをテストし、この目的のために、REM睡眠中のISA位相とシータリズム位相の両方による広い範囲ガンマパワーの変調の強さを定量化した。60-120HzのガンマパワーはISA位相によって変調され、ISAのピーク（~10°）で最大パワーに達した（図5h-左）。また、頭蓋内記録73に基づく発表研究と同様に、高いガンマ（120-150Hz）パワーはシータ位相によって変調された（図5h-右）。
g-SGFETを用いると、脳や運動の状態に応じて選択的に大脳皮質の信号を記録できることがわかったので、次に、行動と大脳生理学を関連付ける技術の適用性を実証することにした。この目的のために、我々は特定の、まれにしか発生しない自発行動である後肢の挙上動作に注目した。リアリングはネズミの探索行動で、文脈やストレスに敏感であり74,75、周辺環境の認知モデルを構築するために遠くのランドマークをサンプリングすることをサポートすると仮定されており75,76、シータおよびガンマ周波数における皮質-海馬相互作用の調節に関係していると考えられています76,77。一般に、飼育事象は散発的かつ自然発生的であるため、その神経生理は、課題特異的に訓練された運動動作に比べ、従来の記録方法ではあまり研究されてこなかった。今回紹介するような、長期間の記録安定性、高い空間分解能、ワイヤレス手法、動物の行動の精密な3Dトラッキングを組み合わせた技術は、このクラスの現象を非常に詳細に調べるための扉を開くものである。そこで、今回発表した技術を活用して、24時間の全期間において、個々の自発的な飼育イベントを大量に収集しました。ガンマ上皮活動バンド上の飼育の署名を評価することは、高周波数 LFP 範囲で g-SGFET の能力を説明するために使用できるため、私たちの研究のための追加の関心事です。飼育エピソードを確実に検出するために、我々は連続的な3Dトラッキングを利用し、地面からの頭の高さに基づいて飼育イベント（n = 163）を検出した（「方法」および補足情報S6を参照）。飼育イベントは記録期間中ずっと発生していたが、飼育活動の発現は運動活動全体と同様、1時間あたり250秒から0秒の範囲で非常に変動していた（平均43.8±12.1秒、補足情報S10）。また、高さ（平均250,6 ± 2.7 mm、図5jおよび図S10d参照）および時間（平均5.7 ± 2.8 s、図S10e参照）の点でも、飼育事象にばらつきが見られた。
この一連の自然飼育エピソードを検出した後、上皮LFPのパワースペクトルの解析を進めたところ、特定の周波数範囲において、飼育に関連した脳信号の明確な変化が見られた。リアリングは皮質の高周波数（90-200Hz）活動の抑制と関連しており（図5i）、これはリアリングの高さの範囲にわたって単試行レベルで観察でき（図5j）、我々のアレイのより前頭部のチャンネルで最も顕著に見られた（補足情報S11を参照）。一方、60Hzから70Hzのガンマ帯域では、このような抑制は見られなかった（図5iおよび補足情報S11参照）。
その後、g-SGFETアレイの低速度記録機能を利用し、発達期のてんかん様活動時に示されるのと同様に、大きな低速度電流に関連する最も可能性の高い皮質ダイナミクスとして、稀な高電圧スピンドル（HVS）振動の同期に関連する位相的低速度およびスペクトルAC上皮信号78、79を特性評価することにした80。HVSの発生は、先行研究78,79と同様に、主に警戒不動状態（IMM）（566イベント、図6a）と関連していた（IMMは不活性状態と覚醒状態の間の交差点として定義される）。海馬のシータ振動と共存しているレム睡眠中のHVS（92イベント）も記録された（図6b）。HVS事象の中央値は不動時とレム睡眠時で同程度であったが（約5秒、図6c-上）、検出されたHVS事象の割合は24時間の記録期間中、変化した（図6c-下）。興味深いことに、両脳の状態におけるHVSは、単一例（図6a、b）および平均プロファイル（図6d、e）に見られるように、一過性の低速揺らぎと関連していることが判明した。特に、アレイの後頭部と前頭部では、それぞれ正（推定ソース）と負（推定シンク）の低速遷移が、HVSの振動ダイナミクスと持続時間（中央値5秒）で一致していた（図6c、d、e）。HVSのスペクトルのピークパワーの位相プロファイルは両状態で同等であり、感覚運動皮質に重なる前頭部でベースラインに対する最大増加を示した（Fig.6f）。レム睡眠のHVSは、平均して、不動状態のHVSよりも遅く、パワーも大きかった（Wilcoxon Ranksum Test, p < 1e-19 for power and p < 1e-8 for frequency, Fig.6g）。一方、HVSに関連する低速ゆらぎの空間構造と大きさは、後方DCチャンネルの正のゆらぎと前方DCチャンネルの負のゆらぎで表され、両状態で同等であった（IMMとREM間のWilcoxon Ranksum検定、後方のピーク大きさでp = 0.5、前方のピーク大きさでp = 0.9）。
一方、HVSに伴う低速ゆらぎの空間構造と大きさは、後部の正のゆらぎと前部の負のゆらぎで表され、両状態で同等であった（IMMとREM間のウィルコクソン順位検定、後部のピーク幅はp=0.5、前部のトラフの幅はp=0.9、図6h）。
図6：高電圧紡錘に関連するACおよびDCダイナミクスのトポグラフィー。
図6
a, b 無動(a)とレム睡眠(b)中のHVS事象の例。アレイの後方（上）と前方（中）のスペクトログラムは、HVSのダイナミクス（オンセットの縦線）と進行中の振動ダイナミクス（無動状態の低周波同期、REM状態のシータ振動）を可視化したものである。下2枚は、アレイ後方（緑）と前方（茶）のDC LFP信号と頭部速度。 c 無動とREMの単一HVSイベントの継続時間（上）と記録期間中のHVSの合計時間（下）の分布。d 無動およびレム睡眠中のHVS発生時にトリガーされた平均DC LFPトレース（チャンネルは図2g-左と同様に配置、挿入図はDC ECoG記録部位の解剖学的局在を示す） e 無動（左）およびレム睡眠（右）のHVS発生時にトリガーされた平均AC LFPスペクトログラム。シータ振動（後）とHVS振動（前）にそれぞれ関連するスペクトル内容を対比させたアレイ上の後方（上）と前方（下）のスペクトログラム。f 無動時（左）とレム睡眠時（右）のピーク振動数におけるHVSパワーのベースラインに対する変化のトポグラフィマップ。 h 無動時とレム睡眠時の単一HVSの後外側と前頭内側におけるDC変動の大きさの分布（カラーコードはgと同じ）。
これらの観察結果を大規模な動物集団で再現するためには今後の研究が必要であるが、今回の長期記録により、稀な生理学的パターンの詳細な定量分析が可能となり、この技術の威力を示すことができた。これらの現象は、その発生頻度がまばらで、状態依存性が強く、広い周波数帯に分布しているため、その機能研究には、我々の無線電気生理システムによって可能となる、自由に動く動物における高い時空間分解能と大きな時空間スパンの両方を持つ神経-行動計測の統合が必要となるクラスの現象の例証となるものである。
考 察
グラフェンアクティブセンサーアレイは、神経工学における新しい技術の一つであり、近年、多カウントセンサーアレイの製造や、広帯域の神経センシングに強い可能性を示している6,7。本稿では、グラフェンセンサーの性能の均一性、専用ヘッドステージに求められる仕様、g-SGFETの感度の限界、あるいは生体内での慢性的な安定性や生体適合性など、実際の応用に必要なさまざまな技術的側面を詳細に評価し、その技術特性によって可能となる研究ラインを示した。
まず、市販のCVDグラフェンを用いてウェーハスケールのプロセスで製造したg-SGFETの高い収率と均質性が実証されました。この実証は、グラフェンを用いた神経プローブの産業規模での生産に向けた重要なマイルストーンとなる。一方、グラフェン・トランジスタを神経センシングに応用するためには、センサにバイアスをかけ、測定したドレイン-ソース間電流をゲートでの等価電圧信号に変換するための特定の電子機器を開発することも必要である。本研究では、専用のワイヤレスヘッドステージを提示し、信号増幅およびデジタル化プロセスが記録システムの感度に与える影響を記述することを可能にしました。このように、ワイヤレスアプリケーションのための特定のエネルギーと重量の制約を与えられたフルバンドアンプの設計における課題を明らかにした。さらに、専用のヘッドステージを用いて、グラフェンアクティブセンサーのISA帯の感度が、データ取得システムの他の構成要素に大きく影響されないことを実証しています。しかし、生体内では、グラフェンチャンネルへの荷電分子の吸着や電極基準電位のドリフトに起因すると思われる、測定信号のゆっくりとしたドリフトが観測された。これらのドリフトは、1 mHzのハイパスフィルターで容易に除去できた。しかし、今後の実験では、グラフェンチャンネルの機能化や、より安定したドーピングレベルを維持するための代替参照電極の使用などを検討することができるだろう。
さらに、グラフェンセンサーの感度を4週間にわたって評価することにより、生体内での安定性を実証した。また、信号品質の安定性を判断するために、LFP周波数帯の双極子刺激によって誘発される信号も評価し、時間経過とともにむしろ安定した周波数応答を示すことを実証しました。これらの結果から、インプラント周囲のグリア組織のインピーダンスは、in vivoでのg-SGFETの感度に大きな影響を与えないことが示唆された。デバイスの安定性の特性評価の締めくくりとして、行動学的および組織学的マーカーを介して、12週間にわたるグラフェンデバイスの生体適合性を評価しました。この結果、白金系デバイスと同等の急性異物反応が確認され、移植後12週間で対照動物に近い値まで回復している。グラフェンの生体適合性と慢性移植における長期安定性が実証されたことは、グラフェンを用いた神経プローブの大量生産に向けたもう一つの重要な転機となる。
この技術の実験的検証は、制約のない行動と広い周波数帯域の感度を持つ多チャンネル記録へのアクセスが重要となる電気生理研究において、多くの可能性を開くものである。本研究では、最大24時間の長時間の記録セッションで脳活動の準連続的なモニタリングを示し、非撹乱の行動および脳状態にわたって神経活動の大規模なサンプルを取得することができました。また、3D-trackingと組み合わせることで、時間的にまばらに発生する神経活動パターンと行動事象の関係を、十分な統計的検出力で探索することが可能となった。特に、上皮のLFP信号を飼育行動と関連付けて解析したところ、60-70Hzのガンマと90-200Hzの高ガンマ域に差のある変調が観測されました。90-200Hzの高周波数帯の活動は局所的に一貫して抑制されていたが、60-70Hz帯ではそのような抑制は観察されず、回路機構の行動選択性が明瞭であることが指摘された。このことは、LFPの高周波スペクトルにおいて、本システムが高い感度を持つことを示している。
低周波領域では、低速パワー<0.2HzがSWSと比較してREM睡眠エピソード中にDC部位間で有意に増加し、したがって低速振動帯域（1-4Hz）のパワーとは逆の状態依存性を示すことを見いだした。興味深いことに、低速ダイナミクスはレム睡眠中のシータおよびガンマリズムのパワーを変調し、低強度ではあるがSWS中の睡眠紡錘のパワーも変調することがわかった。BOLD信号とDC EEGから得られるISA位相によるシータ、ベータ、ガンマ帯域のLFPパワーの変調は、ヒトで81,82、最近では麻酔下ラット70で示されているが、今回の結果は、自由に動くげっ歯類において、生理的に確立した振動ダイナミクス、シータ、スピンドル、ガンマ振動とECoG由来のISAとの相互作用を初めて示したものである。頭蓋内で測定された海馬のシータは皮質表面で測定され、皮質のガンマパワーを変調させた73。
SWS中のISA変調睡眠紡錘振動パワーはREM中よりはるかに低かったが、関連する視床皮質過同期リズム、HVSははるかに大きなDC過渡電流と関連していた。長期間の無線記録により、大規模な統計サンプルにおけるHVSの特性を評価することができた。また、異なる脳状態における発生率を24時間にわたって測定し、一般に選択的に発生すると報告されている覚醒安静状態以外でも発生していることを強調した。具体的には、レム睡眠時に顕著に発現していることがわかった83。このような二重の状態特異性を確立した上で、HVSイベントを覚醒不動状態とREM睡眠に分離して解析した。HVSのピークパワーのトポグラフィー解析により、これらの振動の感覚運動皮質優位性は、これら2つの状態において同程度であることが示された。一方、両状態の事象のサンプル数が多いことから、HVSの周波数コンテンツとパワーの両方において、これら2つの脳状態間の有意な差異を同定することができた。さらに、ISAパターンの同時マッピング機能により、HVSに関連する空間的に特異的な低速周波数成分の明確なトポグラフィー構造を決定することができ、前後軸にわたる位相反転を示すことができた。重要なことは、これらのISAの特徴は、レム睡眠時と覚醒時無動状態の間で保存されていたことで、DC信号の根本的な起源がHVSイベント自体に関連し、脳の状態とは無関係であることが強調された。
今後、大規模な動物コホートで発表した結果を再現し、縦断的に追跡し、表面パターンを層内および皮質下のシータ、スピンドル、ガンマ77およびHVS84ジェネレータに関連付ける研究が必要である。我々は上皮のISAパターンに注目したが、皮質層全体のISAダイナミクスとの相関を分析することで、ISAの起源と意味合いについて重要な洞察を得ることができるだろう。この方向での有望な戦略は、ここで紹介した上皮アレイをグラフェンベースの深さプローブと組み合わせることである33。今後、自由に動く拘束されていない動物で、行動や行動状態にわたって深さおよび大規模LFP信号を慢性的に記録することにより、低速から超高速周波数までの脳ダイナミクス調査における新しい定性的ステップの基礎ができ72、安静状態やデフォルトモードネットワークとの関連におけるISAダイナミクスの起源とその高速脳ダイナミクスへのつながりに関する我々の理解に貢献することができるだろう。
まとめると、グラフェンアクティブセンサーのセンシング能力と長期記録能力をシステムの観点からin vitroおよびin vivoで徹底的に評価したことは、この技術の成熟度を示し、高周波数のLFP成分を犠牲にすることなくISAの研究に適用できることを裏付けている。この方向性で、我々は、異なる脳状態中のISAパターンと、高周波振動と特定のまばらに発生する行動との相関を評価することに成功しました。この結果は、神経科学研究へのグラフェンアクティブセンサーアレイの広範な導入に向けた重要なステップであり、自発行動時の広周波数帯域上皮質脳活動の長期マッピングのための安定で生体適合性のあるセンシング技術を提供するものである。
研究方法
g-SGFETアレイの作製
Si/SiO2 4インチウエハ上に厚さ10μmのポリイミド（PI-2611，HD MicroSystems）フィルムをスピンコートし，350℃で焼成してg-SGFETのアレイと生体適合性の高いデバイスを作製した。ポリイミドは、熱酸化安定性、高い機械的強度、絶縁性、耐薬品性63,85に加え、生体適合性が期待でき、慢性インプラントに対する安定性が以前に報告されていることから、基板として選択された4,5。最初の金属層（10 nm Ti/100 nm Au）は、あらかじめ光陰極処理を施したAZ 5412E（Clariant、ドイツ）上に電子ビーム蒸着し、リフトオフプロセスによって構造化した。その後、Cu上に化学気相成長させたグラフェンを転写した（プロセスはGraphenea s.a.が行った）。生体適合性研究のための白金デバイスでは、最初のものに続いて、別のフォトリソグラフィー、金属蒸着およびリフトオフが行われた。次に、反応性イオンエッチング（RIE）において、酸素プラズマ（50 sccm、300 W、1分間）によりグラフェンをパターン化した。チャネル領域のグラフェン保護に使用した光硬化性レジストは、汚染レベルを最小限に抑えるためにHIPR 6512を選択した。グラフェンエッチングの後、第1層と同じ手順でコンタクト上に第2層の金属をパターニングした。リフトオフ工程の後、超高真空でアニールを行い、コンタクト抵抗を向上させ、グラフェンチャンネルからレジスト残渣を除去した。その後、厚さ3μmの光硬化性SU-8エポキシ樹脂（SU-8 2005 Microchem）でトランジスタを絶縁し、トランジスタチャネルの活性領域を覆わないようにした。
絶縁材料としてSU-8フォトレジストを選択したのは、光硬化性があることと、慢性インプラントへの使用が以前に報告されているためである86,87。現在のグラフェン技術では、パッシベーション層をエッチングするとその下のグラフェンチャネルもエッチングされてしまうため、光硬化性パッシベーションポリマーを使用することが必要である。ポリイミド基板は、厚いAZ9260-ポジ型フォトレジスト（Clariant）層をエッチングマスクとして使用し、反応性イオンエッチングプロセスで構造化した。その後、神経プローブをウェーハから剥がし、挿入力ゼロのコネクターに入れて、当社のカスタム電子計測器と連動させました。最後に、デバイスをエタノールで洗浄し、グラフェンチャンネルに残っているレジストを除去した。
位相・振幅結合の評価
低速周波数帯（0.005-0.05 Hz）でチャンネル間に見られる信号の反転は、信号振幅の確率密度を第2の信号に対する位相の関数として計算することで定量的に評価された。2つの信号間の位相を推定するために、パイソンライブラリscipyを用いてそれぞれの信号のヒルベルト変換を計算し、それらの位相の差を計算した。そして、振幅-位相空間における信号振幅の確率密度を表すために、2次元ヒストグラムを用いた（Fig.3c）。
倫理的承認と動物の取り扱い
生体内実験は、実験に使用する脊椎動物の保護に関する欧州連合ガイドライン（2010年9月22日付欧州議会・理事会指令2010/63/EU）に準拠した。Long Evans ラットを用いた電気生理学的実験は，ドイツ動物保護法（TierSchG）に基づき実施し，現地当局の承認を得た（ROB-55.2-2532.Vet_02-16-170）．生体適合性評価のために Sprague Dawley ラットを用いた実験手順は、1986 年英国動物（科学的手順）法に従って実施され、内務省およびマンチェスター大学の現地動物倫理審査グループによって承認された。ラットは標準的な条件（室温22±2℃、12：12時間の明暗サイクル、10：00に点灯）で飼育し、餌と水は自由に摂取できるようにした。
電気生理学的測定のためのグラフェンセンサーアレイの埋め込み
Garcia-Cortadella et al.34に記載されているように、体重580gの成体Long EvansラットをMMFで麻酔した（Midazolam 2 mg/kg, Medetomidin 0.15 mg/kg, Fentanyl 0.005 mg/kg）。MMF導入1時間後、ラットの麻酔状態を維持するためにイソフルランを1％添加し、メタミゾールを110mg/kgで投与した。頭部後背部を剃毛し、ポビドンヨードで皮膚を局所的に消毒し、局所麻酔薬ブピバカインを皮下に浸潤させた。その後、皮膚を切開し、鈍的剥離により頭蓋骨背面を丁寧に洗浄した。乾燥した頭蓋骨を紫外線硬化型接着剤Optibond（Kerr）で覆い，3DプリントしたベースリングをネジとMetabondセメント（Parkell）で頭蓋骨に固定した．
最大幅5 mmの左右対称の開頭術を行い，前後軸はBregmaに対して+2 mmから-8 mmの範囲に伸ばした．硬膜はこれらの開頭内で切開され除去された．さらに小脳の上に1×1 mmの開頭術を施した．すべての開頭を混合比1：10の予備重合ポリジメチルシロキサン（PDMS）（Sylgard 184, Dow Corning, USA）で覆い、Vetbond（Animal Care Products, USA）で密封した。インプラント周囲の皮膚縁を縫合し、インプラントを保護キャップで閉じた。
1週間の回復後、イソフルラン麻酔（5％導入1％維持）下でg-SGFETアレイを移植した。右半球を覆うポリマーを部分的に開き、横にばたつかせた後、アレイは右半球の後面（ブレグマから約7～2mm）を覆うように配置され、咽頭表面に置かれた。さらに、2本のPt-Irワイヤーをg-SGFETアレイの両脇に植え付けた。1本はアレイの近位に、もう1本は反対側の半球の遠位に埋め込んだ。ポリマーカバーは、g-SGFETアレイのフレキシブルケーブルが残りのスリットを通って離れるように所定の位置に戻ってフラップされた。切開したポリマーとアレイの両方を覆うために第2のPDMSカバーを用い、VetbondとEvoflow（Ivoclar Vivadent、Lichtenstein）で頭蓋骨に固定し、シリコンジェル3-4680（Dow Corning、米国）で密封した。最後に、神経活動を記録するための基準として、Ag/AgCl電極を小脳に接触させた。
生体適合性評価のためのグラフェン、白金、およびPIデバイスの埋込
Sprague Dawley ラット（200-280 g）を 100%酸素中でイソフルラン吸入（通常、導入は 3.5%、維持は 1.5～2.5%） して麻酔をかけた。動物の頭頂部を剃毛し、動物を歯と耳の棒を固定した定位フレーム内に位置づけた。動物を加熱毛布上に置き、足にパルスオキシメーターを装着し、直腸プローブを挿入して体温をモニターした。Viscotears liquid gel (Bausch & Lomb, UK)を眼に塗布し、処置中の保護を行った。麻酔の深さは、ペダル反射がないことで確認し、手術中も維持した。すべての実験動物にブプレノルフィン（0.03 mg/kg）の皮下注射を行った。頭部はヨウ素で拭き取り、大きなフラップ状の皮膚を切除して頭蓋骨を露出させたが、側頭筋は露出させなかった。骨膜はボーンスクレーパーで除去した。除去した組織の周囲の皮膚をVetbond tissue adhesive (3 M, UK)を用いて骨に接着剤で固定した。高速外科用マイクロドリルを用いて開頭（～4mm x 6mm）を行った。ラムダは、矢状静脈洞を避けるために、正中線から少なくとも1mm外側に位置する開頭用の後方基準として使用された。穿孔部位は熱による損傷を防ぐため、定期的に生理食塩水で洗浄した。開頭境界周辺の骨が十分に薄くなったら、圧縮空気を用いてすべての骨削片およびその他の破片を除去し、骨フラップを静かに取り出した。皮質表面はリンゲル液を用いて湿潤状態に保たれた。先端を90°に曲げた細い針で硬膜を皮質表面から静かに持ち上げ、別の針で硬膜にスリットを入れ、血管を避けるように慎重に位置決めした。細い鉗子を用いて開口部の隣の硬膜を持ち上げてポケットを作り、デバイスを皮質表面に注意深く配置した。その後、硬膜の位置を変えて、デバイスを固定した。適切なサイズのガラス窓（UQG Optics, UK）を開頭部を埋めるように配置し、歯科用セメント（Superbond C&B, Prestige Dental）を使用して固定した。動物には0.9％生理食塩水（1 ml）の皮下注射を行い，麻酔が切れるまで回復ケージに入れた．
生体適合性評価のための行動試験
すべての動物で、5週齢時に手術前の行動ベースラインを取得した。1週間後、すべての動物を、グラフェン電極、白金電極、ブランク電極、偽手術（電極を埋め込まない）、ナイーブ（手術をしない）の5つのグループのいずれかに割り付けた。そして、術後2週間、2週間と6週間、6週間と12週間という1つまたは2つのタイムポイントで動物をテストした。タイムポイントは、ISO 10993の定義に沿って選択された。ここで、長期暴露は24時間以上30日未満、永久暴露は30日以上と定義されている（ISO 10993-6:2007）。
NORに初めて暴露する前に、試験前日にラットを空のアリーナに20分間ケージメイトと一緒に入れ、順応させた。プレキシガラスの正方形の箱(底辺52cm、高さ30cm)は、床が白、壁が黒であった。実験開始前に動物をNORアリーナに3分間入れ、アリーナ内に物がない状態で馴化させた。NORテストはトレーニングトライアルとテストトライアルから構成され、トライアル間の時間を隔てて行われる。訓練では、同じ形と大きさの2つの瓶など、2つの同じ物体がアリーナ内に置かれた。テストでは、訓練時と同じものと、缶のような全く新しいものの2つがアリーナに置かれる。トレーニングセッションでは、動物をアリーナに入れ、3分間探索させた後、ホームケージに戻した。その後、ホームケージに30分放置した後、テストセッションのためにアリーナに入れ、再びアリーナで3分間自由に探索させた。訓練時と試験時の両方で、動物が対象物に触れている時間を測定した。健康な動物であれば、テスト時に新規物体とのインタラクションに費やす時間はより長いはずである。理想的には、これらの試験はどの動物に対しても3回以上使用すべきではない。したがって、12週間移植群の動物は、ベースライン時、移植後6週間および12週間でNOR試験を行った。他のすべての動物は、犠牲となる前に選択されたすべてのタイムポイントで試験された。
NOR試験のビデオは、オンラインストップウォッチ(http://jackrrivers.com/program/)を用いて盲検化された研究者が手動で採点した。動物は鼻または前足が対象物に触れた場合、その対象物と相互作用したと分類された。2つの物体との相互作用に費やされた時間を分析し、新規物体との相互作用に費やされた時間と既知物体との相互作用に費やされた時間を割って識別比を決定した。識別比が0.5以上であれば、新規物体への選好性があることを示し、正常な認知の兆候であることが示された。
組織採取と処理
移植後2週間、6週間、12週間で、その後の解析の種類に応じた適切な方法で動物を淘汰した。組織学のために、動物は、ヘパリン化生理食塩水を用いた灌流固定、次いでリン酸緩衝生理食塩水（Sigma-Aldrich, UK; D8537）中の4％パラホルムアルデヒド（PFA; Sigma-Aldrich, UK; 441244）の固定を受けた。組織はPFA中で最低24時間保存し、48時間スクロース溶液に移し、凍結してから1匹あたり25μmで40枚の切片を凍結採取した。(i) イオン化カルシウム結合アダプター分子1（Iba1）によるミクログリア集団の定量、(ii) ターミナルデオキシヌクレオチジル転移酵素dUTPニックエンドラベル（TUNEL）染色によるアポトーシス評価、(iii) ヘモティキシリンとエオシン（H&E）による脳組織の総形態の評価、のいずれかのマーカーについて、凍結切片を染色した。組織切片は、0.1％トリトン-Xを含むPBS中の5％ヤギ血清でブロックした後、Iba1一次抗体（1：200、019-19741、Wako）と一晩インキュベートした。可視化にはヤギ抗ウサギAlexa 594二次抗体（1:1000, A11012, Invitrogen）を使用した。免疫蛍光染色された組織については、DAPIカウンターステインを行った後、ProLong Gold mountant (P10144, ThermoFisher) を用いてスライドをマウントした。
TUNEL 染色には、DeadEnd™ Colorimetric TUNEL System（G7360, Promega）を使用し、製造元の指示に従った。TUNEL染色のジアミノベンジジン（DAB）可視化後、スライドはメチルグリーン（0.1％w/v水溶液、Alfa Aesar）でカウンターステインした。H&E染色は、ヘモトキシリン染色時間1分、酢酸リンス、エオシン染色時間30秒を標準として実施した。TUNEL染色とH&E染色の両方のスライドは、DPX mountant（06522、Sigma-Aldrich）を使用してマウントした。スライドは3D Histec Pannoramic250 スライドスキャナーを使用して画像化し、CaseViewer（Version 2.2, 3DHistech Ltd）を使用して画像を解析した。TUNEL陽性細胞は、半球あたり40枚の25μm切片の皮質表面全体でカウントして平均化した。ミクログリア細胞は、前述88のように、グレード0（静止／ramified）、グレード1（脱ramifying／再ramifying）、グレード2（活性化／アメーバ）、グレード3（クラスター化／活性化）の4形態のいずれかに個別に分類された。活性化は、グレード3または4のいずれかである全ミクログリア細胞の割合として決定された。
ELISAのために、動物は、血液を抽出するために心臓穿刺を行う前に、CO2濃度の上昇によって淘汰された。脳組織を抽出し、液体窒素でスナップ冷凍し、さらに使用するまで-80℃で保存した。抽出した血液を採血管（Vacutainer, Becton Dickson, UK）に採取し、室温で15〜30分間凝固させた。このチューブを5000RPM、4℃で10分間遠心分離し、得られた血清上清を回収し、さらに使用するまで-80℃で保存した。ナイーブコントロール群から実行する血清試料が不十分であったので、この群は分析から除外した。脳組織を液体窒素を加えて溶解し、組織を粉砕して粉末にし、これにプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（Halt™ Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, ThermoFisher Scientific）を含むNP-40溶解バッファ（150 mM NaCl, 50 mM Tric-Cl, 1% Nonidet P40 substitute, Fluka, pH 7.4に調節）を添加した。サンプルは5000RPMで10分間遠心分離し、上清はさらに使用するまで-80℃に保存した。IL-17a（437904、Biolegend）、IFN-γ（439007、Biolegend）、TNF-α（438204、Biolegend）、およびIL-6（437107、Biolegend）という4つのサイトカイン用のELISAキットが使用された。4つのキットすべてについて、製造元の指示に従った。
モーションキャプチャと行動状態の分類
ラットは100×100cmの記録用アリーナで自発行動を24時間まで記録し、事前に馴化させた。記録中は餌と水を自由に摂取することができた。モーションキャプチャ（Mocap）システム（Optitrack）は，受動反射マーカーと8台のカメラを用いて，動物の頭部の動きを3次元空間上で追跡するものである．4個の反射型マーカーを保護帽に固定し、その位置を平均化することで頭部の3次元的な位置と向きを推定した。3次元での瞬時の頭部速度は空間座標のモジュラスの時間微分として計算された．Mocapデータの解析には、Motive 2.2ソフトウェアを使用した。
行動を能動的か非能動的かに分類するために、ヘッドスピードが100mm/sを超える期間を能動的とした。第二段階として、5秒未満のアクティブ期間はスキップされ、5秒未満のアクティブ期間のギャップは隣接するアクティブ状態に連結された。このアクティブの定義に当てはまらないタイムポイントは、非アクティブとラベル付けされた。アクティブと非アクティブの比率は、記録期間全体で大きく変化した（1時間あたり6.6%から88.0%の間、平均40.2%±4.7%で、アクティブ）。
リアイベントは、後肢で立たなければならない高さまでの短時間の頭部挙上と定義した。記録中のz高度を目視検査した結果、地面からの高度200mmを閾値とし、区切りの良いリアリングオンセット/オフセットと低いz位置で継続する高さの変動を効果的に分離することにした（補足情報S10を参照）。アクティブ状態とインアクティブ状態は相互に排他的であると定義したが、リアクションイベントはアクティブな運動状態の基質であると考えた。
神経信号の処理と解析
ワイヤレスヘッドステージはMulti Channel Experimenter 2.12.1ソフトウェアを用いて制御し、記録したデータはMulti Channel Data Manager 1.13.1を用いてHDF5形式に変換した。神経データはPython 2.7スクリプトを用いてg-SGFETのトランスコンダクタンスに従って校正し、データ探索のためにNeuroscopeソフトウェアにエクスポートした（データおよびコードの利用可能性に関する記述を参照）。神経信号の解析は、Matlab 2016bスクリプトを使用して実施された（コード利用可能性ステートメントを参照のこと）。
脳状態の分類
脳の状態を分離するために、上皮アレイの2つのチャンネルが選ばれた。1チャンネルはアレイの後方領域から選択され、海馬形成の上と推定され、顕著なシータ振動を示す。もう1つのチャンネルは前頭部から選択し、高電圧スピンドルの発現が最も顕著な体性感覚皮質の領域とその近傍から記録した。パワースペクトルは、1Hzから200Hzの範囲で、4秒窓を0.5秒ステップでスライドさせるマルチテーパー法を用いて、白くしたLFP信号から計算した。まず、デルタ（1-4 Hz）、アルファ、ベータ（10-25 Hz）のパワーの合計のzスコアが-0.1を超える期間を徐波（SW）状態と同定した。5秒未満のギャップは、隣接する期間と連結された。
非活動的な運動状態と一致し、最後に先行した高電圧紡錘体（HVS）イベントから10秒以上離れたSW状態を徐波睡眠（SWS）と定義した。先行文献に従い、無麻酔ロングエバンスラットのHVSと深部徐波睡眠は非互換であると仮定した84。HVSはθ波と周波数が近いが、強く非正弦波的な波形のため、複数の高次高調波を表現する点で顕著な違いがある。このため、HVSエピソードを選択的に検出し、シータ活動と区別するために、HVS参照チャンネルの20～50Hzの周波数帯域のスペクトルパワーを使用した。20から50Hzのマルチテーパーのパワースペクトルの平均を計算し、その後zスコアをつけた。z スコア値が 0.7 を超える周期を HVS とした。1秒未満のHVS候補期間は、生理学的性質が不明な時折の鋭い単一波過渡現象による偽陽性を最小限に抑えるためにスキップされた。個々のHVSイベントのスペクトルプロファイルは、アーチファクト汚染を除去するためにポストホック分類された。ピークパワーのオンセットとオフセット、最初のスペクトルピークの瞬時周波数とパワーを各イベントから抽出した。
シータ状態は、シータ基準チャンネルのシータ (5-9.5 Hz) とデルタ (2-4 Hz) 範囲のパワー間の比率に基づいて定義された。10秒未満のギャップは、隣接するシータ期間と連結された。非活動的な運動状態と一致するシータは、非活動的シータとラベル付けした。1秒以内にSW状態が先行し、5秒以上の非活性シータ期間はすべてREM睡眠とした。残りのシータ期間はすべて覚醒シータとした。最後に、SWSでもREMでもなく、覚醒シータでもないすべての期間を覚醒非シータと定義した。NREM睡眠中に低振幅のマイクロステートが存在することは、以前から報告されていることに留意すべきである89。本研究でAwake-Nonthetaに割り当てられたSW範囲の低振幅の期間のサブセットが、宮脇ら89によって低活性睡眠マイクロステートとして定義された状態にどの程度対応するかは、まだ確定していない。
すべての状態は、HVSを除いて相互に排他的であると考えられ、HVSは進行中の背景状態の間に発生するが中断されない事象とみなされた。したがって、各HVSエピソードについて、その直前と直後の脳の状態が同じ状態に属している場合は、それらを統合した。すべてのスペクトル解析は、マルチテーパー推定90のカスタム開発されたMatlabの実装を使用して実行された。g-SGFETの性能の解析はPythonで行われた。ISAブレインダイナミクス解析は、モーションアーチファクトが低速ゆらぎに与える潜在的な影響を排除できる、無動とレム睡眠に限定された。
統計解析
g-SGFETs性能の歩留まりと均質性の評価のために、各64 g-SGFETsと9神経プローブは、in vitroで特徴づけされた。このデータは図2の箱ひげ図にプロットされており、箱は中央値に線を引いて、下位四分位値から上位四分位値まで伸びています。ひげは四分位範囲の1.5倍に伸び、ひげを越えたデータポイントはドットで示されている。g-SGFETのインビボ安定性の縦断的評価は、ラットの大脳皮質に移植された1つの64チャンネルアレイで行われた。図3に示す箱ひげ図は、図2におけるものと同様に定義されている。図3のパネルa及びeにおいて、統計的サンプルは、ヘッドステージのDC結合チャンネルに接続された8個のg-SGFETすべてである。図3のパネルdとfは、アレイ上のすべての64 g-SGFETに対応しています。最後に、パネルgは、双極刺激中に最も高い誘導電界の下の位置上の10g-SGFETの正規化された応答を示す。
生体適合性評価のために、白金、グラフェン、ポリイミド（ブランク）の3種類のデバイスを作製した。これらの各グループのラットは、脳の頭頂皮質に3種類のデバイスのうちの1つを移植された。第4のグループの動物は、いかなるデバイスも移植することなく完全な手術を受け（シャムコントロール）、第5のグループ（ナイーブ）は、手術を受けなかった。NOR試験において、使用したラットの数は、12週を除くすべての時点において、すべてのグループでn = 7であり、グループによってn = 3〜7であった。脳組織のサイトカイン検出については、移植後2週間と6週間でn＝4、12週間でn＝3のラットを使用した。ミクログリア活性化については、ラット数は2週と12週でn＝3、6週でn＝2（対側半球は3）であった。また、いずれの場合も、対照として対側半球を評価した。n=3以上のデータは、すべての時点と介入を比較するために二元配置分散分析で解析された。その後、各時点で、各手術介入を対照と比較するDunnettの多重比較が行われた。*p < 0.05, **p < 0.005, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 は、図4で各外科的介入について示されている。
飼育中のガンマ活動変調の測定は、1匹のラットの24時間の記録の過程で測定された163の飼育イベントに対して評価された。また、同じ24時間の記録中にHVSも測定された。不動時に560イベント、REM睡眠時に92イベントが検出された。HVSのスペクトル含有量の差は、Wilcoxon Ranksum検定によって評価した（p値は本文中に示した）。電気生理学的データは、1匹のラットに対応する。イベントの統計的サンプルが多いため、グラフェンベースの技術の能力を説明することができるが、これらの結果の解釈は、測定や動物間のばらつきに左右されるはずである。
レム状態対SWSによるISAパワーの変調は、2つの方法で評価された。第二に、SWS-REM遷移時だけでなく、両状態の全期間にわたってISAパワーを評価した。REM状態とSWS状態のISAパワーの比較は、40秒以上持続する44のREMエピソードに限定した（補足情報S12Bを参照）。状態遷移に伴う周波数特異的な変化を調べるために、各周波数ビンについて、SWS-REM遷移前30秒と後30秒の試行にわたるスペクトルパワー中央値の分布を比較した。有意性は各周波数ビンについて並べ換え検定で評価した（n = 1000並べ換え、図5dの例チャンネルとすべてのワーキングDCチャンネルについての補足情報S12Cを参照）。SWS-REM移行時のISAの増加および1-4Hzの同時減少が、順列検定後（n = 1000順列）、図3a、eの経時的評価と同じ、S/Nが悪いため除外した1チャネルを除くすべてのDCチャネルで有意である（補足情報S12C）。次に、SWS状態とREM状態におけるISA（0.01-0.1Hz）帯域の積算電力の分布の統計的差異をウィルコクソン順位和検定を用いて検定した（図5e参照、各チャンネルの検定結果は補足情報S12Dに記載）。
DC信号由来のISAおよびLFP位相によるLFPパワーの変調は、ISAまたはLFPの好ましい位相に対するLFPパワー変調の強さを反映する大きさについて、それぞれの帯域72の平均LFPパワーで正規化した瞬時低周波位相ベクトルの瞬時速い周波数パワー重み付け結果長を用いて定量化された。ISAとLFPの位相とLFPパワーは、それぞれ0.04と0.4Hzの帯域幅でバンドパスフィルターをかけたそれぞれのACとDCチャネル信号の解析信号の角度と絶対値として計算された。変調の有意性は、互いに100秒までランダムにずらした1000組の代理位相パワーに基づいて検証された。得られた経験的p値は、誤検出率制御手順に従い、誤差0.001で補正された。シータおよび紡錘体パワーバンド変調のトポグラフィーマップの作成には、LFPパワーバンド8-9Hz（シータ）および10-14Hz（紡錘体バンド）の平均変調強度と、すべてのACチャンネル（LFPパワー）および前頭・内側DCチャンネル（ISA位相）について計算したISA位相周波数0.05-0.1Hzが使用されました。
報告書の概要
研究デザインに関する詳細な情報は、この記事にリンクされているNature Research Reporting Summaryをご覧ください。
データの入手方法
デバイスの特性評価と電気生理学的な生データの例は、GINリポジトリで識別子(https://doi.org/10.12751/g-node.4zw2lt)を付けて入手可能である。電気生理学的データ一式は、適切な要求があれば、対応する著者から入手可能である。ソースデータは本論文に添付されています。
コードの入手
デバイス特性解析のためのカスタムコードは、GINリポジトリに識別子(https://doi.org/10.12751/g-node.4zw2lt)をつけて提供しています。電気生理学的データ解析のための完全なコードは、対応する著者から要求があれば入手可能である。
変更履歴
2021年4月30日 本論文の訂正を掲載しました。https://doi.org/10.1038/s41467-021-23078-z
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謝辞
本研究は、欧州連合の研究・イノベーションプログラム「Horizon 2020」の助成契約番号732032（BrainCom）およびグラフェン・フラッグシップ助成契約番号785219（GrapheneCore2）および881603（GrapheneCore3）の助成を受けています。ICN2は、スペイン研究庁（AEI、助成金番号SEV-2017-0706）が出資するSevero Ochoa Centres of Excellenceプログラム、およびCERCA Program/Generalitat de Catalunyaから支援を受けています。R.G.C.は、国際博士課程プログラムLa Caixa-Severo Ochoa (Programa Internacional de Becas "la Caixa"-Severo Ochoa)による支援を受けています。この研究は，MICINNとICTS "NANBIOSIS "によって部分的に支援されているスペインICTSネットワークMICRONANOFABS，特にIMB-CNMのCIBER in Bioengineering, Biomaterials, and Nanomedicine (CIBER-BBN) のマイクロ・ナノ技術ユニットが利用されている。本研究は、スペイン「Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades」、「Agencia Estatal de Investigación（AEI）」、「Fondo Europeo de Desarrollo Regional（FEDER/UE）」が資金提供するプロジェクト FIS2017-85787-R 内のものである。A.S.とG.S.はBundesministerium für Bildung und Forschung [助成番号01GQ0440]の支援も受けた。R.G.C.は、この研究がバルセロナ自治大学の電気・通信工学の博士課程の枠組みの中で行われたことを認めます。モーショントラッキングデータの前処理を手伝ってくれたEduardo Blanco Hernándezに感謝する。
著者情報
著者ノート
これらの著者は等しく貢献した。R. Garcia-Cortadella, G. Schwesig.
著者および所属
カタルーニャ・ナノサイエンス・ナノテクノロジー研究所（ICN2）、CSIC and BIST、Campus UAB, Bellaterra, 08193, Barcelona, Spain
R. ガルシア-コルタデラ、K. コスタレロス、J. A. ガリード
ミュンヘン計算神経科学バーンスタインセンター、ルートヴィヒ・マクシミリアン大学医学部、ドイツ・プラネッグ・マルティンスリード
G. シュヴェシグ & A. シロタ
マルチチャンネルシステムズ（MCS）GmbH、ドイツ・ロイトリンゲン
C. イェシュケ
バルセロナ微小電気研究所、IMB-CNM（CSIC）、エスフェラUAB、ベラテラ、スペイン
X. イラ、E. マスヴィダル-コディナ、A. ギメラ-ブリュネ
スペイン、マドリッド、バイオインジェニア・バイオマテリアル・ナノメディシナ研究センター（CIBER-BBN)
X. Illa, E. Masvidal-Codina & A. Guimerà-Brunet
国立グラフェン研究所およびマンチェスター大学生物学・医学・健康学部ナノメディシンラボ（英国・マンチェスター
アンナ・L・グレイ、S・サベージ、E・スタマティドゥ、K・コスタレロス
英国マンチェスター大学生物学・医学・健康学部生物科学科神経科学・実験心理学部門（マンチェスター、M13 9PT
I. Schiessl
ICREA, Pg. Lluís Companys 23, 08010, Barcelona, Spain
J. A. Garrido
貢献内容
R.G.C.はグラフェンセンサーアレイの作製とin vitroでの特性評価を行い、ヘッドステージの特性評価と電気生理活動の記録・解析に貢献した。G.S.は移植方法を開発し、手術を行った。また、電気生理学的信号の記録と解析に貢献した。C.J.はワイヤレスヘッドステージの設計とアクティブセンサーアレイの操作のためのソフトウエアの設計を行った。X.I.は神経プローブの設計と製作に貢献した。A.G.、S.S.、I.S.、E.S.は生体適合性研究のための実験を行った。E.M.は生体適合性試験用デバイスの作製と試験を行った。K.K.，S.S.，A.G.は，生体適合性データの設計と解釈を行った．K.K.とS.S.は、生体適合性研究のためのチーム全体のコーディネートを行った。A.G.B.は、記録システムの設計に貢献した。A.S.は電気生理学的データ取得のための実験をコーディネートし、電気生理学的信号の解析に貢献した。J.A.G. は ICN2 におけるセンサーアレイの製作をコーディネートした。原稿は R.G.C., G.S., S.S., A.S., J.A.G. が執筆した。
協力者
A. Sirota または J. A. Garrido 宛てにご連絡ください。
倫理に関する宣言
利益相反CSIC、ICREA、CIBER、ICN2、IDIBAPSによる電気生理信号測定用グラフェントランジスタシステムに関する特許出願（番号P201831068）、本論文の共著者である発明者はA.G.B., X.I., E.M., J.A.G. です。
その他の情報
査読情報 Nature Communicationsは、Jonathan Viventiおよびその他の匿名の査読者の方々による本論文の査読への貢献に感謝します。査読レポートをご覧ください。
出版社からのコメント Springer Natureは、出版された地図や所属機関に関する管轄権の主張に関して、中立的な立場を維持しています。
補足情報
権利と許可
オープンアクセス この記事はクリエイティブ・コモンズ 表示 4.0 国際ライセンスの下に提供されており、原著者と出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更を加えたかどうかを示す限り、あらゆる媒体や形式での使用、共有、適応、配布、複製が許可されています。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、素材へのクレジット表示で別段の指示がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれます。素材が記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれておらず、あなたの意図する利用が法的規制により許可されていない場合、または許可された利用を超える場合は、著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。