神経イメージングおよびオプトジェネティクス応用に向けたグラフェンベースの炭素層電極アレイ技術
Dong-Wook Park, Amelia A. Schendel, ...Justin C. Williams
ネイチャーコミュニケーションズ 5巻 記事番号：5258（2014）
公開日：2014年10月20日
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概 要
紫外線から赤外線までの広い波長域を透過する神経微小電極アレイは、電気生理と光学イメージングを同時に実現し、さらに脳組織の光遺伝学的変調を可能にすることが期待される。また、神経用マイクロ電極の長期的な生体適合性と信頼性には、機械的な柔軟性と軟組織との適合性が必要である。
本論文では、グラフェンを用いた炭素層電極アレイ（CLEAR）デバイスを紹介します。このデバイスは、ネズミの脳表面に移植して高解像度の神経生理学的記録を行うことができます。このデバイスの光学的透明性は、紫外から赤外までのスペクトルにおいて90%以上であり、この広いスペクトル透明性を利用した光インターフェース実験により、その有用性を実証しています。具体的には、電極直下の皮質局所領域の光遺伝学的活性化、蛍光顕微鏡による皮質血管系のin vivoイメージング、3次元光コヒーレンス・トモグラフィーなどがあります。
本研究は、CLEARデバイスの様々なインターフェース能力と、神経アプリケーションにおけるその有用性を実証しています。
はじめに
神経インターフェースは、神経組織と生体外環境との間の接続を可能にします。これらのデバイスは神経科学の研究に役立つだけでなく、パーキンソン病、脊髄損傷、脳卒中など、多くの神経細胞障害に悩む患者の治療にも役立っています。光遺伝学の登場は、神経細胞を光刺激に反応するように遺伝子改変する新しい技術であり、神経科学研究に革命をもたらしただけでなく、神経インターフェースデバイスに求められる要件も一変させました1。現在、光遺伝学的に大脳皮質を刺激し、同時に誘発された反応を記録することが望まれています。マイクロエレクトロコルチコグラフィー（micro-ECoG）デバイスなどの神経表面電極アレイは、侵襲性と記録される信号の質のバランスをとることができます2,3,4,5. しかし、これらのデバイスは不透明な金属導電材料を使用しています。そのため、電極部位の周囲を刺激することは可能ですが、電極と組織の界面を直接刺激することはできません6。インビボ・イメージング法のさらなる進歩により、移植された電極アレイに対する組織の反応に関する貴重な情報が得られ、組織の挙動と記録された信号の相関をとるのに役立つ可能性があります7。現在までのところ、これらの方法は、主にマイクロECoG電極の周囲の組織をイメージングするために使用されています。なぜなら、電極と組織の界面におけるイメージングは、導体の不透明性のために不可能だからです7。そのため、イメージングデータと神経信号の相関をとることが困難であった。完全に透明なマイクロECoGデバイスの開発は、オプトジェネティクスと皮質イメージングの両方のアプリケーションにおいて、神経研究の進歩にとって貴重であり、脳機能への洞察をもたらし、神経インターフェース治療への応用をさらに向上させると期待されます。
これまで、透明マイクロECoGアレイは、太陽電池によく使われる透明導電体であるインジウム-スズ酸化物（ITO）を用いて作製されてきた8,9。しかし、ITOはさまざまな理由から、マイクロECoG技術に用いるには適していない。まず、ITOはもろいため、フレキシブルエレクトロニクスへの応用には向いていない10。マイクロECoGの大きな利点は、皮膜表面に適合することであるため、ITOのもろさは制約になる。第二に、ITOの成膜には高温処理が必要であり、ガラス転移温度の低いパリレン基板を使用するマイクロECoGアレイには適さない11,12。第三に、ITOはプロセスに依存した透明性を持ち、紫外および赤外域に限定される13,14。神経イメージングやオプトジェネティクスの用途では、さまざまな種類のオプシンを刺激し、蛍光標識された細胞を可視化するために、幅広い波長（紫外線から赤外線まで）を使用することが必要とされます。そのため、汎用性を最大限に高めるには、幅広い波長域で高い透明性をもって光を透過できる神経インターフェースが有効である。
ITOの欠点により、透明なマイクロECoG技術はまだ慢性的な実装のために実証されていない。そこで、我々はグラフェンを用いた透明マイクロECoGアレイを提案し、完全な透明性を有し、広い波長範囲にわたって慢性的に安定なデバイスの実現を目指す。
グラフェンは、その優れた電気・熱伝導性、転写性、強度、調整可能な電子特性から、さまざまな用途で広く研究されている15,16,17。
さらに、グラフェンの生体適合性、広範な透明性、柔軟性、大量生産性から、ITOに代わる神経インターフェースデバイスの理想的な候補とされています18,19,20,21。ここでは、グラフェンを用いた神経インターフェース用炭素層電極アレイ（CLEAR）デバイスの作製方法を報告し、電気生理学、オプトジェネティクス、皮質イメージング実験における生体内での長期安定性と生存性を実証する。
研究成果
CLEARデバイスの作製
ラマン分光法によるグラフェンの特性評価（補足情報参照）に続き、埋め込み型グラフェン神経電極アレイを4インチシリコンウェハ上に作製した。図1aは、作製プロセスの簡略図である。まず、ウェーハにパリレンC膜を化学気相成長法（CVD法）でコーティングした。次に、電子ビーム蒸着とリフトオフ技術により、接続パッドとトレースの初期部分に金をパターニングした。トレースとパッドに金を使用するのは、脳信号をコンピューターに読み込む際に使用するゼロ挿入力プリント基板（PCB）コネクターとの良好な機械的接続を確保するために必要であった。電極の脳との接触部分には、グラフェンの転写とパターニングを行い、電極の脳との接触部分が透明になるようにした。メタライゼーション後、ウェーハ表面に4枚のグラフェン単層膜を、図S1～S4に示す湿式転写技術によって順次転写・積層した。次に、この後の反応性イオンエッチング（RIE）工程でグラフェン層がエッチングされないように、犠牲層としてSiO2を堆積させた。その後、RIEを用いてグラフェンをパターニングして電極サイトを形成し、さらにパリレンCの絶縁層を成膜した。その後、RIEにより、電極サイトとパッドを露出させ、アレイの外形を形成した。最後に、デバイスをウェーハから剥がし、ウェットエッチングによってSiO2保護層を除去し、PCBコネクタにアレイを挿入した。詳細な製造プロセスおよびラマン分光法によるグラフェンの特性評価については、それぞれ補足図S5およびS6に記載した。
図1 CLEARミクロECoGデバイス
(a) 基本的な製造工程：パリレンC/シリコンウエハ上のトレースと接続パッドのメタルパターンニング。シリコンウエハはハンドリング基板となる。4枚の単層グラフェンを順次転写・積層する。グラフェンをパターニングし、電極サイトを形成する。2回目のパリレンCの蒸着とパターニングにより、デバイスの外形を形成する。シリコンウェハーからデバイスを取り外す。
(b) CLEARデバイスの層構造を示す図。
(c）CLEARデバイスの柔軟性を示す図。半径2.9mmのガラス棒にデバイスを巻き付けたところ。
(d）ラット脳サイズのCLEARデバイス：白い破線で囲んだ部分（電極面積3.1×3.1mm2）。
(e）ラット用デバイスの拡大写真。パリレンC基板上の透明グラフェン電極の部位と痕跡を示す。この面は脳表面に接している。スケールバー：500μm。
(f）ゼロ挿入力（ZIF）PCBコネクタを備えたマウス脳サイズのCLEARデバイス（電極面積：1.9 × 1.9 mm2）。
デバイスの特性評価
完成したデバイスの開口性は、電気インピーダンス分光法によって検証された。インピーダンススペクトルは、Autolab PGSTAT12ポテンショスタットを使用して、各電極部位について取得された。デバイスはPCBコネクタを介してAutolabマシンに接続され、PCBコネクタは32チャネルのTucker-Davis Technologies（TDT）ヘッドステージに接続された。インピーダンスは、10～30,937 Hzの30種類の周波数で評価された。電極部位が1kHzの周波数で600kΩ以下のインピーダンスを示した場合、その部位は移植可能であると判断された。1キロヘルツの周波数が評価に選ばれたのは、神経インピーダンス解析の一般的なベンチマークであることが知られているからである22,23。図2aは、生理食塩水でテストしたCLEARと従来のプラチナ製マイクロECoGデバイスの代表的な電気インピーダンススペクトルを示しています。プロットから明らかなように、CLEARデバイスの場合、位相角が高いことがわかります。これは、リアクタンスの値が、白金よりもグラフェンサイトの方が高いことを意味している。しかし、周波数1kHzにおけるインピーダンスの平均値は、白金アレイよりもCLEARデバイスの方がわずかに高かった（グラフェン243.5±5.9 kΩに対して白金188.8±92.9 kΩ）。信号記録装置には高入力インピーダンス増幅器が使用されているため、このリアクタンスの違いが信号記録に悪影響を与えることはないと考えられる。
(a) 生理食塩水中におけるCLEARおよび白金マイクロECOGデバイスの電気インピーダンス・スペクトル。x軸は実インピーダンス、y軸は虚インピーダンスを表す。各ポイントは、10Hzから31kHzの間で異なる周波数で取得された。
(b) CLEAR、金、白金マイクロECOGアレイの16箇所の電極の平均CV結果。
(c) CLEARと金のマイクロECoGアレイの16電極部位の平均CV結果。
(d) CLEARおよび白金マイクロECOGデバイスの平均アーティファクト効果試験結果。青色レーザーに取り付けた光ファイバーで各デバイスの単一電極部位に光を照射し、63.7mW mm-2のパワーで3ミリ秒間印加した結果。
(e) グラフェン層数の関数としてのシート抵抗の傾向。エラーバーは、5つのサンプル測定から抽出したシート抵抗のs.d.を表す。
(f）15μmのパリレンCフィルム上の1マスあたり76Ωのグラフェン単層（CLEAR）、1マスあたり76Ωのグラフェン単層（Graphene）、パリレンCフィルムのみ（Parylene）、1マスあたり60ΩのITO/PETおよび1マスあたり100 76Ω ITO/PET フィルムに関する光透過率試験結果。
(g) 各種導電材料（グラフェン、ITO、極薄金属）の透過率対シート抵抗のグラフ。
インピーダンス分光法に加えて，サイクリックボルタンメトリー（CV）を，一部のCLEARデバイスと，比較のために金と白金の電極サイトを持つデバイスで実施した。CVは、Autolabシステムを使用しても実施されました。CVスキャンは、0.0105Vのステップ電位と0.0500V s-1のスキャンレートで-0.6から0.8Vまで行った（refs 24、25）。電圧範囲は水の窓の中に収まるように選択した。金、白金、CLEARデバイスの平均CVカーブをFig.2b,cに示す。白金デバイスのCV結果は、金デバイスやCLEARデバイスのCV結果とは大きく異なっていた。これは、白金電極サイトがより大きな電荷運搬能力を持つことを示しているが、CLEARデバイスを神経インターフェース用途に使用することを否定するものではありません。実際、クリア電極と金電極の平均寿命曲線はほぼ同じであった。金は記録用電極サイトの信頼できる材料であることが証明されているため26,27、このことは、グラフェン導体も十分であることを示唆している。
完全に透明な神経表面電極アレイを構築することで、光刺激をアレイを通して、記録を取得する脳部位に直接届けることができ、光遺伝学28と電気生理学を組み合わせたユニークな研究機能を実現することができる。電極が光学的に透明であっても、高強度の光が電極部位に直接照射されると、アーチファクトが発生する。このアーチファクトは、一般に光遺伝的に誘発される神経信号よりも振幅が小さく、時間的に異なる。このアーティファクトは再現性があり、電極部位を生理食塩水でテストしたり、野生型動物に移植したり、死体実験でテストすることで特徴付けることができます。アーティファクトをテストするために、デバイスを生理食塩水中に下向きに置き、100mW、473nmのダイオードレーザーに接続した200μmの光ファイバーを使って、電極部位の裏側に光を照射した。光パルスは、レーザーに3Vを3ms印加することで照射した（最大63.7mW mm-2）。図2dは、グラフェンおよび白金サイトへの光照射によって誘発された電気パルスを示す。この図から、アーチファクトの振幅はグラフェンと白金の両サイトで同程度であることがわかるが、白金電極の方がより早くベースラインに戻っていることがわかる。これは、1839年にベクレルが初めて示した古典的な光電気化学効果であるベクレル効果として知られている（参考文献29, 30）。詳細は、光遺伝学的試験のセクションで、さらなるin vivoの実験と分析について説明します。
CLEARデバイスの光遺伝学的応用にとってもう1つ重要な特性は、グラフェン電極部位とパリレン基板を透過する光の量である。透明なデバイスは、画像化すると同時に脳組織に光を投影することができるため、アレイに入射する光の大部分がデバイスを透過することが重要である。材料には、透明性と導電性の間にトレードオフが存在する。一般に、材料の厚みを増すと、導電性は向上するが、透明性は低下する。このトレードオフは、グラフェンの場合にも存在する。Bae ら（21）は、グラフェン単層を1層から4層にすると、コンダクタンスが増加（つまり、S7）。図2eは、1層および4層グラフェンにおいて、シート抵抗が1平方あたり152Ωから76Ωに減少していることを示している。これは、前回の報告書と同様のシート抵抗の傾向を示している。なお、報告値よりも相対的に高い値は、そのHNO3ドープグラフェンに起因するものである21。CLEARデバイスでは、90％程度の透過率を維持しながらシート抵抗が最小となるように4層グラフェンを選択した。また、4層グラフェンは、転写プロセスで各グラフェン層が機械的に剥がれる可能性があるため、層数の少ないグラフェンよりも高い歩留まりが期待される。
図2fは、パリレン、4層グラフェン、CLEAR（4層グラフェン／パリレン）、ITO／PET（ポリエチレンテレフタレート）膜の波長に対する光透過率をプロットしたものである。紫外可視分光光度計を用いて、300〜1,500nmの光の波長について測定した。透過率曲線の形状が正弦波であることは、パリレンC材料で共通である31。CLEARデバイスでは、基板に入射した光の平均約90%が目的の波長（チャネルロドプシンの励起には470 nm、ハロロドプシンの励起には570 nm）を透過していることがわかった。これは、これまでに報告された結果と同様であり、多くの光遺伝学的および画像処理に十分である。
これは、以前に報告された結果と同様であり、多くのオプトジェネティックおよびイメージングアプリケーションに十分なものである9,32。CLEARフィルムとITOフィルムを比較するため、シート抵抗値が同程度の市販のITO/PETフィルム（60Ω/□と100Ω/□）も同じ装置で測定した。両フィルムとも、可視赤外域では平均80%程度の透過率を示し、紫外域付近では劇的に透過率が低下していることがわかる。また、420〜440nmの領域で〜10%の透過率の差があり、これはITO膜の特性の違いに起因するものであることがわかった。
図2gには、グラフェン、ITOおよび金属超薄膜をより定量的に比較するために、透過率およびシート抵抗の測定値を、文献で報告されているさまざまな値とともにプロットしている。シート抵抗は、導電性材料の評価や比較に広く用いられている13,14,21,33,34。このプロットから、与えられたシート抵抗の範囲では、グラフェン膜は90%を超える透過率を示し、ITOおよびITO/PET膜は80%に近い透過率を示していることがわかる。さらに、超薄膜金属は透過率がはるかに低い（〜60％）。この比較から、CLEARデバイスの光透過率は、ITOや超薄膜金属よりも優れていることがわかります。
神経信号とインピーダンスの記録によるin vivo検証
CLEARデバイスのin vivo性能を実証するために、4匹のラットと5匹のマウスにアレイを移植しました。1匹の野生型マウスはイメージング用、4匹のThy1::ChR2マウスはイメージングとオプトジェネティックテスト用として使用しました。表1は、それぞれのケースで行われた移植の種類と、各動物から収集されたデータの種類を説明しています。ラットの移植のうち3例は、公平な比較のためと全体の動物数を減らすために、CLEARと白金デバイスを同じ動物内に移植した両側移植であった。
図3aは、同じ動物に移植されたCLEARと白金マイクロECoGアレイの平均電極部位インピーダンス（デバイス移植の初日から測定）を経時的にプロットしたものである。どちらのデバイスも移植後最初の10日間でインピーダンスが急上昇したが、これはおそらく移植されたアレイに対する初期の組織反応によるものである22。この最初の急激な上昇の後、インピーダンスは、若干の日々の変動はあるものの、プラトー状態にあるようである。これらのインピーダンス曲線の形状は、硬膜外埋込型マイクロECoGデバイスに特徴的である7。CLEARとプラチナのマイクロECOGデバイスのインピーダンスの変化には、植え込み期間全体にわたって統計的に有意な差がなかったことから、CLEARデバイスは、探索した期間中、プラチナデバイスと同様に機能することが示唆される。
(a) 同じ動物に移植されたクリアとプラチナのマイクロECoGデバイスの縦方向1kHzのインピーダンスの平均値。エラーバーは16チャンネル測定から抽出されたインピーダンスのs.d.を表す。
(b）デクスメデトミジン下のCLEARおよび白金デバイスのベースライン信号パワースペクトル（ジャックナイフ再サンプリングによる95％信頼区間付き）。
(c) デクスメデトミジンとイソフルランという2つの鎮痛条件下でのCLEARデバイスのベースライン信号パワースペクトルを覚醒条件と比較。
(d) アレイの反対側にあるラットの後肢の坐骨神経を電気刺激してCLEARデバイスで記録した感覚誘発電位。デバイスは体性感覚皮質の上に埋め込まれた。刺激は3mAと1.5mAの電流レベルで1ms印加した。xスケールバー：50ms、yスケールバー：100μV。
図 3b は、CLEAR と白金マイクロ ECoG デバイスの単一チャンネルで記録したベースライン局所電位のパワースペクトルを 1-100 Hz の周波数帯で示したものである。縦方向のインピーダンスデータと同様に、2つの異なるアレイによって記録された信号の間にはほとんど差がない。CLEARデバイスとプラチナデバイスの95%信頼区間は重なっており、異なるデバイスによって記録された信号の間にほとんど差がないことが示唆される。この類似性は、高周波領域（1-600Hz）においても同様に示されている（補足図S8a）。さらに、図3cは、デクスメデトミジンとイソフルランという2種類の麻酔薬を用いて動物を麻酔した状態で得られたベースラインスペクトルである。デクスメデトミジンは睡眠様リズムを誘導し、低周波の振動が多くなるのに対し、イソフルランは図に示すように、一般的な信号パワーを抑制している。デクスメデトミジン、イソフルランともに、80Hzで高ガンマ-6dBを抑制しており、覚醒状態と比較して75%の振幅の減少が見られる。これは、ECoGベースのブレイン・コンピュータ・インターフェイスのアプリケーションに有用であることが判明している高ガンマ信号を、透明な電極が拾うことができることを示唆している35,36。
ベースライン信号の記録とインピーダンス分光法の測定に加え、ラットは電気誘発電位についても実験された。これらの実験では、動物の後肢を坐骨神経の上下に設置した表面電極で刺激した。刺激は1msの二相性電気パルスで、振幅は1～3mAに変化させた。誘発電位は、電気刺激に対する体性感覚反応であることを確認するため、植え込み装置の同側と反対側の両方で刺激を加えて記録された。もしそうであれば、脳幹と脊髄の神経経路が交差しているため、植え込み型電極アレイの対側に刺激を加えたときのみ誘発電位が見られるはずである。図3dは、対側に植え込んだCLEARデバイスの2つの刺激レベルにおける誘発電位の結果をまとめたものである。この結果は、〜100μVの誘発電位で神経反応を示している。同側の脚部刺激で装置に記録された信号は、対側で見られた神経誘発電位を欠いていた（補足図S8b）。一般に、図3に表示された結果は、グラフェン電極部位が、自発的なベースライン活動と誘発神経信号の両方を、白金部位と同じレベルの明瞭さで記録でき、概して同様のインピーダンス挙動と経時安定性を有することを示している。
オプトジェネティック試験
3匹のThy1::ChR2マウスに、光遺伝学的評価のためにCLEARデバイスを終末移植しました。これらのマウスは、チャネルロドプシン-2タンパク質を発現するニューロンを持ち、青色光（473 nm）にさらされると励起されやすくなっている。図4cに、3種類の光強度の刺激に対する平均誘発反応を示す。刺激時間は3msである。最初のピークは予想される刺激アーチファクトに対応し、2番目の長いピークは誘発された神経反応である。刺激アーチファクトのピークは刺激開始後3msで検出され、誘発神経反応のピークは刺激開始後7.7msの潜伏時間を持つ。これらの潜時は、最終的に意図する実験要件の詳細（すなわち、光強度、刺激時間、刺激間間隔）に大きく依存する。このことは、多くの実験パラダイムにおいて刺激アーチファクトは誘発された神経反応と完全に区別されるであろうし、他の実験パラダイムにおいてはかなりの重複があり得るという論理的帰結を導くものである。
(a) マウスの大脳皮質に埋め込まれたCLEAR装置と、光ファイバーで神経細胞に青色光刺激を与えている様子を示す光実験の模式図。
(b) Thy1::ChR2マウスの大脳皮質に埋め込まれたCLEAR装置から光ファイバーで青色光刺激を照射している画像。
(c) CLEAR装置で記録した光誘発電位。Xスケールバーは50ms、Yスケールバーは100μVを表す。
(d) CLEARデバイスの電極部位11に光照射し、レーザーを24.4mW mm-2に設定した死後のコントロールデータ。xスケールバー、50ms；yスケールバー、100μVを表す。
実験が終了した後、動物を殺し、記録された信号が光刺激の影響を受けた神経細胞からのものであり、アーチファクトによるものではないことを確認するために、殺した動物の体性感覚野にCLEAR micro-ECoGアレイを設置した対照実験を実施した。Fig. 4dから、死後の対照実験から得られた信号は、生きている動物から記録された信号とは、時間的にも、負のピークの振幅によっても異なっていることがわかる。これらの結果から、Fig.4cの信号は光刺激に対する誘発性神経応答であることが示された。
また、CLEAR装置の空間分解能の向上を実証するために、1.24mW mm-2という低パワーの光で実験を行った。この低パワーの光は空間的な広がりを少なくするため、活性化される神経組織の体積もより限定され、その反応をより焦点の合った領域で検出することができた。補足図S9aは、低強度の光刺激で、比較的局所的な脳領域（この場合は1つの電極部位が主）を活性化することが可能であることを示している。この場合、神経反応の振幅も、補足図S9bで使用した高い光強度（24.4mW mm-2）と比較して減少している。これは、光刺激の半径と深さが減少したことにより、刺激されるニューロンの体積が減少したことに起因する37。
より詳細なアーティファクト解析のために、光刺激タイミングとパワーの依存性を調べた。光刺激アーチファクトは、あらゆる種類の記録電極にとって重要な考慮事項であり、導体-電解質界面のイオン電荷移動層により回避することが困難である。イオン性溶液中の導電性材料は、一般にベクレル効果を受ける。これは、1839年にベクレルが初めて示した古典的な光電気化学効果で、従来の金属電極の刺激アーティファクトの主なメカニズムとして知られている29,30。グラフェン自体は金属のようなゼロバンドギャップの性質を持ち、それ以上のバンドギャップ工学を必要としない導電材料である15,17。したがって、グラフェンの仕事関数が比較的高い（4.5 eV）ことから、古典的な光電効果がアーティファクトに寄与することは考えにくい。本研究の実験によると、グラフェンと白金電極のいずれにおいてもアーティファクトの振幅レベルは同程度であり（図2d）、同様の根本的なメカニズムがあることが示唆された。また、追加の実験でも、金属電極の場合と同様の光刺激時間およびパワーへの依存性が示された（補足図S10）( http://www.openoptogenetics.org/index.php?title=Light-Induced_Artifact.)38. 刺激時間を3msから25msに増加させると、アーチファクトの振幅が増加したが、これは金属電極を変化させた場合の既報告と同様である( http://www.openoptogenetics.org/index.php?title=Light-Induced_Artifact. )。また、刺激時間の増加に伴い、アーティファクトのピークも時間的に増加した。また、光パワー依存性は金属電極38と同様であり、刺激パワーの減少に伴いアーチファクトは減少した（Supplementary Fig.S10b）。刺激パワーを下げるとアーチファクトが著しく低下することは、従来の金属電極の挙動から予想されることであり、興味深い点である。したがって、従来のイメージングパラダイムで受けるような低レベルの光刺激で刺激アーチファクトが減少または除去される可能性があることに注目することが重要である。また、他の光遺伝学的研究で提案されているように、刺激アーチファクトをさらに特徴づけ、低減するために、他の戦略も採用することができる39 、電気刺激アーチファクトを扱う際に同様に成功しているもの40 。グラフェンデバイスの全体的な性能と潜在的なアーティファクトの原因を完全に明らかにするためには、さらなる研究が必要である。
In vivoイメージング
移植された動物のサブセットは、Schendelらによって以前に説明された頭蓋窓イメージング法によってイメージングされた。7 CLEAR micro-ECoGデバイスを通した皮質血管系の代表的な画像を図5a～dに示す。左の列の画像は明視野で撮影され、右の列の画像は、血管を蛍光標識するためにフルオレセインイソチオシアネートデキストランを尾静脈注射して青色光（470 nm）下で撮影されたものである。これらの画像は、グラフェン電極部位の鮮明さ、CLEARデバイスを通して大脳皮質と脳血管系を見ることができることを示す。透明なグラフェン電極部位を通して撮影した血流動画の記録は、補足動画1および2で見ることができる。図5e,fは、白金マイクロECoGアレイの頭蓋窓画像で、電極部位と痕跡がはっきりと見える。
(a) CLEARデバイスをマウスの大脳皮質に移植し、頭蓋窓の下に置いたときの明視野像。
(b) aと同じデバイスの蛍光画像。マウスにフルオレセインイソチオシアネート-デキストランを静脈内注射し、血管系を蛍光標識している。
(c,d) a,bと同じ装置の高倍率明視野像と蛍光像。
(e,f) 白金電極部位を有する標準的なラットサイズのマイクロECoGアレイの明視野像および蛍光像。スケールバー、500μm (a,b), 250μm (c,d), 750μm (e,f)。In vivo血管系イメージングを3匹のラットで繰り返し、それぞれCLEARと白金マイクロECoGアレイを使用した。画像は発表されたデータおよび既報のデータの代表的なものである7,50。
大脳皮質血管の蛍光イメージングに加え、光コヒーレンス・トモグラフィー（OCT）イメージングでは、赤外スペクトル領域での高い透明性に基づくCLEARデバイスの能力が発揮される。図6a,cに示すように，脳血管の構造は，デバイスを通して3次元（3D）OCTアンギオグラム41,42,43として捉えることができる．さらに、図6b,dにCLEARデバイス下の血流の2つの典型的な速度プロファイル44,45,46,47を示す。これらの画像では、右側に金のトレースによる暗線が見えるが、アレイの中心部には暗線がなく、血管も容易に確認することができる。図6eはCLEAR装置で造影した後の典型的な断面血管像である。OCTシステムは、電極部位と電極跡の下にある血管を検出することができる。血管造影データの3D可視化48は、図6fに示されている。構造データはグレーで、血管は赤で表示されている。白金デバイスの同様のデータは、図6g-jに示されており、白金電極部位の不透明さを示しています。CLEARと白金デバイスの3次元構造動画は、それぞれ補足動画3、4で見ることができます。この比較から、CLEARデバイスが従来の白金デバイスに対して優位であることがわかる。さらに、OCTは赤外光の波長を使用するため、ITO系デバイスでは作製プロセスによってはアーティファクトが発生する可能性があることに留意する必要があります。
(a,c) CLEARマイクロECoGデバイスを通して見える皮質血管を示すOCT血管像の最大強度投影（MIP）（それぞれFOV 2.8 × 2.8 mm2 および 1.1 × 1.1 mm2）。
(b,d) CLEAR装置下の血管を流れる血液の方向性を示すドップラー血流速度画像（FOV 2.8 × 2.8 mm2, 1.1 × 1.1 mm2）。赤色は水晶体に向かって流れる血液、緑色は遠ざかっていく血液を表しています。
(e）造影・デシャドウ後の断面血管像（CLEAR装置）。
(f）構造データ（グレー）に重ねた血管（赤色）の3D可視化（CLEARデバイス）。
(g) 白金マイクロECOGデバイスによる血管造影のMIP。
(h) 対応するドップラー血流速度測定。
(i）対応する血管断面図。
(j）白金電極を用いたマイクロECoGアレイの血管構造の3D可視化。スケールバー：200μm (a,b), 100μm (c-i)。
考察
本研究の結果、CLEAR micro-ECoGデバイスは、白金アレイと同程度の鮮明さで神経信号を記録でき、同等の縦方向組織応答を有することが実証された。白金アレイとは異なり、CLEARデバイスでは、グラフェンの幅広いスペクトル透明性により、電極部位を通して直接、光遺伝学的刺激と蛍光およびOCTイメージングを行うことが可能です。CLEARデバイスの電極サイトの密度を高めれば、記録された信号の空間分解能を向上させることができる。もし、不透明な金属電極アレイを用いて電極サイトの密度を高めると、電極だけでなくトレースも含めて金属材料の量が増えるため、刺激光の割合がますます増えてしまう。皮質表面記録の空間分解能には、おそらく根本的な限界があり、この分野ではまだ活発な研究が行われている4。しかし、表面電極のチャンネル数を増やそうとする動きがあり、電極部位だけでなく、電極のリード線の密度が高くなることで、同様の問題が発生します。電極のレイアウト設計の大部分では、リード線はより内側の電極の間を横切るため、従来の金属導体を使用した場合、チャンネル数が増加すると、デバイスの中心部では不透明なリード線の密度がますます高くなることになります。このデバイスの長期安定性については、生体適合性と記録信号の質の両面から今後の研究が必要であるが、これらの知見とCVDグラフェンの生体適合性を報告したこれまでの研究から、CLEARデバイスは神経インターフェース用途に適したマイクロ電極アレイであることが示唆された。このグラフェンデバイスは、機械的柔軟性が飛躍的に向上し21、関連するスペクトル領域での透明性が大幅に向上しているため、現在のITOベースの透明電極技術よりも優れている。グラフェンの調整可能な電気特性は、将来的にこれらのデバイスへの能動的な電子素子の集積につながる可能性がある。透明な神経インターフェース研究の今後の方向性としては、CLEAR技術によるこれらの特性の探索と実装が考えられる。
現在、この技術は高密度表面アレイを中心に実装されているが、この原稿で説明した製造技術は、単一ユニット、マルチユニット、および局所フィールドを記録できる貫通型多電極アレイの製造にも容易に対応できるものである。この可能性のある研究に対する唯一の大きな障害は、この超柔軟なデバイスの挿入に関わる課題である。柔軟なポリマーベースの貫通デバイスを挿入する問題に取り組んだ多くの研究があり49、これらと同じ戦略がCLEAR技術で実行可能であろう。さらに、グラフェンの利点として提案されているのは、グラフェンを用いたトランジスタをモノリシックに集積して、能動回路をデバイスに組み込むことができる点である。回路を追加するためには、電極、トレース、回路素子の透明化がさらに必要になる。
CLEAR技術の利点は、特に光学イメージング用途で顕著に現れます。今回の OCT 実験で実証されたように、CLEAR 電極は、従来の金属電極と比較して、3D イメージング用途で劇的な改善を示しています。特に、多光子共焦点イメージングや OCT などの高度なイメージングモダリティにおいては、グラフェンの赤外スペクトルにおける優れた性能により、ITO などの他の透明材料よりも魅力的な選択となります。また、多光子励起やホログラフィーを用いた新たな技術により、より微細な刺激分解能や大脳皮質内の深部への刺激が可能になり、いずれもグラフェン電極材料の広いスペクトル透明性による恩恵が期待される。また、本研究で提示された光刺激は、光遺伝学的入力の上限範囲にあり、この技術にとって最悪のシナリオを示すものであることも注目すべき点である。提案されているイメージング用途では、かなり低い出力レベルを使用し、時間的な活性化パターンを大幅に減少させる。グラフェン電極は、意図されたイメージング用途の大部分において「アーティファクトフリー」であると考えられる。
オプトジェネティック実験、蛍光顕微鏡やOCTを用いた皮質血管のin vivoイメージングにより、このデバイスのユニークな能力がさらに明らかにされましたが、これはその幅広いスペクトル透明性によって可能になったものです。本研究は、CLEARデバイスの幅広いインターフェース能力を実証し、神経およびその他の生物医学的応用への幅広い有用性を示している。
研究方法
デバイスの作製
シリコンウェハーをCVDプロセス（SCS Labcoter 2 Parylene Deposition System）により15 μmのパリレンCでコーティングした。パリレン基板上に10ナノメートルのクロム（Cr）と200ナノメートルの金（Au）を蒸着し、リフトオフ技術でパターニングして、接続パッドと電極トレースの初期部分を形成した。
金属蒸着後、付録の手順に従い、4枚の単層グラフェンを基板上に転写した。次に、積層したグラフェンを30nmのSiO2犠牲層でコーティングし、その後のRIE工程でのダメージから保護した。次に、酸素プラズマを用いたRIEによってグラフェンとSiO2層をパターニングし、各金パッドに接続された16個の電極サイトを形成した。
その後、パリレンCをCVDでさらに10μm堆積し、フォトリソグラフィーとRIEでパターニングして、アレイの外形を形成し、電極サイトとパッドを開口させた。アレイは、脱イオン水に浸してシリコンウェハーから剥離した。最後に、1:6緩衝酸化物エッチャントを使用して保護SiO2層を除去した。その後，各デバイスのパッド領域にポリイミド補強材を接着し，アレイの厚みを十分大きくして，挿入力ゼロのPCB（Imagineering Inc．イリノイ州エルク・グローブ・ビレッジ）に良好に接続できるようにした．詳細な工程図は、補足図S5に記載されている。
外科的移植
すべての動物処置は、ウィスコンシン大学マディソン校のInstitutional Animal Care and Use Committeeによって承認された。外科的処置およびin vivoイメージングセッションは、麻酔下で行われ、動物の不快感を最小限にするためにあらゆる努力がなされた。CLEARおよび白金MicroECoGアレイは、雄のSprague-Dawleyラット〜2ヶ月齢、雄および雌のThy1::ChR2/H134R-YFP (Jackson Labs 012350) および野生型マウス〜6〜16週齢に移植された。術前にブプレノルフィン（疼痛管理用）およびデキサメタゾン（脳腫脹防止用）の注射を受けた後、動物をイソフルランガスで麻酔し、頭部を固定した。頭蓋骨の上部を切開し、外科用ドリルを用いて開頭した。電極を体性感覚皮質の上に定位して、円形のガラス製カバースリップをアレイの上に貼り、頭蓋窓を形成した。カバースリップの端は歯科用アクリルで頭蓋骨に密閉された。接地線と参照線はステンレス鋼のネジに取り付け、頭蓋骨に穴を開け（ラット）、または接着剤で取り付けた（マウス）。すべての位置が決まった後、露出したネジを歯科用アクリルで覆い、滑らかな頭蓋内インプラントを形成した。その後、ラットではインプラントの周囲に皮膚を縫合し、動物を回復させた。動物は術後にブプレノルフィンの注射を受け、またインプラント後1週間アンピシリン抗生物質を投与された。
インピーダンススペクトルとベースライン信号の記録
デバイスの埋め込み後、電極部位のインピーダンススペクトルとベースライン信号の記録を取得した。インピーダンススペクトルは、ラットへの埋め込み期間中、最低でも週に3回記録された。電極部位インピーダンススペクトルは、Autolab PGSTAT12 (Metrohm Eco Chemie, Utrecht, Netherlands) を使用して生成した。ベースライン信号の記録は、TDT神経生理学作業システムを用いて得た。信号は、PCBコネクタに差し込まれた32チャンネルのアクティブTDTヘッドステージを介して記録された。ヘッドステージはTDT PZ2アンプに接続され、アンプはTDT RZ2システムに送る前に信号を増幅し、そこからコンピュータに送られた。各セッションで3～5分間のベースライン信号データを記録した。麻酔薬の違いによる神経信号活動への影響を調べる実験を除き、ベースライン信号の記録とインピーダンススペクトルの収集のために、動物は覚醒し行動していた。
電気誘発電位
動物は塩酸デクスメデトミジン（0.05 mg kg-1, Orion Pharma）で麻酔し、後肢を剃毛した。片足ずつに粘着性の表面電極を2個ずつ貼り付け、テープで固定した。これらの電極をBNC（Bayonet Neill-Concelman）ケーブルでTDT RZ2システムにリンクした刺激ボックス（A-M Systems Isolated Pulse Stimulator, Model 2100）にフックアップした。動物の電極は、TDTのヘッドステージとPZ2アンプを経由してRZ2システムに接続された。このようにして、RZ2システムから動物の坐骨神経に電気刺激を送り、体性感覚野の反応をCLEAR装置を通して記録し、コンピュータに返送した。終了後、塩酸アチパメゾール（0.3 mg kg-1、オリオンファーマ）の注射で動物を回復させた。
オプトジェネティック試験
CLEARおよび白金マイクロECoGアレイをThy1::ChR2マウス（Jackson Labs, 012350）の大脳皮質に移植したが、この場合、アレイの上に窓は置かなかった。その代わり、脳は開いたままにして、レーザー（Laserglow Technologies, Ontario, Canada）に取り付けた光ファイバーを大脳皮質に近接させた（Fig. 4a）。麻酔は、神経シグナルを抑制するイソフルランから、ケタミン（75 mg kg-1）とデクスメデトミジン（25 μg kg-1）の組み合わせに切り替えた。次に、最大出力63.7mW mm-2の高輝度青色光をCLEAR装置を通して脳のさまざまな部位に照射し（図4b）、同時に光刺激に対する神経応答を記録した。実験終了後、Fatal PLUSペントバルビトール溶液を腹腔内注射して動物を殺し、対照実験を行った。
In vivoイメージング
ライカMZ 16Fステレオスコープでイメージングを行った。動物はイソフルランガスと塩酸デクスメデトミジン（0.05 mg kg-1, Orion Pharma）の組み合わせで麻酔し、加熱したウォーターブランケット上で飼育した。呼吸のアーティファクトを防ぐため、動物の頭部を安定させた。動物に12 mg ml-1 フルオレセインイソチオシアネート標識デキストランをPBSに溶解したものを注射し、青色光下で血管を蛍光させた。電極アレイとその周囲の脳組織の明視野画像と蛍光画像が撮影された。さらに，ライカMZ16Fステレオスコープの光路とソニーHDR-SR11ハイビジョンビデオカメラを組み合わせて，血流動画を撮影した．
光コヒーレンス・トモグラフィー
3 次元 OCT 血管像と速度プロファイルを得るために，カスタムスペクトラルドメイン OCT システムを使用した．スペクトルドメインOCTシステムは、中心波長1,300nm、スペクトル帯域幅200nmの光源を使用し、シングルモードファイバーの先端で10mWの光パワーを供給した。このシステムは，10倍のテレセントリックレンズにより，軸方向5μm，横方向4μmの解像度を提供する。
断面OCTアンギオグラムは，各断面で10回のOCT Bスキャンを記録し，そのOCTデータに位相感応型アンギオグラフィ技術を適用して得た．2.8 × 2.8 mm2の視野では，650の断面アンギオグラムが得られ，各断面は650の横位置で構成されている。1.1 × 1.1 mm2 の視野では，断面像の数および横方向の位置の数は 500 であった．すべての断面血管像を積層してボリューム血管像を形成した後，3次元ぼかしカーネルを適用してノイズを低減し，血管像の2次元最大強度投影を得た．適応的ヒストグラム等化（MATLAB and Image processing toolbox Release 2012b, The MathWorks, Inc, Natick, Massachusetts, United States）を適用し，最大輝度投影画像のコントラストを向上させた．3次元可視化のために，3次元血管造影データの強度にバイアスをかけたシグモイド非線形変換を行い，コントラスト強調と血管のデシャドーを行った．シグモイド関数のバイアスは，この関数が0.5となる値に定義された．各ポイントにおいて，シグモイド関数のバイアスは，その上の血管造影の値に応じて決定した．
血流速度の測定は，1断面あたり3,500Aスキャン（FOV=2.8 × 2.8 mm2）または2,000Aスキャン（FOV=1.1 × 1.1 mm2）で組織をスキャンした。スキャンは500の組織断面、40,000A-scan/secの速度で行われた。各位置において、その位置での連続した7つのOCT信号からなる信号の平均パワースペクトル密度（ωa）を計算することにより、移動粒子によってもたらされるドップラーシフトを推定した。その深さでの軸方向速度は，.
追加情報
この記事の引用方法 Park, D.-W. et al. Graphene-based carbon-layered electrode array technology for neural imaging and optogenetic applications（グラフェンベースの炭素層電極アレイ技術による神経イメージングおよび光遺伝学的応用）. Nat. Commun. 5:5258 doi: 10.1038/ncomms6258 (2014) に掲載されました。
参考文献
元記事参照。
参考記事
DARPAは、電気的および光学的手法を同時に使用して神経組織を測定および刺激できる、はるかに小型で透明な接点を実証する概念実証ツールを作成しました。
ウィスコンシン大学マディソン校の研究者たちは、DARPAの信頼性の高い神経インターフェース技術（RE-NET）プログラムの支援を受けて、この新技術を開発しました。