オルガクアント、深層畳み込みニューラルネットワークを用いたヒト腸管オルガノイドのローカライゼーションと定量化

2022年8月26日 16:54

掲載：2019年8月28日
Timothy Kassis, Victor Hernandez-Gordillo, ...Linda G. Griffith
Scientific Reports 9巻記事番号：12479 (2019)

元記事はこちら。
https://www.nature.com/articles/s41598-019-48874-y

要　旨

　オルガノイド培養は、本来の組織の細胞成分を忠実に模倣した強力なin vitroモデルであることが証明されつつある。オルガノイドは通常、天然由来または合成の細胞外マトリックスを用いて3次元環境で展開・培養されます。
これらの培養物の形態や成長特性を評価することは、対応する画像に多くのアーチファクトが伴うため困難であった。単一細胞培養とは異なり、3次元培養環境におけるオルガノイドの位置特定と定量化を可能にする信頼性の高い自動セグメンテーション技術は存在しません。
ここでは、明視野画像中のヒト腸管オルガノイドのサイズ分布を特定および定量化できる、深層畳み込みニューラルネットワークの実装であるOrgaQuantについて説明します。

OrgaQuantは、パラメータの微調整を必要としないエンドツーエンドの学習済みニューラルネットワークであるため、ユーザーの介入なしに数千の画像を分析する完全自動化が可能である。OrgaQuantを開発するために、バウンディングボックスを用いて手動でアノテーションしたヒト腸管オルガノイド画像の独自のデータセットを作成し、TensorFlowを用いてオブジェクト検出パイプラインを学習させました。我々はデータセット、学習済みモデル、推論スクリプトを詳細な使用法と共に公開した。

はじめに

　今日の生物学的発見の多くは、in vitro細胞培養系を用いて行われている。これらの培養系により、研究者は特定の細胞種について仮説に基づいた研究を行い、その様々なプロセスを機構的に理解したり、製薬研究において薬剤をテストしたりすることができます。
従来のin vitro培養では、2次元表面上にプレーティングした初代細胞や不死化細胞株が用いられてきた。これらは有用ではあるが、複雑な生理的環境を忠実に再現することは難しく1、生体内の挙動を予測することはほとんどできない。
最近、「オルガノイド」培養と呼ばれるものが増えてきている2,3,4,5。オルガノイドは、一次ドナーまたは幹細胞から誘導された多細胞スフェロイドである。多くの点で、機能的にも細胞構成的にも親臓器に類似している。例えば、腸6,7,8、膵臓9,10,11、脳12、肝臓13、子宮内膜14などからのオルガノイドの樹立は、いくつかのよく知られた研究によって証明されています。オルガノイドは、発生を理解し、生理学を研究し、薬物を試験するための理想的なモデルシステムとして急速に普及しつつあります3,15,16。

標的臓器のin vivoでの機能性と細胞構成を再現するオルガノイド培養を成功させるには、研究者による膨大な量の最適化が必要である。
これらのオルガノイドを得るには、成長因子や構造的支持など必要な細胞外微小環境を提供する生体ハイドロゲルに埋め込んで、時間経過（数日から数週間）にわたってモニタリングする必要がある。
増殖や刺激条件によるサイズや形状などの形態変化を定量的に把握することは、研究への応用の基本である。現在、標準的な分化培養プロトコルは、細胞培養用マルチウェルプレートやペトリ皿のポリスチレン底部に置かれたゲル液滴（図1a）内に、これらのオルガノイドを形成することです。これらの培養をモニターするために、低倍率の対物レンズを使って明視野で液滴を撮影します（Fig. 1b）。

図1
図1
オルガノイド培養の画像化における課題。
(a) オルガノイドは通常、天然由来または合成の細胞外マトリックスから形成された3Dハイドロゲル液滴の中で培養されます。液滴は、マルチウェル培養プレートのポリスチレン底部などの透明な基質上に置かれる。各液滴は0個から数百個のオルガノイドを持つことができる。
(b) オルガノイド液滴は、低倍率の対物レンズを用いて、明視野モダリティで効率よく広視野を撮影することができる。
(c-h) 培養とイメージング方法の結果として、従来のセグメンテーションと画像処理技術を信頼できなくする様々なイメージングアーチファクトが存在する。これらのアーチファクトには、オクルージョンやオーバーラップ（c）、ピンぼけオルガノイド（d）、不均質なサイズ分布（e）、最適でない照明条件（f）、非常に高密度（g）または非常に疎（h）の培養が含まれます。

フルサイズ画像
得られた画像は、従来の画像処理技術を極めて困難にする多数の画像アーチファクトに悩まされています。アーチファクトには、オルガノイドの閉塞や重なり、スフェロイドのピンぼけ、サイズや形状の大きな不均一性、不適切な照明条件などがあります。

アーチファクトには、オルガノイドの閉塞や重なり、スフェロイドのピンぼけ、サイズや形状の大きな不均一性、照明条件、オルガノイドの高密度分布や疎密分布などがあります（図 1c～h）。これらのオルガノイドを手作業で計測・カウントすることは、非常に非効率的な作業である。そのため、ほとんどの研究では、限られた数の画像を手作業でスコアリングするか、画像を代表サンプルとして使用し、定量化はしていない。

最近、Bortenらは、これらの課題のいくつかに対処したエレガントなオープンソースのソフトウェアパッケージ、OrganoSeg17をリリースしたが、依然として従来の画像処理技術に依存しており、同様の光学条件を持つ任意の画像セットに対して複数のパラメータを調整する必要がある。しかし、深層畳み込みニューラルネットワークを用いたインスタンスベースの検出は、このような問題に対処するための有効なアプローチとなる。Tensorflow18をベースに、Googleは最近、物体検出API19をリリースし、様々な物体検出ニューラル・アーキテクチャの設定、トレーニング、テスト、実行を、以前より大幅に科学者が利用しやすくしました。このオブジェクト検出APIを利用して、我々は、誰でも典型的な明視野画像内のヒト腸内器官を自動的に検出し、位置特定することができる実用的なオープンソース実装、OrgaQuantをここに紹介します。トランスファー・ラーニング20の考え方に基づき、事前に学習させたニューラルネットワークをさらにオルガノイド画像で学習させ、各オルガノイドの周囲にバウンディングボックスを描くことで非常に高い精度を達成しました。バウンディングボックスが決定されると、下流処理により、サイズや形状の測定など、さらなる定量化が可能になります。本アルゴリズムは、パラメータチューニングを必要とせず、与えられたフォルダやサブフォルダ内のすべての画像に対して自律的に実行され、図1c-hで説明した様々なイメージングアーチファクトに対してロバストであることが特徴です。我々は、学習データセット、学習済みモデル、推論スクリプトを、詳細な使用方法とともに公開しています。また、すぐに実行可能なクラウド実装を www.scipix.io で公開しています。

研究成果

　明視野ヒト腸管オルガノイドの新しいバウンディングボックス注釈付き画像データセット
一般に公開されているデータセットがないため、バウンディングボックス座標が付与された約14,240個のオルガノイドからなる独自のデータセットを作成しました（図2）。データセット作成のワークフローについては、方法のセクションを参照してください。画像と注釈を含む完全なデータセットは、MITライセンスの下、https://osf.io/etz8r で公開されています。

図2
図2
データセット作成ワークフロー。(a) 1枚の画像を4倍の対物レンズで撮影し、クラウドソーシングコミュニティに負担をかけないよう、またニューラルネットワーク学習用ハードウェアのGPUメモリに収まるよう300×300（および450×450）のピクセルパッチに分割しています。(b）その後、パッチは、何をアノテーションするかという詳細な指示とともに、CrowdFlowerというクラウドソーシングプラットフォーム（現在はFigure Eightとして知られています）で配布されました。手法にあるように、品質を保証するためにいくつかの冗長性技術が使用されました。得られたデータセットには、画像中の各オルガネラのボックス座標（xmin, ymin, xmax, ymax）が含まれている。

ヒト腸管オルガノイドのローカライゼーションと定量のための高速、正確、パラメータレス、完全自動化アルゴリズム
OrgaQuantは、フォルダとサブフォルダ内のすべての画像を定量化するために実行可能な定量化Jupyter Notebookファイルを提供します。出力は、各画像のCSVファイルで、各オルガネラのバウンディングボックス座標、投影された2次元面積、およびオルガネラの長軸と短軸（楕円であると仮定）の長さが含まれています。推論スクリプトは、必要に応じてユーザーがサイズと重なり具合を設定できるスライディングウィンドウを使用して入力画像を定量化する（図3a）。スライディングウィンドウは、高解像度画像全体が入力として与えられた場合のGPUメモリの制限を回避するために使用される。各スライディングウィンドウのパッチの端にあるオルガノイドは無視されるので、ウィンドウ間のオーバーラップを使用する必要がある。出力は、すべてのラベルを集約した1枚の画像である。ラベル付けされた画像とCSVラベルファイルの両方が、オリジナルの入力画像と同じフォルダに保存されます。OrgaQuantのラベリング品質は、与えられた画像セット（図3b）に対して、平均平均精度（mAP）80%で人間のそれと区別がつきません（p=0.35）が、人間が25から284秒かかるのに対し、30秒/パッチ（NVIDIA Quadro P5000 GPU上）しかかからず、より高速で一貫しています（図3c）。

図3
図3
OrgaQuant を使用したオルガノイドの自動定量化。(a) 推論スクリプトは、個々のパッチ（サイズはユーザーが制御可能）上で実行される。画像全体をカバーするために、オーバーラップを持つスライディングウィンドウが使用される。元の入力画像は、水平・垂直の各スライディング軸を整数個のウィンドウがカバーするように、下辺と右辺（黒で示す）でパディングされている。すべての結果は自動的に集約され、完全にラベル付けされた画像とそれに対応するバウンディングボックス座標が得られる。(b) ヒトとOrgaQuantの測定値に差はない、N = 1,135 organoids。P = 0.35 (Welch's unpaired t-test) (c) OrgaQuantは我々の訓練された人間のアノテーターと比較して大幅に速く、パッチあたりの推論時間は常に同じです（使用するGPUによって約30秒）。N = 112人の異なる人間。

フルサイズ画像

考　察

　オブジェクトの検出とローカライズは、コンピュータビジョンアプリケーションにおける複雑な問題である。特に、高速な検出性能が要求される場合は厄介である。これまで、速度と精度のバランスを取るために、いくつかの検出アルゴリズムが実装されてきた。2 つの一般的なアプローチは、Single Shot Multibox Detector (SSD)21 と You Only Look Once (YOLO)22である。これらはリアルタイムの検出には理想的ですが、精度を犠牲にすることでスピードを達成しています。OrgaQuantでは、領域畳み込みニューラルネットワーク（R-CNN）、特にFaster R-CNNと呼ばれるものを実装することにしました。Faster R-CNNは、ResNet 10123やInception v224を含むいくつかの異なるアーキテクチャに基づく検出モデルを使用することができます。ここでは、TensorFlowオブジェクト検出APIで実装が提供されているInception-ResNet-v225というInception v2とResNetの両方に基づいたアーキテクチャを選択しました。このモデルは、ボックスアノテーションされたCOCOデータセット26で事前に学習され、我々の目的のために、我々のオルガノイドデータセットで学習することによってモデルを微調整した。Inception-ResNetモデルは多くのパラメータを持つため、非常に大きなデータセットを使用することが重要である。これを実現するために、方法セクションで説明したように、データセットを拡張した。

その結果、OrgaQuantの実装は、明視野画像内のオルガノイドを自動的にローカライズし、バウンディングボックスを用いてラベル付けすることができます。切り出されたオルガノイド画像は、下流の画像処理および解析パイプラインで使用することができます。この原稿で紹介するモデルは、トレーニングセットの性質上、球状のオルガノイド（すなわち、暗号化されていない構造を持つオルガノイド）しか正確に位置決めすることができない。ここでは、ヒトの腸内オルガノイドのサイズを測定する能力を示しましたが、畳み込みニューラルネットワークの重要な副産物として、他の様々な機械学習アルゴリズムで使用可能な特徴を抽出することが挙げられます。この特徴は、例えば、視覚的な類似性に基づいて類似したオルガノイドをクラスタリングしたり、通常の人間の視覚では必ずしも検出できない刺激に応じたオルガノイドの形態の微妙な変化を検出するために利用することができます。

また、各オルガネラは2次元空間に局在しているため、液滴内の各オルガネラの成長過程を時系列で追跡することも可能です。このためにOrgaQuantを明示的に使用しているわけではありませんが、フォルダ内のタイムラプス画像セットをロードして解析するのと同じくらい簡単です。我々はOrgaQuantが多くのエキサイティングでインテリジェントなオルガノイド定量化技術の基礎になると信じており、このオープンソースの実装をさらに発展させるために、オルガノイドコミュニティと協力することを楽しみにしています。

メソッド

　腸内オルガノイドの培養
消化器系の愁訴で内視鏡検査を受けた小児および成人患者の無患部十二指腸から非同定組織生検を採取した。すべての実験方法とプロトコルは、Boston Children's HospitalのInstitutional Review Board (IRB-P00000529)に承認され、それに従って実行された。
成人の患者および未成年のドナーの法的保護者からインフォームドコンセントを取得し、患者の同意を得て、すべてBoston Children's Hospitalで実施された。組織は2mg/mlのコラゲナーゼIで37℃、40分間消化され、その後機械的に解離させた。単離した陰窩は、成長因子低減（GFR）マトリゲル（Becton Dickinson）に再懸濁し、37℃で重合させた。オルガノイドは、L-WRN調整培地（50％vol／vol、ATCC、cat. No.）を添加したAdvanced DMEM／F12からなるオルガノイド拡大培地（OEM）中で増殖させた8、CRL-3276。CRL-3276）8、グルタミン酸、HEPES、マウス上皮成長因子（EGF、50 ng/ml）、N2サプリメント（1×）、B27サプリメント（1×）、ヒト［Leu15］-ガストリンI（10 nM）、N-アセチルシステイン（1 mM）、ニコチンアミド（10 mM）、SB202190（10μM）、A83-01（500nM）および Y-27632（10 μM）を記載27，28に従って添加して、Advanced DMEM／F12で構成されるオルガノイド拡張培地（OEM）を増殖させた。培地は 2 日ごとに交換し、オルガノイドは 4 日ごとに Cell Recovery Solution で 40 分間 4℃、その後トリプシン消化で 37℃、5 分間インキュベートして単細胞を得、継代した。単細胞を25μLのGFR Matrigelに25,000細胞の密度で播種した。合成ハイドロゲルを用いた実験では、単細胞を500cells/μLの密度で播種した。3 µLの細胞懸濁液（マトリゲルまたは合成ハイドロゲル）を96ウェルプレートにロードし、37℃で15-20分間ポリメラーゼをさせた。各ウェルに100 µLのOEMをロードした。培地は2日おきに交換した。

画像取得
ゲル滴に浮遊するオルガノイドの画像は、Thermo EVOS FL 顕微鏡を用い、4x 対物レンズを使用し、培養 4 日目と 6 日目に通常の明視野モードで取得した。画像は、スケールバーとともに 8-bit TIFF として保存した。1つの液滴に対して1枚の画像を撮影した。オルガノイドはゲル内に浮遊しているため、ユーザーの主観で判断して、最も多くのオルガノイドに焦点が合うようにフォーカスレベルを選択した。得られた画像は 1500 × 1125 ピクセルで、サイズは約 4.5 MB であった。

トレーニングデータセットの作成

ラベル付きオルガノイド画像のデータセットは一般に公開されていない。そのため、独自に作成した（図2）。各画像（約1500×1125ピクセル）は、300×300ピクセルと450×450ピクセルのパッチに分割されました。これは、元の画像が（1）大きすぎてGPUのメモリに収まらない、（2）数百個のオルガノイドがあるためラベル付けが難しい、という理由から、パッチを使用することが重要だったのです。パッチは、クラウドソーシングのプラットフォーム（Crowdflower.com、現在はFigure-Eightとして知られている）を使ってラベル付けされ、作業者は、ん焦点が合っていると考えられる（つまり、縁があまりぼやけない）各オルガネラの周りに境界線を引きました。ピントが合っている」という定義は非常に主観的なもので、手作業でラベリングする過程でそれを簡単に標準化する方法はありませんでした。各画像は2人の作業者によってラベリングされ、80%未満の一致（CrowdFlowerによるIntersection over Union (IoU) の計算による）の場合、3人目の作業者に提示され、さらにアノテーションが施されることになった。各画像に選ばれたバウンディングボックスは、全作業者の間で70％の合意があった場合にのみ選ばれる集合体であった。作業員には詳細な指示と例が提供され、作業員は品質テストを受けた後、タスクを完了することができた。さらに、個々のラベリングタスクには、データの完全性を保証するために、個別のテスト画像が用意された。得られたデータセットは1,750の画像パッチと合計14,242個のバウンディングボックスから構成される。このデータセットはランダムにトレーニングセットとテストセットに分けられた。トレーニングには13,004個のボックスがあり、テストには1,135個のボックスがあった。少なくとも1つのバウンディングボックスを持つ画像は1,745枚であった。バウンディングボックスのデータは'.csv'ファイルに格納され、各行には以下の内容が含まれる。

ファイル名：バウンディングボックスが配置されている画像名

幅、高さ：画像パッチのサイズ（我々の場合は300×300と450×450の2種類のパッチサイズがあった） 3.

class：バウンディングボックスのラベル。ここでは、「オルガノイド」のみをラベルとして使用した。

xmin, ymin, xmax, ymax: 原点（0,0）を画像の左上隅とするバウンディングボックスの座標を定義する。

ハイパーパラメータの選択とニューラルネットワークの学習
Faster R-CNNをゼロから実装するのは簡単な作業ではありません。TensorFlowのオブジェクト検出APIを使えば、驚くほど簡単にできる。TensorFlow APIのGitHubページで十分に文書化されている手順を繰り返し説明することはしませんが。ここでは、全体の実装を簡単に説明し、詳細については私たちのコードを参照してください。

データセットは、オルガノイドの大きな顕微鏡画像を300×300と450×450ピクセルのパッチに分解して作成されました。

2.クラウドソーシングのアノテーターがアクセスできるように、パッチはGoogle Storage Bucketにアップロードされた。

CrowdFlower.comというクラウドソーシングプラットフォームの詳細なマニュアルを作成し、プラットフォーム上に新しいジョブを立ち上げ、指示されたバウンディングボックスを使用して画像にアノテーションを施しました。
出来上がった'.csv'ファイルには、各バウンディングボックスのxmin, ymin, width, heightが含まれていた。このファイルは、以下のヘルパースクリプトに適した形式であるため、xmin、ymin、xmax、ymaxに変更するために小さなPythonスクリプトが書かれました。
「.csv」ファイルをトレーニングセットとテストセットに分割した。
APIが提供するヘルパースクリプトを用いて、.csv形式のデータをTFrecords（APIが使用するTensorFlowのデータ形式）に変換した。
設定スクリプトを作成し、クラスの数（今回は1クラスのみ）、オーグメンテーション戦略、データの場所などを指定した。また、Faster R-CNNアーキテクチャに関連するパラメータを指定するオプションもありましたが、最初のテストではうまく機能するように思えたので、デフォルトのままにしておくことにしました。我々が調整したハイパーパラメータは以下の通りです。

a.
バッチサイズは1つで、それ以上大きくすると1つの GPU メモリに収まらないからです。

b.
総トレーニングステップ数を200kとし、停止基準を設けない。

c.
SGDオプティマイザを使用し、運動量は0.9、学習率はステップ数に応じて減少するよう以下のように調整した。

i.
ステップ0～50kまでLR=0.001

ii.
ステップ50-80kからLR = 0.0001

iii.
LR = 0.00001 80kを超える部分

トレーニングはPaperspace.comのクラウドベースのWindows Server 2016インスタンスで実施し、16GBのGPU RAMを搭載したQuadro P5000 GPUで3日程度かかりました。使用したサービスは、トレーニングを行った時点でAWSとGoogle Cloudの両方（GPUインスタンスの場合）よりも安価であったため、Paperspace.comを使用しました。

TensorFlowにはTensorBoardが付属しており、学習中の損失を観察したり、APIで提供されるコードベースを使って実装の平均平均精度（mAP）を計算したりすることができた。

アルゴリズムの精度を評価するために使用した主な指標は、平均平均精度（mAP）です。この指標は、物体検出アルゴリズムを評価するためのゴールドスタンダードである。mAPは、学習アルゴリズムが見たことのない10%のテストセットを使用して決定されました。この指標をもう少し詳しく説明します。平均精度は、アルゴリズムによってグランドトゥルース（手動注釈）のバウンディングボックスの何パーセントが検出されたかを意味します。例えば、ある画像に2つのオルガノイドがあり（したがって、2つのバウンディング・ボックスがある）、アルゴリズムがそのうちの1つだけを検出した場合、平均精度は0.5、つまり50%である。もし、両方が検出されれば、100％となる。そして、mAPは全てのテスト画像で計算された全ての精度の平均となります。したがって、mAPが100%に近ければ近いほど、優れたアルゴリズムであると言える。なお、アルゴリズムが作成したバウンディングボックスをグランドトゥルースと比較するために、70％のオーバーラップ（すなわち、ユニオンを超える0.7の交差）があれば、同じバウンディングボックスと見なすことにした。計算効率を測る指標があると便利な場合もありますが、ここでは実装が高速である必要はないため、大きな関心事にはなりませんでした。例えば、リアルタイムの検出は望まれない。

コードとデータの利用可能性
推論に関する全てのコードは https://github.com/TKassis/OrgaQuant から入手可能です。学習済みモデルと完全な学習データセットは https://osf.io/etz8r からダウンロード可能です。

参考文献

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オルガクアント、深層畳み込みニューラルネットワークを用いたヒト腸管オルガノイドのローカライゼーションと定量化

掲載：2019年8月28日
Timothy Kassis, Victor Hernandez-Gordillo, ...Linda G. Griffith
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参考記事

武部研究室　ヒューマン・オルガノイド　プロジェクトでは、人工多能性幹細胞（iPS細胞）などのヒトの細胞から造られた臓器のミニチュア版「オルガノイド」をツールとして、新薬開発や臓器移植への応用を実現するための基礎となる技術開発を進めています。

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