ラットグリア細胞に対するテラヘルツ放射の影響調査

バイオメディカルオプティクスエクスプレス Vol.8, Issue 1, pp.273-280 (2017)
 -https://doi.org/10.1364/BOE.8.000273

元記事はこちら。

Optica Publishing Group

マリア・ボロフコワ、マリア・セレブリアコワ、ヴィアチェスラフ・フェドロフ、エゴール・セディフ、ウラジミール・ヴァクス、アレキサンダー・リチューチン、アリーナ・サルニコワ、ミハイル・コジツキー


図 (3)
表 (1)

1.  要旨

　テラヘルツ（THz）放射（0.12-0.18THz、平均出力密度3.2mW/cm2）のラットグリア細胞株への影響について検討した。THz放射の用量依存的な細胞毒性効果が実証された。

1分間の照射でアポトーシス細胞の相対数が1.5倍に増加し、3分後には2倍に増加しました。この結果は、強力なテラヘルツ放射の生物学的危険性の概念を裏付けるものである。
THz放射の診断への応用は、放射パワー密度と照射時間によって制限される可能性があります。

© 2016 Optical Society of America

2.  はじめに

　過去数十年にわたり、テラヘルツ（THz）技術は非常に急速に発展してきた。現在では，テラヘルツ波（0.1～10 THz）は医療を含む様々な分野で応用されている[1]。診断・治療技術を効果的に開発するためには，テラヘルツ放射の基本的な生物学的影響を知っておくことが不可欠です。テラヘルツ波は、細胞レベルも含め、様々な生物学的効果を引き起こすことが知られています。この問題に関する詳細なレビューは、論文[2-7]で見ることができます。テラヘルツ波が細胞に与える影響は，遺伝子活性の変化や細胞膜の状態の変化で明らかにされている。以前には，テラヘルツ波がヒト赤血球膜の電荷を変化させること [8, 9]，カタツムリや軟体動物の神経細胞膜の接着性を損なうこと [10, 11]も報告されている。ヒトの赤血球やリンパ球[12]、実験用ラットの赤血球[13, 14]を用いた実験で示されたように、膜透過性の増大が構造的損傷の兆候である。
THz放射に対する細胞の反応の大部分は、細胞間の影響によって決定される。単球がリンパ球の活性を調節していることは認められている。この調節は、サイトカインという特殊なシグナル伝達物質によって行われている。リンパ球と単球を同時または別々に照射した場合、照射したリンパ球と照射していない単球をインキュベートした場合、照射した単球と照射していないリンパ球をインキュベートした場合では、リンパ球の増殖指数に異なる影響を与えることが明らかにされています。この指標は、単球とリンパ球を別々に照射した後に共培養した場合に最も高く、照射したリンパ球と非照射の単球をインキュベートした場合に最も低くなる[12]。
著者らによると、照射された単球は非照射のリンパ球にも影響を与え、その増殖指数を増加させるため、これらの違いは単球の状態によって引き起こされる[12]。単球はまた、細胞の生存率に影響を与える。したがって、同じ血液試料に由来するリンパ球と単球を同時に照射した場合、リンパ球の生存率は対照試料のそれに比べて減少するが、別々に照射した場合、あるいは照射したリンパ球と非照射単球をインキュベートした場合には、この指標は増加する。また、照射した単球を非照射のリンパ球とインキュベートした場合は、染色されていないリンパ球の割合が減少する[12]。
上記の実験はすべて、単離した細胞の調製品を用いて行われた。培養細胞の膜透過性に対するテラヘルツ放射線の影響は、培養中の単一細胞の性質が、隣接する細胞の生命活動や細胞間の関係によって引き起こされる多くの要因によって規定されることを考慮すると、特に興味深いものである。また、培養細胞の状態は、培養状態全般に関するパラメータに依存する。特に、カロンによる細胞状態の調節が大きく寄与している[15]。このような多面的な効果により、テラヘルツ波に対する培養細胞の応答の性質が決定される。
特に、カンガルーラット腎臓細胞（細胞株PTK2）[16]とチャイニーズハムスター卵巣[17]の培養実験では、不均質な反応が実証された。
一部の細胞では、3H-thymidine（DNA合成前駆体）の取り込み数が減少しており、著者らはDNA合成の阻害と判断している。最大の効果は、照射中に細胞周期のS期にある細胞で観察された。さらに、標識ウリジン（RNA合成前駆体）を含むTHz照射では、影響がないことが示された。この違いは、細胞膜の状態に対するTHz放射の影響の結果であると考えられる。

細胞への影響の中でも、テラヘルツ放射の細胞毒性は多くの科学者が懸念している問題でもある。現在のところ、この問題についてのコンセンサスは得られていない。いくつかの研究では、この効果は発生しないことが実証されているが [18-25]、他の研究では、この効果は明確に表示されている [10-12, 26-28]。特に，論文 [19, 20, 25, 28] の実験では，ほぼ同じ周波数 (0.10 - 0.15 THz) と電力密度 (0.04 - 5 mW/cm2) の THz 放射を照射した後に，異なる結果が得られている。いずれの実験でも、効果の登録は適切な方法で行われているが、照射する試料が異なっている。しかし、照射する試料は異なっており、効果の有無は特定の細胞の特性や性質に関連している可能性がある。そこで、今回はグリア細胞を実験試料として選択した。グリア細胞は、環境中のイオン変化に対して非常に敏感である[29]。生体システムに対するテラヘルツ放射線の影響のメカニズムの1つは、細胞の内因性場の状態に対する撹乱効果であると考えられ、これは細胞から環境へのイオンフラックスの変化、またはその逆の変化をもたらし、細胞の生存率に影響を与える。

3.  試料と方法

細胞
　この研究では、Collection of cell cultures of vertebrates (Institute of Cytology of the Russian Academy of Sciences)から入手したC6ラットグリア細胞株を用いた実験が行われた。細胞の培養は、研究所の勧告に従って行った。実験を設定するために、細胞を24ウェル平底プレート（Sarstedt, Germany）のウェルに播種した。実験では、20ウェルのプレートを使用し、4ウェルのサンプルはコントロールとして使用した。細胞密度50%の単層細胞を照射した。照射後、細胞を5% CO2雰囲気下、37℃で24時間培養した。培養終了後、37℃に加熱した過剰のVersene溶液（Biolot、St.Petersburg）でウェルを2回洗浄した。単層崩壊には、37℃に加熱したアキュターゼ溶液（Sigma-Aldrich, USA）を用いた；インキュベーション時間は、5% CO2下、37℃で7分間であった。インキュベーション終了後、アキュターゼを不活性化するために、2% FCS (Biolot, St. Petersburg, Russia) を含む冷却したリン酸緩衝食塩水 (PBS, pH 7.2 - 7.4) をウェルに添加した。得られた細胞懸濁液を15ml遠心管（Sarstedt, Germany）に移し、PBSで2回洗浄した（300g、8分）。得られた細胞懸濁液は、後述の実験に用いた。

ミトコンドリア膜電位の変化の評価
　この方法は，テトラメチルローダミンメチルエステル（TMRM）と DNA 結合型 DRAQ7 染料の 2 種類の蛍光色素の使用に基づく[30]．TMRM は，細胞のミトコンドリア膜電位の研究に用いられるカチオン性の親油性染料の一群に相当する．TMRM は，そのカチオン性により，二脂質の細胞膜を自由に透過し，プロトン濃度の高い領域，すなわちミトコンドリア内膜に集積することができる．この効果は、フローサイトメーターによる解析時に記録される、スペクトルの赤橙色部分（最大発光波長573nm）の細胞蛍光強度の変化を伴います。生理的細胞死（アポトーシス）の初期には、ミトコンドリア膜の脱分極が起こり、プロトン濃度が低下するため、色素が細胞質内に放出され、その蛍光が著しく減少する。このように、ミトコンドリアが有効に機能している生細胞（その結果、蛍光強度が高い（表現型「TMRM high」））と、ミトコンドリア機能が阻害された瀕死の細胞や死細胞（表現型「TMRM low」）を区別することが可能である。ミトコンドリアの脱分極はアポトーシス開始の「初期」のイベントと考えられているが、膜表面の完全性の侵害（すなわち、その断片化）は、通常、死の終末期に位置する細胞に特徴的である。そこで、アポトーシスの各ステージを識別するために、TMRMの他に、核酸細胞と相互作用することができる色素であるDRAQ7で細胞をさらに染める。DRAQ7は脂質膜を通過して拡散することができないため、細胞のDNAと通信することができないが、細胞質膜と核膜の断片化の際に色素は細胞内に入り、DNAおよびRNAと相互作用する。このような相互作用の結果，細胞質および核に色素が蓄積され，細胞の蛍光が赤色部分に現れる（検出は波長725±20 nmで行われる）。
図1は、生細胞とアポトーシスの異なる段階にある細胞の分離に使用されるゲーティング戦術を示しています。生細胞はTMRMを検出するための明るい蛍光チャンネルを持つが、DRAQ7は蓄積していない - 表現型「TMRM high / DRAQ7 -」。アポトーシスの初期段階では、細胞はミトコンドリア電位が低下しているが、DRAQ7に対する逼迫感は保たれている - 表現型「TMRM low / DRAQ7 -」。アポトーシス後期または既に死んでいる（ネクローシス）細胞は、TMRMを効果的に蓄積しないが、DRAQ7によって染色される - 表現型 "TMRM low / DRAQ7 +".

図1

図 1 生細胞とアポトーシスの異なる段階にある細胞の分離に使用されるゲーティング戦術。

細胞標識の手順
ミトコンドリア膜電位の評価のために、テトラメチルローダミンメチルエステル（TMRM (Cat.# T668, Thermo Fisher Scientific Inc, USA)）溶液を100μlの細胞懸濁液に添加した。TMRMの最終濃度は150nMであった。サンプルを十分に混合し、37℃、5% CO2雰囲気下で20分間インキュベートした。インキュベーション終了後、サンプルを2％FCSを含む過剰のPBSで洗浄した（300gで8分間）。その後、上清を除去し、細胞ペレットを100μlの新鮮なPBSに再懸濁した。得られた細胞懸濁液にDNA結合色素DRAQ7 (Cat.# B25595, Beckman Coulter, USA) のワーキング溶液5μlを加え、サンプルを光から保護しながら室温で10分間インキュベートした。インキュベーション終了後、200μlのPBSをサンプルに添加し、サイトメトリー勘定を実施した。

フローサイトメトリー
サンプルのフローサイトメトリー解析は、Naviosフローサイトメーター（Beckman Coulter, USA）を用いて実施した。各サンプルについて、少なくとも20,000個の単一細胞が分析された。単一細胞がくっついた状態から識別し、凝集体を解析から識別するために、前方光散乱（細胞の大きさに比例する量、FS）および側方光散乱（細胞の構造を特徴付ける量、SS）の信号の以下の組み合わせを使用した：積分FSまたはSS信号強度に対するピーク強度、ならびに積分FSまたはSS信号強度に対する検出ゾーン通過細胞飛行時間（TOF）。結果の解析は，Kaluza 1.3 ソフトウェア (Beckman Coulter, USA) を用いて行った．データは、Microsoft Office Excel (Microsoft, USA), Statistica 8 (StatSoft, USA) および GraphPad Prism (GraphPad Software, USA) ソフトウェアとアプリケーションパッケージを使用して処理した。結果は算術平均値で報告し、誤差は平均値の標準誤差（Mean ± SEM）として報告した。サンプルの比較はStudentのt-testを使用して行った。差はp＜0.05で信頼できると判断した。

実験セットアップ
広帯域 THz 放射を細胞培養に照射するために，0.12 ～ 0.18 THz 周波数領域で動作する後方波発振器（BWO）光源を使用した [31]．実験セットアップをFig.2に示す。

図2

図. 2 実験セットアップ。BWO から放射された THz 信号はホーンアンテナに送られ、TPX レンズで平行化されて幅 20 mm のビームが得られます。ビームはミラーによって、照射中の細胞培養を行うプレートの底面に直交するように伝搬される。

BWOは、中心周波数0.15 THzで約10 MHzの周波数幅の放射を、平均出力10 mW、平均電力密度3.2 mW/cm2で放出した。BWOの出力は、20mm幅の平行ビームを得るために、平凸TPXレンズを取り付けたホーンアンテナで終端されました（図2）。入射テラヘルツ波を反射するのに十分な厚さの金コーティングを施したミラーを使用して、ビームを透明な組織培養プレートの底面に直交するように照射しています。一連の実験は室温下で行い、THz放射の照射時間は1、2、3、4、5分であった。

4.  結果

　結果 分析のために，TMRM（蛍光の増加はミトコンドリアの膜電位に依存する）および Draq7（表面膜の完全性を破壊した後，アポトーシスとネクロシスの後期に細胞内に浸透する）の二次元蛍光強度ヒストグラムを構築した。得られたデータをTable 1およびFig.3に示す。THz放射線を照射した試料では、ミトコンドリアが活発に機能している細胞（表現型「TMRM high / Draq7-」）の数が、対照試料の同じ特徴よりも著しく低いことが実証された（p < 0.05）。露光時間を長くすると、試料中のそのような細胞の量が減少する。一方、ミトコンドリア色素を蓄積する能力が低下した細胞（表現型「TMRM low」）の数は、暴露時間と共に有意に増加した。なお、表現型「TMRM low / Draq7 +」細胞、すなわちミトコンドリア膜電位の低下と外膜の損傷を伴う細胞集団では、対照試料と比較して試験試料に有意な変化は認められなかった。

表 (元記事参照)
表1. 異なる照射時間のTHz放射光を照射した試料における生細胞とアポトーシスの異なる段階にある細胞の相対数（%）（平均±SEM、n = 4、*p < 0.05, **p ⩽ 0.001)

図3

図3 THz照射時間に対する試料中の生細胞数およびアポトーシス初期・後期細胞数。

なお，テラヘルツ波照射後に観察された効果は熱的なものではなかった。照射中の温度変化は0.1℃を超えなかった [32]。

5. 考察

　文献分析によると、テラヘルツ波は、ある種の細胞との相互作用においては細胞毒性 を示さないが、他の種の細胞との相互作用においては、同様の照射条件下で細胞毒性 を示すことがわかった。注目すべきは、被覆細胞や支持組織細胞（上皮細胞 [19、33]、線維芽細胞 [20]、ケラチノサイト [22、23]）を調査した場合に細胞毒性作用の欠如が起こるということである。我々は、感受性の欠如が、生体をテラヘルツ波から遮蔽する機能を持つことを示唆する。テラヘルツ光に無関心な細胞の第二のタイプは、幹細胞である[21, 24]。この場合、膜もまた、外部のTHz電界が分化の過程に与える影響を許さないスクリーンとして機能すると考えられる。3つ目のタイプの非感受性細胞は、細菌細胞である[18]。この場合、膜は外部のテラヘルツ波から微生物を保護する役割も果たしていると考えられる。

細胞毒性は、リンパ球[12, 26-28], 神経細胞[10], 赤血球[12]、すなわち体内に存在する細胞に対して典型的なものである。生物の機能にとって不可欠な局所的なテラヘルツ波ナノ・マイクロ磁場が、その内部で生成されている可能性がある。この理論には、いくつかの物理的な前提条件がある。前述の理由により、体内に存在するすべての細胞は、テラヘルツ波に対して高い感度を有している必要があります。以下に、テラヘルツ波が影響を及ぼす可能性のあるメカニズムについて述べる。グリア細胞の細胞内構造の多くは著しく偏光しており [29]，グリア細胞の大きさは使用するTHz光源の波長よりも小さいため，グリア細胞による放射線の直接吸収（共振まで）が可能なメカニズムであると考えられる。

さらに、グリア細胞の培養は水性媒体の中で行われる。水はTHz放射の吸収率が非常に高い[34]。水に吸収されたエネルギーは，膜タンパク質分子の状態を変化させるきっかけとなる．さらに，水の状態を変化させることで，水分子の構造，分子の溶媒和殻，水素結合のシステムの変化によってある程度変化する生化学的プロセスに，テラヘルツ放射が影響を与える可能性がある．

さらに、グリア細胞は高い膜電位を持っています。これは神経細胞よりも高い。このため、細胞内の恒常性の維持や神経細胞とグリア細胞間のイオン交換に役立っている。さらに、グリア細胞は、細胞表面膜にイオンチャネルに関連するタンパク質が高密度に存在することが特徴である[29]。グリア細胞のサイズよりも大きな波長のTHz放射の影響は攪乱的である。これは，細胞膜やライソゾーム，ミトコンドリアの膜の脱分極につながる．このことは、照射した細胞質内にTMRM色素が登録されることで確認された。膜の脱分極の結果、膜タンパク質の構造が変化し、細胞内の恒常性を回復できなくなり、ミトコンドリアから細胞質へアポトーシス蛋白質が放出され、リソソームからタンパク質分解酵素が放出されてアポトーシス過程が更に進行する。

グリア細胞のもう一つの特徴は、チャネルタンパク質であるアクアポリンが多量に存在することである[35]。THz放射はタンパク質分子の構造変化を誘発することから、アクアポリンの構造変化、ひいては細胞内への水の流入の促進、細胞の膨潤による細胞膜の変形を期待することは合理的であった。しかし、細胞膜が変形した細胞の相対数は、実験を通してほとんど変化しなかった。このことは、DRAQ7色素の蓄積がないことからも明らかである。このことは、このような細胞破壊のメカニズムが除外されることを意味しない。しかし、その顕著な発現のためには、他の実験条件が必要である。
本研究で得られた結果は、テラヘルツ波が生物学的な危険をもたらす可能性があることを示す新たな証拠となる。この問題は、科学文献 [1, 3, 28, 36] ですでに提起されていた。

6.  結論

 　この研究では、ラットグリア細胞に対するテラヘルツ放射の用量依存的な細胞毒性効果を実証した。
実験では、C6 ラットグリア細胞株を平均出力密度 3.2 mW/cm2 の THz 線 (0.12 - 0.18 THz) で連続的に照射した。その結果、1分後にはアポトーシス細胞数が1.5倍、5分後には2.4倍となり、生物学的効果を確認することができた。
この結果は、高強度テラヘルツ放射の生物学的危険性の概念を裏付けるものである。したがって、THz放射の診断応用は、放射パワー密度と照射時間によって制限される可能性があると主張する。

資金提供
本研究は、ロシア連邦政府より助成金 074-U01 を受けた。

謝辞
本論文は、2016 年 9 月 27 日に逝去された Viacheslav Fedorov 教授の祝福された記憶に捧げます。

7.  参考文献とリンク

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