PEG化酸化グラフェンは表面不活性化にもかかわらず強い免疫反応を引き起こす
PUbMed
Nana Luo,, Jeffrey K. Weber, Guanghui Ma
Nature Communications volume 8, Article number: 14537 (2017)
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概要
人工ナノ材料は、バイオ・ナノ界面における医療の変革をもたらすと期待されている。しかし、合成ナノ材料をヒトに安全に使用するためには、合成ナノ材料が重要な生物学的システムとどのように相互作用するかを解明することが重要である。
これまでの研究から、ポリエチレングリコールPEGで官能基化されたナノ材料は、生体適合性に優れ、原型のままのナノ材料よりも劇的な免疫反応を引き起こさないことが示唆されている。
我々は、これらの知見と矛盾する結果を報告する。
PEG化酸化グラフェンナノシート（nGO-PEG）は、内在化しないにもかかわらず、腹膜マクロファージにおいて強力なサイトカイン応答を引き起こすことを見出したのである。
原子論的分子動力学シミュレーションは、nGO-PEGが細胞膜に優先的に吸着したり、部分的に挿入したりすることで、刺激性の表面受容体との相互作用を増幅するメカニズムを支持するものであった。
さらなる実験により、nGO-PEGはインテグリンβ8関連シグナル伝達経路を増強することにより、実際にサイトカイン分泌を誘発することが示された。本結果は、表面不活性化が2次元ナノ材料に対する免疫反応を必ずしも防ぐものではないことを示すとともに、免疫刺激を必要とするPEG化ナノ材料の応用を示唆するものである。
はじめに
バイオ・ナノ界面は、ナノ材料がタンパク質複合体や脂質膜などの生体分子集合体と接触することで形成される1,2。ある媒体の中で、バイオ・ナノ界面の物理化学的特性は、主に人工ナノ材料が持ちうる多様な組成、形態、表面化学的性質によって決定される3,4。これらの特性を調整することで、バイオセンシング、ドラッグデリバリー、イメージング、組織工学などの生物医学的応用に向けた無数のナノ材料機能性を実現することができる5,6。
このような生物医学的応用のための重要な前提条件として、問題となっているナノ材料の生体内での安定性と生体適合性を確立することが挙げられます7,8。蓄積された証拠によると、ナノ材料の本来の活性は、しばしば生体環境からの生体分子コロナの吸着によって上書きされることが示唆されている9,10。これらのコロナ分子は、ナノ材料に新しい特性を与え、生体-ナノ界面での相互作用を変化させ、設計されたナノ材料の特性と生来の生体分子機能の両方に干渉する。このような効果を回避するために、ナノ材料は、ポリエチレングリコール（PEG）鎖などの防汚性、親水性、電荷中和性の部位でコーティングすることができる11,12。その結果得られる「不動態化」表面は、マクロファージによる内在化を抑制し、侵入粒子に対する身体の予備的防御ラインから人工ナノマテリアルを逃がすことができることが示されている13,14,15。このような特性は、原理的には、マクロファージの活性化とそれに続く免疫学的反応を防ぐと考えられ、外因性ナノ物質の安全な使用を保証するものである。
2次元（2D）ナノ材料は、その生物医学的応用性から特に注目されている16,17,18。例えば、グラフェン誘導体は、大きな比表面積を持つため、薬物送達に優れた吸着特性を示すとともに、固有の発光特性を持つため、生細胞イメージングを容易にする。しかし、ナノ粒子のパッシベーションに関するこれまでの研究は、主にミセル、リポソーム、人工高分子などの従来の球状材料に集中している19。そこで、ここでは、代表的な2次元ナノ材料であるナノグラフェンオキシド（nGO）の表面パッシベーションの免疫学的影響について研究する。
興味深いことに、PEG化したnGOに対するマクロファージの反応は、仮説よりも劇的であることがわかった。非内包化という我々の推測はほぼ正しいにもかかわらず、nGO-PEGは高レベルのサイトカイン分泌を促進することによってマクロファージを活性化することが示された。このマクロファージの興奮は、nGO-PEGと細胞膜の物理的接触、すなわち細胞の移動性・遊走性を高める相互作用によって引き起こされていることを発見した。遺伝子チップ解析の結果、nGO-PEGの刺激がインテグリンβ8のアップレギュレーションとそれに続くシグナル伝達経路の活性化を通じて化学シグナルに変換されることが示された。分子動力学（MD）シミュレーションにより、PEG化ナノシートは内在化しにくい一方で、フェイスオン／エッジオン配置で膜表面に吸着／部分挿入しやすく、インテグリンを介したシグナル伝達経路を誘起するという考えが支持された。これらの結果について、以下に詳しく説明する。
結果
nGO-PEGに対するサイトカイン応答の上昇
ヒトの血清中に侵入した異物は、通常、マクロファージによって飲み込まれ、サイトカイン分泌、炎症、その他の関連するストレス応答を含む生理的な挙動を変化させる20,21。PEGは、免疫細胞によるこのような内在化を避けるために、一般的にナノ材料表面にコンジュゲートされている22,23。我々の実験では、マクロファージによるnGO-PEGのごくわずかな内在化が実際に観察され、nGO-PEG共焦点画像に細胞内蛍光シグナル（紫）がないことが示された（図1a）。しかし、内在化したナノシートからのシグナルは、プリスティンnGOに曝露した細胞では明らかに存在する。細胞に実質的な核損傷を与えたプリスティンnGOとはさらに対照的に、nGO-PEGに曝露したマクロファージの核特性（例えば、形状、面積、丸み、強度）は正常細胞のものと一致したままであった（補足Fig.1）。我々の過去の研究13に見られる他の生存性試験（CCK-8、Live-DeadおよびAnnexin-V/PIアッセイなど）の結果と相まって、我々のデータは、nGO-PEGが高い生体適合性を有することを示唆している。
図1：マクロファージの挙動に対するnGOおよびnGO-PEGの影響
これまでの観察結果と一致するように、純粋なnGOをマクロファージに取り込ませると、インターロイキン（IL）-6、単球走化性タンパク質-1、インターフェロン-γ、腫瘍壊死因子-α、IL-12といった活性化に関連するサイトカインの分泌が促進された（Fig. 1b）。しかし、予想に反して、不活性であるはずのnGO-PEGとインキュベートしたマクロファージでは、実質的に大きなサイトカイン産生（リポ多糖で処理した陽性対照細胞群よりもさらに高い）が観察された（Fig.1b）。これらの不可解な結果を探るため、まずサイトカインレベルを時間の関数として測定した（図1c）。これらのデータは、nGO-PEGが試験した材料の中で最も顕著なサイトカイン反応を誘発することを確認した（Fig.1c）。用量依存的なアッセイ（2.5から10μg ml-1の範囲のnGO-PEG濃度を特徴とする）において、検出されたすべての活性化関連サイトカインのレベルは、nGO-PEG用量の増加とともに増加した；抑制因子IL-10の分泌にはほとんど変化が見られなかった（Fig. 1d）。遊離のPEGも、nGOとPEGの単純な混合物（2つのグループ間の共有結合がないことが特徴）も、nGO-PEGで見られた規模のマクロファージ活性を喚起しなかった（補足図2）。さらに、サイトカイン産生量はPEG鎖の結合密度と正の相関があることがわかった（Supplementary Fig.）このようにPEGとnGOの化学結合は、PEG化GOで観察されるサイトカイン分泌の著しい増加にとって重要であると思われる。
マクロファージ膜に対するnGO-PEGの影響
次に、細胞膜パラメータに対するnGO-PEGの影響を明確に測定しようとした。nGO-PEGと24時間インキュベートした後、共焦点画像からマクロファージ表面にnGO-PEG（紫色）と絡み合った糸状体（緑色）が深く伸びていることがわかった（図2a）。これらの糸状体は、透過型電子顕微鏡写真でも確認できた（Fig.2b）。
図2：nGOとnGO-PEGが細胞の移動と膜の完全性に与える影響
細胞膜の完全性に対するこれらのnGO-PEG相互作用の影響を測定するために、乳酸脱水素酵素漏出アッセイを実施した（図2c）。nGO-PEG処理群ではごくわずかな漏出が検出されただけで、nGO-PEG曝露マクロファージの膜は大部分、無傷のままであり、正常な細胞機能を維持できることが示された。膜の運動性は膜の機能と密接な関係があるため、細胞膜をDiOで標識し、光退色後の蛍光回復法を用いて膜の拡散特性を調べた（図2d、補足図4）。観察された回復速度論によると、正常細胞は回復半減期（t1/2）が12.21秒、拡散係数が0.031μm2 s-1であることが示された。一方、プリスティンのnGOに暴露すると、回復半減期（t1/2）は7.51秒となり、膜拡散係数は0.145μm2 s-1と増加した。nGO-PEG処理細胞の蛍光曲線の傾きはさらに急で、半減期は5.5秒、対応する拡散係数（0.166 μm2 s-1）は正常細胞やnGO処理細胞のそれよりも高いと判断された。nGO-PEG処理群およびnGO-PEG処理群におけるこの膜移動度の増加は、ナノシートと細胞膜の相互作用に起因すると考えられ、この現象はnGO-PEG曝露でより顕著になった。拡散ダイナミクスが加速される正確なメカニズムについては、まだ解明されていない。我々のシミュレーションの文脈で述べたように、nGOと直接接触すると、局所的な膜セグメントが凍結し、脂質との部位特異的な相互作用によって拡散が停止すると予想される。しかし、マクロファージの活性化が促進されると、下流のプロセスで拡散速度が増加する可能性も十分にある。どのようなメカニズムであれ、脂質の移動度が高まれば、膜に吸着したnGO-PEGの輸送特性が向上し、おそらくマクロファージの活性がさらに高まるはずである。
観察された膜移動度の増加は、一部、nGO-PEGの存在によって誘導されたマクロファージ移動の激化と関連している可能性がある（図2e）。観察後1時間以内に、正常細胞は静止状態と不活性状態を維持し、元の場所にとどまった。nGOの添加により、細胞はわずかな距離だけ遠くに移動した。しかし、nGO-PEGに暴露した細胞は、移動球を大きく広げ、監視時間中に視野の外にまで移動する細胞もあった（補足図5）。より定量的には、nGO-PEGは細胞の軌道を30μmの球状領域の周辺に接近させるが、未処理およびnGO処理細胞はその領域の中心付近に留まっていた（補足図6）。したがって、非内包化nGO-PEGの存在は、マクロファージの運動性の増加と明確に関連しており、その運動はおそらく活性化の結果である。
膜-nGO-PEG相互作用の分子的基盤
二次元ナノ材料が持つユニークな特性を考慮すると、nGO-PEGの平面構造がマクロファージ活性化の原因となる相互作用を規定する可能性があると考えられる。この仮説の初歩的な検証として、PEG化カーボン球（約200 nm）と一次元カーボンナノチューブ（長さ約4 μm）の存在下でマクロファージをインキュベートした（図3a）。表面積と投与量（10μg ml-1）に同様の制約がある場合、2次元nGO-PEGは、サイトカイン分泌、膜拡散および細胞移動を、圧倒的に高いレベルで誘導した（図3b、補足図7）。このサイトカイン分泌の傾向は、原始的なナノ材料間でも同様に保存されている（補足図8）。単純な物理的議論に基づけば、2次元PEG化ナノ材料は、確かに細胞膜と最も顕著な相互作用を持つはずである。例えば、nGO-PEGは、細胞膜との平面間相互作用を好むかもしれない。これは、PEG化炭素球および一次元カーボンナノチューブの点から面、線から面への「結合モード」よりも、面積が広く（したがって強いファンデルワールス相互作用を支える）、長く持続するはずだ（図3c）。このような平面的な相互作用特性は、後述するように、マクロファージ表面の活性化受容体を介して高いフラックスに変換される可能性がある。
図3：PEG化カーボンナノ材料のサイトカイン分泌への影響
nGO-PEGとマクロファージ表面の間の微視的相互作用についてより明確な洞察を得るため、我々は脂質膜の存在下でGOナノシート（プリスティンおよびPEG化）の広範囲な分子力学シミュレーションを実施した。特に、過去の実験とシミュレーションの結果、プリスティンのnGOは、直接切開メカニズムによってリン脂質二重膜に破壊的な影響を与え、さらに積極的な脂質抽出によって膜の完全性を損なうことが明らかになった24,25,26,27,28。
この過去の証拠を裏付けるように、我々のシミュレーションでは、切開と抽出の両方のメカニズムが観察された（図4）。初期（例えばt=30 ns）には、反動でnGOが膜中心に向かっていくため、脂質の抽出現象が挿入プロセスを妨げていた。シミュレーションが進むにつれて、nGOとの相互作用点から離れた膜領域で、脂質密度の減少が明らかになった。数百ナノ秒後、ナノシートの頂部は膜表面下にほぼ消失し、二重層の反対側をほぼ貫通した。この物理的な切り込みと、GO表面への脂質の吸着によって引き起こされる長距離密度不足の両方が、膜構造の不安定化につながる。これらの結果は、マクロファージ細胞膜に損傷を与える原始的なnGOに関する過去の実験的観察を支持するものである13。また、ここで観察されたnGOの完全な挿入は、他で報告されているように、マクロファージによるnGOの内部化が受動的および能動的な手段で進行する可能性を示唆している26,27,29。
図4：エッジオン配置からのnGO-およびnGO-PEG-膜間相互作用のシュミレーション
さらに、PEGとnGOの結合による不動態化効果を明らかにするために、MDシミュレーションを行った。まず、PEG化GOナノシート（4本のPEG鎖がnGOの端から、2本がnGOの面から突き出ている）を、膜がない状態でシミュレーションした。ポリマーが完全に伸長した状態からスタートすると、タンパク質吸着剤で見られるように、PEG鎖はすぐに崩壊し、GO表面に吸着した（補足図9）30。したがって、nGOの2次元的な性質は、nGO-PEGにおいてもほぼ保存されているはずである。平衡化した nGO-PEG を膜表面上にエッジオンで置くと、表面に結合した PEG 鎖が脂質の吸着と競合し、ナノシートの挿入を妨げ、完全な膜透過を阻害していることが観察された。吸着した血清タンパク質が、グラフェンの挿入を同様に妨害していることが観察されている31。図4bの質量中心分離トレースが示すように、nGO-PEG挿入は、純粋なnGOの場合よりも緩やかに進行している。興味深いことに、結合したPEG分子は、膜との相互作用の過程で脱離しにくい。脂質がnGO表面に付着してナノシートを下方に引き下げると、吸着した鎖が上方に押し出されるのである。GO表面の利用可能な領域を使い果たすと、挿入プロセスは終了し、PEGで覆われたグラフェン表面が膜の外側に部分的に露出した状態となる。そのため、膜が受けるダメージは、素のnGOに見られるような中程度のものとなる。吸着したPEGは、膜貫通の立体障害となるだけでなく、脂質を引き寄せ、二重膜の平衡密度をさらに低下させる表面積を占有することになる。PEG官能基化の基本的な結果、すなわち膜切断および脂質抽出能力の低下は、様々なサイズのnGO-PEGに適用されると予想され、PEG化ナノシートが保護されていないものに比べてより穏やかである理由を説明することができる13。
nGO-PEGは細胞膜へのダメージが少ないという考え方は、その免疫活性特性を理解する鍵になると思われる。マクロファージは、nGO-PEGに曝露されても高い生存率を維持するはずであるが、その生存率はPEG化ナノシートが細胞膜に付着するのを妨げはしない。図4に示したような、部分的に挿入されたnGO-PEGは、その状態を長時間維持し、細胞表面を横切って拡散する可能性がある。しかし、nGO-PEGはフェイスオン構成で膜に吸着する可能性も高い。Fig. 5のシミュレーションはこの言葉を裏付けるものであった。これらのシミュレーションの軌跡から定量的な結合速度を推定することはできないが、フェースオン吸収後の総相互作用エネルギーは、およそ2倍でnGO-PEGに有利であった（Fig.5b）。最初の面接触後、PEG鎖のループと末端が脱離し、脂質二重層に食い込む一過性の「アンカー」を形成する（図5c）。このような一本鎖のアンカーが膜の完全性を損なうとは考えられないが、PEG分子の突出により表面積と極性部位が増えるため、膜との静電的およびファンデルワールス的相互作用が強まる（補遺図10）。実際、素のnGOと比較して、この相互作用エネルギーの増大は、nGO-PEGと膜の間の空間的に緊密な結合と相関している（補足図11）。
図6：nGO-PEGによるサイトカイン大量分泌のメカニズム解明
インテグリンシグナル伝達経路の初期には、focal adhesionと呼ばれる高分子複合体が細胞内部へのシグナル伝達の担い手として働く39。このシグナル伝達プロセスは、インテグリンクラスターへのfocal adhesion kinase (FAK) の動員によって進行し、結合時に自己リン酸化を介して活性化される40,41。2日間にわたるphospho-FAK (p-FAK) の発現をウェスタンブロッティングで観察したところ（図6d、補足図16）、nGO-PEGは正常細胞との有意差をもって徐々にp-FAKの生成を誘発した（P<0.001）。p-FAKに加え、vinculinというタンパク質も接着斑複合体の重要な構成要素である42。そこで、共焦点顕微鏡を用いてインテグリンとビンキュリンの分布を画像化した（Fig. 6e）。未処理細胞とは対照的に、nGO-PEGの導入はintegrin β8の発現を促進するだけでなく、細胞周囲の分布にも影響を及ぼしていた。また、ビンキュリンとインテグリンの強い共局在化（図6eの高倍率挿入図に示す）も観察され、ビンキュリンがnGO-PEG結合部位に動員されると、接着斑の増殖とそれに伴うシグナル伝達が起こることが示唆された。
遺伝子チップ解析で示された推定経路（補足表1）を考慮し、量子遺伝子検出による関連遺伝子の発現の定量化をさらに試みた。図 6f および補足図 16、17 に示すように、nGO-PEG との物理的相互作用が推定される結果、Shc1、Kras、Map2k1、Fos などの遺伝子が何倍もアップレギュレートされている。抗体阻害実験と同様に、integrin β8 siRNAで前処理すると、コントロール群に匹敵するレベルまで発現が抑制された。
これらの結果を総合すると、nGO-PEGへの曝露がサイトカイン分泌を促進する明確なメカニズムが示唆された（図6g）。
膜表面に存在するインテグリンαvβ8は、膜に吸着または挿入されたnGO-PEGとの相互作用によって活性化され、その結果、ビンキュリンの動員およびFAKの自己リン酸化を引き起こす。P-FAKはその後、Ras、Raf、Mek、Erk遺伝子の発現を上昇させ、核内転写因子Fosの発現上昇を支配する。phosphoinositide-3 kinaseとprotein kinase Cの遺伝子も活性化され、Nuclear factor-κBの細胞質から核への移行を促す（補遺図18）。
これらの現象は、マクロファージによるサイトカインの合成と分泌を促進し、下流でさらなる免疫学的反応を引き起こす可能性がある。
結論として、表面不動態化は、ナノ材料の安定性と生体適合性を向上させ、マクロファージの内在化と活性化を回避し、バイオ・ナノ界面でのクロストークを効果的に減衰させるものと広く考えられている。
しかし、我々の研究によって、2次元ナノ材料のPEG化は、これまで考えられていたよりも不動態化しにくいことが明らかになった。安定で生体適合性があり、内在化しないにもかかわらず、nGO-PEGはサイトカインの強力な放出を誘発することにより、マクロファージを活性化することができたのである。nGO-PEGは、すべての2次元ナノ材料に共通する膜相互作用のための高い利用可能表面積を有しており、これが問題の細胞に対する刺激効果を決定しているのではないかと推測される。nGO-PEGの曝露により、膜の形態に明確な変化が見られ、同時に膜の移動度が増大し、細胞の移動が促進された。nGO-PEGと膜の相互作用に関する我々のシミュレーションは、マクロファージの活性化を促進する特定の分子メカニズム（エッジおよびフェースオン接触による）を示唆した。
さらに、インテグリン αvβ8 が nGO-PEG と膜の結合に関連したシグナル伝達において重要なイニシエーターとしての役割を担っていることを実験的に明らかにした。integrin β8 のアップレギュレーションとそれに続く FAK 関連の細胞内シグナル伝達経路の活性化を通じて、nGO-PEG がもたらす外部刺激が化学シグナルに変換され、最終的にマクロファージの活性化を引き起こすことがわかった。
重要なことは、本研究は、表面不活性化によって2次元ナノ材料が常に免疫学的反応から逃れられるとは限らないということである。我々は、2回目の刺激時にサイトカインが減少することに注目した（補足図21）。この観察は、nGO-PEG誘導マクロファージ活性化が時間と共に減衰する可能性を示唆している。興味深いことに、非炭素系二次元ナノ材料MoS2のPEG化でも、非常に同程度の活性化が観察された（Supplement Fig.22）。PEG化2次元ナノ材料によるこのような活性化が、さらなる炎症反応や免疫反応を引き起こすかどうか、またその程度はどの程度かについては、さらなるin vivoでの実験が必要である。一方、免疫系において重要な抗原提示細胞である樹状細胞などの関連システムにおいて、nGO-PEGによる活性化の可能性を探ることは価値があると思われる43。実際、我々の観察は、PEG化ナノ材料が、免疫系が刺激を必要とする状況での使用に適している可能性をも示唆している44,45。nGO-PEGが、マクロファージに顕著な損傷を与えることなく、活発な免疫反応を引き起こすという事実は、おそらく治療の観点から有望である。
より多くの研究が必要であることは確かだが、nGO-PEGのような慎重に送達されたナノ材料によって誘導される標的サイトカイン分泌は、将来の免疫療法の有効な構成要素となる可能性がある。nGO-PEGへの曝露の免疫学的意義に関するさらなる研究は、表面機能化の効果に関する現在の知識を補うだけでなく、これらの新規ナノ材料のより安全で効果的な生物医学的応用への道を開くものであろう。
メソッド
細胞培養
腹膜マクロファージ（PMØs）は、典型的なプロトコルに従って、刺激されたC57BL/6マウスから採取された
ナノ材料の合成と特性評価
原始的なnGO（単層、横サイズ約200 nm）および他のカーボンベースのナノ材料のPEG化は、以前に確立された方法に基づいて行われた47。簡単に言えば、1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) (20 mM) をプリスティン nGO 懸濁液（約 500 μg ml-1）に導入して 15 分間超音波処理を行い、その後 mPEG-NH2 を添加して一晩反応をさせた。最終生成物は、脱イオン水で繰り返し洗浄した後、70,000gで遠心分離して採取した。ナノ材料の形態は、原子間力顕微鏡（Bruker）、走査型電子顕微鏡、透過型電子顕微鏡（JEOL）を用いて画像化された。nGOとnGO-PEGのより詳細な特性は、補足図23と24、補足表2と3、および我々の以前の研究13に記載されている。
サイトカイン分泌量の測定
サイトカイン分泌レベルを測定するために、PMØ細胞を、異なる期間（6、12、24、48時間）、異なる投与量（10および40μg ml-1）で様々なGO溶液に曝露した。サイトカイン分泌量（IL-6、IL-10、IL-12、腫瘍壊死因子-α、単球走化性タンパク質-1、およびインターフェロン-γ）をフローサイトメトリー（Beckman Coulter）により評価した。
細胞イメージング
イメージング応用のため、PMØをシャーレに播種し（1×105 ml-1）、10-40μgml-1のnGO複合体とともに24時間インキュベートした。NGO複合体イメージングは、グラフェン固有の光ルミネセンスを利用し、フローサイトメーターまたは共焦点レーザー走査顕微鏡（Leica）を用いて実施した。細胞骨格と核は、ローダミン-ファロイジン（画像では緑色の疑似カラー、Invitrogen）とヘキスト（Hoechst）で別々に染色した。膜形態の特徴のために、nGO-PEGで処理した細胞を染色し、固定し、Reichert Ultracutミクロトーム（Leica）で切断し、透過電子顕微鏡で画像化した。乳酸脱水素酵素漏出アッセイと光退色後の蛍光回復実験 は、標準的な手順で行った。細胞軌跡のビデオは、Ultraview（PerkinElmer）インキュベーター内で明視野モードで記録された。
遺伝子チップ解析
遺伝子チップ解析の準備として、PMØ細胞を培養した後、10μg ml-1 nGO-PEGにそれぞれ12、24および48時間曝露した。各サンプルから 0.6 ml の trizol 試薬を用いて RNA を抽出し、Shanghai Gene Corporation に送付してさらに解析した。パスウェイ解析は、KEGGデータベースを用いて行った。12、24および48時間の同時培養後、コントロール、nGO-PEGおよびβ8遺伝子サイレンシングしたnGO-PEG群に分割したPMØ細胞について、定量的遺伝子検出を実施した。
抗体ブロッキング実験
抗インテグリンβ1、β2（Millipore）、α1（Abcam）、αL、β8（Santa Cruz Biotechnology）及びαv（Biolegend）を指示した濃度で加え、4時間インキュベートさせた；その後、細胞を10μg ml-1 nGO-PEG を含む培養液に24時間曝露し、サイトカイン量を上記の通り検出した。PMØへのマウスインテグリンβ8 siRNAのトランスフェクションは、RNAimax試薬（Invitrogen）を用いて、製造者の説明書に従って実施した。
ウェスタンブロッティング
GADPH (1:1,000, Goodhere Corporation), FAK (1:1,000, Santa Cruz), p-FAK (1:500, Cell Signaling Technology), integrin β8 (1:500, Biolegend) および西洋わさびペルオキシダーゼ標識抗ウサギ IgG (1:2,000, Cell Signaling Technology) に対する一次抗体を免疫ブロッティング解析に使用した。一次抗体にはβ8インテグリン（1：200）およびビンキュリン（1：200、Sigma-Aldrich）を、共焦点レーザー走査顕微鏡によるイメージングにはAlexa Fluor 488およびAlexa Fluor 647色素を結合した抗ウサギIgGを用いて免疫蛍光性実験を実施した。12、24、48時間の同時培養後、コントロール、nGO-PEG、およびβ8遺伝子サイレンシングしたnGO-PEG群に分割したPMØ細胞で定量遺伝子検出を実施した。
シミュレーションのパラメータと構成
nGOシートの座標と化学的性質は、まず標準Lerf-Klinowskiモデル49の若干縮小版に準拠するように（VMD Nanotube Builderプラグイン48を使用）生成された。次に、15個のモノマーからなるPEG鎖の構成を手動で作成した。PEG鎖は、我々の実験で使用したものと同様のアミド結合を介してnGOに共有結合させた。PEGモノマーと末端に関する力場パラメータは、 CHARMMエーテル力場50から直接抽出し、 GO官能基とアミド結合に関するパラメータは、 CHARMM27力場内の類似モチーフから適応させた51。
シミュレーションのセットアップ
NAMD シミュレーションパッケージ52 を用いて、 Langevin integrator (310 K; 1 atm), CHARMM27 force field, TIP3P water model, PME electrostatics and normal SETTLE constraints を適用し、 nGO-PEG 初期配置を最小化して単独で平衡化させた。nGO-PEG系の平衡化スナップショットを補遺図10に示す。シミュレーションに使用した1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine（POPC）膜フラグメントは、通常の手順で生成し平衡化しました。
生産シミュレーション
生産シミュレーションでは、平衡化されたnGO-PEG（または素のnGO）は、面上または縁上配置で膜の上に初期化された。軌跡データは、上記の同じ力場とシミュレーションパラメータを用いて数百ナノ秒（いくつかのケースでは、マイクロ秒）の間収集された。
データの入手方法
本研究の結果を裏付けるデータは、本論文（およびその補足情報ファイル）および対応する著者から入手可能であり、適切なリクエストに応じて提供される。
追加情報
本論文の引用方法Luo, N. et al. PEG化グラフェンオキシドは、表面の不動態化にもかかわらず、強い免疫学的応答を誘発する。Nat.Commun.8, 14537 doi: 10.1038/ncomms14537 (2017)に掲載されました。
出版社からのコメント：
シュプリンガー・ネイチャーは、出版された地図や機関所属の管轄権主張に関して中立的な立場を維持しています。
参考文献1〜52
謝辞
GO粉末とCNT粉末をご提供いただいた北京大学Ding Maのグループに感謝します。また、MoS2溶液をご提供いただいた南洋理工大学Hua Zhangのグループに感謝します。本研究は、国家科学技術主要プロジェクト（2014ZX09102045-004）、973プログラム（2013CB531500）、中国国家自然科学基金（21320102003、11374221、11574224、31370018）により一部支援されたものである。このプロジェクトは、江蘇省高等教育機関重点学術プログラム開発（PAPD）により一部資金提供された。R.Z.はIBM Blue Gene Science Program (W125859, W1464125, W1464164)の支援を受けたことを認めます。J.D.は清華大学(2012Z02133)の支援も受けています。
著者情報
著者ノート
Nana Luo、Jeffrey K. Weber。これらの著者は、この研究に等しく貢献している。
著者および所属
中国科学院プロセス工学研究所生物化学工学国家重点実験室，〒100190 北京市瑞穂区瑞穂町1-1-1，中国科学院瑞穂分院内
Nana Luo, Shuang Wang, Hua Yue, Xiaobo Xi, Wei Wei & Guanghui Ma（羅奈緒、王双、岳華、西暁波、馬光輝
中国科学院大学、北京、100049、PR ChinaNana Luo, Shuang Wang, Xiaobo Xi & Guanghui Ma.
IBMトーマス・J・ワトソン・リサーチ・センター（米国ニューヨーク州10598、ヨークタウンハイツ）計算生物学センター
ジェフリー・K・ウェーバー、ビンクアン・ルアン、ルホン・ズー
清華大学バイオメカニクス・医用工学研究所工学部，〒100084 中国北京市東山区東山町1-1-1
杜 景
江蘇省蘇州市高等教育機関放射線医学共同イノベーションセンターSRMP・RAD-X定量生物医学研究所 〒215123 江蘇省蘇州市楠町1-1-1
Zaixing Yang & Ruhong Zhou
コロンビア大学化学部、ニューヨーク、10027、アメリカ
Ruhong Zhou
江蘇省国立先進材料イノベーションセンター（SICAM）、南京工科大学、南京、211816、PR China
馬 光輝
寄稿
G.M.とR.Z.は研究の着想を得て、すべての実験をデザインした。N.L., S.W., H.Y., X.X. J.D. and W.W. はすべての実験を実施し、分析した。J.K.W., B.L., Z.Y. は分子動力学シミュレーションと計算機解析を行った。N.L., J.K.W., W.W., R.Z. and G.M.は、全著者の協力のもと、原稿を執筆した。
協力者
Wei Wei，Ruhong Zhou，Guanghui Maのいずれかにご連絡ください。
倫理的宣言
利益相反
著者らは、競合する経済的利害関係を宣言していない。
補足説明
補足情報
補足図、補足表、補足方法、補足参考文献。(PDF 1745 kb)
補足動画1
nGO-PEG非存在下での細胞の軌跡 (MOV 20359 kb)
補足動画2
nGO-PEG存在下での細胞の軌跡 (MOV 17300 kb)
ピアレビューファイル (PDF 2611 kb)
権利と許可
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