グラフェン系材料の構造-活性相関。グラフェン系材料の構造-活性相関：表面化学、表面比表面積、横方向サイズが体外毒性に与える影響
Salma Achawi, Bruno Feneon, [...], and Valérie Forest
学際電子出版協会（MDPI)
元記事はこちら。
論文追加情報
関連データ
補足資料
nanomaterials-11-02963-s001.zip (292K)
GUID: 4B043528-7358-49C3-AF09-E21E6D6E9CFF
データの利用可能性に関する声明
本データは、対応する著者からの合理的な要求により利用可能です。
要 旨
ナノ材料の数が増え、従来のケースバイケースの毒性評価では手に負えなくなったため、毒性予測や構造活性相関（SAR）が注目されている。グラフェン系材料（GBM）は、この10年間で最も有望なナノ材料の一つであり、その応用によっていくつかのイノベーションがもたらされる可能性がある。しかし、その毒性への影響は十分に評価される必要がある。
この点に関して、我々は22種のGBMについて、完全な物理化学的特性評価およびin vitro毒性評価（RAW264.7細胞上）を行うことにより、その潜在的SARを調べる研究を実施した。
使用したのは、横方向のサイズ（0.5～38 µm）、比表面積（SSA、30～880 m²/g）、表面酸化度（2～17％）が変化するGBMです。その結果、還元型グラフェン酸化物（RGO）はグラフェンナノプレートレット（GNP）よりも反応性が高く、GBMの表面化学と表面欠陥密度が生物学的影響に果たす役割を明らかにする可能性があることが確認された。
また、GNPの場合、横方向のサイズが小さいほど、高い細胞毒性を示すことも確認された。
最後に、200 m²/g以上のSSAを示すGBMは、より高い活性酸素の産生を誘導することがわかった。そのメカニズムについては、考察の中で提案されています。
結論として、大規模なサンプルの物理化学的特性評価と標準化された毒性評価の組み合わせにより、SARを明らかにし、セーフバイデザインGBMへのさらなるステップを提供することができました。
キーワード：グラフェン系材料、構造活性相関、毒性、セーフ・バイ・デザイン
1. はじめに
ナノ毒性学は、約20年前に出現し[1]、それ以来、ナノ材料の数は指数関数的に増加している[2,3]。多くのナノ材料は、エレクトロニクス [4]、光学 [5]、さらに生物医学 [6]など、様々な産業分野で興味深い可能性を秘めています。しかし、これらの材料の潜在的な危険性により、これらのアプリケーションのほとんどはまだ実現されておらず、特に職業暴露に関する多くの懸念があります[7,8]。したがって、ナノ材料のリスクを評価することは、公衆衛生にとって絶対的に必要であるだけでなく、科学と産業の進歩の可能性を秘めた多くの道を開く可能性がある。リスク評価は、曝露とハザードの特性評価という 2 つの主要なステップで構成される[9]。この作業では、ハザード評価に焦点を当てる。
ナノマテリアルのハザード評価は、国によって異なる場合がある。しかし、特に職業暴露の場合、in vivo試験が必要であることが多いと言ってよい。ナノ材料は非常に数が多く、その毒性を個別に評価することは、費用と時間がかかりすぎるため、不可能である。さらに、多くの科学者は、動物実験の使用を減らし、in vivo試験が不可欠でない場合には、代替的なアプローチに焦点を当てようとしている[10]。これらの代替アプローチは、グループ化[11]やリード・クロス[12]など、過去10年間に出現しています。構造活性相関（SAR）の研究は、新しい展望を開くもう一つの方法であり、現在、規制目的のための関連する代替方法として考えられています[13]。ナノ材料の毒性は、その物理化学的特性に依存します[14]。特に、サイズ、分布、凝集状態、形状、結晶構造、化学組成、表面積、表面化学、表面電荷、多孔性が最も重要である [15]。どの物理化学的特性が特定の生物学的エンドポイントにどのように影響を与えるかを知ることは、セーフバイデザイン・ナノマテリアルを目指す第一歩となるであろう[16,17]。
グラフェン系材料（GBM）は2004年に単離され[18]、以来、多くの注目を集めている。他のナノ材料と同様に、その応用可能性は非常に重要であり、電池 [19,20]、エレクトロニクス [21]、さらには電子皮膚 [22] など、数多くのイノベーションにつながる可能性がある。GBM には、酸化グラフェン（GO）、還元酸化グラフェン（RGO）、グラフェンナノプレートレット（GNP）、グラフェン量子ドット（GQD）など、すべてグラフェンから派生したさまざまな材料が含まれる。これらの材料は、そのサイズ、酸化状態、または厚さによって異なる場合がある[23]。
GBMの潜在的な毒性は、まだ完全には明らかにされていない。毒性が極めて低いと思われるGBMがある一方で、毒性の非常に強い兆候を示すものもある。炎症 [24] や細胞毒性 [25] も、いくつかのGBMで強調されています。GBMの毒性は、例えばそのサイズ [26]、形状 [27]、または酸化状態 [28]によって異なることが知られています。
しかし，これらの SAR は特に複雑であり，物理化学的特性評価と標準化された毒性アッセイの両方が欠如しているため，利用可能な文献では現在のところ明確な概要を把握することはできない[29]．
本論文では，22 種類のサンプルを用いて GBM の潜在的な構造活性相関を探索することを提案する．我々は，これらすべてのナノ材料の物理化学的特徴を完全に把握し，in vitro 毒性（細胞毒性，炎症性反応，酸化ストレス）を探索した．そして、物理化学的特徴と毒性エンドポイントとの間の潜在的相関関係を調査し、構造活性相関の可能性を強調した。
2. 材料と方法
2.1. ナノマテリアルと物理化学的特性評価
これらの試験サンプルは、すべて 5 つの異なるサプライヤーから入手した工業用市販材料である。これらの試料には、合計 22 種類の GBM が含まれる。15個のGNPと7個のRGOである。比表面積は、BET法（窒素吸着法、脱気装置付き Micromeritics, Norcross, GA, USA）で測定した。表面酸化は，XPS (X-ray Photo Spectroscopy, Quantera Scanning XPS microprobe, Physical Electronics, Chanhassen, MN, USA) によって測定した．横方向のサイズは電子顕微鏡（電界放出型走査電子顕微鏡、日本電子、東京、日本）で決定した。表面欠陥は，ラマン分光法（XploRA，堀場製作所，日本，京都）を用いて算出したID/IG強度比を用いて評価した．比較のため，カーボンブラック2試料とアモルファスシリカ1試料についても試験を行った。
2.2. 毒性評価
2.2.1.細胞培養
RAW 264.7 マウスマクロファージ細胞株は、ATCC Cell Biology Collection (Promochem LGC, Teddington, UK)から提供された。これは、Albeson Murine Leukemia Virusによって形質転換されたマウス腹膜マクロファージから得られたものである。この細胞モデルを選択した根拠は、マクロファージが免疫系の一部であるユビキタス細胞であり、したがってナノ材料への曝露時に最初の応答者として作用するという事実に基づいている[30]。マクロファージは、食作用によって異物を認識・除去する役割を担っている。細胞は、10%の子牛胎児血清と1%のペニシリン-ストレプトマイシン（Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany）を添加したダルベッコ変法イーグル培地 （DMEM, Invitrogen, Waltham, MA, USA）（完全DMEM、cDMEM）で培養し、5%二酸化炭素加湿雰囲気下で37℃に維持された。細胞は、曝露の前日に96ウェルプレートに播種した。
2.2.2. ナノ材料への細胞曝露
この曝露プロトコルは、LDH、TNF-α、および DCFH-DA のアッセイに使用された。ナノ材料の高濃度（1600 µg/mL）ストック溶液を脱イオン水中で調製した。このストック溶液をボルテックスで分散させ、以下に示すように2段階の超音波処理を行った。
Vortex TopMix FB15024 Fisher Scientific (Hampton, VA, USA)-Mode: continuous-Frequency: 40 Hz-Room temperature-Time: 60 s.
Ultrasonicate Bath Fisher Scientific Bioblock (Hampton, VA, USA)-温度：20℃-周波数：130 Hz-パワー：100％-時間：15分。
Branson S-450 Sonicator, without probe (Emerson, Saint Louis, MO, USA)-Program: プログラム：2秒パルス+2秒インター-70%で10分、その後85%で5分。
次に、ナノマテリアルハザードの in vitro 評価に推奨される最終曝露濃度 15、30、60、120 µg/mL になるように、ストック溶液を cDMEM で希釈した [31]。これらの溶液を RAW264.7 細胞に添加した。
2.2.3. 細胞毒性
細胞膜の完全性を評価するため，CytoTox-96™ Homogeneous Membrane Integrity Assay（Promega, Charbonnières-les-Bains, France）を用いて，上清中の細胞質乳酸脱水素酵素（LDH）放出を製造者の説明書に従って評価した．サンプルの光学密度は、450 nm に設定したマイクロプレートリーダー（Multiskan RC; Thermolabsystems, Helsinki, Finland）を用いて測定した。3回の独立した実験をそれぞれ4重で行い、放出されたLDHの活性を、陰性対照細胞（ナノ粒子なしでインキュベート）の活性と比較して報告した。陽性対照は、細胞溶解後に放出された最大細胞性LDHから構成された。
2.2.4. 炎症促進反応
ナノ粒子とのインキュベーション後、上清中のTNF-αの産生を、市販のELISAキット（Quantikine® Mouse TNF-α Immunoassay; R&D Systems, Lille, France）を用いて、製造者の説明書に従って評価した。450 nmに設定したマイクロプレートリーダー（Multiskan RC; Thermolabsystems, Helsinki, Finland）を用いて各サンプルの光学濃度を測定した。標準曲線が確立され、結果は上清1ミリリットルあたりのTNF-αのピコグラムで表された。3つの独立した実験をそれぞれ4重で行い、TNF-αの産生を対照細胞（ナノ粒子なしでインキュベート）の産生に対して報告した。
2.2.5. 活性酸素の生成
OxiSelect™ ROS Assay Kit (Euromedex, Mundolsheim, France) を用いて、さまざまな活性酸素の活性を評価することができる。このアッセイは、細胞膜を容易に拡散する非蛍光性基質2.7′-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテートを活性酸素の存在下で蛍光性分子2′.7′-ジクロロジヒドロフルオレセイン（DCF）に変換し、蛍光量が活性酸素レベルに直接関連することを利用している。蛍光は、ナノ粒子と細胞を90分または24時間インキュベートした後、Fluoroskan Ascent蛍光計（Ex: 480 nm, Em: 530 nm, Thermolabsystems, Helsinki, Finland）を用いて検出された。ポジティブコントロールとして、細胞を H2O2 (1 mM) と共にインキュベートした。3つの独立した実験がそれぞれ二重に行われ、活性酸素の生成は、陰性対照（ナノ粒子なしでインキュベートした細胞）のものに対して報告された。
2.2.6. FRAS測定
FRAS（Ferric Reduction Ability of the serum）アッセイは、血中ヒト血清に対するナノ材料の生物学的酸化ダメージを測定するものである。簡単に言えば、ナノ材料（または他の化学物質）にさらされた血清サンプルの、第二鉄イオンを第一鉄イオンに還元する能力を測定するアセルラーアッセイである。生体マトリックスの還元能は、その抗酸化能を近似することができます[32]。この試験法については、別の場所で説明されており[33]、最近、我々のチームによって、GBMに対するこの試験の実現可能性を研究する作業が行われ、完全な最適化プロトコルが説明されています[34]。
2.2.7. 毒性分類
LDH、TNF-α、および ROS 試験について、以下のように毒性分類を実施した。
毒性なし：最高用量（120 µg/mL）でも陰性対照と比較して有意な反応がない。
高LOAEL（Lowest Observed Adverse Effect Level）：暴露量が120μg/mLまたは60μg/mLと高い場合、陰性対照と比較して有意な反応が見られる。なお、簡略化のため、このクラスは「中程度の毒性」と表記しています。
低 LOAEL：暴露量が低い場合、陰性対照と比較して有意な反応が認められる：15 µg/mL または 30 µg/mL. なお、簡略化のため、このクラスは「高毒性」と表記しています。
次に、毒性を示さない試料と毒性を示す試料を比較しました（中毒性と高毒性のグループ分け）。
なお、FRAS試験については、試験方法や暴露濃度が異なるため、毒性分類は別の方法で行っています。
最低暴露量（5 g/L）での反応が30 mMTEUを超えない場合、低FRAS効果を宣言した。
中程度のFRAS効果は、最低暴露量（5 g/L）での反応が30～60 mMTEUであった場合に宣言された。
高FRAS効果は、低暴露量（5 g/L）での反応が60 mMTEUを超えた場合に宣言された。
3. 結果
3.1. ナノ材料の物理化学的特性評価
試験サンプルの主な物理化学的特徴を表 1 に報告する。誘導結合プラズマ分光法（ICP, SPECTRO, Kleve, Germany）の結果は、補足データ（表S1）に、完全なXPS分析（表S2）とラマンスペクトル（図S1）に示されている。また、試料の平均横サイズと比表面積の分布をそれぞれ図S2、図S3に示す。
表1
22種類のGBM、2種類のカーボンブラック、1種類の非晶質シリカの物理化学的特徴。
3.2. 毒性評価
毒性評価の全結果を示した表は，補足資料（表 S3）に掲載されている．
細胞毒性（LDH Release Assay） GBM タイプによる細胞毒性分類を図 1 に示す。2.2.7 節で示したように，GNP と RGO を分離し，その毒性分類を検討した．細胞毒性分布は、GBMの種類によって明らかに影響を受けていないように見えた。また、RGOは43％、GNPは47％が細胞毒性を示さなかった。しかし、GNPはほとんどが中程度の細胞毒性を示したのに対し、RGOはほとんどが高い細胞毒性を示した。
図1
GBMタイプによる細胞毒性分類。3回の独立した実験をそれぞれ4重で行い、放出されたLDHの活性を陰性対照細胞（ナノ粒子なしでインキュベート）の活性と比較して報告した後、我々は...と考えた。
次に、GBMの物理化学的特徴とその細胞毒性との間の潜在的な相関を調べた。図2に示すように、GNPの細胞毒性と平均横方向サイズとの間にSARが観察された。RGOでは、このような相関は見られなかった。
図2
GNPsの細胞毒性と横方向サイズとの関係。* p < 0.05 (Student検定)。
図2では、非細胞毒性に分類されたGNPの平均横方向サイズと、中程度または高細胞毒性に分類されたGNPの平均横方向サイズの間に有意差があることが強調されている。実際、非細胞毒性に分類されたサンプルの平均横方向サイズは19.2μmであったのに対し、中程度および高細胞毒性GNPは、それぞれ平均横方向サイズが4.1μmと1.4μmであることがわかった。非細胞毒性GNPは0.7 µmから38.6 µmの間でさまざまな横方向のサイズを有していた。しかし、15 µm以上の横方向のサイズを示した4つのサンプルは、すべて非細胞毒性に分類されました。
まとめると、RGOは高い細胞毒性を示すのに対し、GNPはほとんどが中程度の細胞毒性に分類される。GNP では、最も大きな試料（15 µm から 40 µm）は非細胞毒性に分類される可能性が高く、最も小さな試料（5 µm 未満）は大部分が中程度または高い細胞毒性に分類された。
炎症促進反応（TNF-α ELISA Assay） 図3では、GBMの種類によって異なる炎症促進反応が観察されました。GNPの53%、RGOの14%は炎症反応を示さないが、GNPの40%、RGOの86%は炎症反応を強く示した。
図3
GBMタイプに応じた炎症反応の分類。3つの独立した実験をそれぞれ4重で行い、TNF-αの産生を対照細胞（ナノ粒子なしでインキュベート）の産生に報告し、次に...。
要約すると、大多数のRGOは高い炎症反応を引き起こしたが、ほとんどのGNPは炎症反応を起こさなかった。表面化学の影響を除けば、炎症反応というエンドポイントに関わる他の構造活性相関は観察されなかった。
3.2.3. 酸化ストレス
活性酸素産生（DCFH-DAアッセイ） 図4a,bに、GBMファミリーに応じた活性酸素産生（曝露90分、24時間）を示す。GNPのみ（両曝露時間とも53％）は、活性酸素の産生を誘導しなかった。一方、RGOの大部分（90分暴露で57％、24時間暴露で100％）は、高い活性酸素の生成を引き起こすと分類された。これらの結果は、活性酸素の生成に関してGNPとRGOの間に大きな違いがあることを強調し、細胞毒性に関しては、酸化ストレスはGBMの化学的性質に依存することを実証している。
図4
90分（a）または24時間（b）暴露後のROS産生の分類は、GBMの種類によって異なる。3つの独立した実験をそれぞれ二重に行い、ROSの産生を対照細胞（ナノ粒子なしでインキュベート）のそれ、...に報告した。
また、GNPの暴露時間と比表面積の両方において、ROS産生の間にSARがあることを強調した。この SAR は、図 5a,b に示されている。SSAが増加すると、ROS産生が増加するように見えた。この傾向は、90 分間の暴露では特に明確で統計的に有意であるが、24 時間の暴露では少しぼやけているように見える。しかし、いずれの暴露時間においても、高ROS生成と判定された試料は、ROS生成のない試料よりも比表面積が大きいことがわかった。RGOについては、このような相関は強調されていない。
図5
90分（a）または24時間（b）暴露後の活性酸素生成量と比表面積の構造活性相関。* = p < 0.05 (Student検定)。
図6では、すべてのGBM（RGOとGNP）について、24時間暴露後のROS生成量に対する比表面積と表面酸化の影響を観察した。活性酸素生成に影響を与えない3つの試料、および24時間暴露後に中程度の活性酸素生成しか示さなかった5つの試料は、比表面積が200 m²/g 未満であることが観察される。また、高い活性酸素の生成を誘導した14のサンプルのうち、13のサンプルは比表面積が200 m²/g以上であった。
図6
表面酸化と比表面積が活性酸素生成量に与える影響（暴露24時間後）。
表面酸化については、10%以上の表面酸化を示したサンプルは3つだけであった。この3つのサンプルは、高い活性酸素生成量を誘導すると分類された。しかし、ほとんどの試料は表面酸化が8%未満であり、活性酸素の生成量もまちまちであったため、活性酸素生成量と表面酸化の構造相関活性については結論づけることができない。
要約すると、大多数のRGOは高い活性酸素の生成を引き起こしたが、ほとんどのGNPは活性酸素の生成を引き起こさなかった。GNPsについては、比表面積と活性酸素生成量の間にSARがあることを強調した。
細胞生物学的酸化損傷（FRASアッセイ） FRASアッセイでは、すべてのRGOが高いFRAS効果を引き起こしたのに対し、GNPsのみ（両方の暴露時間において40％）が低いFRAS効果を導いた（Figure 7）。
図7
GBMタイプに応じたFRASの分類。2 つの独立した実験をそれぞれ 3 重で行い、観察された FRAS 効果を陰性対照（ナノ粒子なしでインキュベートした血清）のそれに対して報告し、その後、分布を考慮した...。
この特定のエンドポイントについて、我々はGNPのSSAとFRASアッセイとの間に構造活性相関を観察した（図8）。
図8
FRAS 効果と比表面積の構造活性相関。* = p < 0.05 (スチューデントテスト)。
要約すると、すべてのRGOは高いFRAS効果を引き起こしたが、GNPはほとんど低から中程度のFRAS効果を引き起こした。GNPsについては、比表面積とFRAS効果の間にSARがあることが明らかになった。
4. 考察
GBMの構造活性相関を調べたところ、主に以下のような知見が得られた。
RGOとGNPは同じ毒性を示さなかった。RGOは一般に毒性の影響が大きいようであった。
GNPについては、横方向のサイズが小さくなると、細胞毒性が有意に増加した。
GNPsでは、比表面積が増加すると酸化ストレス（細胞性または細胞性）が著しく増加し、200m²/gを閾値とすることができた。この限界以下では、ほとんどの試料が活性酸素の生成を示さず、低いFRAS効果しか示しませんでした。
このように、RGOは、特に炎症反応と酸化ストレス（ROS産生とFRASアッセイ）に関して、高い毒性シグナルを示す傾向があることが分かりました。これらの観察は、いくつかの発表された結果と一致しています。SkinEthic™（復元したヒト表皮）に対する毒性学的結果を提示した研究 [35] では、GO（表面酸化＜36.6％、横寸法15100 nm）、RGO（表面酸化＜17.7％、横寸法5500 nm）、および数層グラフェン（表面酸化＜3.7％、横寸法171 nm）のFLGといった異なるGBMをテストした。FLGとGOでは生存率の低下は見られなかったが、RGOでは顕著な効果が見られた。さらに、レビュー[36]では、in vivoの結果のグローバルな分析に基づいてさまざまなGBMの毒性を分類し、吸入曝露後、RGOがGNPよりも大きなダメージを与えることを強調した。
これらの知見は、いくつかのパラメータによって説明することができる。GNPは少なくとも10層で構成され、酸化されないのに対して、RGOはより薄く、時には酸化される可能性があります。さらに、その製造プロセスもさまざまである。RGOは、還元型酸化グラフェンであり、さまざまなプロセスで製造することができる。その製造方法は、グラファイトを酸化させ、超音波処理によって酸化グラフェンとする。この製品は、最終製品の毒性に影響を与える可能性のあるさまざまなプロセスを通じて還元されることになる。ある研究 [37] では、熱還元型酸化グラフェン（TRGO）や化学還元型酸化グラフェン（CRGO）など、GBMの毒性学的影響について述べている。その結果、TRGOは、BEAS-2BおよびA459の両細胞に対して、生存率、活性酸素生成、遺伝毒性、およびミトコンドリア障害に関してより高い毒性影響を示すことがわかった。TRGOは、横方向の寸法が小さく（CRGOの250 nmに対して約150 nm）、エッジが鋭いため、（貪食やエンドサイトーシスによって）より内部に取り込まれ、毒性を示すことがわかった。したがって、製造方法はGBMの毒性に大きな影響を与える可能性があります。RGOの製造は，しばしば化学的酸化とそれに続く還元を伴うが，これは，その表面に反応性基が存在し，潜在的に炭素ラジカルを生成することを説明でき，しばしば毒性の生物学的相互作用につながる[38]．さらに、その強い超音波処理と還元工程は、GBMに対してより高い毒性を誘発することがよく知られている鋭いエッジの存在を引き起こす可能性がある。これは、Akhavanらによる研究[39]の結論であり、還元型酸化グラフェンナノウォールは非還元型酸化グラフェンナノウォールよりも高い抗菌効果を示したが、これはエッジの鋭さや電荷移動により細菌膜にダメージを与えたことが原因である。私たちのGNPのID/IG比は0.06から0.72であったのに対し、RGOのID/IG比は0.82から1.06であった。ID/IG比は、表面欠陥密度の測定値です（ID/IG比とともに表面欠陥密度は増加します）[40]。したがって、RGOはGNPよりも多くの表面欠陥を示したと結論づけることができる。これは、上述のように、超音波処理と還元ステップによりシャープエッジと表面欠陥が発生しやすいその製造工程に起因する可能性があります。
我々が証明したGBMの横方向サイズと毒性の関係は、文献で報告されている研究とも一致している。たとえば、最小のグラフェン（29 nm）は、中程度のグラフェン（307 nm）よりも細胞毒性（CCK-8）に高い影響を与えることが報告された[41]。しかし、残念ながらこの論文ではサイズが測定されていない最大のグラフェン（l-G）は、小さいグラフェン（s-G）に匹敵する細胞毒性を示していた。すなわち、超音波処理をしていないものは大きなサイズ（1320 nm）、2時間超音波処理したものは小さな（270 nm）粒子、26時間超音波処理したものは超小型（130 nm）のGOが生成された。主な結論の1つは、横方向のサイズを小さくするほど、より多く内包されることであった。さらに、著者らは、これらの GO の「マスク効果」 が、細胞への取り込みを促進する可能性があり、このマスク 効果は、より小さなフレークに対してより容易であることを 述べた。別の研究 [43] では、hMSCs 細胞を 11、90、418、および 3110 nm の RGO に 24 時間曝露した。最小のRGOは強い毒性（細胞毒性、酸化ストレス、遺伝毒性）の兆候を示したが、最大のRGOは非常に中程度の毒性の兆候を示しただけであった。
一方、別の研究[44]では、サイズが大きくなる（200 nmから1025 nm）3つのGOを、細胞モデル（J774.A1）とin vivoモデル（マウス、腹腔内注射による曝露）でテストした。最も大きなGOは、最も小さなGOと比較して、J774.A1細胞およびマウスに高い炎症性影響を与えた（気管支肺胞洗浄液、血漿および腹膜洗浄液には、より多くの炎症性サイトカインが検出され、炎症細胞がより多く検出される）。全体として、主なメカニズムは、TLR 相互作用による M1 マクロファージの誘導であった。最小の GO は細胞によって急速に取り込まれたが、 最大の GO は大部分がマクロファージ表面に残り、その膜と結合して TLR を活性化した。別の研究 [45] では、200 nm 未満と 5 ～ 15 µm の 2 種類の GO の毒性を比較した。どちらのサンプルも BEAS-2B 細胞に取り込まれたが、最大サイズのものは特に酸化ストレスに高い影響を与え、この傾向は in vivo アッセイで検証された。しかし、この最後の研究では、どちらのサンプルも10 µg/mLから大きな細胞毒性反応（LDHアッセイで測定）を誘導したことに注意してください。この結果を私たちの研究に置き換えると、どちらの材料も高い細胞毒性を持つと分類されるでしょう。結論として、試料の大きさは、その内在化に関連しているようである[46]。GBMは、それが小さいと、容易に内在化されるようであるが、これは、上に引用したいくつかの出版物が報告したように、それらを系統的により有毒にするものではない。実際、内在化と毒性の影響は、たとえ両者がGBMの生物学的結果に強く影響するとしても、個別に検討する必要があります。最後に、細胞モデルの選択、さらにはモデルの種類（in vitroまたはin vivo）により、多くの場合、内在化と毒性作用様式の組み合わせに起因するさまざまな生物学的影響を観察することができます。
小さなGNPは、細胞を突き刺す可能性のある鋭いエッジを多く示す。いくつかのGBMの鋭いエッジは、細胞膜に物理的な損傷を与え、しばしば細胞毒性につながることが分かっている[47]。
上記に引用した出版物で試験されたGBMのサイズは、我々の研究で試験されたものと必ずしも同じ範囲にないことに注意する必要がある。細胞毒性が高いと分類された試料の平均横サイズは1.3μm、細胞毒性が中程度と分類された試料の平均横サイズは約4μm、細胞毒性がないと分類された試料の平均横サイズは約19μmであるが、文献データでは、GBMはほとんどが50〜1000nmのサイズであった。これは、我々が工業用に製造された商業用GBMに焦点を当てたという事実によって説明できる。これらのサンプルはしばしば非常に高いスケールで製造され、非常に小さなGBMの製造はしばしば高価なプロセスである。したがって、私たちの結果を入手可能な文献と比較することは困難である。
横方向のサイズが細胞毒性に影響を与えるとする我々の結論は、GBMのSARを調査した機械学習研究 [48] と一致するものであった。横方向のサイズもまた、細胞毒性に大きな影響を与えることが判明した。
また、比表面積が最も大きいサンプルは、ほとんどが酸化ストレスに対する反応性が高い（活性酸素の生成とFRAS効果）と分類されることが分かりました。これらの結果は、いくつかの論文と一致している。残念ながら、比表面積は毒性試験中のGBMについてほとんど調査されておらず、同等の毒性エンドポイントについてSSAを測定したGBMを研究しているものは数少なかった。我々は、ヒト呼吸器細胞（BEAS-2BおよびA549）に対するMTT評価の結果を提示する2つの異なる論文［49,50］を検討した。それぞれの研究でテストされたサンプルは、どちらもGNPで、ほとんどが比サイズ面積（196 m²/g vs. 735 m²/g）により異なっていました。SSAが735 m²/gのGNPは、SSAが196 m²/gのサンプルよりもはるかに高い細胞毒性を示したように見えた（24時間暴露後）。残念ながら、SSAが196 m²/gのサンプルは、酸化ストレスのテストが行われなかった。しかし、SSAが735 m²/gのサンプルは、DCFH-DAアッセイでテストされ、そのROS生成量は高く、24時間の暴露後、5 µg/mLの用量でROS生成量を著しく誘発するのに十分でした。
しかし、試料の細孔に関する点を強調する必要がある：本研究では、試料の細孔径を評価していない。この情報は、GBM のバイオアベイラビリティと毒性に影響を与える可能性があります [51]。
in vitro 試験では，比表面積が最も大きい試料が，最も高い毒性影響を持つように見えた．これは、生物学的相互作用のために利用可能な表面が最も高く、しばしばより多くの毒性をもたらすことによって容易に説明することができる[52]。In vivo 吸入試験 [53,54] も、SSA が 8 から 131 m²/g まで増加する様々な試料を用いて、ラットを用いて実施された。SSAが最も小さいGBMは、肺への影響（気管支肺胞洗浄液中のタンパク質および細胞）が小さいようであった。一方、別の in vivo 研究 [55] では、20 µm から 2 µm 未満へとサイズが大きくなる GNP Gr20、Gr5、および Gr1 を使用したが、これらは依然としてヒトにとって呼吸可能なサイズである。Gr1は、その高いSSA（735 m²/g 対 Gr5とGr20の約100 m²/g ）により最も反応性の高い表面（DTT）を有していたが、Gr20は、マウスの咽頭吸引後に高い肺炎を引き起こすようであった。さらに、BALを採取してLDHの定量を行ったところ、Gr20はGr1よりも高いLDHの放出を引き起こした。Gr20とGr5はアスペクト比が高く、貪食作用が亢進している可能性があり、比表面積の増加よりも高い効果をもたらした可能性がある（明らかな痕跡は観察されなかったが）。
酸化ストレスはGBMの主要な作用機序であり［56］、ミトコンドリア活性［57］など他の多くの機構にしばしば影響を与え、最終的にアポトーシスを引き起こす可能性がある［58］。酸化ストレスの複雑さと細胞生理学におけるその関与は、潜在的なSARの研究をさらに困難なものにする可能性がある。したがって、酸化ストレスが関与する SAR の研究は、生物全体を考慮しながら慎重に行う必要があります。
結論として、私たちの発見は、1つの細胞のスケールだけでなく、生物全体のスケールで考える必要があります。サンプルをin vivoモデルで試験する場合、やはり高いSSAを示すものは生物学的相互作用が高く、より多くの毒性の影響をもたらす可能性がある。しかし、この事実は、他の特性がin vivoでの毒性に関与している可能性があることを考慮すると、まだ整理されていない。吸入暴露の場合、肺クリアランスは不可欠なパラメータであり、生物スケールでの影響を考慮する必要がある。実際、肺クリアランスは、表面化学やサイズなど、いくつかのパラメータによって調節することができ、これにより、GBMが肺から容易に排出されるかどうかが決定される。このパラメータは非常に重要であり、グローバルな毒性に強く影響しますが、in vitroの毒性と同じメカニズムではありません。
私たちの研究では，ほとんどがGNPのSARを発見しました。これは、RGOがより反応性が高く、最も高い毒性カテゴリーに分類される可能性が高いという事実によって説明することができる。したがって、RGOのような反応性の高い試料は、様々な毒性カテゴリーに分類できるように、最低暴露量を使用することをお勧めします（我々の最低暴露量は15 µg/mLで、多くのRGOはこの用量で大きな影響を示しました）。さらに、我々は7つのRGOサンプルをテストしただけで、有意な相関関係を結論づけるには少し少ないと思われます。関連性のある結論を得るためには、各GBMsファミリーについて少なくとも10個のサンプルを研究することを提案します。
我々は、横方向の大きさが細胞毒性に相関していることを観察した：最小のGBMは、有意に高い細胞毒性を引き起こした。これは、先に述べたように、その内在化に関連しているのかもしれない。しかし、内在化しやすいことが系統的に高い細胞毒性につながるわけではないこともわかっている。内在化の研究により、GBMの作用機序や、横方向のサイズを小さくすることがいかに高い細胞毒性につながるかについて、より明確な洞察が得られるかもしれない。
また、物理化学的なパラメータは、時に相互に相関することがあることを念頭に置く必要がある。これは、特に比表面積とGBMの横方向のサイズの場合である。図S4（補足資料）では、比表面積と横方向のサイズとの相関関係を分析した結果を提示しています。その結果、5 μm未満のGBMでは、比表面積と横方向のサイズとの間に相関関係があるように思われた。しかし、5 μm以上のGBMでは、同じ傾向をたどらない様々な比表面積が見られた。物理化学的パラメータの相互相関は，特にSARの研究において考慮しなければならない重要な事実であるにもかかわらず，その相関の性質や安定性は，時に予想外であると結論付けることができる。各試料の物理化学的プロファイルを確立するためには、パラメータを評価することが最も安全な方法であることに変わりはない。
試験サンプルは様々な GBM であったが，機能化されたものはなかった。表面化学および機能化は、毒性に強く影響することがまだよく知られている[59]。GBM の SAR における官能基化の影響を統合するため、この点については前向きな研究で調査する必要がある。
SARについては，我々の結果がいくつかの研究と一致し，機構的に説明できることを強調した。しかしながら、他の研究（特に in vivo 試験）では、時には逆の SAR が見出されることもあります。毒性学では、モデルの選択が重要であり、結果に強く影響する。in vitro試験では、細胞の種類やアッセイによって結果が異なることがある[51]。in vivo試験とin vitro試験を比較すると、その差はさらに明らかである[52]。
リスク評価とSARの研究において、どちらのモデルもその特質を備えている。in vitro試験では、バイアスを最小限に抑えながら、より迅速に多くのサンプルを試験することができ、細胞スケールでの正確な観察が可能である。In vivo モデルでは、ヒトに適用しやすい曝露量での観察が可能であり、生物スケールでの毒性作用の全体像を把握することができます。しかし、SAR研究では、セーフバイデザインGBM構築の基礎となる有意な相関関係を明らかにするために、多くのサンプルを試験する必要があります。そのため、バイアスを避けるために同じ細胞モデルを全試験に使用することを考慮し、SARs研究にはin vitroモデルを使用することを推奨しています。In vivo試験は非常に重要であるが、可能な限り使用しないため、SARs試験の結論を確認するためにのみ使用する。
我々の研究によって、潜在的なSARsの最初の検証を提案します。まず、RGOはGNPよりも毒性が強いように見える。これは、RGOの製造工程が、時に最も鋭いエッジ、より多くの表面欠陥、およびより化学的に反応性の高い表面を持つことにつながるため、説明することができます。GNPについては、細胞毒性が横方向のサイズと関連していると結論づけた。GNPが小さい（約1μm）ほど細胞毒性が強く、一方、最大のGNPである約4μmと約19μmは、それぞれ中程度の細胞毒性を示すか全く示さないのである。この仮説を確認するためにはさらなる研究が必要であるが、このことは、小さいGNPほど効果的と思われる内在化プロセスによって説明できるかもしれない。最後に、GNP の場合、比表面積が高いほど酸化ストレスの影響が大きいことを強調した。これは、表面積が大きいほど、より多くの生物学的相互作用が可能になるためであろう。
5. 結論
我々の知る限り、本研究は、多種多様な GBM の完全かつ体系的な物理化学的特性評価および in vitro 毒性評価を提案した最初の研究である。この方法論により、細胞モデルやアッセイのばらつきによるバイアスのリスクを排除して結果を比較することが可能になった。さまざまな GBM の大規模な物理化学的特性を調べることで、非常に明確な構造活性相関が浮き彫りになりました。その結果、横方向のサイズが最も小さい（約1μm）GNPほど細胞毒性が高く、一方、最も大きい（10μm以上）GNPは細胞毒性がない可能性が高いという結論に達した。また、比表面積と酸化ストレス（活性酸素の生成とFRAS効果）の間に明確な関係があることも見いだされた。最後に、RGOはGNPと比較して、高い炎症反応と活性酸素産生を引き起こす可能性が高いことが観察されました。このようにRGOとGNPの生物学的影響が異なることから、GBMの毒性を研究する際には、それぞれのファミリーを個別に考慮することが重要であることが強調された。構造活性相関はセーフバイデザインアプローチの基礎となり、様々な産業分野で注目されているGBMの毒性を低減することを可能にする。
謝辞
XPS 分析を実施した Science et Surface 研究所に感謝する。また、ラマン分光法を実施した Ecole des Mines de Saint Etienne の Laeticia Vieille 氏に感謝する。
略号
µm: マイクロメートル。BET: Brunauer, Emmett, and Teller。CCK-8: Cell Counting Kit-8。CRGO：化学還元型グラフェン酸化物。DCFH-DA：2′，7′-dichlorofluorescin diacetate（ジクロロフルオレキシンジアセテート）。DMEM：Dulbecco's Modified Eagle Medium（ダルベッコ変法イーグル培地）。FRAS。血清の鉄還元能。GBM：グラフェン系材料。GNP：グラフェンナノプレート。GO: グラフェンオキサイド。GQD：グラフェン量子ドット。 hMSCs: ヒト間葉系幹細胞。ICP：Inductively Coupled Plasma（誘導結合プラズマ）。LDH：乳酸デヒドロゲナーゼ。LOAEL。Lowest Observed Adverse Effect Levelの略。MTT：テトラゾリウム塩（3-（4，5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2，5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）。RGO：還元型グラフェンオキサイド。ROS: 活性酸素種。SAR：Structure-activity Relationship（構造活性相関）。SSA：比表面積。TLR：toll-like受容体。TNF-α：tumor necrosis factorα（腫瘍壊死因子α）。TRGO：熱還元型グラフェン酸化物（Thermally reduced graphene oxide）。XPS：X-ray spectroscopy。
補足資料
以下は、https://www.mdpi.com/article/10.3390/nano11112963/s1、表S1：ICP分析、表S2：XPS全分析、図S1：ラマンスペクトル（a）RGOおよび（b）GNPs、表S3：オンラインにて入手可能である。毒性試験結果。図S2：平均横サイズ分布。図S3: 比表面積分布。図S4。物理化学的特性（比表面積とラテラルサイズ）の相互相関の検討。
追加データファイルはこちら(292K, zip)
執筆協力
構想、S.A., B.F., J.P., V.F.; 形式分析、S.A.; 調査、S.A.; 視覚化、S.A., B.F., J.P., V.F.; 執筆-原案作成、S.A.; 執筆-レビューおよび編集、B.F., J.P., V.F.; すべての著者は原稿の出版バージョンを読み、同意しています。
資金提供
本研究はミシュランの資金援助により行われた。
データの利用可能性
本データは、対応する著者から要請があれば入手可能である。
利益相反
著者らは以下の利害関係を宣言する。Salma Achawi と Bruno Feneon は世界的なタイヤ・ゴム製品メーカーである Michelin 社の従業員である。
脚注
出版社からのコメント：MDPIは、出版された地図や所属機関の管轄権に関する主張については中立的な立場をとっています。
記事情報
ナノマテリアルズ（バーゼル）. 2021 Nov; 11(11): 2963.
2021年11月4日オンライン公開 doi: 10.3390/nano11112963
PMCID: PMC8619174
PMID: 34835726
Salma Achawi,1,2 Bruno Feneon,2 Jérémie Pourchez,1 and Valérie Forest1,3,*.
Marco Pelin、学術編集者、Fabio Candotto Carniel 学術編集者
1Mines Saint-Etienne, Univ. Lyon, Univ. Jean Monnet, Etablissement Français du Sang, INSERM, U1059 Sainbiose, Centre CIS, 42023 Saint-Etienne, France; rf.esme@iwahca.amlas (S.A.); rf.esme@zehcruop(J.P.)
2Manufacture Française des Pneumatiques Michelin, Place des Carmes Déchaux, CEDEX 9, 63040 Clermont-Ferrand, France; moc.nilehcim@noenef.onurb
3Valérie Forest, Mines Saint-Etienne, 158 Cours Fauriel, CS 62362, CEDEX 2, 42023 Saint-Etienne、France
*Correspondence: rf.esme@tserofv
Received 2021 Oct 12; Accepted 2021 Oct 28.
Copyright © 2021 by the authors.
ライセンシー：MDPI, Basel, Switzerland. この記事は、クリエイティブ・コモンズ表示（CC BY）ライセンス（https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）の条件に基づいて配布されるオープンアクセス記事です。
この記事は、PMCの他の記事によって引用されています。
Nanomaterialsからの記事は、Multidisciplinary Digital Publishing Institute (MDPI)の提供でここに提供されます。
参考文献
1. Donaldson K., Stone V., Tran C.L., Kreyling W., Borm P.J.A. Nanotoxicology (ナノ毒性学). Occup. Environ. Med. 2004;61:727-728. doi: 10.1136/oem.2004.013243. [PMC フリーアーティクル] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
2. また、このような場合にも、「計算毒性学」は有効である。計算毒性学（Computational Toxicology）。Chem. Res. Toxicol. 2021;34:171-175. doi: 10.1021/acs.chemrestox.1c00032. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
3. Inshakova E., Inshakov O. MATEC Web of Conferences, Proceedings of the International Conference on Modern Trends in Manufacturing Technologies and Equipment (ICMTMTE 2017), Sevastopol, Russia, 11-15 September 2017. 第129巻。EDP Sciences; Les Ulis, France: 2017. ナノマテリアルの世界市場。Structure and Trends; p.02013. [CrossRef] [Google Scholar] を参照。
4. Li T., Galli G. MoS 2 ナノ粒子の電子的性質. J. Phys. C. 2007;111:16192-16196. doi: 10.1021/jp075424v. [CrossRef] [Google Scholar].
5. Rechberger W., Hohenau A., Leitner A., Krenn J.R., Lamprecht B., Aussenegg F.R. 2つの相互作用する金ナノ粒子の光学特性. Opt. Commun. 2003;220:137-141. doi: 10.1016/S0030-4018(03)01357-9. [CrossRef] [Google Scholar].
6. Taylor-Pashow K.M.L., Della Rocca J., Huxford R.C., Lin W. Hybrid Nanomaterials for biomedical applications. Chem. Commun. 2010;46:5832-5849.論文番号: 10.1039/c002073g. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
7. Bergamaschi E. ナノマテリアルの職業曝露。現在の知識と将来の発展。Nanotoxicology. 2009;3:194-201. doi: 10.1080/17435390903037038. [CrossRef] [Google Scholar].
8. Schulte P., Geraci C., Zumwalde R., Hoover M., Kuempe E. Occupational risk management of engineered nanoparticles（ナノ粒子の職業的リスク管理）. J. Occup. Environ. Hyg. 2008;5:239-249. doi: 10.1080/15459620801907840. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
9. Oomen A.G., Steinhäuser K.G., Bleeker E.A.J., Van Broekhuizen F., Sips A., Dekkers S., Wijnhoven S.W.P., Sayre P.G. ナノ材料のリスク評価フレームワーク.スコープ、規制との関連、適用範囲: ナノ材料のリスク評価フレームワーク：範囲、規制との関連、適用性、および必要な効率向上の観点から見た将来の方向性の概要。NanoImpact. 2018;9:1-13. doi: 10.1016/j.impact.2017.09.001. [CrossRef] [Google Scholar] を参照。
10. Sewell F., Edwards J., Prior H., Robinson S. Opportunities to apply the 3Rs in safety assessment programs（安全性評価プログラムにおける3Rの適用機会）. ILAR J. 2016;57:234-245. doi: 10.1093/ilar/ilw024. [PMC フリーアーティクル] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
11. Wohlleben W., Hellack B., Nickel C., Herrchen M., Hund-Rinke K., Kettler K., Riebeling C., Haase A., Funk B., Kühnel D., et al. nanoGRAVUR framework to group (nano)materials for their occupational, consumer, environmental risks based on a harmonized set of material properties, applied to 34 case studies. Nanoscale. 2019;11:17637-17654. doi: 10.1039/C9NR03306H. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
12. Dekkers S., Oomen A.G., Bleeker E.A.J., Vandebriel R.J., Micheletti C., Cabellos J., Janer G., Fuentes N., Vázquez-Campos S., Borges T., et al. Towards a nanospecific approach for risk assessment.日本科学未来館, pp. Regul. Toxicol. Pharmacol. 2016;80:46-59. doi: 10.1016/j.yrtph.2016.05.037. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]を参照。
13. Organisation for Economic Co-operation and Development OECD Guidance Document on the Validation of (Quantitative) Structure-Activity Relationship [(Q)Sar] Models(定量的構造活性相関)モデルの検証に関するガイダンス文書. Transport. 2007;2:1-154. [Google Scholar].
14. Gatoo M.A., Naseem S., Arfat M.Y., Mahmood Dar A., Qasim K., Zubair S. ナノ材料の物理化学的特性: ナノマテリアルの物理化学的特性：関連する毒性発現への含意。Biomed. Res. Int. 2014;2014:498420. doi: 10.1155/2014/498420. [PMC フリーアーティクル] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
15. Oberdörster G., Maynard A., Donaldson K., Castranova V., Fitzpatrick J., Ausman K., Carter J., Karn B., Kreyling W., Lai D., et al. ナノ材料への曝露による潜在的人健康影響を特徴付けるための原理。スクリーニング戦略の要素。Part. Fibre Toxicol. 2005;2:1-35. doi: 10.1186/1743-8977-2-8. [PMC フリーアーティクル] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
16. Kraegeloh A., Suarez-Merino B., Sluijters T., Micheletti C. Implementation of Safe-by-Design for Nanomaterial Development and Safe Innovation（ナノ材料開発と安全なイノベーションのためのセーフ・バイ・デザインの実施）: Why We Need a Comprehensive Approach. Nanomaterials. 2018;8:239. doi: 10.3390/nano8040239. [PMC フリーアーティクル] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
17. Schwarz-Plaschg C., Kallhoff A., Eisenberger I. Making Nanomaterials Safer by Design? ナノエシックス。2017;11:277-281. doi: 10.1007/s11569-017-0307-4. [CrossRef] [Google Scholar].
18. Novoselov K.S. Atomically Thin Carbon Filmsにおける電界効果. Science. 2004;306:666-669. doi: 10.1126/science.1102896. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
19. Cai X., Lai L., Shen Z., Lin J. Graphene and graphene-based composites as Li-ion battery electrode materials and their application in full cell. J. Mater. Chem. A. 2017;5:15423-15446.doi:10.1039/C7TA04354F.を参照。[CrossRef] [Google Scholar] を参照。
20. Li G., Huang B., Pan Z., Su X., Shao Z., An L. Advances in three-dimensional graphene-based materials: 三次元グラフェン系材料の進歩：金属（Li, Na, K, Mg, Al）二次電池の構成、調製および応用. エネルギー・エンバイロメント. Sci. 2019;12:2030-2053. doi: 10.1039/C8EE03014F. [CrossRef] [Google Scholar] を参照してください。
21. Naghibi S., Kargar F., Wright D., Huang C.Y.T., Mohammadzadeh A., Barani Z., Salgado R., Balandin A.A. Noncuring Graphene Thermal Interface Materials for Advanced Electronics.（先進エレクトロニクス用非硬化グラフェン熱インターフェース材料）. Adv. Electron. Mater. 2020;6:1901303. doi: 10.1002/aelm.201901303. [CrossRef] [Google Scholar].
22. Qiao Y., Wang Y., Tian H., Li M., Jian J., Wei Y., Tian Y., Wang D.-Y., Pang Y., Geng X., et al. Multilayer Graphene Epidermal Electronic Skin（多層グラフェン表皮電子皮膚）. ACS Nano. 2018;12:8839-8846. doi: 10.1021/acsnano.8b02162. [PubMed] [CrossRef][Googleスカラー]を参照。
23. Wick P., Louw-Gaume A.E., Kucki M., Krug H.F., Kostarelos K., Fadeel B., Dawson K.A., Salvati A., Vázquez E., Ballerini L., et al. Classification Framework for Graphene-Based Materials Open Archive TOULOUSE Archive Ouverte (OATAO) 分類グラフェンバースのための分類フレームワーク グラフェン ナノテクノロジー 構造-活性相関毒性学. Angew. Chemie Int. Ed. 2014;53:7714-7718. doi: 10.1002/anie.201403335. [PubMed] [CrossRef][Googleスカラー]。
24. 藤田和彦、竹聡、谷亮太、丸壽一、小原聡、遠藤晋一郎：剥離グラフェンの細胞毒性および変異原性評価. Toxicol. Vitr. 2018;52:195-202. doi: 10.1016/j.tiv.2018.06.016. [PubMed] [CrossRef][Googleスカラー]を参照。
25. De Marzi L., Ottaviano L., Perrozzi F., Nardone M., Santucci S., De Lapuente J., Borras M., Treossi E., Palermo V., Poma A. flake size-dependent cyto and genotoxic evaluation of graphene oxide on in vitro A549, CaCo2 and vero cell lines. J. Biol. Regul. Homeost. Agents. 2014;28:281-289. [PubMed］［Google Scholar］．
26. このような場合、「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」..................................................................... Colloids Surf. B Biointerfaces. 2017;153:300-309. doi: 10.1016/j.colsurfb.2017.02.036. [PubMed] [CrossRef][Googleスカラー]。
27. Tabish T.A., Narayan R.J. Crossing the blood-brain barrier with graphene nanostructures.（グラフェンナノ構造による血液脳関門の横断）. Mater. Today. 2021 doi: 10.1016/j.mattod.2021.08.013. in press. [CrossRef] [Google Scholar].
28. Zhang W., Yan L., Li M., Zhao R., Yang X., Ji T., Gu Z., Yin J.J., Gao X., Nie G. Deciphering the underlying mechanisms of oxidation-state dependent cytotoxicity of graphene oxide on mammalian cells. Toxicol. Lett. 2015;237:61-71. doi: 10.1016/j.toxlet.2015.05.021. [PubMed] [CrossRef][Googleスカラー]。
29. Achawi S., Pourchez J., Feneon B., Forest V. Graphene-Based Materials In vitro Toxicity and Their Structure-Activity Relationships: 系統的な文献レビュー。Chem. Res. Toxicol. 2021;34:2003-2018. doi: 10.1021/acs.chemrestox.1c00243. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
30. このような場合、「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」..................................... Nanotoxicology. 2015;9:719-728. doi: 10.3109/17435390.2014.969346. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
31. Drasler B., Sayre P., Steinhäuser K.G., Petri-Fink A., Rothen-Rutishauser B. In Vitro approaches to assess the hazard of nanomaterials.（ナノ材料の危険性を評価するための体外アプローチ）。NanoImpact. 2017;8:99-116. doi: 10.1016/j.impact.2017.08.002.を参照。[CrossRef] [Google Scholar].
32. Piątek-Guziewicz A., Zagrodzki P., Paśko P., Krośniak M., Mach T., Zwolińska-Wcisło M. Ferric reducing ability of plasma and assessment of selected plasma antioxidants in adults with celiac disease.血漿の鉄還元能力とセリアック病の成人の血漿抗酸化物質の評価。Folia Med. Cracov. 2017;4:13-26. [PubMed］［Google Scholar］．
33. Gandon A., Werle K., Neubauer N., Wohlleben W. Grouping and Read-acrossに必要な表面反応性測定。先進的な FRAS プロトコル。J. Phys. Ser. Inst. Phys. Publ. 2017;838:12033. doi: 10.1088/1742-6596/838/1/012033.を参照。[CrossRef] [Google Scholar] を参照してください。
34. Achawi S., Feneon B., Pourchez J., Forest V. Assessing biological oxidative damage induced by graphene-based materials（グラフェン系材料による生物学的酸化損傷の評価）。FRAS アッセイを用いたアプローチのグループ化のための資産。Regul. Toxicol. Pharmacol. 2021;127:105067. doi: 10.1016/j.yrtph.2021.105067. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
35. Fusco L., Garrido M., Martín C., Sosa S., Ponti C., Centeno A., Alonso B., Zurutuza A., Vázquez E., Tubaro A., et al. 非動物試験によるグラフェン系材料の皮膚刺激性. Nanoscale. 2020;12:610-622. doi: 10.1039/C9NR06815E. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
36. グラフェン系ナノマテリアルの職業曝露。リスク評価。Nanoscale. 2018;10:15894-15903. doi: 10.1039/C8NR04950E. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
37. Mittal S., Kumar V., Dhiman N., Chauhan L.K.S., Pasricha R., Pandey A.K. Physico-chemical properties based differential toxicity of graphene oxide/reduced graphene oxide in human lung cells mediated through oxidative stress.（酸化ストレスを介したヒト肺細胞における酸化グラフェン/還元グラフェンの物理化学的特性に基づく差異毒性）. Sci. Rep. 2016;6:39548. doi: 10.1038/srep39548. [PMC フリーアーティクル] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
38. Li R., Guiney L.M., Chang C.H., Mansukhani N.D., Ji Z., Wang X., Liao Y.P., Jiang W., Sun B., Hersam M.C., et al. Graphene Oxide の表面酸化は肺の毒性モデルでマクロファージの膜損傷、脂質過酸化、細胞毒性に決定する. ACS Nano. 2018;12:1390-1402. doi: 10.1021/acsnano.7b07737. [PMCフリーアーティクル] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
39. Akhavan O., Ghaderi E. Toxicity of Graphene and Graphene Oxide Nanowalls Against Bacteria.（グラフェンおよびグラフェンオキサイドナノウォールの細菌に対する毒性）。ACS Nano. 2010;4:5731-5736. doi: 10.1021/nn101390x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
40. Cançado L.G., Jorio A., Ferreira E.H.M., Stavale F., Achete C.A., Capaz R.B., Moutinho M.V.O., Lombardo A., Kulmala T.S., Ferrari A.C. 異なる励起エネルギーのラマン分光によるグラフェンの欠陥の定量化. Nano Lett. 2011;11:3190-3196. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
41. Jia P.-P.、Sun T.、Junaid M.、Yang L.、Ma Y.-B.、Cui Z.-S.、Wei D.-P.、Shi H.-F.、Pei D.-S.。異なるサイズのグラフェン（G）および酸化グラフェン（GO）のin vitroおよびin vivoにおけるナノ毒性。Environ. Pollut. 2019;247:595-606。doi: 10.1016/j.envpol.2019.01.072. [PubMed] [CrossRef][Googleスカラー]。
42. Russier J., Treossi E., Scarsi A., Perrozzi F., Dumortier H., Ottaviano L., Meneghetti M., Palermo V., Bianco A. Evidencing the mask effect of graphene oxide.酸化グラフェンによるマスク効果。ヒトおよびネズミの初代食細胞に関する比較研究。Nanoscale. 2013;5:11234-11247. doi: 10.1039/c3nr03543c. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
43. グラフェンナノプレートレットのサイズに依存したヒト幹細胞における遺伝毒性。Biomaterials. 2012; 33:8017-8025.論文番号: 10.1016/j.biomaterials.2012.07.040. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
44. Ma J., Liu R., Wang X., Liu Q., Chen Y., Valle R.P., Zuo Y.Y., Xia T., Liu S.マクロファージの活性化および細胞や動物における炎症反応の促進におけるグラフェンオキサイドの横方向のサイズの重要な役割。ACS Nano. 2015;9:10498-10515. doi: 10.1021/acsnano.5b04751. [PMCフリーアーティクル] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
45. Vranic S., Rodrigues A.F., Buggio M., Newman L., White M.R.H., Spiller D.G., Bussy C., Kostarelos K. Label-Free Graphene Oxide Live Imaging Reveals Critical Factors Causing Oxidative-Stress-Mediated Cellular Responses. ACS Nano. 2018;12:1373-1389. doi: 10.1021/acsnano.7b07734. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
46. Dziewięcka M., Pawlyta M., Majchrzycki Ł., Balin K., Barteczko S., Czerkawska M., Augustyniak M. The Structure-Properties-Cytotoxicity Interplay: 酸化グラフェンの生体適合性を決定するための重要な経路。Int J. Mol. Sci. 2021;22:5401. doi: 10.3390/ijms22105401. [PMC フリーアーティクル] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
47. Li Y., Yuan H., Von Dem Bussche A., Creighton M., Hurt R.H., Kane A.B., Gao H. Graphene microsheets enter cells through spontaneous membrane penetration at edge asperities and corner site（グラフェンのマイクロシートは、端のアスペリティとコーナーサイトにおいて自発的に膜を貫通する。Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013;110:12295-12300. doi: 10.1073/pnas.1222276110. [PMC フリーアーティクル] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
48. Ma Y., Wang J., Wu J., Tong C., Zhang T. グラフェンの細胞毒性に関するメタアナリシス（文献のデータマイニングおよび機械学習による）。Sci. Total Environ. 2021;793:148532. doi: 10.1016/j.scitotenv.2021.148532. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
49. Park E.J., Lee G.H., Han B.S., Lee B.S., Lee S., Cho M.H., Kim J.H., Kim D.W. Toxic response of graphene nanoplatelets in vivo and in vitro. Arch. Toxicol. 2015;89:1557-1568. doi: 10.1007/s00204-014-1303-x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
50. Nasirzadeh N.、Azari M.R.、Rasoulzadeh Y.、Mohammadian Y. A assessment of the cytotoxic effects of graphene nanoparticles on the epithelial cells of the human lung. Toxicol. Ind. Health. 2019;35:79-87. doi: 10.1177/0748233718817180. [PubMed] [CrossRef][Googleスカラー]。
51. Tabish T.A., Pranjol M.Z.I., Jabeen F., Abdullah T., Latif A., Khalid A., Ali M., Hayat H., Winyard P.G., Whatmore J.L., et al. 肺がん細胞および生体組織に対するグラフェンナノポアの毒性作用に対する検討. Appl. Mater. Today. 2018;12:389-401. doi: 10.1016/j.apmt.2018.07.005. [CrossRef] [Google Scholar] を参照。
52. Schmid O., Stoeger T. Surface area is the biologically most effective dose metric for acute nanoparticle toxicity in the lung.表面積は、肺の急性ナノ粒子毒性にとって生物学的に最も効果的な線量指標である。J. Aerosol Sci. 2016;99:133-143. doi: 10.1016/j.jaerosci.2015.12.006.を参照。[CrossRef] [Google Scholar] を参照。
53. Kim Y.H., Jo M.S., Kim J.K., Shin J.H., Baek J.E., Park H.S., An H.J., Lee J.S., Kim B.W., Kim H.P., et al. Graphene oxide nanoplatesの短期吸入試験. Nanotoxicology. 2018;12:224-238. doi: 10.1080/17435390.2018.1431318. [PMCフリーアーティクル] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
54. Ma-Hock L., Strauss V., Treumann S., Küttler K., Wohlleben W., Hofmann T., Gröters S., Wiench K., van Ravenzwaay B., Landsiedel R. Multiwall carbon nanotubes, graphene, graphite nanoplatelets and low surface carbon blackの比較吸引毒性.Maximum inhalation toxicity of multi-wall carbon nanotubes, graphene, graphite nanoplatelets and Low surface carbon black. Part. Fibre Toxicol. 2013;10:1-20. doi: 10.1186/1743-8977-10-23. [PMC フリーアーティクル] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
55. グラファイトナノプレートの肺曝露後の肺および全身毒性評価。グラフェン系ナノ材料ファミリーの一員。Part. Fibre Toxicol. 2016;13:1-22. doi: 10.1186/s12989-016-0145-5. [PMC フリーアーティクル] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
56. Fadeel B., Bussy C., Merino S., Vázquez E., Flahaut E., Mouchet F., Evariste L., Gauthier L., Koivisto A.J., Vogel U., et al. Graphene-Based Materialsの安全性評価: グラフェン系材料の安全性評価：ヒトの健康と環境に焦点をあてて ACS Nano. 2018;12:10582-10620. doi: 10.1021/acsnano.8b04758. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
57. Jarosz A., Skoda M., Dudek I., Szukiewicz D. Oxidative Stress and Mitochondrial Activation as the Main Mechanisms Underlying Graphene Toxicity against Human Cancer Cells. Oxid. Med. Cell. Longev. 2016;2016:5851035. doi: 10.1155/2016/5851035. [PMC フリーアーティクル] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
58. Jaworski S., Strojny B., Sawosz E., Wierzbicki M., Grodzik M., Kutwin M., Daniluk K., Chwalibog A. Degradation of mitochondria and oxidative stress as the main mechanism of toxicity on U87 glioblastoma cells and tumors and HS-5 cells.原生グラフェンの毒性に関する主要メカニズム. Int. J. Mol. Sci. 2019;20:650. doi: 10.3390/ijms20030650. [PMCフリーアーティクル] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
59. Li Y., Feng L., Shi X., Wang X., Yang Y., Yang K., Liu T., Yang G., Liu Z. Surface coating-dependent cytotoxicity and degradation of graphene derivatives（グラフェン誘導体の表面コーティングに依存した細胞毒性と分解。無毒性で分解可能なナノグラフェンの設計に向けて。Small. 2014;10:1544-1554. doi: 10.1002/smll.201303234. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
参考記事
組織工学の基本因子であるヒト間葉系幹細胞を臍帯血から分離し、rGONPのサイズに依存した細胞毒性および遺伝毒性を初めて検討した。